早產新生兒的治療的制作方法

專利名稱：早產新生兒的治療的制作方法
早產新生兒的治療本發明涉及對早產新生兒(pre-term neonate)的治療,例如涉及減小或防止與早產有關的死亡和患病。早產影響著5% 10%的發達國家人口和約25%的發展中國家人口 L早產占新生兒死亡的大部分，并且占據了新生兒重癥監護病房工作量的絕大部分。這意味著巨大的成本負擔，在2006 2007年，一天的新生兒重癥監護花費約1000英鎊，在英國的總年度花費據估算為4. 2億英鎊2。在新生兒重癥監護中最成功的措施之一是在出生后立即將合成的表面活性劑施用到早產兒的肺中。該措施減小了與早產有關的死亡率和患病率(綜述見Soil3)。在動物研究中鑒定出了表面活性劑，在這些研究中發現，當新生兒進行其第一次呼吸時表面活性劑在降低肺部表面張力上起關鍵作用。在妊娠期的最后1/3表面活性劑在肺內的表達升高，并且，在包括人在內的多種物種中，這受到胎兒中的皮質類固醇的誘導。對表面活性劑 的使用是如何可以將對出生準備生物學的理解轉化為可行的且可獲益的治療措施的實例。本發明涉及以下發現編碼對氧磷酶3 (paraoxonase 3, P0N3)和血清淀粉樣蛋白A3 (serum amyloid A like protein 3, SAA3)的轉錄本在正常哺乳動物妊娠末期的胎兒中上調，并且在使新生兒適應在出生時從母體環境分娩后所出現的變化中起重要作用。因此，對氧磷酶3(P0N3)和/或血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)可用作減小或防止早產新生兒中的死亡和患病的治療劑。本發明的一方面提供治療早產新生兒的方法，所述方法包括提高早產新生兒的對氧磷酶3 (P0N3)多肽的水平或活性。本發明的另一方面提供治療早產新生兒的方法，所述方法包括提高早產新生兒的血清淀粉樣蛋白A3 (SAA3)多肽的水平或活性。早產新生兒是在正常妊娠期結束之前出生的嬰兒。在人類中，通常認為在妊娠期少于37周(從對估計到期日的最佳臨床估計中推算得到，其中估計到期日等于40周O天)時分娩的嬰兒是早產的。在一些實施方式中，早產新生兒可以是極早產新生兒，例如，在妊娠期少于32周時分娩的人類嬰兒。適于本文中所述治療的早產新生兒可以是哺乳動物早產新生兒，優選為人類早產新生兒。適于本文中所述治療的早產新生兒可缺乏P0N3。換言之，該早產新生兒的P0N3水平或活性可低于足月新生兒的P0N3水平或活性。在一些實施方式中，直接地通過測量分娩前或分娩后的P0N3水平，或者間接地通過鑒定與P0N3缺乏相關的一種或多種癥狀(例如與氧化應激有關的并發癥)，可以在治療前鑒定早產新生兒缺乏P0N3。在另外一些實施方式中，可以在未鑒定早產新生兒缺乏P0N3的情況下對其進行所述治療。適于本文中所述治療的早產新生兒可缺乏SAA3。換言之，該早產新生兒的SAA3水平或活性可低于足月新生兒的SAA3水平或活性。在一些實施方式中，直接地通過測量分娩前或分娩后的SAA3水平，或者間接地通過鑒定與SAA3缺乏相關的一種或多種癥狀(例如與氧化應激有關的并發癥)，可以在治療前鑒定早產新生兒缺乏SAA3。在另外一些實施方式中，可以在未鑒定早產新生兒缺乏SAA3的情況下對其進行所述治療。鑒定具有患病和/或死亡風險的早產新生兒的方法可以包括確定從該新生兒獲得的樣品中的P0N3和/或SAA3的水平或活性；其中，與對照相比P0N3和/或SAA3的水平或活性降低表明該早產新生兒具有患病和/或死亡風險。使用標準技術(例如諸如ELISA等免疫測定)或者使用酶活測定，可以在從早產新生兒獲得的樣品(例如血液或血清樣品)中確定P0N3和/或SAA3的水平。

具有患病和/或死亡風險的早產新生兒相對于足月新生兒可具有升高的死亡和/或患病風險。對于被鑒定具有患病和/或死亡風險的早產新生兒，可以按本文所述進行治療。提高本文所述的早產新生兒的P0N3多肽和/或SAA3多肽的水平或活性，可以降低死亡和/或患病的程度、嚴重性或風險。例如，本文所述的治療可以防止或降低早產的醫學并發癥(例如，與氧化應激相關的并發癥)的嚴重性或風險。可以治療的早產并發癥包括呼吸并發癥，例如呼吸窘迫綜合征、肺性高血壓和支氣管肺發育不良；神經學并發癥，例如早產兒呼吸暫停、低氧缺血性腦病(HIE)、顱內出血、早產兒視網膜病變(ROP)、發育性殘疾和腦癱；心血管并發癥，例如動脈導管未閉(PDA)；胃腸及代謝并發癥，例如低血糖癥、喂食困難和壞死性小腸結腸炎(NEC);以及血液學并發癥，例如早產兒貧血、血小板減少癥和高膽紅素血癥(黃疸)及核黃疸。在一些實施方式中，本文所述的可以治療的早產并發癥不包括敗血癥或感染或者與敗血癥或感染相關的病況。可以使對氧磷酶3 (P0N3)多肽的水平或活性在新生兒中系統性地升高，或者在特定器官或組織(例如，早產新生兒的肺、血管系統和/或其他組織)中局部性地升高。優選的是，通過向早產新生兒施用P0N3多肽來提高P0N3多肽的水平。對氧磷酶3(P0N3 ；GeneID: 5446)是與血清中的高密度脂蛋白關聯的磷酸二酯酶(EC 3. I. 8. I)。人P0N3的氨基酸序列的Genbank數據庫識別號為NP_000931. IGI: 29788996，并示于SEQ ID NO: 2中。編碼人Ρ0Ν3的核苷酸序列的Genbank數據庫識別號為NM_000940. 2GI:94538355，并示于 SEQ ID Ν0:1 中。發明人還鑒定了具有 SEQ IDN0:4 所示的氨基酸序列的人P0N3剪接變體。編碼該人P0N3剪接變體的核苷酸序列示于SEQ ID NO:3中。適合于本文所述應用的其他P0N3多肽可以包括來自非人哺乳動物(例如牛或豬)的P0N3的氨基酸序列，或者可以是其片段、變體或等位基因產物。牛P0N3 (GeneID:510953)的氨基酸序列的Genbank數據庫識別號為ΝΡ_001068947. IGI: 115496165。編碼牛P0N3的核苷酸序列的Genbank數據庫識別號為NM_001075479. IGI: 115496164。豬 P0N3 (GeneID: 733674)的氨基酸序列的 Genbank 數據庫識別號為 ΝΡ_001038069. IGI: 113205866。適合于本文所述應用的P0N3多肽可以包括參照P0N3序列的氨基酸序列(例如SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4)或者該參照P0N3序列的片段、等位基因產物或變體。例如，參照P0N3序列(例如SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4)的等位基因產物或變體可以包含與參照P0N3序列的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的氨基酸序列。通過插入、增加、替換或缺失I個、2個、3個、4個、5 10個、10 20個或20 30個氨基酸，P0N3多肽可以包含例如與參照P0N3序列(例如SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4)不同的氨基酸序列。