通過雙特異性抗體預靶向的用于細胞毒性藥物的遞送系統的制作方法

專利名稱：通過雙特異性抗體預靶向的用于細胞毒性藥物的遞送系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有改良的靶向以下疾病的能力的治療偶聯物如癌癥、感染性疾病、自體免疫性疾病、免疫功能障礙(例如移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應)、心血管疾病、代謝疾病和神經(例如神經退化性)疾病。優選地，遞送系統包含預靶向方法，其中雙特異性抗體具有針對疾病相關抗原的一個或多個結合位點和針對可靶向構建體上的半抗原的一個或多個結合位點。可靶向構建體可包含治療劑(如細胞毒性藥物)和/或診斷劑(如放射性核素)。更優選地，細胞毒性藥物可為SN-38。更優選地，雙特異性抗體是通過對接鎖定(DNL)技術制備。
背景技術：
已使用單克隆抗體來將毒性劑靶向遞送到癌癥和其它患病細胞。然而，抗體和毒性劑的免疫偶聯物已在癌癥或自體免疫性疾病的治療中獲得各種成功，而在其它疾病，如感染性疾病中卻極少應用。毒性劑最通常為化學療法藥物，不過已將粒子發射性放射性核素或細菌或植物毒素與抗體偶聯，尤其用于治療癌癥(Sharkey和Goldenberg, 2006, CACancer J Clin 56:226-243)，以及利用放射性免疫偶聯物用于某些感染性疾病的臨床前治療(Dadachova 和 Casadevall, 2006，Q J Nucl Med Mol Imaging 50:193-204)。喜樹堿(Camptothecin ；CPT)和其衍生物是一類有效抗腫瘤劑。伊立替康(Irinotecan)(也稱為CPT-11)和拓撲替康(topotecan)是已批準用作癌癥治療劑的CPT類似物(Iyer 和 Ratain, 1998，Cancer Chemother Phamacol 42:S31_S43)。CPT 通過抑制拓撲異構酶I起作用(Hsiang等，1985，J Biol Chem 260:14873-78)。盡管作為有效細胞毒性劑，但喜樹堿的治療用途仍受其在水溶液中相對不溶和高全身性毒性限制，這使得可遞送到所靶向疾病細胞的有效劑量受到限制。在本領域中對更有效的用于喜樹堿和其它治療劑的靶向遞送方法存在需要。
發明概要本發明通過提供改良的用于靶向遞送治療劑的方法和組合物解決本領域中未滿足的需要。在優選實施方案中，方法和組合物包括用新穎雙特異性抗體構建體進行預靶向，所述構建體含有至少一個針對疾病相關抗原(如腫瘤相關抗原、B細胞相關抗原或病原體相關抗原)的結合位點，和至少一個針對可靶向構建體上的半抗原的結合位點。可靶向構建體用作治療劑或診斷劑的載體。更優選地，所述雙特異性抗體構建體是通過對接鎖定(DNL)技術制備(參見例如美國專利 No. 7，550，143 ;7，521,056 ;7，534，866 ;7，527，787 和 7，666，400，各專利的實施例部分以引用的方式并入本文^DNL技術利用來自蛋白激酶A的二聚化與對接結構域(DDD部分)與來自多種已知A激酶錨定蛋白(AKAP)中任一種的錨定結構域(AD部分)之間發生的特異性結合相互作 用。DDD部分自發地形成二聚體，其接著結合AD部分。通過將適當效應部分(如抗體或其片段)連接于AD和DDD部分，DNL技術允許特異性共價形成任何期望靶向遞送復合物。在效應部分為蛋白質或肽的情況下，AD和DDD部分可并入與效應部分偶聯的融合蛋白中。所使用的抗體或其它靶向分子可結合本領域中已知的任何疾病相關抗原。舉例來說，在疾病病況是癌癥的情況下，由腫瘤細胞表達或以其它方式與腫瘤細胞相關的許多抗原在本領域中是已知的，包括但不限于碳酸酐酶IX、a-胎蛋白、a-輔肌動蛋白-4、A3、對 A33 抗體具特異性的抗原、ART-4、B7、Ba 733、BAGE, BrE3 抗原、CA125、CAMEL、CAP-UCASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CDl、CDla, CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCLl2, HIF-I a、結腸特異性抗原 p (CSAp)、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、c_met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-l、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-l、Flt-3、葉酸受體、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB, HLA-DR、HMl. 24、人絨毛膜促性腺激素(HCG)和其亞基、HER2/neu、HMGB-1、低氧誘導因子(HIF-I)、HSP70-2M、HST-2、la、IGF-1R、IFN- y、IFN- a、IFN- ^、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、KC4抗原、KS-I抗原、KS1-4、Le-Y, LDR/FUT、巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-I、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF, MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、胎盤生長因子453、？1^612、前列腺酸性磷酸酶、？5么、？狀1^、？5獻、？16 、111^、111^-11 、11-6、IL-25、RS5、RANTES, TlOl、SAGE、S100、存活素、存活素-2B、TAC、TAG-72、肌腱蛋白、TRAIL受體、TNF- a、Tn抗原、湯姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreich antigens)、腫瘤壞死抗原、^^^ 30-8纖維連接蛋白、1!'-1、17-認抗原、補體因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成標志、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因標志和致癌基因產物(參見例如Sensi等，Clin Cancer Res2006, 12:5023-32 ；Parmiani 等，J Immunol 2007,178:1975-79 ；Novellino 等 Cancer Immunol Immunother 2005,54:187-207)。可利用的示例性抗體包括但不限于hRl (抗IGF-1R，3/12/10提交的美國專利申請 No. 12/722，645)、hPAM4 (抗粘蛋白，美國專利 No. 7，282，567)、hA20 (抗 CD20，美國專利 No. 7，251，164)、hA19 (抗 CD19,美國專利 No. 7，109，304)、hIMMU31 (抗 AFP，美國專利 No. 7，300，655)、hLLl (抗 CD74,美國專利 No. 7，312，318)、hLL2 (抗 CD22,美國專利No. 7，074，403)、hMu-9 (抗 CSAp，美國專利 No. 7，387，773)、hL243 (抗 HLA-DR，美國專利No. 7，612，180)、hMN-14(抗 CEACAM5，美國專利 No. 6，676，924)、hMN_15(抗 CEACAM6，美國專利 No. 7，541，440)、hRS7 (抗 EGP-1，美國專利 No. 7，238，785)、hMN_3 (抗 CEACAM6，美國專利申請No. 7，541，440)、Ab124和Ab 125 (抗CXCR4，美國專利No. 7，138，496)，各引用專利或申請的實施例部分以引用的方式并入本文。所使用的抗體或抗原結合片段可以是嵌合、人源化或人的。對于親本鼠類抗體，優選使用嵌合抗體，因為其具有人抗體恒定區序列并且因此不會引發同鼠類抗體一樣強的人抗小鼠抗體(HAMA)反應。甚至更優選使用人源化抗體，以便進一步降低誘發HAMA反應的可能性。如下文所論述，通過將鼠類框架區和恒定區序列置換為相應人抗體框架區和恒定區序列對鼠類抗體進行人源化的技術在本領域中是熟知的并且已應用于眾多鼠類抗癌抗體。抗體人源化還可能涉及將一個或多個人框架氨基酸殘基取代為來自親本鼠類框架區序列的相應殘基。同樣如下文所論述，用于制造人抗體的技術也是熟知的。各種實施方案可能涉及使用主題方法和組合物來治療疾病，包括但不限于非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphomas)、B細胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞白血病、急性和慢性骨髓性白血病、T細胞淋巴瘤和白血病、多發性骨髓瘤、神經膠質瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(Waldenstrom’smacroglobulinemia)、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神經膠質瘤和皮膚癌。癌瘤可選自由口腔癌、胃腸道癌、結腸癌、胃癌、肺氣管癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、膽囊癌、腎癌、皮膚癌和睪丸癌組成的組。