P0N3多肽可以是全長P0N3氨基酸序列(例如SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4)的片段，或者是SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4的變體或等位基因產物。片段是截短的多肽，由比、全長序列更少的氨基酸組成，且保留了對氧磷酶3的活性。適合的片段可以包含全長序列中的至少100、至少150、至少200、至少250或至少300個氨基酸。適合的片段保留了 P0N3活性。適合于本文所述應用的P0N3多肽可以由核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ IDNO: 3編碼，或者可以由SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 3的等位基因或變體編碼。例如，P0N3多肽可以由與核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:3的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的核苷酸序列編碼。通過插入、增加、替換或缺失I個、2個、3個、4個、5 10個、10 20個或20 30個核苷酸，編碼P0N3多肽的核苷酸序列可以例如與SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 3不同。類似地，可以使血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)多肽的水平或活性在早產新生兒中系統性地升高，或者在特定器官或組織(例如，該新生兒的肺、血管系統和/或其他組織)中局部性地升高。優選的是，通過向早產新生兒施用SAA3多肽來提高SAA3多肽的水平。人SAA3的氨基酸序列的Genbank數據庫識別號為AA048437. IGI: 28864698，并示于SEQ ID NO:6中。編碼人SAA3的核苷酸序列的Genbank數據庫識別號為AY209188. IGI:28864697，并示于 SEQ ID N0:5 中。適合于本文所述應用的其他SAA3多肽可以包括來自非人哺乳動物(例如牛、大鼠或小鼠)的SAA3的氨基酸序列，或者可以是其片段、變體或等位基因產物。鼠SAA3 (GeneID: 20210)的氨基酸序列的 Genbank 數據庫識別號為 NP_035445. 1GI:6755396。編碼鼠SAA3的核苷酸序列的Genbank數據庫識別號為NM_011315. 3GI: 118130197。編碼大鼠SAA3的核苷酸序列的Genbank數據庫識別號為BF282318 GI: 11213489，并且在Rat230_2陣列上與Affymetrix探針1392647_at雜交。牛SAA3 (GeneID: 281474)的氨基酸序列的Genbank數據庫識別號為NP_851359. 2GI: 38566696。編碼牛SAA3的核苷酸序列的Genbank數據庫識別號為 NM_181016. 3GI: 38566695。適合于本文所述應用的SAA3多肽可以包括參照SAA3序列的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:6)或者該參照SAA3序列的片段、等位基因產物或變體。例如，參照SAA3序列(例如SEQ ID NO:6)的等位基因產物或變體可以包含與參照SAA3序列的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的氨基酸序列。通過插入、增加、替換或缺失I個、2個、3個、4個、5 10個、10 20個或20 30個氨基酸，SAA3多肽可以包含例如與參照SAA3序列(例如SEQ ID NO:6)不同的氨基酸序列。
SAA3多肽可以是全長SAA3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:6)的片段，或者是SEQIDNO:6的變體或等位基因產物。片段是截短的多肽，由比全長序列更少的氨基酸組成，且保留了血清淀粉樣蛋白A3的活性。適合的片段可以包含全長序列中的至少30、至少40或至少50個氨基酸。適合的片段保留了血清淀粉樣蛋白A3的活性。適合于本文所述應用的SAA3多肽可以由核苷酸序列SEQ ID N0:5編碼，或者可以由SEQ ID NO: 5的等位基因或變體編碼。例如，SAA3多肽可以由與核苷酸序列SEQ ID NO: 5的序列同一性為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的核苷酸序列編碼。通過插入、增加、替換或缺失I個、2個、3個、4個、5 10個、10 20個或20 30個核苷酸，編碼SAA3多肽的核苷酸序列可以例如與SEQ ID NO:5不同。通常，參照GAP 算法(GCG Wisconsin Package , Accelrys, San Diego CA)來定義
核苷酸和氨基酸序列同一性。GAP使用Needleman & Wunsch算法36來比對兩條完整序列，使匹配數最大化且使空位數最小化。通常，使用默認參數，即空位建立罰分=12，空位延伸罰分=4。可以優選使用GAP，但也可以使用其他算法，例如BLAST或TBLASTN (其使用Altschul等，(1990) J. Mol. Biol. 215:405-410 中的方法),FASTA(其使用 Pearson 和 Lipman (1988)PNAS USA 85:2444-2448 中的算法)或 Smith-Waterman 算法(Smith 和 Waterman (1981) J.Mol Biol. 147:195-197)，通常采用默認參數。可以將一個或多個異源氨基酸(例如異源肽或異源多肽序列)接合或融合至本文所述的P0N3或SAA3氨基酸序列。例如，P0N3多肽可以包含與一個或多個異源氨基酸連接或融合的上文所述的P0N3氨基酸序列。所述一個或多個異源氨基酸可以包括來自非P0N3來源的序列。類似地，SAA3多肽可以包含與一個或多個異源氨基酸連接或融合的上文所述的SAA3氨基酸序列。所述一個或多個異源氨基酸可以包括來自非SAA3來源的序列。P0N3或SAA3多肽可以包含在融合蛋白中。在一些實施方式中，在用于治療本文所述的早產兒之前，融合蛋白可以經加工而產生成熟的P0N3或SAA3多肽。例如，除了 P0N3或SAA3多肽以外，融合蛋白可以在N端或C端包含一個或多個異源氨基酸，這些異源氨基酸構成位點特異性蛋白酶識別序列的全部或一部分。通過切割該位點特異性蛋白酶識別序列(例如使用位點特異性蛋白酶，如凝血酶或因子Xa)，可以從該融合蛋白得到成熟的P0N3或SAA多肽。融合蛋白可以包含純化標簽，在純化后用位點特異性蛋白酶將該純化標簽除去。適合的純化標簽包括谷胱甘肽-S-移轉酶(來自日本血吸蟲(Schistosoma japonica))。P0N3和SAA3多肽可以用任何常規技術來制造，并且有多種適合的方法可供使用。可以從非人哺乳動物(例如豬或牛)中分離和/或純化出P0N3和SAA3多肽。可以通過化學合成產生完整或部分的P0N3和SAA3多肽。例如，可以使用以下方式來合成多肽使用液相或固相合成法；在溶液中；或者使用固相、液相和溶液化學的任何組合，例如，首先完成各肽部分，隨后，如有需要且合適，在除去所存在的任何保護性基團后，憑借相應的碳酸或磺酸或其反應性衍生物的反應來引入殘基X。多肽的化學合成在本領域中是公知的(J. M. Stewart和J. D. Young, Solid PhasePeptide Synthesis,第 2 版,Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)；M. Bodanzsky和A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, NewYork(1984) ；J. H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford UniversityPress, Oxfordl991 ；Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc. , Foster City,California ；G. A. Grant，(編)Synthetic Peptides, A User’s Guide. W. H. Freeman &Co.，New York 1992 ；E. Atherton 和 R. C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, APractical Approach. IRL Press 1989 ；G. B. Fields,(編)Solid_Phase PeptideSynthesis(Methods in Enzymology 第 289 卷).Academic Press, New York and London1997)o可以用重組技術產生完整或部分的P0N3和SAA3多肽。例如，編碼P0N3或SAA3多肽的核酸可以在宿主細胞中表達，并且可以從細胞培養物中分離和/或提純所表達的多肽。為了產生重組P0N3或SAA3多肽，可以將編碼P0N3或SAA3多肽的核酸序列(即P0N3核酸或SAA3核酸)包含在表達載體中。可以選擇或構建合適的載體，其包含適合的調控序列，包括啟動子序列、終止子片段、多腺苷酸化序列、增強子序列、標志基因和其他適合的序列。優選的是，載體包含適合的調控序列來驅動P0N3或SAA3核酸在宿主細胞中的表達。驅動異源核酸編碼序列在多種表達系統中的表達的適合的調控序列在本領域是公 知的，其包括組成型啟動子，例如病毒啟動子(例如CMV或SV40)和誘導型啟動子(例如Tet-on控制的啟動子)。載體還可以包含諸如復制起點和選擇性標記等序列，這些序列使得可以對其進行選擇并且可以使其在細菌宿主(例如大腸桿菌)和/或真核細胞(例如酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞)中復制和表達。適用于表達P0N3或SAA3核酸的載體包括質粒和病毒載體(例如噬菌體或噬菌粒)，而對載體的精確選擇將取決于所用的特定表達系統。P0N3或SAA3多肽可以在任何便利的表達系統中表達，并且在本領域中有多種適合的系統可供使用，包括細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物的細胞表達系統。更多細節參見例如《分子克隆實驗指南》(MolecularCloning:a Laboratory Manual)(第 3 版)，Russell 等，2001, Cold Spring HarborLaboratory Press。用于在細胞培養物中表達重組多肽以及其隨后的分離和純化的技術和操作規程在本領域中是公知的(參見例如Protocols in Molecular Biology,第2版，Ausubel 等編，John Wiley & Sons, 1992 ；Recombinant Gene Expression ProtocolsEd RSTuan(1997 年 3 月)Humana Press Inc.)。如上所述，P0N3或SAA3多肽可以作為包含P0N3或SAA3多肽序列和純化標簽的融合蛋白在表達系統中表達。優選的是，蛋白酶識別位點位于P0N3或SAA3多肽與純化標簽之間。在表達后，可以使用可與純化標簽結合的固定試劑通過親和層析來分離出融合蛋白。在分離后，可以使用例如凝血酶或因子Xa來以蛋白水解方式切割融合蛋白，從而產生P0N3或SAA3多肽。純化標簽是構成特異性結合對的一個成員的異源氨基酸序列。通過所述特異性結合對的另一個成員與多肽的結合，可以檢測、分離和/或純化包含所述純化標簽的多肽。例如，該純化標簽可以構成抗體分子所結合的表位。多種適合的純化標簽在本領域中是已知的，例如包括MRGS冊6、DYKDDDDK (FLAG )、T7-、S- (KETAAAKFERQHMDS)、聚 Arg(R5_6)、聚 His (H2_10)、聚 Cys (C4)聚Phe (F11)聚 Asp (D5_16)、Strept-tag 11 (WSHPQFEK) > c_myc (EQKLISEEDL)、Influenza-HA 標簽(Murray, P. J.等，(1995) Anal Biochem 229，170-9)、Glu-Glu-Phe 標簽(Stammers, D.K.等，(1991)FEBS Lett 283, 298-302) ,Tag. 100(Qiagen ;源自哺乳動物MAP激酶2 的 12氨基酸標簽)和Cruz tag 09 (MKAEFRRQESDR, Santa Cruz Biotechnology Inc.)和Cruz tag22 (MRDALDRLDRLA, Santa Cruz Biotechnology Inc·)。在 Terpe(2003)Appl. Microbiol.Biotechnol. 60523-533中綜述了已知的標簽序列。在一些優選實施方式中，可以采用谷胱甘肽-S-移轉酶純化標簽。在表達后，可以使用固定的谷胱甘肽通過親和層析來分離出包含P0N3或SAA3多肽和谷胱甘肽-S-移轉酶的融合蛋白。對谷胱甘肽-S-移轉酶融合蛋白的純化在本領域中是公知的。在分離后，可以以蛋白水解方式切割該融合蛋白，從而產生P0N3或SAA3多肽。可以向上文所述的早產新生兒施用P0N3多肽和/或SAA3多肽。雖然可以單獨施用P0N3或SAA3多肽，但優選使其呈現為藥物組合物(例如，制劑)，所述藥物組合物包含上文定義的P0N3多肽和/或SAA3多肽，以及一種或多種藥物可接受的載劑、佐劑、賦形劑、 稀釋劑、填充劑、緩沖劑、穩定劑、防腐劑、潤滑劑或本領域技術人員公知的其他材料，以及可選的其他治療藥物或預防性藥劑。本文所述的包含與一種或多種藥物可接受的載劑、賦形劑、緩沖劑、佐劑、穩定劑或其他材料混合或配制在一起的P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物可以用于上文所述的方法中。本發明的另一方面提供制備藥物組合物的方法，所述方法包括提供上述P0N3多肽和/或SAA3多肽，和將所述P0N3多肽和/或SAA3多肽與藥物可接受的賦形劑混合。