此外，可使用主題方法和組合物來治療自體免疫性疾病，例如急性特發性血小板減少性紫癜、慢性特發性血小板減少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham’schorea)、重癥肌無力、全身性紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、風濕熱、多腺性綜合癥、大皰性類天包瘡、糖尿病、亨諾克-斯奇賴恩紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、鏈球菌感染后腎炎、結節性紅斑、高安氏動脈炎(Takayasu's arteritis)、愛迪生氏病(Addison’s disease)、類風濕性關節炎、多發性硬化癥、肉狀瘤病、潰瘍性結腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結節性多動脈炎、強直性脊柱炎、古德帕斯丘綜合癥(Goodpasture’s syndrome)、血管閉塞性脈管炎、休格倫氏綜合癥(Sjogren’s syndrome)、原發性膽汁性肝硬化、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、甲狀腺素癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常型天皰瘡、韋格納氏肉芽腫病(Wegener’s granulomatosis)、膜性腎病、肌萎縮性側索硬化、脊髓癆(tabes dorsalis)、巨細胞性動脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球腎炎、牛皮癬或纖維性肺泡炎。在某些實施方案中，疾病療法可通過與一種或多種其它治療劑的組合療法來增強。所使用的已知治療劑包括毒素、免疫調節劑(如細胞因子、淋巴因子、趨化因子、生長因子和腫瘤壞死因子)、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸(如siRNA或RNAi)、光敏治療劑、抗血管生成劑和促細胞凋亡劑。治療劑可通過與相同或不同抗體或其它靶向分子偶聯進行遞送或可以未偶聯形式遞送。其它治療劑可在雙特異性抗體和可靶向構建體之前、同時或之后施用。在一優選實施方案中，治療劑是細胞毒性劑，如藥物或毒素。同樣優選的是，藥物選自由以下組成的組氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱(gemcitabine)、三氮烯、葉酸類似物、蒽環霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌 呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼白毒素、鉬配位絡合物、長春花生物堿、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、激素拮抗劑、內皮抑素、紫杉酚、喜樹堿、SN-38、阿霉素(doxorubicins)和其類似物、抗代謝物、烷基化劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、HDAC抑制劑、促細胞凋亡劑、甲氨蝶呤、CPT-Il和其組合。在另一優選實施方案中，治療劑選自由以下組成的組的毒素蓖麻毒素(ricin)、相思豆毒素(abrin)、a毒素(alpha toxin)、阜草素(saporin)、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A(Staphylococcal enterotoxin-A)、美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白樹毒素(gelonin)、白喉毒素(diphtheria toxin)、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)和假單胞菌內毒素(Pseudomonas endotoxin)以及其組合。或者選自由以下組成的組的免疫調節劑細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、紅細胞生成素、血小板生成素和其組合。在其它優選實施方案中，治療劑選自由以下組成的組的放射性核素mIn、177Lu、 212Bi,213Bi,211At,62Cu,67Cu,90Y, 1251 , 131 1 , 32P,33P,47Sc,111Ag,67Ga,142Pr, 153Sm^161Tb, 166Dy,166Ho,186Re,188Re,189Re,212Pb, 223Ra^ 225Ac,59Fe,75Se,77As,89Sr,"Mo,105Rh,109Pd^143Pr,149Pm^169Er,194Ir、198Au、199Au和211Pb。隨俄歇發射粒子(Auger-emitting particle)實質上衰變的放射性核素也是優選的。例如 Co-58、Ga-67、fo-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-lll、Sb-119、1-125、Ho-161、0s-189m和Ir-192。適用^粒子發射核素的衰變能優選為〈1，OOOkeV，更優選為〈lOOkeV，并且最優選為<70keV。隨著a粒子產生而實質上衰變的放射性核素也是優選的。所述放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。適用a粒子發射放射性核素的衰變能優選為 2，000-10, OOOkeV,更優選為 3，000-8, OOOkeV,并且最優選為 4，000-7, OOOkeV0 其它潛在適用放射性同位素包括 nC、13N、150、75Br、198AU、224AC、126I、133I、77Br Ji3mIrK95Riu97Riu1c13Riu105Ru、107Hg^ 203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tnu 167Tnu 168Tnu 197Pt、109PcU 105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166H0、199Au、57C0、58C0、51Cr、59Fe、75Se、2(llTl、225AC、76Br、169Yb 等。在其它實施方案中，治療劑是選自由色原體和染料組成的組的光敏治療劑。或者，治療劑是選自由以下組成的組的酶蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、6 -V-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、a -甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。所述酶可與例如以相對無毒形式施用且在靶位點由酶轉化成細胞毒性劑的前藥組合使用。在其它替代方案中，藥物可在受試者體內由內源性酶轉化成毒性較低形式，但可能由治療性酶再轉化成細胞毒性形式。因此，可應用所公開的方法和組合物來治療疾病和病狀，其中靶向部分是用來遞送細胞毒性劑。所述疾病或病狀的特征可在于存在當在如對癌癥或病原性生物體感染進行的免疫治療中使用未偶聯或裸靶向部分時影響不充分的靶分子或靶細胞。(關于制備抗體與同位素、藥物和毒素的免疫偶聯物供在疾病療法中使用的方法，請參見例如美國專利 No. 4，699，784 ;4，824，659 ;5，525，338 ;5，677，427 ;5，697，902 ;5，716，595 ；6，071，490 ;6，187，284 ;6，306，393 ;6，548，275 ;6，653，104 ;6，962，702 ;7，033，572 ；7，147,856 ;7，259，240 和美國專利申請公布 No. 20050175582(現已放棄)；20050136001 ；20040166115(現已放棄)；20040043030(現已放棄)！2OO3OO68322 (現已放棄)和20030026764 (現已放棄)，各文獻的實施例部分以引用的方式并入本文。)喜樹堿(CPT)和其類似物及衍生物是優選的化學治療部分，不過本發明不限于此。本發明范圍內的其它化學治療部分為紫杉烷(例如漿果赤霉素IIKbaccatin III)、紫杉酌')、卡奇霉素(calicheamicin)、埃坡霉素(epothilones)、蒽環類藥物(anthracyclinedrugs)(例如阿霉素(DOX)、表柔比星(epirubicin)、嗎啉基阿霉素(嗎啉基-D0X)、氰基嗎啉基-阿霉素(氰基嗎啉基-D0X)和2-吡咯啉基阿霉素(2-PD0X);參見Priebe W(編著),ACS symposium series 574,由 American Chemical Society 出版,WashingtonD. C.，1995 (第 332 頁)和 Nagy 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2464-2469，1996)、由格爾德霉素(geldanamycin)作為實例的苯奎類安莎霉素(benzoquinoid ansamycins)(DeBoer 等，Journal of Antibiotics 23:442-447，1970 ;Neckers 等，Invest. New Drugs17:361-373，1999)等。
在涉及治療癌癥的某些實施方案中，藥物偶聯物可與手術、放射療法、化學療法、利用裸抗體的免疫療法、放射性免疫療法、免疫調節劑、疫苗等組合使用。類似組合在適于靶向部分的其它疾病的治療中是優選的，如自體免疫性疾病。例如，喜樹堿偶聯物可與TNF抑制劑、B細胞抗體、干擾素、白介素和其它有效治療自體免疫性疾病的藥劑組合，所述自體免疫性疾病如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、休格倫氏綜合癥、多發性硬化癥、脈管炎以及I型糖尿病(青少年糖尿病)。這些組合療法可允許在所述組合中給予較低劑量的各治療劑，由此減少某些嚴重副作用，并且可能縮短所需的療程。在病毒性疾病中，藥物偶聯物可與其它治療性藥物、免疫調節劑、裸抗體或疫苗(例如針對肝炎、HIV或乳頭狀瘤病毒的抗體，或者基于這些病毒的免疫原的疫苗)組合。針對這些和其它病毒性病原體的抗體和抗原基疫苗在本領域中是已知的，并且在一些情況下已在商業上使用。附圖