本文所用的術語“藥物可接受的”是描述在可靠的醫學判斷范圍內適合用于與受試對象(例如人或其他哺乳動物)的組織接觸且不會引起過量的毒性、刺激、過敏反應或者其他問題或并發癥的化合物、材料、組合物和/或劑型，具有合理的益處/風險比。各載劑、賦形劑等還必須在與制劑中其他成分相容的意義上也是“可接受的”。適合的載劑、賦形劑等可見于標準的藥學教科書中，例如，RemingtonJ sPharmaceutical Sciences,第 18 版,Mack Publishing Company,Easton, Pa.，1990。可以方便地使制劑以單位劑型形式存在，并且可以用藥學領域中公知的任何方法來制備該制劑。此類方法包括使P0N3多肽和/或SAA3多肽與可以構成一種或多種附屬成分的載劑結合的步驟。通常，通過使活性化合物與液體載劑和/或細分的固體載劑均勻緊密地結合，并隨后視需要使產品成形，來制備制劑。優選的制劑可以為液體或溶液形式，或者為緩釋植入物或膠囊形式，例如用于口服施用。可以通過任何方便的施用途徑向受試對象施用P0N3多肽、SAA3多肽或者包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物。在一些實施方式中，通過注入靜脈內途徑、皮下途徑、鞘內途徑或氣管內途徑等胃腸外途徑來進行施用。例如，可以通過注射、特別是靜脈內注射來施用P0N3多肽和/或SAA3多肽。在其他實施方式中，通過腸內途徑來進行施用，例如，通過鼻空腸管或氣管內管(endotracheal tube)。適合于胃腸外施用(例如通過注射，包括靜脈內注射)的制劑包括水性或非水性的、等滲的、無致熱原的無菌注射溶液，該溶液可以包含抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、穩定齊U、抑菌劑和使所述制劑與計劃的接受者的血液等滲的溶質；和水性或非水性的懸液，所述懸液可以包含懸浮劑和增稠劑。用于此類制劑中的適合的等滲載質的實例包括氯化鈉注射液、林格氏液或乳酸林格氏注射液。通常，活性化合物在溶液中的濃度為約I μ g/ml 約100mg/ml,例如約 10 μ g/ml 約 50mg/ml。適合于腸內施用(例如通過吞入)的制劑可以呈現為離散單元，例如膠囊劑、扁囊劑或片劑，其中每個單元都包含預定量的P0N3多肽和/或SAA3多肽；散劑或顆粒劑；水性或非水性液體中的溶液或懸液；水包油乳液或油包水乳液；推注劑；藥糖劑；或糊劑。可以可選地為片劑或膠囊提供腸溶衣，從而使其釋放在腸的各部分中而不是胃中。包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的制劑可以為單位劑量或多劑量封裝的容器(例如，安瓿瓶和小藥水瓶(vial))中，并且可以儲存在冷凍干燥(凍干)的條件下，從而僅需在使用前即刻添加無菌液體載劑(例如注射用水)。應認識到的是，P0N3多肽和/或SAA3多肽以及包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物的適合劑量可以根據情況而在患者間有所不同。對最佳劑量進行確定會通常涉 及到在治療益處水平與施用所帶來的任何風險或有害副作用之間進行權衡。選定的劑量水平將取決于多種因素，包括但不限于施用途徑，施用時間，P0N3多肽和/或SAA3多肽的排泄率，組合使用的其他藥物、化合物和/或材料，以及早產兒的成熟度、性別、體重、病況和整體健康情況。P0N3多肽和/或SAA3多肽的量以及施用途徑最終將由醫師的判斷來決定，但通常該劑量將實現足以產生有益效果且不引起較大的有害或有毒副作用的P0N3多肽和/或SAA3多肽的血清濃度。體內施用可以以一個劑量持續地或間歇性地(例如，具有適當間隔的分割的劑量)實現。確定最有效的施用方式和施用劑量的方法對本領域的技術人員而言是公知的，并且根據制劑和受治療的受試對象而有所變化。用醫師所選定的劑量水平和方式，可以進行單次或多次施用。P0N3多肽和/或SAA3多肽優選在早產新生兒分娩后立即或短時間內施用。例如，P0N3多肽和/或SAA3多肽可以在分娩后I小時內、3小時內、6小時內、12小時內、24小時內或48小時內施用。在其他實施方式中，P0N3多肽和/或SAA3多肽可以在出生后超過48小時后施用。在分娩后，或者在早產新生兒顯示出一種或多種與P0N3缺乏相關的癥狀(例如與氧化應激有關的并發癥)時，可以預防性地施用P0N3多肽。在分娩后，或者在早產新生兒顯示出一種或多種與SAA3缺乏相關的癥狀時，可以預防性地施用SAA3多肽。在一些實施方式中，可以將SAA3多肽施用至未受到機械通氣和/或肺損傷或炎癥的早產新生兒中。P0N3多肽和/或SAA3多肽以及包含P0N3多肽和/或SAA3多肽的藥物組合物可以與其他治療劑組合施用，例如上文所述的表面活性劑和類固醇。本發明的其他方面提供用于治療早產新生兒的上述P0N3多肽和/或SAA3多肽，以及P0N3多肽和/或SAA3多肽在制造用于治療早產新生兒的藥物中的應用。如上文所述，使用P0N3多肽和/或SAA3多肽對早產新生兒進行的治療可以減小死亡和/或患病的程度、嚴重性或風險。本發明的其他各方面和實施方式將因本公開內容而對本領域的技術人員而言變得顯而易見。將本說明書中提及的所有文獻都通過援弓I完整地并入本文。將在申請日時具有數據庫(例如Genbank)登錄號的上述序列也通過援引完整地并入本文。本文所用的“和/或”應理解為對兩種具體特征或組成部分中的每一個或兩個的具體公開。例如“A和/或B”應理解為對⑴A、(ii)B和(iii)A和B中的每一個的具體公開，相當于在本文中對每個都進行了單獨敘述。除非上下文另有說明，否則上文所述的對特征的描述和定義不限于本發明的任何特定方面或實施方式，并且等同地適用于所描述的所有方面和實施方式。下文將通過實施例并結合附圖
來闡明本發明的某些方面和實施方式。圖I顯示了用于鑒定在妊娠后期胎兒中發生上調或下調的轉錄本的實驗方案。
圖2顯示了對在起始陣列中所用大鼠的同胞的肺組織(A)、腸(B)和肝(C)中的與18S RNA相對的Pon3mRNA的RT-PCR分析的結果，對在孕齡為16天和20天時分娩的大鼠進行了比較(二者均為η=ιο，每只動物來自一次獨立的產崽)。P值使用學生未配對T檢驗比較了給定組織中的在兩個孕齡時的對數轉換后的Pon3轉錄本水平(相對于18S RNA)。圖3顯示了對妊娠期最后1/3的不同孕齡(每組中n=5)的羊的肺㈧和腸⑶中的相對于四種管家基因的幾何平均值的P0N3mRNA的RT-PCR分析的結果。柱=平均值；條=SEM。P值來自對數轉換后的Pon3轉錄本水平(相對于四種管家基因)對孕齡的線性回歸。斯皮爾曼等級相關系數P在A中為O. 94，在B中為O. 79，兩者的P都小于O. 001。圖C和D是對數轉換后的Pon3水平對對數轉換后的皮質醇值的作圖。P值來自對數轉換后的Pon3水平對對數轉換后的皮質醇的線性回歸。斯皮爾曼等級相關系數P在C中為O. 94，在D中為O. 80，兩者的P都小于O. 001。圖4顯示了對130天孕齡的經地塞米松處理的羊和對照羊(每組中n=5)的肺和腸中的P0N3 mRNA的PR-PCR分析的結果。柱=平均值；條=SEM。顯示了相對于四種管家基因的幾何平均值的P0N3 mRNA水平。圖5顯示了對經歷了未足月時(115dGA 188dGA)腎上腺切除術的羊和對照羊的肺和腸中的P0N3 mRNA的PR-PCR分析的結果，這兩組均在145天孕齡時分娩(每組中n=5)。柱=平均值；條=SEM。顯示了相對于四種管家基因的幾何平均值的P0N3mRNA水平。圖6顯示了對成體血液(Ad)和來自4個早產兒和4個足月嬰兒的臍帶血中的P0N3的蛋白質印跡分析，比較了使用不同的商購抗體的情況(上圖)。還顯示了對信號的密度計量結果，從而對足月和早產進行了比較(下圖)。圖7顯示了對孕齡為16天和20天時的大鼠的肺(A和C)和腸(B和D)的蛋白質印跡分析。圖A和B采用了對P0N3有特異性的抗體。圖C和D采用了分別與A和B相同的印跡，對其進行剝離，并用對GAPDH有特異性的抗體再次探測。圖A和C :泳道I和2為來自16dGA的肺，泳道3和4為來自20dGA的肺。圖B和D :泳道I和2=合并了來自16dGA的小腸和大腸；泳道3和4=來自20dGA的小腸；泳道5和6=來自20dGA的大腸。圖8A顯示了對來自8個早產兒和10個足月嬰兒的臍帶血清中的P0N3的蛋白質印跡分析。圖8B顯示了對信號的密度計量結果，從而對足月和早產進行了比較。P值為對數轉換后的密度計量值，用學生未配對T檢驗比較了早產和足月。表I示出了用于在羊中進行實時RT-PCR的引物和探針。
表2示出了在基因陣列上選定轉錄本在16天和20天孕齡(dGA)之間的倍數變化。實駘方法動物樣品所有實驗程序都是按照《英國動物(科學程序)法案1986》在適合的內政部執照下且在當地倫理審查過程的許可下進行的。用過量CO2將孕齡(dGA)為16天(n=10)和20天(n=10)的交配20次的懷孕Wistar
大鼠無痛處死，其中將陰栓日(day of plug)定義為第O天，而足月期是21天。使用剖腹生產術使幼崽分娩，通過頸椎脫位術將其無痛處死，并在解剖顯微鏡下摘除它們的器官。將來自多個同胞動物的組織在液氮中急速冷凍，隨后儲藏在_80°C下以用于后續的分析。對羊進行的實驗按之前所詳細描述的進行7。簡言之，將孕齡已知的懷孕威爾士山脈母羊置于單獨的圍欄中，并以200g/日的精料維持，且可以自由獲取干草、水和舐食巖鹽塊。為了研究孕齡對基因表達的影響，在孕期的第100天(n=5)、第114 116天(n=5)、第129 131天(n=5)和第144 145天(n=5)(足月期為145±2天)在全身麻醉(靜脈內施用20mg/kg的戊巴比妥鈉)下用剖腹生產術使正常胎畜分娩，以便進行組織收集。為了研究對足月時出現的內源皮質類固醇的正常上升進行阻止所造成的影響，在第116 120dGA時在全身麻醉(在I: I的O2:N2O中的I. 5%氟烷)下對胎兒(n=5)進行腎上腺切除，隨后使其足月分娩。之前已顯示，這會使皮質醇水平降低到正常足月水平的15%。為了研究母體糖皮質激素處理的效果，用兩份劑量的12mg地塞米松或者用鹽水從125dGA開始24小時時處理母羊(每組n=5)，在第二次注射后10小時，用剖腹生產術使胎兒分娩。在所有情況中，新生的羊在分娩后立即用戊巴比妥鈉(200mg/kg)無痛處死。在分娩后獲得臍帶血。使用經驗證可用于綿羊血漿的放射免疫測定2°，測量了皮質醇濃度。皮質醇的最小可檢測量是I. 5ng/ml,測定間變動系數為11%。在尸體剖檢過程中，將胎兒的肺和空腸(幽門括約肌和回腸-盲腸連接處之間的中部)的樣品在液態中冷凍，并儲藏在_80°C直至進行分析。人臍帶血樣品用于獲得人臍帶血的操作規程已得到劍橋本地第2研究倫理委員會的許可。所有的女性都提供了書面通知的同意書。早產兒如果在孕齡完成了 24 28周時活產，則適于進行研究。將足月期定義為大于等于37周。RNA抽提和cDNA合成使用·ΓΚ ζ Γ_ (Invitrogen, Paisley,英國)根據制造商的使用說明從冷凍的組織中分離出總RNA,并且用DNaseI (Promega, Southampton,英國)在37 °C下處理30分鐘。添加終止溶液并在65°C下加熱10分鐘來使反應終止。使用分光光度計和Agilent2100Bioanalyzer確認了 RNA的完整性。僅將OD 260/280〉I. 8的RNA用于定量PCR，并將RNA完整性指數大于7的RNA用于陣列雜交。在定量RT-PCR中，使用隨機六聚體弓I物(Bioline，倫敦，英國)和Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen, Paisley,英國)將總RNA逆轉錄為cDNA。微陣列分析采用了 Affymetrix大鼠基因組230. 2基因芯片。使用標準Affymetrix雙循環靶標標記和雜交操作規程對總RNA進行了加工。使用魯棒性多陣列平均技術(robustmultiarray averaging)對數據進行了預標準化,并使用LIMMA軟件包(微陣列數據的線性模型，http://bioinf.wehi.edu.au/limma/)實現了標準化。使用兩種獨立的方法，即Cyber-T算法和排名結果(Rank Product)分析21’22，在16dGA和20dGA之間對標準化的轉錄本豐度數據進行比較。Cyber-T算法是通過包含基于數據集中其他轉錄本的方差的貝葉斯先驗信息(Bayesian prior)而修飾過的未配對T檢驗。將使用Cyber-T (貝葉斯P值〈O. 001，差異表達的后驗概率>0.99)和排名結果分析(P〈0.0001)時都具有統計學顯著性的轉錄本鑒定為是差異表達的。使用NetAffx 分析中心(AfTymetrix)對微陣列數據進行了注釋。大鼠cDNA的定量實時RT-PCR所有實時PCR都是在ABIPrism 7900HT 系統(Applied Biosystems, Warrington,、英國)上完成的，并且是在含有IOOng cDNA模板、I XABI PCR Mix No AmpEraseUNG (Applied Biosystems, Warrington,英國)和為對氧憐酶 3 (Pon3)和 18S 預先設計并預先優化的基因表達測定試劑(購自Applied Biosystems,分別為Rn01500926_ml和Rn00824548_ml)的IOyl體積中進行。這些專賣的引物-探針組的序列未知。PCR循環包括在95°C下進行20秒的起始變性，隨后進行40個循環的95°C下I秒和60°C下20秒。對所有樣品都以三等分試樣進行分析。使用ddCt法對相對于18S的表達水平進行了定量。羊cDNA的克隆和定量實時RT-PCR由于綿羊Pon3基因的序列尚未公開，發明人使用牛Pon3mRNA (nm_001075479)在NCBI表達序列標簽(EST)數據庫中進行了搜索。該搜索鑒定出了與牛基因的同一性超過95%的若干羊EST。為了克隆推定的羊Pon3cDNA的片段，發明人使用了顯示出最高同源性的兩個EST (EE859920和EE792195)來設計PCR方案。引物如下正向(5' -CCCTAGTCGGGGAGAGATTT-3 ')，反向(5 ' -TTCTATGCCACCAGAGACCA-3 ')。所用的模板是從胎羊的腸產生的cDNA。PCR在含有最終濃度為I. 25nM的MgCl2、200ii M的每種dNTP、800nM的每種引物和0. I單位/ Ul的BioTaq DNA聚合酶(Bioline，倫敦，英國)的50 u I中進行。