簡述圖UMP 453 的合成。圖2.活化SN-38以供肽偶聯。圖3 用于SN-38的樹突載體。圖4.合成疊氮基-SN-38以供連接至樹突。發明詳述定義除非另外規定，否則“一 (a/an) ”意指一個(種)或多個(種)。如本文所用，“約”意指加或減10%。例如，“約100”將包括90與110之間的任何數值。如本文所述，抗體是指全長(即，天然存在的或通過免疫球蛋白基因片段重組方法形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特異性結合)部分，如抗體片段。抗體片段是抗體的一部分,如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。與結構無關,抗體片段與由全長抗體識別的相同抗原結合。術語“抗體片段”也包括由抗體的可變區組成的分離片段，如由重鏈和輕鏈的可變區組成的“Fv”片段，和重鏈和輕鏈可變區由肽連接子連接的重組單鏈多肽分子(“scFv蛋白”)。嵌合抗體是一種重組蛋白，其含有來源于一個物種的抗體，優選嚙齒動物抗體的可變結構域，包括互補決定區(CDR)，而抗體分子的恒定結構域是來源于人抗體的恒定結構域。對于獸醫學應用，嵌合抗體的恒定結構域可來源于其它物種，如貓或狗的恒定結構域。人源化抗體是一種重組蛋白，其中將來自一個物種的抗體，例如嚙齒動物抗體的CDR從嚙齒動物抗體的可變重鏈和可變輕鏈轉移到人重鏈和輕鏈可變結構域(例如框架區序列)中。抗體分子的恒定結構域是來源于人抗體的恒定結構域。在某些實施方案中，可將有限數量的親本(嚙齒動物)抗體的框架區氨基酸殘基取代成人抗體框架區序列。人抗體是例如從已進行“工程改造”以回應于抗原激發而產生特定人抗體的轉基因小鼠獲得的抗體。在此技術中，將人重鏈和輕鏈基因座的元件引入由胚胎干細胞系獲得的小鼠品系中，所述品系含有內源性鼠類重鏈和輕鏈基因座的靶向破壞。轉基因小鼠可合成對特定抗原具特異性的人抗體，并且所述小鼠可用于產生分泌人抗體的雜交瘤。用于從轉基因小鼠獲得人抗體的方法由Green等，Nature Genet. 7:13 (1994) ;Lonberg等，Nature、368:856 (1994);和Taylor等，Int. Tmmun. 6:579 (1994)描述。還可通過遺傳或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術構建完全人抗體，所述方法和技術在本領域中都是已知的。參見例如McCafferty等，Nature 348:552-553 (1990)，其描述從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變結構域基因譜系體外產生人抗體和其片段。在此技術中，將抗體可變結構域基因同框克隆到絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體粒子的表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀粒子含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能性質進行選擇也導致選擇編碼呈現所述性質的抗體的基因。以此方式，噬菌體模擬B細胞的一些性質。曬菌體展示可以多種格式執行，關于綜述，請參見例如Johnson和Chiswell, CurrentOpinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)。人抗體也可由體外活化B細胞產生。參見美國專利No. 5，567，610和5，229，275，其實施例部分以引用的方式并入本文。治療劑是與抗體部分分開、同時或依序施用或者與抗體部分偶聯(即，抗體或抗體片段，或子片段)并且適用于治療疾病的化合物、分子或原子。治療劑的實例包括抗體、抗體片段、藥物、毒素、核酸酶、激素、免疫調節劑、促細胞凋亡劑、抗血管生成劑、硼化合物、光敏劑或染料以及放射性同位素。所使用的治療劑在下文更詳細描述。免疫偶聯物是與至少一種治療劑和/或診斷劑偶聯的抗體、抗體片段或融合蛋白。CPT是喜樹堿的縮寫，且如本申請中所用，CPT表示喜樹堿本身或喜樹堿的類似物或衍生物。喜樹堿和其一些類似物的結構在下文示出，其中指定編號并且環標記為字母A-E0
CPT: Ri-R2-R3-HgI JfID-擇基-CPI: RIOJfI: R"s 一 .二 M
) 秦 C|X,:H: .: ',OO &乙基;^
SN-38: R1 - OH; R2 二乙基;% = H
(U U;! *撲替康柃=Oil; R2 = 11; R3 - CIl3-N(CJ-I3)2在一優選實施方案中，化學治療部分選自由以下組成的組阿霉素(DOX)、表柔比星、嗎啉基阿霉素(嗎啉基-D0X)、氰基嗎啉基-阿霉素(氰基嗎啉基-D0X)、2_吡咯啉基-阿霉素(240( )、0 1\10-羥基喜樹堿、SN-38、拓撲替康、勒托替康(Iurtotecan)、9-氨基喜樹堿、9-硝基喜樹堿、紫杉烷、格爾德霉素、安莎霉素和埃坡霉素。在一更優選實施方案中，化學治療性部分是SN-38。可靶向構建體在某些實施方案中，經過一種或多種診斷劑和/治療劑標記的部分包括可包含肽或其它可靶向構建體。經過標記的肽(或蛋白質)可經過選擇以直接結合靶細胞、組織、病原性生物體或其它標靶。在其它實施方案中， 經過標記的肽可經過選擇以例如使用具有針對可靶向構建體肽的一個或多個結合位點和針對與疾病或病狀相關的靶抗原的一個或多個結合位點的雙特異性抗體間接結合。雙特異性抗體可用于例如預靶向技術中，其中所述抗體可首先施用于受試者。可給予足夠時間讓雙特異性抗體結合靶抗原和使未結合抗體從循環清除。接著可向受試者施用可靶向構建體(如經過標記的肽)并讓其結合雙特異性抗體和定位于患病細胞或組織。所述可靶向構建體可具有多種結構并且經過選擇以便不僅可利用以高親和力結合所述可靶向構建體的抗體或片段，而且還在用于預靶向方法和雙特異性抗體或多特異性抗體中時在體內快速清除。疏水性藥劑對于引發強免疫反應來說最佳，而親水性藥劑對于在體內快速清除是優選的。因此，建立疏水性特征與親水性特征之間的平衡。此可部分通過使用親水性螯合劑來抵消許多有機部分的固有疏水性來實現。同樣，可選擇具有相反溶液性質的可靶向構建體的亞基，例如所含有的一些氨基酸是疏水性并且一些氨基酸是親水性的肽。除肽以外，也可使用碳水化合物。可使用具有少至兩個氨基酸殘基，優選兩個至十個殘基的肽，并且還可與其它部分偶聯，如螯合劑。連接子應為低分子量偶聯物，優選具有低于50，000道爾頓，并且有利地低于20，000道爾頓、10，000道爾頓或5，000道爾頓的分子量。可靶向構建體肽更通常具有四個或更多個殘基，如肽 DOTA-Phe-Lys (HSG) -Tyr-Lys (HSG) -NH2 (SEQ ID NO: 81)，其中DOTA是1，4，7，10-四氮雜環十二烷1，4，7，10-四乙酸并且HSG是組胺琥珀酰基甘氨酰基。或者，DOTA可置換為NOTA (1，4，7-三氮雜-環壬烷_1，4，7-三乙酸)、TETA (對溴乙酰胺基-苯甲酰基-四乙胺四乙酸),NETA ([2- (4，7-雙羧甲基[1，4，7]三氮雜環壬-I-基-乙基]-2-羰甲基-氨基]乙酸)、DTPA或其它已知螯合部分。可靶向構建體還可在主鏈結構中包含非天然氨基酸(例如D-氨基酸)以增強肽在體內的穩定性。在替代實施方案中，可使用其它主鏈結構，如由非天然氨基酸或類肽構建的結構。用作可靶向構建體的肽在自動肽合成儀上使用固相載體和重復正交保護基脫除和偶合的標準技術便利地合成。肽中欲稍后用于偶聯螯合部分或其它藥劑的游離氨基宜用標準保護基(如Boc基團)阻斷，而N-端殘基可進行乙酰化以增加血清穩定性。所述保護基為熟練技術人員所熟知。參見Greene和Wuts Protective Groups in OrganicSynthesis, 1999 (John Wiley and Sons, N. Y.)。當制備肽以供稍后用于雙特異性抗體系統中時，宜將其從樹脂裂解以產生相應C-端酰胺，以便抑制體內羧肽酶活性。肽合成的示例性方法公開于以下實施例中。當使用雙特異性抗體進行預靶向時，抗體將含有針對由靶組織產生或與靶組織有關的抗原的第一結合位點和針對可靶向構建體上的半抗原的第二結合位點。示例性半抗原包括但不限于HSG和In-DTPA。針對HSG半抗原產生的抗體是已知的(例如679抗體)并且可容易地并入適當雙特異性抗體中(參見例如美國專利No. 6，962，702 ;7，138，103和7，300, 644，關于實施例部分以引用的方式并入本文)。然而，其它半抗原和與其結合的抗體在本領域中是已知的并且可使用，如In-DTPA和734抗體(例如美國專利No. 7，534，431，實施例部分以引用的方式并入本文)。在替代實施方案中，點擊化學反應的特異性可用作雙特異性抗體預靶向中所用的抗體-半抗原結合反應的替代。如下文所論述，例如疊氮化物部分的環辛炔部分或硝酮部分的炔部分的特異性反應性可用于體內環加成反應中。抗體或其它靶向分子通過并入經過取代的環辛炔、疊氮化物或硝酮部分來活化。可靶向構建體用一種或多種診斷劑或治療劑和互補反應性部分標記。即，在靶向分子包含環辛炔的情況下，可靶向構建體將包含疊氮化物；在靶向分子包含硝酮的情況下，可靶向構建體將包含炔等。將經過活化的靶向分子施用至受試者并且允許定位于靶細胞、組織或病原體，如關于預靶向方案所公開。接著施用經過標記的反應性可靶向構建體。因為可靶向構建體上的環辛炔、硝酮或疊氮化物不與內源性生物分子反應并且不與靶向分子上的互補部分高度反應，所以結合反應的特異性導致可靶 向構建體與組織定位靶向分子的高度特異性結合。熟練技術人員將認識到，盡管大部分下文實施例中公開的可靶向構建體是肽，但也可使用其它類型的分子作為可靶向構建體。例如，如聚乙二醇(PEG)等聚合分子可用官能團容易地衍生化以結合診斷劑或治療劑。在連接了適當反應性基團之后，如經過取代的環辛炔、硝酮或疊氮化物，可利用經過標記的聚合物來遞送診斷劑或治療劑。所述載體分子的許多實例在本領域中是已知的并且可資利用，包括但不限于聚合物、納米粒子、微球體、脂質體和微胞。抗體靶抗原所使用的靶向抗體可對多種細胞表面或疾病相關抗原具有特異性或選擇性。成像或治療各種疾病、病狀、綜合癥或病癥，如惡性疾病、心血管疾病、感染性疾病、炎癥性疾病、自體免疫性疾病、代謝性(例如內分泌)疾病或神經(例如神經退化性)疾病(如阿茲海默氏病(Alzheimer’s))所使用的示例性靶抗原可包括碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CDU CDla, CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD 19, IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1 a、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM6、c-met、B7、纖維連接蛋白的ED_B、因子H、FHL-I、Flt_3、葉酸受體、GROB, HMGB-1、低氧誘導因子(HIF)、HM1. 24、胰島素樣生長因子-I (ILGF-I)、IFN-Y、IFN-a、IFN-P、IL_2、IL_4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6, IL-8, IL-12, IL_15、1L_17、IL-18, IL-25,IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、I a、HMl 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、肌腱蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、湯姆森-弗里德里希抗原、腫瘤壞死抗原、TNF-a ,TRAIL受體(Rl和R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、補體因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、PLAGL2和致癌基因產物。
在某些實施方案中，如治療腫瘤，所使用的抗體可靶向腫瘤相關抗原。這些抗原性標志可為腫瘤所產生的物質或者可為在腫瘤部位、在腫瘤細胞表面上或在腫瘤細胞內部積累的物質。所述腫瘤相關標志部分由以下公開Herberman, "Immunodiagnosis ofCancer〃, Fleisher 編著，〃The Clinical Biochemistry of Cancer〃，第 347 頁(美國臨床化學家協會(American Association of Clinical Chemists), 1979)和美國專利No. 4，150，149 ；4, 361，544 ;和4，444，744，所述各文獻的實施例部分以引用的方式并入本文。關于腫瘤相關抗原(TAA)的報導包括Mizukami等，(2005, Nature Med. 11:992-97)；Hatfield 等，(2005，Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48) ；Vallbohmer 等(2005，JClin. Oncol. 23:3536-44);和 Ren 等(2005, Ann. Surg. 242:55-63)，關于所鑒別的 TAA 的各文獻以引用的方式并入本文。腫瘤相關標志已由Herberman，同上歸類于多種類別中，包括癌胚抗原、胎盤抗原、致癌或腫瘤病毒相關抗原、組織相關抗原、器官相關抗原、異位激素和正常抗原或其變體。有時候，有利地使用腫瘤相關標志的亞基來產生具有較高腫瘤特異性的抗體，例如人絨毛膜促性腺激素(HCG)的P亞基或癌胚抗原(CEA)的Y區，其刺激與非腫瘤物質的交叉 反應性顯著降低的抗體產生，如美國專利No. 4，361，644和4，444，744中所公開。另一目標標志是跨膜活化因子和CAML-交互因子(TACI)。參見Yu等Nat.Immunol. 1:252-256(2000)。簡單地說，TACI是B細胞惡性疾病(例如淋巴瘤)的標志。TACI和B細胞成熟抗原(BCMA)由腫瘤壞死因子同源物增殖誘導配體(APRIL)結合。APRIL刺激初級B細胞和T細胞的體外增殖并且在體內因積累B細胞而使脾腫瘤增加。APRIL還與TALL-I (也稱為BLyS或BAFF)競爭受體結合。可溶性BCMA和TACI特異性阻止APRIL的結合并且阻斷初級B細胞的APRIL刺激的增殖。BCMA-Fc在小鼠體內還抑制針對鑰孔螺血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)和肺炎疫苗(Pneumovax)的抗體的產生,表明通過BCMA和/或TACI進行的APRIL和/或TALL-I信號轉導為產生體液免疫所需。因此，APRIL-TALL-I和BCMA-TACI形成參與刺激B細胞和T細胞功能的雙配體-雙受體路徑。在疾病包括淋巴瘤、白血病或自體免疫性疾病的情況下，靶抗原可選自由以下組成的組CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD67、CD74、CD79a、CD80、CD126、CD138、CD154、CXCR4、B7、MUC1、la、Ii、HMl. 24、HLA-DR、肌腱蛋白、VEGF、PlGF、ED-B 纖維連接蛋白、致癌基因、致癌基因產物(例如 c-met 或 PLAGL2)、CD66a_d、壞死抗原、IL-2、TlOU TAG、IL-6、MIF、TRAIL-Rl(DR4)和 TRAIL-R2(DR5)。產生抗體的方法MAb可通過多種已確立的技術從雜交瘤培養物分離和純化。所述分離技術包括蛋白質A或蛋白質G瓊脂糖親和色譜、尺寸排阻色譜和離子交換色譜。參見例如Coligan的第 2. 7. 1-2. 7. 12 頁和第 2. 9. 1-2. 9. 3 頁。另外參見 Baines 等，"Purification ofImmunoglobulin G (IgG)，"METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第 10 卷，第 79-104 頁(TheHumana Press, Inc. 1992)。初始產生了針對免疫原的抗體之后，可對抗體進行測序并隨后通過重組技術進行制備。鼠類抗體和抗體片段的人源化和嵌合為本領域的技術人員所熟知，如下文所論述。嵌合抗體嵌合抗體是一種重組抗體，其中人抗體的可變區已置換為例如小鼠抗體的可變區，包括小鼠抗體的互補決定區(⑶R)。嵌合抗體在施用至受試者時顯示降低的免疫原性和增強的穩定性。克隆鼠類免疫球蛋白可變結構域的通用技術公開于例如Orlandi等，Proc.Nat' I Acad. Sci. USA 6:3833(1989)中。構建嵌合抗體的技術為本領域的技術人員所熟知。舉例來說,Leung等，Hybridoma 13:469 (1994)通過將編碼鼠類抗⑶22抗體LL2的Vk和Vh結構域與相應人K和IgG1恒定區結構域的DNA序列組合產生了 LL2嵌合體。人源化抗體產生人源化MAb的技術在本領域中是熟知的(參見例如Jones等，Nature321:522 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332:323 (1988) ；Verhoeyen 等，Science239:1534(1988) ;Carter 等，Proc. Nat' I Acad. Sci. USA 89:4285(1992) ；Sandhu, Crit.Rev. Biotech. 12:437(1992);和 Singer 等，J. Immun. 150:2844(1993))。嵌合或鼠類單克隆抗體可通過將來自小鼠免疫球蛋白的可變重鏈和輕鏈的小鼠CDR轉移到人抗體的相應可變結構域中來進行人源化。嵌合單克隆抗體中的小鼠框架區(FR)也可置換為人FR序列。因為簡單地將小鼠CDR轉移到人FR中通常導致抗體親和力降低或甚至喪失，所以可能需要進行額外修飾以恢復鼠類抗體的初始親和力。此舉可通過將FR區中的一個或多個人殘基置換為其鼠類對應物以獲得對其表位具有良好結合親和力的抗體來實現。參見例如Tempest 等，Biotechnology 9:266 (1991)和 Verhoeyen 等，Science 239:1534(1988)。用于取代的優選殘基包括位于CDR殘基側鏈的1、2或3埃以內、位于CDR序列附近或預測與⑶R殘基相互作用的FR殘基。人抗體使用組合方法或經過人免疫球蛋白基因座轉化的轉基因動物產生完全人抗體的方法在本領域中是已知的(例如Mancini等，2004，New Microbiol 27:315-28 ；Conrad 和 Scheller,2005，Comb. Chem. HighThroughput Screen. 8:117-26 ；Brekke 和Loset, 2003, Curr. Opin. Pharmacol. 3:544-50)。還可通過遺傳或染色體轉染方法以及噬菌體展示技術構建完全人抗體，所述方法和技術在本領域中都是已知的。參見例如McCafferty等，Nature 348:552-553(1990)。預期所述完全人抗體表現比嵌合或人源化抗體甚至更少的副作用并且在體內起基本上內源性人抗體的作用。在一個替代方案中,可使用曬菌體展示技術來產生人抗體(例如Dantas-Barbosa等，2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40)。