PCR程序的組成如下，在95°C下進行5分鐘的起始變性，隨后進行40個循環95°C下45秒、60°C下45秒、72°C下60秒，和72°C下10分鐘的最終延伸步驟。在I. 5%瓊脂糖凝膠上分析PCR產物，切下具有預期大小的條帶并使用Qiaquick 凝膠抽提試劑盒(Qiagen, Crawley,英國)進行純化,隨后將其克隆至pGEM-T-Easy 質粒(Promega)中。測序驗證了三個克隆。使用對綿羊P0N3克隆的部分cDNA和公眾可獲得的綿羊管家基因序列數據(NCBI)用Applied Biosystems File Builder 3. I設計了米用帶6-FAM標記的大溝結合劑(MGB)探針的實時PCR測定(表I)。針對四種管家基因(18S、GAPDH、親環素A和￠-肌動蛋白)的幾何平均值對Pon3進行了相對定量，這是因為發明人在羊中觀察到了更大的動物間變化性，并且該方法據報道優于使用任何單一參照基因23。PCR在含有IOOng cDNA模板、IX TaqMan Fast Universal PCR Mix No AmpErase UNG(Applied Biosystems, Warrington,英國)和定制設計的引物-探針組的10 體積中進行。PCR循環包括在95°C下進行20秒的起始變性，隨后進行40個循環95°C下I秒和60°C下20秒。使用參照樣品的梯度稀釋液為每個測定制作了相對標準曲線，并且用相對標準曲線法分析結果。蛋白質印跡
為了分析大鼠腸中的Pon3蛋白表達，使用玻璃勻漿器在每IOml含有I片Complete Mini無EDTA蛋白酶抑制劑混合片劑(Roche)的IXRIPA緩沖液(Millipore)中使冷凍的組織均質化。使用BioRad DC蛋白測定來確定蛋白濃度。通過添加Nupage樣品還原劑(Invitrogen)來還原含有20 y g蛋白的樣品，使之熱變性并將其加載到10%NovexBis-Tris凝膠(Invitrogen)上。電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜(Invitrogen)上，用TBS-tween-20 (0. 05%)中的5%脫脂奶封閉I小時，隨后在振蕩器上用0. 2 u g/ml的山羊多克隆抗人Pon3抗體(Lifespan Biosciences)于4°C過夜探測。用偶聯有辣根過氧化物酶的兔抗山羊二抗(DAKO)檢測抗體結合。隨后使用ECL底物(Amersham Biosciences)來使結合可視化。用Restore 蛋白質印跡剝離緩沖液(Pierce)在室溫下對膜進行15分鐘的剝離，隨后用0. 2 u g/ml的針對人GAPDH的兔多克隆抗體再次探測，從而確認等量的蛋白載量。

為了分析人胎兒中的Pon3表達，將臍帶血樣品收集在肝素鋰管中，并通過在4 °C下以3000rpm離心10分鐘來進行分離。將血清樣品以1:10稀釋在PBS中，通過添加Nupage樣品還原劑(Invitoogen)來進行還原，隨后使之熱變性。將3 iU以1:10稀釋的樣品加載至Ij 10%Novex Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上。電泳后，將蛋白轉移到PVDF膜(Invitrogen)上，用PBS-tween20 (0. 05%)中的5%脫脂奶封閉I小時，隨后按上文所述用抗人Pon3抗體(LifespanBiosciences, LB)進行探測。對蛋白質印記再次探測來確認等量的載量并不是必要的，因為所有泳道都載有等體積的血清。因此，并沒有與蛋白抽提效率的變化性或與蛋白濃度測量有關的干擾。通過用麗春紅S對印跡進行染色來估算總蛋白。統計學對轉錄本和皮質醇的水平進行對數轉換，隨后使用學生未配對T檢驗對平均值進行比較。使用斯皮爾曼等級相關和線性回歸來評估兩個連續變量之間的關聯。在P〈0.05時認為有統計學顯著性，且所有的P值都是雙側的。結果總結發明人研究了大鼠和羊的肺和腸，它們在種系發生上關系甚遠。在這兩種哺乳動物的全部兩種組織中的上調說明該基因在哺乳動物(通常包括人)出生的系統性準備中很重要,例如在防御氧化應激中很重要。發明人研究了多種不同孕齡，還研究了皮質類固醇在羊中的效果，這是因為這些因素與準備出生的胎兒中多種關鍵過程的上調有關。該實驗方案示于圖I中。陣列實驗顯示了編碼對氧磷酶3的mRNA在第16天和第20天之間在肺(24倍)和腸(31倍)中的上調。使用定量TaqMan RT-PCR進行的樣本外驗證(out of samplevalidation)確認了來自獨立系列的動物的肺和腸中(圖2A和2B)以及肝中(圖2C)的相似幅度的變化。隨后，發明人克隆了羊的P0N3cDNA的片段，設計了用于RT-PCR的引物和探針，并使用定量TaqMan RT-PCR分析了四組動物(每組有5只在孕期最后1/3期間分娩的動物)的P0N3 mRNA水平。小腸樣品取自幽門括約肌和回腸-盲腸連接處之間的中點。P0N3 mRNA隨著孕齡的推進而線性增加，并且全部兩種組織中的變化具有高度的統計學顯著性。在肺和腸中(圖3A和3B)都觀察到了約5倍的上調。
發明人研究了在暴露于外源合成皮質類固醇(地塞米松)和載質的早產羊胎兒中P0N3的表達。該研究顯示出，皮質類固醇使肺和腸中的P0N3mRNA增加，但是由于樣本間的變化性較大，該差異在腸中不具有統計學顯著性(圖4A和4B)。隨后，發明人在足月(145天)分娩的動物中檢驗了內源皮質類固醇對P0N3mRNA水平的影響。將對照動物與在孕齡約115 118天時通過腎上腺切除術阻止了孕后期內源皮質類固醇增加的動物進行了比較。腎上腺切除與足月時的全部兩種組織的較低P0N3mRNA相關，但是該差異也因較大的樣品間變化性而在腸中不具有統計學顯著性(圖5A和5B)。這些結果顯示在大鼠和羊的肺和腸中的R0N3mRNA在出生前發生上調。隨后，通過獲得臍帶血(在4個早產兒和4個足月出生的嬰兒出生時獲得)，發明人比較了在早產人胎兒和足月人胎兒中循環的P0N3的水平。足月嬰兒中的P0N3蛋白水平與成年人的相仿，但是早產兒的臍帶血中的P0N3表達水平卻較低(圖6)。
孕后期的大鼠胎兒中的Pon3表達肺和腸中的微陣列分析均展示在陣列上在16dGA和20dGA之間上調大于20倍的四種基因(表2):血清淀粉樣蛋白A3、對氧磷酶3 (Pon3)、溶質運載家族34成員2和細胞內氯離子通道5。相比之下，Pon基因家族的另兩個成員(Ponl和Pon2)的表達沒有顯著變化。發明人通過實時定量RT-PCR分析了陣列中所用的動物的同胞動物的Pon3的表達，確認了在大鼠肺、腸和肝中Pon3mRNA在16dGA和20dGA之間的上調(圖2)。對16dGA和20dGA時的大鼠肺和腸的蛋白質印記分析顯示出，Pon3蛋白在16dGA時檢測不到，但是在20dGA時存在具有恰當分子量的清晰條帶(圖7)。胎羊中的Pon3表達由于綿羊P0N3基因序列尚未公開，發明人克隆了直系同源綿羊基因的部分cDNA。發明人獲得了在核苷酸水平上與牛Pon3的同源性為96%且與人Pon3的同源性為87%的505bp序列。相比之下，該序列與牛PONl的同源性(62%)和與牛P0N2的同源性(70%)較低。使用該克隆序列設計了定量RT-PCR方案(表2)。隨后，發明人分析了 P0N3在四組動物中的表達，其中每組具有5只在孕期最后1/3期間分娩的動物。在肺和腸中，P0N3表達均隨著孕齡的推進(圖3A和3B)和皮質醇水平的增加(圖3C和3D)而線性增加，且所有變化都具有高度的統計學顯著性。隨后，發明人對暴露于外源合成皮質類固醇(地塞米松)或載質的早產羊胎兒進行了比較。該比較顯示出，地塞米松使肺和腸中的P0N3表達均增加，但是由于樣本間的變化性較大，該差異在腸中不具有統計學顯著性(圖4A和4B)。隨后，通過將對照足月動物與在115 IlSdGA時進行了胎兒腎上腺切除的足月動物進行比較，發明人檢驗了對正常的孕后期內源糖皮質激素升高的阻斷給足月(145天)分娩的動物的P0N3表達帶來的影響。腎上腺切除與足月時的兩種組織的較低P0N3表達均有關，但是該差異也因較大的樣品間變化性而在腸中不具有統計學顯著性(圖4C和4D)。人臍帶血中的Pon3蛋白使用對人臍帶血清的蛋白質印跡,可檢測到具有適合大小的P0N3條帶。對8個早產兒和10個足月嬰兒的臍帶血清的P0N3水平進行了比較。早產兒的平均孕齡為27周零3天，平均出生體重為986g。4個為正常分娩，4個通過剖腹生產術分娩。一個嬰兒在出生前已接受單劑量的倍他米松，而其余全部嬰兒則完成了出生前類固醇療程。在8個嬰兒中，有6個的起始CRP小于5mg/l，有2個的起始CRP更高(14mg/l和68mg/l)。在出生后測試的第一個樣品中，沒有一個嬰兒具有陽性血培養或陽性CSF培養。足月時的P0N3水平更高，達6.3倍(圖8)。如果表達相對于總蛋白(通過麗春紅S染色來估算)的P0N3，足月時的水平高達4. 9倍，而且對數轉換后的平均值的比較結果保持了高的統計學顯著性(P〈0. 001)。在陣列上的28，532個基因中，僅有4個在孕后期大鼠的肺和腸中的上調超過20倍，對氧磷酶3是其中之一。該上調在同胞動物中得到了驗證。之前的研究還顯示出，在人類中，P0N3主要在肝中表達24，而且，發明人還觀察到了在孕后期大鼠中Pon3在該器官中的上調。蛋白質印跡確認了蛋白水平上的上調。發明人確認了在胎羊(種系發生上遠距離的哺乳動物物種)中P0N3 mRNA在孕期最后1/3期間發生明顯的系統性上調。此外，像表面活性劑一樣19，胎羊P0N3 mRNA的表達受到糖皮質激素的控制，這可以在下述現象中得到證實與內源皮質醇水平的強相關性，在母體已接受了地塞米松的早產動物中表達升高，在115 118dGA時接受了腎上腺切除術的足月胎兒中表達下降。P0N3在血液中與低密度脂蛋白關聯地循環25。因此，通過測量臍帶血清濃度，發明人能夠研究該蛋白是否在孕后期的 人嬰兒中也上調。發明人發現，盡管所研究的8個早產兒中有7個曾接受完整的出生前倍他米松療程，但足月出生的人嬰兒的P0N3水平更高，超過6倍。從這些分析中發明人得到如下結論在大鼠、羊和人的胎兒中都觀察到的P0N3上調可能是出生的系統性準備過程，且受到糖皮質激素的控制。對氧磷酶家族由編號為I 3的3種蛋白組成。編碼這些蛋白的基因位于人類染色體7q21_22上的簇中，具有約65%的同源性。全部三種蛋白都是水解酶，具體而言，水解多種內酯和羥基酸。兩項研究表明，P0N3作為抗氧化劑起作用。已發現，P0N3(而非P0N2)保護低密度脂蛋白(LDL)不發生銅誘導的體外氧化25。最近的研究表明，人Pon3在小鼠骨骼肌中的轉基因表達與四氯化碳(CCl4)的肝毒素效應下降有關26。施用CCl4會通過肝內誘導自由基而引起肝損傷。轉基因的人P0N3使脂質過氧化水平降低，并且減少了 CCl4引起的肝損傷的生物化學和組織學現象。此外，轉基因的人Pon3使內源抗氧化劑谷胱甘肽和過氧化物歧化酶的正常肝內水平得到保持，而這兩者在對照動物中都發生了消耗。另據顯示，人Pon3在小鼠中的轉基因表達抑制粥樣硬化病變形成和肥胖27。P0N3在孕后期大鼠胎兒中的上調的系統性特征表示其具有為不同器官中的不同細胞類型所需的某種作用。此外，Pon3在孕后期大鼠和羊中的系統性上調現象表示該上調與出生前后的各種哺乳動物物種所共有的過程有關。出生后，在所有哺乳動物物種中動脈氧分壓快速上升。在羊中，胎兒動脈血中的氧分壓為約18 28mmHg，在出生后幾分鐘內，該分壓上升至約lOOmmHg28。出生后氧張力的升高是心血管系統進行出生后適應(例如促進動脈導管的閉合16a和提高肺血流3°)的關鍵觸發因素。然而，氧張力的快速上升能夠導致產生反應性氧物種(ROS)，可以將其定義為描述“出現在生理環境中的氧的所有氧化態和激發態，最高從超氧化物開始，但不包括水”31。鑒于出生后氧分壓的急劇上升，新生兒可能暴露于出生后ROS的增量生成。鑒于Pon3的抗氧化劑效果，由于對出生后立即限制氧化應激的共同需要，該酶在孕后期的系統性上調可能在多種物種中是保守性的。早產與死亡率和患病率的升高相關。這與以下事實有關嬰兒在新生生命的正常準備性變化前出生，而這些變化出現在孕后期的胎兒中。表面活性劑療法是成功的臨床措施的實例，其基于為早產兒補充通常在孕后期上調的物質。這些結果說明，向早產的人類新生兒施用P0N3可能因此改善早產的后果并提供抵抗上述早產兒并發癥的保護。P0N3的關鍵性質是其出現在血清中。首先，這允許我們通過測量獲自臍帶血樣的血清中的水平來確認人嬰兒中的上調。其次，如果P0N3在新生兒中的作用在部分上由該蛋白循環水平的升高的介導， 這表示向早產新生兒靜脈內施用外源Pon3可以是有益的。這些解釋得到了上述小鼠中轉基因人P0N3研究的支持。Pon3在骨骼肌中的轉基因表達導致血液中Pon3內酯酶活性升高，這與CCl4所誘導的肝中自由基生成效應的下降有關26。因此，這些觀察支持了循環中的Pon3的系統性效果。對不同的對氧磷酶的生物化學研究表明，雖然三種亞型具有一些相同的底物，但它們每一個還能夠水解特定的底物32。在孕后期的大鼠肺和腸中，還有另外3種基因的上調超過20倍。其中兩種是離子通道(溶質運載家族34成員2和細胞內氯離子通道5)。因此，這兩者均不是潛在的候選替代性治療劑，但是它們在孕后期的系統性的、有意義的上調表明它們可能在出生前后的適應過程中有重要作用。另外一個上調的轉錄本，血清淀粉樣蛋白A3，是急性期蛋白。先前的研究已涉及了機械通氣、內毒素和糖皮質激素對該蛋白在胎羊中的表達的影響33_35。然而，本文首次顯示出在孕后期大鼠胎兒中的轉錄本水平上的生理上調。因此，血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)也代表了早產新生兒中的候選新型療法。參考文獻(I)Steer P. BJOG 2005; 112Suppll: 1-3.(2) National Audit Office (UK). Caring for Vulnerable Babies : Thereorganisation of neonatal services in England.London:The StationeryOffice;2007.(3)Suresh GK, Soil RF. J Perinatol 2005;25Suppl 2:S40_S44.(4)Heymann MA, Rudolph AM. Physiol Rev 1975;55 (I):62-78.(5)Nathan C. J Clin Invest 2003;111 (6):769-778.