人抗體可由正常人或由表現特定疾病病況(如癌癥)的人產生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病個體構建人抗體的優勢在于循環抗體譜系可能偏向針對疾病相關抗原的抗體。在此方法的一個非限制性實例中，Dantas-Barbosa等(2005)由骨肉瘤患者構建了人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫。一般來說，從循環血液淋巴細胞獲得總RNA (同上)。從U、Y和K鏈抗體譜系克隆重組Fab并插入噬菌體展示文庫中(同上)。將RNA轉變成cDNA并用于使用針對重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特異性引物制備Fab cDNA文庫(Marks等，1991，J Mol. Biol. 222:581-97)。文庫構建是根據 Andris-Widhopf 等進行(2000:PhageDisplay Laboratory Manual, Barbas 等(編著)，第I版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY第9. I至9. 22頁)。最終Fab片段用限制性核酸內切酶消 化并插入噬菌體基因組中以制備噬菌體展示文庫。可如本領域中所已知，通過標準噬菌體展示方法對所述文庫進行篩選。噬菌體展示可以多種格式執行，關于其綜述，請參見例如Johnson 和 Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。人抗體也可由體外活化B細胞產生。參見美國專利No. 5，567，610和5，229，275，其以引用的方式整體并入本文。熟練技術人員將認識到，這些技術是作為示例并且可利用制備和篩選人抗體或抗體片段的任何已知方法。在另一替代方案中，可使用已進行遺傳工程改造以產生人抗體的轉基因動物來使用標準免疫方案產生針對基本上任何免疫原性標靶的抗體。用于從轉基因小鼠獲得人抗體的方法由 Green 等，Nature Genet. 7:13 (1994) ；Lonberg 等，Nature368:856(1994);和Taylor等，Int. Immun. 6:519 (1994)公開。所述系統的非限制性實例為來自 Abgenix (Fremont, CA )的XenoMouse (例如 Green 等,1999, J. Immunol. Methods231:11-23,以引用的方式并入本文)。在.XenoMouse 和類似動物中，已使小鼠抗體基因失活并置換為功能性人抗體基因，而小鼠免疫系統的其余部分保持完整。將XenoMouse 用含有部分人IgH和IgK基因座，包括大部分可變區序列連同輔助基因和調控序列的生殖系構型YAC(酵母人工染色體)轉化。可使用人可變區譜系來產生抗體產生B細胞，其可通過已知技術加工成雜交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse 將通過正常免疫反應產生人抗體，其可通過上文所論述的標準技術進行收集和/或制造。可獲得XenoMouse 的多種品系，其各自能夠產生不同類別的抗體。已證明轉基因產生的人抗體具有治療潛能，同時保留正常人抗體的藥物動力學性質(Green等，1999)。熟練技術人員將認識到,所主張的組合物和方法不限于使用XenoMouse 系統,而是可利用已進行遺傳工程改造以產生人抗體的任何轉基因動物。已知抗體熟練技術人員將認識到，所使用的靶向分子可包含本領域中已知的對與疾病病況或病狀相關的靶抗原具有結合特異性的任何抗體或片段。所述已知抗體包括但不限于hRl (抗IGF-1R，3/12/10提交的美國專利申請No. 12/772，645)、hPAM4 (抗胰腺癌粘蛋白，美國專利 No. 7，282，567)、hA20 (抗 CD20,美國專利 No. 7，251，164)、hA19 (抗 CD19,美國專利 No. 7，109，304)、hIMMU31 (抗 AFP，美國專利 No. 7，300，655)、hLLl (抗 CD74,美國專利 No. 7，312，318)、hLL2(抗 CD22,美國專利 No. 7，074，403)、hMu_9 (抗 CSAp,美國專利No. 7，387，773)、hL243 (抗 HLA-DR，美國專利 No. 7，612，180)、hMN-14 (抗 CEACAM5，美國專利 No. 6，676，924)、hMN_15 (抗 CEACAM6，美國專利 No. 7，662，378，7/29/10 提交的美國專利申請 No. 12/846，062)、hRS7 (抗 EGP-1，美國專利 No. 7，238，785)和 hMN_3 (抗 CEACAM6，美國專利申請No. 7，541，440)、Ab124和Ab 125 (抗CXCR4，美國專利No. 7，138，496)，各引用專利或申請的實施例部分以引用的方式并入本文。候選抗HIV 抗體包括 Johansson 等(AIDS. 2006 Oct 3; 20 (15) : 1911-5)描述的抗包膜抗體，以及由Polymun (Vienna, Austria)描述和出售的抗HIV抗體，也描述于美國專利 5，831，034、美國專利 5, 911, 989 和 Vcelar 等，AIDS 2007; 21 (16) :2161-2170 和 Joos等，Antimicrob. Agents Chemother. 2006; 50 (5) : 1773-9 中，所有文獻都以引用的方式并入本文。在一個實施方案中，可使用本發明的藥物組合物來治療患有代謝性疾病(如淀粉樣變性病)或神經退化性疾病(如阿茲海默氏病)的受試者。巴匹珠單抗(Bapineuzumab)正處于阿茲海默氏病療法的臨床試驗中。其它提出用于治療阿茲海默氏病的抗體包括Alz50 (Ksiezak-Reding等，1987，J Biol Chem 263:7943-47)、甘替魯單抗(gantenerumab)和索蘭珠單抗(solanezumab)。已報導抗TNF-a抗體英利昔單抗(Infliximab)減少淀粉樣斑塊并且改良認知。已提出抗⑶3抗體用于治療I型糖尿病(Ceraea等，2010，DiabetesMetab Rev 26:602-05)。另外，可使用本發明的藥物組合物來治療患有免疫失調病癥的受試者，如移植物抗宿主疾病或器官移植排斥反應。在一優選實施方案中，可使用所主張的組合物和方法治療的疾病包括心血管疾病，如纖維蛋白凝塊、動脈粥樣硬化、心肌缺血和梗塞。纖維蛋白抗體(例如scFv(59D8)；T2Gls ；MH1)是已知的并且正作為顯露所述凝塊和肺栓塞的成像劑進行臨床試驗，而抗粒細胞抗體(如MN-3、MN-15、抗NCA95和抗⑶15抗體)可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(參見例如美國專利 Nos. 5，487，892 ;5，632，968 ;6，294，173 ;7，541，440，各專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。可使用抗巨噬細胞、抗低密度脂蛋白(LDL)和抗CD74(例如hLLl)抗體來祀向動脈粥樣硬化斑。阿昔單抗(Abciximab)(抗糖蛋白 Hb/IIIa)已批準在經皮冠狀動脈介入干預和治療不穩定型心絞痛中輔助用于預防再狹窄(Waldmann等，2000，Hematol 1:394-408)。已報導抗⑶3抗體減少動脈粥樣硬化的發生和發展(Steffens等，2006，Circulation 114:1977-84)。針對氧化型LDL的抗體在小鼠模型中誘導已建立的動脈粥樣硬化的好轉(Ginsberg, 2007，J Am Coll Cardiol52:2319-21)。已顯示抗ICAM-I抗體在大鼠中減少腦動脈閉塞后的缺血性細胞損傷(Zhang等，1994，Neurology 44:1747-51)。針對白細胞抗原的市售單克隆由以下代表0KT抗T細胞單克隆抗體(可獲自Ortho Pharmaceutical Company),其結合正常T淋巴細胞；由具有ATCC保藏編號HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的雜交瘤產生的單克隆抗體；G7E11、W8E7、NKP15 和 G022(Becton Dickinson) ；NEN9. 4(New England Nuclear);和 FMClI(Sera Labs)。針對纖維蛋白和血小板抗原的抗體的描述含于Knight, Semin. NucI. Med.，20:52-67(1990)中。當使用雙特異性抗體時，第二 MAb可選自本領域中已知的任何抗半抗原抗體，包括但不限于 h679(美國專利 No. 7，429，381)和 734(美國專利 No. 7，429，381 ;7，563，439 ；7，666，415 ;和7，534，431)，各專利的實施例部分以引用的方式并入本文。所使用的各種其它抗體在本領域中是已知的(例如美國專利No. 5，686，072 ;5，874，540 ;6，107，090 ;6，183，744 ;6，306，393 ;6，653，104 ;6，730. 300 ;6，899，864 ；6，926，893 ;6，962，702 ;7，074，403 ;7，230，084 ;7，238，785 ;7，238，786 ;7，256，004 ；7，282，567 ;7，300,655 ;7，312，318 ;7，585,491 ;7，612，180 ;7，642，239 和美國專利申請公布No. 20060193865 ;各自以引用的方式并入本文。)所述已知抗體可用于檢測和/或治療多種疾病病況或病狀(例如hMN-14或TF2(表達CEA的癌瘤)、hA20或TF_4(淋巴瘤)、hPAM4或TF-10 (胰腺癌)、RS7 (肺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌)、hMN_15或hMN3 (炎癥)、抗gpl20和/或抗gp41 (HIV)、抗血小板和抗凝血酶(血液凝塊)、抗肌球蛋白(心臟壞死)、抗CXCR4 (癌癥和炎癥性疾病))。所使用的抗體可從多種已知來源購得。例如，多種分泌抗體的雜交瘤細胞系可從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection ；ATCC, Manassas, VA)獲得。大量針對各種疾病標靶(包括但不限于腫瘤相關抗原)的抗體已保藏于ATCC和/或已公布可變區序列并且可獲得以用于所主張的方法和組合物中。參見例如美國專利No. 7，312，318 ；7, 282，567 ；7, 151，164 ；7, 074，403 ；7, 060，802 ；7, 056，509 ；7, 049，060 ；7，045，132 ；7, 041，803 ；7, 041，802 ；7, 041，293 ；7, 038，018 ；7, 037，498 ；7, 012，133 ；7，001，598 ；6, 998，468 ；6, 994，976 ；6, 994，852 ；6, 989，241 ；6, 974，863 ；6, 965，018 ；6，964，854 ；6, 962，981 ；6, 962，813 ；6, 956，107 ；6, 951，924 ；6, 949，244 ；6, 946，129 ；6，943，020 ；6, 939，547 ；6, 921，645 ；6, 921，645 ；6, 921，533 ；6, 919，433 ；6, 919，078 ；6，916，475 ；6, 905，681 ；6, 899，879 ；6, 893，625 ；6, 887，468 ；6, 887，466 ；6, 884，594 ；6，881，405 ；6, 878，812 ；6, 875，580 ；6, 872，568 ；6, 867，006 ；6, 864，062 ；6, 861，511 ；6，861，227 ；6, 861，226 ；6, 838，282 ；6, 835，549 ；6, 835，370 ；6, 824，780 ；6, 824，778 ；6，812，206 ；6, 793，924 ；6, 783，758 ；6, 770，450 ；6, 767，711 ；6, 764，688 ；6, 764，681 ；6，764，679 ；6, 743，898 ；6, 733，981 ；6, 730，307 ；6, 720，15 ；6, 716，966 ；6, 709，653 ；6，693，176 ；6, 692，908 ；6, 689，607 ；6, 689，362 ；6, 689，355 ；6, 682，737 ；6, 682，736 ；6，682，734 ；6, 673，344 ； 6，653，104 ；6, 652，852 ；6, 635，482 ；6, 630，144 ；6, 610，833 ；6，610，294 ；6, 605，441 ；6, 605，279 ；6, 596，852 ；6, 592，868 ；6, 576，745 ；6, 572，856 ；6，566，076 ；6, 562，618 ；6, 545，130 ；6, 544，749 ；6, 534，058 ；6, 528，625 ；6, 528，269 ；6，521，227 ；6, 518，404 ；6, 511，665 ；6, 491，915 ；6, 488，930 ；6, 482，598 ；6, 482，408 ；6，479，247 ；6, 468，531 ；6, 468，529 ；6, 465，173 ；6, 461，823 ；6, 458，356 ；6, 455，044 ；6，455，040,6, 451，310 ；6, 444，206 ；6, 441，143 ；6, 432，404 ；6, 432，402 ；6, 419，928 ；6，413，726 ；6, 406，694 ；6, 403，770 ；6, 403，091 ；6, 395，276 ；6, 395，274 ；6, 387，350 ；6，383，759 ；6, 383，484 ；6, 376，654 ；6, 372，215 ；6, 359，126 ；6, 355，481 ；6, 355，444 ；6，355，245 ；6, 355，244 ；6, 346，246 ；6, 344，198 ；6, 340，571 ；6, 340，459 ；6, 331，175 ；6，306，393 ；6, 254，868 ；6, 187，287 ；6, 183，744 ；6, 129，914 ；6, 120，767 ；6, 096，289 ；6，077，499 ；5, 922，302 ；5, 874，540 ；5, 814，440 ；5, 798，229 ；5, 789，554 ；5, 776，456 ；5，736，119 ；5, 716，595 ；5, 677，136 ；5, 587，459 ；5, 443，953 ； 5, 525，338。這些僅為示例性的且多種其它抗體和其雜交瘤在本領域中是已知的。熟練技術人員將認識到，可通過簡單搜索ATCC、NCBI和/或USPTO資料庫中針對所選目標疾病相關標靶的抗體獲得針對幾乎任何疾病相關抗原的抗體序列或抗體分泌雜交瘤。所克隆抗體的抗原結合結構域可使用本領域中熟知的標準技術進行擴增、切除、連接至表達載體中、轉染至適應宿主細胞中和用于蛋白質產生。抗體片段可通過已知技術產生識別特定表位的抗體片段。抗體片段是抗體的抗原結合部分,如F(ab，)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。F(ab，)2片段可通過用胃蛋白酶消化抗體分子而產生，而Fab’片段可通過還原F (ab’)2片段的二硫鍵橋而產生。或者，可構建Fab’表達文庫(Huse等，1989，Science, 246:1274-1281)以允許快速且容易地鑒別具有期望特異性的單克隆Fab’片段。抗體片段可通過對全長抗體進行蛋白水解或通過在大腸桿菌或另一宿主中表達編碼所述片段的DNA來制備。這些方法由例如Goldenberg,美國專利No. 4，036，945和4，331，647以及其中所含的參考文獻描述，所述專利以引用的方式整體并入本文。還參見 Nisonoff 等，Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960) ；Porter, Biochem.J. 73:119(1959) ;Ede Iman 等，METHODS IN ENZYM0L0GY 第 I 卷，第 422 頁(Academic Press1967);和 Coligan 第 2. 8. 1-2. 8. 10 頁和第 2. 10. -2. 10. 4 頁。
單鏈Fv分子(scFv)包含Vlj結構域和Vh結構域。\和Vh結構域締合形成標祀結合位點。這兩個結構域由肽連接子(L)進一步共價連接。制備scFv分子和設計適合肽連接子的方法描述于以下文獻中美國專利No. 4，704，692 ;美國專利No. 4，946，778 ；R. Raag 和 M. Whitlow, "Single Chain Fvs. "FASEB 第 9 卷:73-80(1995)和 R. E. Bird 和 B. ff. Walker, "Single Chain Antibody Variable Regions, "TIBTECH,第 9卷132-137(1991),所述文獻以引用的方式并入本文。具有大譜系的scFv文庫可通過使用對應于所有已知VH、Vk和V8tl基因家族的PCR引物從未免疫人供體分離V-基因進行構建。參 見例如Vaughn等，Nat.Biotechnol.，14:309-314(1996)。擴增后，將Vk和Va池組合形成一個池。將這些片段連接至噬菌粒中。接著將scFv連接子連接至噬菌粒中'片段的上游。擴增％和連接子片段并在Jh區上組裝。所得Vh-連接子-VL片段連接至噬菌粒載體中。可根據與所選抗原的結合對噬菌粒文庫進行淘選。其它抗體片段，例如單結構域抗體片段，在本領域中是已知的并且可用于所主張的構建體中。單結構域抗體(VHH)可通過標準免疫技術從例如駱駝、羊駝或美洲駝獲得。(參見例如 Muyldermans 等，TIBS26:230-235，2001 ；Yau 等，J TmmunoI Methods281:161-75, 2003 ;Maass 等，J Immunol Methods 324:13-25,2007)。VHH可具有有效抗原結合能力并且可與常規VH-VL對不可接近的新穎表位相互作用。(Muyldermans等，2001)羊駝血清IgG含有約50%僅有重鏈的駱駝IgG抗體(Cab) (Maass等，2007)。羊駝可用已知抗原免疫并且可分離結合并中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。已鑒別出擴增幾乎所有羊駝VHH編碼序列的PCR引物并且可用于構建羊駝VHH噬菌體展示文庫，所述文庫可用于通過本領域中熟知的標準生物淘選技術分離抗體片段(Maass等，2007)。這些和其它已知抗原結合抗體片段可用于所主張的方法和組合物中。用于抗體克隆和制造的一般技術各種技術，如制造嵌合或人源化抗體，可能涉及抗體克隆和構建的程序。目標抗體的抗原結合Vk (可變輕鏈)和Vh(可變重鏈)序列可通過多種分子克隆程序獲得，如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文庫篩選。來自表達鼠類MAb的細胞的MAb的V基因可通過PCR擴增進行克隆并測序。為證實其可靠性，可使克隆的'和Vh基因在細胞培養物中表達為嵌合 Ab,如 Orlandi 等所述(Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 86:3833 (1989))。