(6)Draganov DI.Circ Res 2007;100 (8):1104-1105.(7)Crowley P. Cochrane Database Syst Rev 2000; (2):CD000065.(8)Soil RF. Cochrane Database Syst Rev 2000; (2):CDOOl149.(9) Forhead AJ 等，Endocrinology 2002; 143 (4) : 1166-1173.(IO)Draganov DI 等，J. Lipid Res 2005; 46 (6) : 1239-1247.(Il)Draganov DI 等，J Biol Chem 2000; 275 (43) : 33435-33442.(12) Rudolph AM 等，Circ Res 1970; 26 (3) :289-299.(13)Smith GCS. Pharmacol Rev 1998;50 (I):35-58.(14)Clements JA. Annu Rev Physiol 1997;59:1-21.(15)Soil RF. Cochrane Database Syst Rev 2000; (2):CDOOl149.(16)Brion LP,Bell EF 等，Cochrane Database Syst Rev 2003; (3):CD003665.(17) Suresh GK 等，Cochrane Database Syst Rev 2001; (I) : CD001968.(18) Soghier LM 等，Cochrane Database Syst Rev 2006; (4) : CD004869.
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1141 aaactgataa ttgtatgata agtggcactg taagtaaata gcaaacacca aaaaaaaaaa1201 aSEQ ID NO:l(Genbank NM_000940. 2 GI:94538355)I mgklvalvll gvglslvgem flafrervna srevepvepe nchlieeles gsedidilps61 glafissglk ypgmpnfapd epgkiflmdl neqnpraqal eisggfdkel fnphgisifi121 dkdntvylyv vnhphmkstv eifkfeeqqr slvylktikh ellksvndiv vlgpeqfyat181 rdhyftnsll sffemildlr wtyvlfyspr evkvvakgfc sangitvsad qkyvyvadva 241 aknihimekh dnwdltqlkv iqlgtlvdnl tvdpatgdil agchpnpmkl lnynpedppg301 sevlriqnvl sekprvstvy anngsvlqgt svasvyhgki ligtvfhktl ycelSEQ ID N0:2(Genbank NP_000931. IGI:29788996)ATGGGGAAGCTCGTGGCGCTGGTCCTGCTGGGGGTCGGCCTGTCCTTAGTCGGGGAGATGTTTCTGGCGTTTAGAGAAAG 80GGTGAATGCCTCTCGAGAAGTGGAGCCAGTAGAACCTGAAAACTGCCACCTTATTGAGGAACTTGAAAGTGGCTCTGAAG 160ATATTGATATACTTCCTAGTGGGCTGGCTTTTATCTCCAGT
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S wmsasmsMtc 80GLKYPGMPNFAPDEPGKIFLMDLNEQNPRAQALEISGGFDKELFNPH 160GISIFIDKDNTVYLYVVNHPHMKSTVEIFKFEEQQRSLVYLKTIKHELLKSVNDIVVLGPEQFYATRDHYFTNSLLSFFE 240
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權利要求
1.一種治療早產新生兒的方法，所述方法包括 向所述早產新生兒施用對氧磷酶3 (P0N3)多肽。
2.如權利要求I所述的方法，其中，所述治療降低了所述新生兒死亡的風險和/或患病的程度、嚴重性或風險。
3.如權利要求I或2所述的方法，其中，所述P0N3多肽與SEQID NO: 2的序列同一性為至少80%。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述PON3多肽配制在藥物組合物中。
5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中，所述PON3多肽胃腸外施用。
6.如權利要求5所述的方法，其中，所述PON3多肽靜脈內施用。
7.如權利要求I 4中任一項所述的方法，其中，所述PON3多肽腸內施用。
8.一種用于治療早產新生兒的PON3多肽。
9.PON3多肽在制造用于治療早產新生兒的藥物中的應用。
10.一種治療早產新生兒的方法，所述方法包括 向所述早產新生兒施用血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其中，所述治療降低了所述新生兒死亡的風險和/或患病的程度、嚴重性或風險。
12.如權利要求10或11所述的方法，其中，所述SAA3多肽與SEQID NO:6的序列同一性為至少80%。
13.如權利要求10 12中任一項所述的方法，其中，所述SAA3多肽配制在藥物組合物中。
14.如權利要求10 13中任一項所述的方法，其中，所述SAA3多肽胃腸外施用。
15.如權利要求14所述的方法，其中，所述SAA3多肽靜脈內施用。
16.如權利要求10 13中任一項所述的方法，其中，所述SAA3多肽腸內施用。
17.如權利要求10 16中任一項所述的方法，所述方法還包括向所述早產新生兒施用對氧磷酶3(PON3)多肽。
18.一種用于治療早產新生兒的SAA3多肽，或用于治療早產新生兒的組合的SAA3多肽與PON3多肽。
19.SAA3多肽或組合的SAA3多肽與PON3多肽在制造用于治療早產新生兒的藥物中的應用。
20.如權利要求I 7和10 17中任一項所述的方法,所述方法包括在所述施用前，鑒定所述早產新生兒為缺乏PON3和/或SAA3。
21.一種鑒定有患病和/或死亡風險的早產新生兒的方法，所述方法包括 確定從所述新生兒獲得的樣品中的PON3和/或SAA3的水平或活性； 其中，與對照相比PON3和/或SAA3的水平或活性降低表明該早產新生兒具有患病和/或死亡風險。
全文摘要
本發明涉及用對氧磷酶3(PON3)或血清淀粉樣蛋白A3(SAA3)對早產新生兒的治療，以減小或防止與早產相關的患病率和死亡率。
文檔編號A61K38/46GK102740876SQ201080054902
公開日2012年10月17日 申請日期2010年10月22日 優先權日2009年10月22日
發明者D·S·查諾克-瓊斯, 戈登·史密斯 申請人:劍橋企業有限公司