基于 V 基因序列，接著可如Leung等(Mol Immunol, 32:1413 (1995))所述設計和構建人源化MAb。可通過一般分子克隆技術從產生鼠類MAb的任何已知雜交瘤細胞系或轉染細胞系制備 cDNA(Sambrook 等，Molecular Cloning, Alaboratory manual,第 2 版(1989))。MAb 的 Vk 序列可使用引物 VK1BACK 和 VK1F0R(Orlandi 等，1989)或 Leung等(BioTechniques, 15:286(1993))所述的擴展引物組進行擴增。Vh序列可使用引物對VH1BACK/VH1F0R(Orlandi 等，1989)或Leung等(Hybridoma, 13:469(1994))所述的與鼠類IgG恒定區退火的引物進行擴增。可如Leung等(Mol. Immunol, 32:1413 (1995))所述通過組合長寡核苷酸模版合成和PCR擴增構建人源化V基因。Vk的PCR產物可亞克隆到支架載體中，如基于pBR327的支架載體VKpBR，其含有Ig啟動子、信號肽序列和適宜的限制性位點。Vh的PCR產物可亞克隆到類似支架載體中，如基于pBluescript的VHpBS。含有Vk和Vh序列連同啟動子和信號肽序列的表達盒可從VKpBR和VHpBS切除并分別連接至適當表達載體中，如pKh和pGlg (Leung等，Hybridoma, 13:469(1994))。所述表達載體可共轉染至適當細胞中并監測上清液的嵌合、人源化或人MAb產生。或者，可切除Vk和卩11表達盒并亞克隆至單一表達載體中，如 pdHL2,如 Gillies 等所述(J Immunol. Methods 125:191 (1989),并且還在 Losman等，Cancer, 80:2660 (1997)中示出)。在一替代實施方案中，可將表達載體轉染至已預先適應在無血清培養基中轉染、生長和表達的宿主細胞中。可使用的示例性細胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF_X細胞系(參見例如美、國專利No. 7，531，327 ;7，537，930和7，608, 425 ;各自的實施例部分以引用的方式并入本文)。這些示例性細胞系是基于以突變型Bcl-EEE基因轉染、暴露于甲氨蝶呤以擴增所轉染基因序列并且預先適應無血清細胞系以供蛋白質表達的Sp2/0骨髓瘤細胞系。雙特異性和多特異性抗體在某些實施方案中，本文公開的用于治療劑遞送的技術和組合物可與作為靶向部分的雙特異性或多特異性抗體一起使用。眾多制造雙特異性或多特異性抗體的方法是已知的，如例如美國專利No. 7，405，320所公開，所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文。雙特異性抗體可通過四重雜交瘤方法制造，所述方法包括使各自產生識別不同抗原位點的單克隆抗體的兩種不同雜交瘤融合(Milstein和Cuello, Nature, 1983;305:537-540)。另一制造雙特異性抗體的方法使用異雙官能性交聯劑以化學系栓兩個不同單克隆抗體(Staerz 等 Nature. 1985; 314:628-631 ；Perez 等 Nature. 1985; 316:354-356)。雙特異性抗體還可通過將兩個親本單克隆抗體各自還原成相應半分子，接著將其混合并使其再氧化以獲得雜交結構來制造(Staerz和Bevan. Proc Natl Acad Sci U SA. 1986;83:1453-1457)。另一替代方案涉及使用適當連接子使兩種或三種經過單獨純化的Fab’片段化學交聯。(參見例如歐洲專利申請0453082)。其它方法包括通過以逆轉錄病毒來源的穿梭載體將不同可選擇標志基因轉移至各別親本雜交瘤中，隨后進行融合(DeMonte等Proc Natl Acad Sci U SA. 1990,87:2941-2945);或者用含有不同抗體的重鏈和輕鏈基因的表達質粒轉染雜交瘤細胞系來提高產生雜種雜交瘤的效率。可將同源V1^P'結構域與具有適當組成和長度(通常由多于12個氨基酸殘基組成)的肽連接子接合以形成具有結合活性的單鏈Fv (scFv)。制造scFv的方法公開于美國專利No. 4，946，778和美國專利No. 5，132，405中，所述專利各自的實施例部分以引用的方式并入本文。將肽連接子長度縮減至少于12個氨基酸殘基阻止同一鏈上的Vh與\結構域配對并且迫使Vh和\結構域與其它鏈上的互補結構域配對，導致形成功能性多聚體。與3至12個氨基酸殘基的連接子接合的Vh和\結構域的多肽鏈主要形成二聚體(稱為雙功能抗體)。使用0至2個氨基酸殘基的連接子，有利于形成三聚體(稱為三功能抗體)和四聚體(稱為四功能抗體)，但除連接子長度外，寡聚化的確切模式似乎還取決于組成以及V-結構域取向(Vh-連接子或連接子-Vh)。制造多特異性或雙特異性抗體的這些技術呈現各種難處，在于技術的產率低、需要純化、穩定性低或耗費大量勞力。最近，已利用一種稱為“對接鎖定”(dock and lock；DNL)的技術來制造幾乎任何期望抗體、抗體片段或其它效應分子的組合(參見例如美國專利 No. 7，550，143 ；7, 521，056 ；7, 534，866 ；7, 527，787 和 USSN 11/925，408，所述專利各自的實施例部分以引用的方式并入本文)。所述技術利用稱為錨定結構域(AD)和二聚化與對接結構域(DDD)的互補蛋白質結合結構域，其彼此結合并且允許組裝范圍為二聚體、三聚體、四聚體、五聚體和六聚體的復雜分子。其以高產率形成穩定復合物而并不需要廣泛純化。DNL技術允許組裝單特異性、雙特異性或多特異性抗體。實施本發明所主張的方法時可利用本領域中已知用于制造雙特異性或多特異性抗體的任何技術。在各種實施方案中，如本文所公開的偶聯物可為復合多特異性抗體的部分。所述抗體可含有兩個或多個具有不同特異性的不同抗原結合位點。多特異性復合物可結合相同抗原的不同表位，或者可結合兩個不同抗原。對接鎖定(DNL)在優選實施方案中，雙特異性或多特異性抗體或其它構建體可使用對接鎖定技術制造(參見例如美國專利 No. 7，550，143 ;7，521,056 ;7，534，866 ;7，527，787 和 7，666，400，各專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。DNL方法利用cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)的調控(R)亞基與A-激酶錨定蛋白(AKAP)的錨定結構域(AD)之間發生的特異性蛋白質/ 蛋白質相互作用(Baillie 等，FEBS Letters. 2005; 579:3264。Wong 和 Scott, Nat. Rev.Mol. Cell Biol. 2004; 5:959)。在研究最多的通過第二信使cAMP結合于R亞基觸發的信號轉導路徑之一中起中樞作用的PKA于1968年首先從兔骨骼肌分離出(Walsh等，J. Biol.Chem. 1968; 243:3763)。全酶的結構由兩個通過R亞基保持為非活性形式的催化亞基組成(Taylor, J. Biol. Chem. 1989; 264:8443)。發現PKA的同工酶具有兩種類型的R亞基(RI和RH)，并且各類型具有Ct和P亞型(Scott, Pharmacol. Ther. 1991; 50:123)。R亞基僅分離為穩定二聚體并且顯示二聚化結構域由前44個氨基端殘基組成(Newlon等，Nat. Struct.Biol. 1999;6:222)。cAMP與R亞基結合導致釋放廣譜絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的活性催化亞基，其通過使PKA與AKAP對接而使PKA區室化來限定于所選底物(Scott等，J. Biol.Chem. 1990;265;21561)。自從第一種AKAP微管相關蛋白_2于1984年表征以來(Lohmann等，Proc. Natl.Acad. Sci USA. 1984; 81:6723)，又在從酵母到人范圍內的物種中鑒別出具有多種結構的超過50種AKAP，其定位于各種亞細胞位點，包括質膜、肌動蛋白細胞骨架、細胞核、線粒體和內質網(Wong 和 Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5:959)。AKAP 中用于 PKA 的 AD 是具有14-18個殘基的兩親性螺旋(Carr等，J. Biol. Chem. 1991; 266:14188)。AD的氨基酸序列在個別AKAP之間十分不同，其中針對RII 二聚體所報導的結合親和力在2至90nM范圍內(Alto 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100:4445)。AKAP 僅結合二聚 R 亞基。對于人RII a , AD結合由23個氨基端殘基形成的疏水性表面(Colledge和Scott, TrendsCell Biol. 1999;6:216)。因此，人RII a的二聚化結構域和AKAP結合結構域都定位在N端同一 44 氨基酸的序列內(Newlon 等,Nat. Struct. Biol. 1999; 6:222 ；Newlon 等,EMBOJ. 2001; 20:1651)，其在本文被稱為DDD。我們已發展出一種平臺技術，其利用人RII a的DDD和AKAP的AD作為一對優良的連接子模塊用于將任何兩個實體(在下文稱為A與B)對接成非共價復合物，所述復合物可通過在DDD與AD的至關重要的位置中引入半胱氨酸殘基以促進形成二硫鍵而進一步鎖定為穩定系栓結構。“對接鎖定”法的一般方法如下。實體A通過將DDD序列連接至A的前驅體、進行構建，產生下文稱為a的第一組分。因為DDD序列將實現二聚體的自發形成，因此A將由a2構成。實體B通過將AD序列連接至B的前驅體進行構建，產生下文稱為b的第二組分。a2中所含的DDD的二聚基元將產生用于結合b中所含的AD序列的對接位點，由此促進a2與b容易地締合形成由a2b構成的二元三聚復合物。利用通過二硫橋共價固定兩個實體的后續反應使此結合事件不可逆轉，基于有效局部濃度的原理，此反應極其有效地發生，因為初始結合相互作用應使安置于DDD與AD兩者上的反應性硫醇基接近(Chmura等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 2001;98:8480)從而位點特異性連接。使用連接子、接頭模塊和前驅體的各種組合，可產生和使用不同化學計量的多種DNL構建體，包括但不限于二聚、三聚、四聚、五聚和六聚 DNL 構建體(參見例如 U. S. No. 7，550，143 ;7，521，056 ;7，534，866 ;7，527，787 和7,666,400。) 通過遠離兩個前驅體的官能團連接DDD和AD，預期所述位點特異性連接還將保留兩個前驅體的原始活性。此方法在性質上是模塊化的并且可潛在應用于位點特異性共價連接多種物質，包括肽、蛋白質、抗體、抗體片段和具有多種活性的其它效應部分。利用構建以下實施例中所述的偶聯AD和DDD的效應物的融合蛋白法，可將幾乎任何蛋白質或肽并入DNL構建體中。然而，所述技術并不具限制性并且可利用其它偶聯方法。已知用于制備融合蛋白的多種方法，包括核酸合成、雜交和/或擴增以產生編碼目標融合蛋白的合成雙鏈核酸。可通過標準分子生物學技術將所述雙鏈核酸插入用于制造融合蛋白的表達載體中(參見例如Sambrook等，Molecular Cloning, A laboratorymanual,第2版，1989)。在所述優選實施方案中，AD和/或DDD部分可連接于效應蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟練技術人員將認識到，AD或DDD部分連接于效應部分的位點可根據效應部分的化學性質和效應部分中參與其生理活性的部分而改變。多種效應部分的位點特異性連接可使用本領域中已知的技術執行，如使用二價交聯試劑和/或其它化學偶聯技術。在其它替代實施方案中，可使用點擊化學反應來產生與效應部分偶聯的AD或DDD肽，或者甚至使AD和DDD部分彼此共價連接從而提供不可逆共價鍵，以使DNL復合物穩定。預靶向雙特異性或多特異性抗體可用于預靶向技術中。預靶向是一種多步驟方法，其最初發展用來解決直接靶向抗體的血液清除緩慢的問題，血液清除緩慢會造成對正常組織(如骨髓)的不當毒性。利用預靶向時，將放射性核素或其它治療劑連接于在數分鐘內從血液清除的小遞送分子(可靶向構建體)。首先施用具有針對可靶向構建體以及靶抗原的結合位點的預靶向雙特異性或多特異性抗體，讓游離抗體從循環中清除并接著施用可靶向構建體。預祀向方法公開于以下文獻中，例如Goodwin等，美國專利No. 4，863，713 ;Goodwin 等，J. Nucl. Med. 29:226，1988 ；Hnatowich 等，J. Nucl. Med. 28:1294，1987 ;Oehr 等,J. Nucl. Med. 29:728, 1988 ；Klibanov 等,J. Nucl. Med. 29:1951, 1988 ；Sinitsyn等，J. Nucl. Med. 30:66，1989 ;Kalofonos 等，J. Nucl. Med. 31:1791，1990 ;Schechter等，Int. J. Cancer 48:167,1991 ；Paganelli 等，Cancer Res. 51:5960,1991 ；Paganelli等，Nucl. Med. Commun. 12:211，1991 ;美國專利 No. 5，256，395 ;Stickney 等，CancerRes. 51:6650，1991 ;Yuan 等，Cancer Res. 51:3119, 1991 ；美國專利 No. 6，077，499 ;7，Oil, 812 -J, 300，644 -J, 074，405 ；6, 962，702 -J, 387，772 -J, 052，872 -J, 138，103 ；6，090，381 ；6, 472，511 ；6, 962，702 ;和6，962，702，各文獻以引用的方式并入本文。治療或診斷受試者的疾病或病癥的預靶向方法可通過以下提供(I)向受試者施用雙特異性抗體或抗體片段；(2)任選地向受試者施用清除組合物，并讓所述組合物從循環中清除所述抗體；和(3)向受試者施用含有一種或多種螯合或化學結合的治療劑或診斷劑的可靶向構建體。免疫偶聯物在優選實施方案中，可將治療劑或診斷劑共價連接至抗體或抗體片段以形成免疫偶聯物。可將載體部分連接至例如經過還原的SH基團和/或碳水化合物側鏈上。載體部分可通過形成二硫鍵連接于經過還原的抗體組分的鉸鏈區。或者，所述藥劑可使用異雙官能交聯劑(如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(STOP))連接。Yu等，Int. J. Cancer 56:244(1994)。所述偶聯的一般技術在本領域中是熟知的。參見例 如 Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis 等,"Modification of Antibodies by Chemical Methods, "MONOCLONALANTIBODIES PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch 等(編著)，第 187-230 頁(ffiley-Liss, Inc. 1995) ；Price,"Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies, "MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING ANDCLINICAL APPLICATION, Ritter 等(編著)，第 60-84 頁(Cambridge University Press1995)。或者，可通過抗體Fe區中的碳水化合物部分偶聯載體部分。通過抗體碳水化合物部分偶聯官能團與抗體的方法為本領域的技術人員所熟知。參見例如 Shih 等，Int. J. Cancer 41:832 (1988) ;Shih 等，Int. J. Cancer 46:1101 (1990)；和Shih等，美國專利No. 5，057，313，所述文獻的實施例部分以引用的方式并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗體與具有至少一個游離胺官能團的載體聚合物反應。此反應產生初始希夫堿(Schiff base)(亞胺)鍵聯,其可通過還原成仲胺而穩定以形成最終偶聯物。在免疫偶聯物的抗體組分是抗體片段的情況下可能不存在Fe區。然而，有可能將碳水化合物部分引入全長抗體或抗體片段的輕鏈可變區中。參見例如Leung等，J.Immunol. 154:5919(1995);美國專利No. 5，443，953和6，254，868，所述文獻的實施例部分以引用的方式并入本文。使用經過工程改造的碳水化合物部分來連接治療劑或診斷劑。連接載體部分與靶向分子的替代方法涉及使用點擊化學反應。點擊化學法最初構想成通過以模塊化方式將小亞基接合在一起快速產生復雜物質的方法。(參見例如Kolb等，2004，Angew Chem Int Ed40:3004-31 ；Evans, 2007, Aust J Chem 60:384-95。)各種形式的點擊化學反應在本領域中是已知的，如胡伊斯根(Huisgen) I, 3-偶極環加成銅催化反應(Tornoe等，2002，J Organic Chem 67:3057-64)，其通常稱為“點擊反應”。其它替代方案包括環加成反應，如狄爾斯-阿爾德(Diels-Alder)、親核取代反應(尤其與如環氧和環乙亞胺化合物等小應變環反應)、脲化合物的羰基化學形成和涉及碳碳雙鍵的反應，如硫醇-炔反應中的炔。疊氮化物炔胡伊斯根環加成反應使用還原劑存在下的銅催化劑以催化連接于第一分子的末端炔基的反應。在包含疊氮化物部分的第二分子存在下，疊氮化物與活化炔反應形成1，4_取代的1，2，3-三唑。銅催化的反應在室溫下進行并且具有足夠特異性，從而通常不需要對反應產物進行純化。(Rostovstev等，2002，Angew Chem Int Ed 41:2596 ；Tornoe等，2002，J Org Chem 67:3057。)疊氮和炔官能團對水性介質中的生物分子基本上呈惰性，從而允許反應在復雜溶液中進行。形成的三唑在化學上為穩定的并且不經歷酶促裂解，使得點擊化學產物在生物系統中高度穩定。盡管銅催化劑對活細胞有毒，但可在體外使用基于銅的點擊化學反應形成免疫偶聯物。已提出無銅點擊反應用于生物分子的共價修飾。(參見例如Agard等，2004, J AmChem Soc 126:15046-47。)無銅反應使用環應變替代銅催化劑來促進[3+2]疊氮化物-炔環加成反應(同上)。例如，環辛炔是包含內部炔鍵的8碳環結構。閉合環結構誘發乙炔的實質性鍵角變形，其極易與疊氮基反應形成三唑。因此，環辛炔衍生物可用于無銅點擊反應(同上)。另一類型的無銅點擊反應由Ning等報導(2010，Angew Chem Int Ed49:3065-68)，其涉及應變促進的炔-硝酮環加成。為解決原始環辛炔反應速率緩慢的問題，與三鍵相鄰連接吸電子基團(同上)。所述經過取代的環辛炔的實例包括二氟化環辛炔、4- 二苯并環辛炔醇和氮雜環辛炔(同上)。一替代無銅反應涉及應變促進的炔-硝酮環加成來得到N-烷基化異噁唑啉(同上)。所述反應據報導具有特別快的反應動力學并且用于一鍋式三步方案中以供對肽和蛋白質進行位點特異性修飾(同上)。硝酮是通過使適當醛與N-甲基羥胺縮合來制備并且環加成反應在乙腈與水的混合物中進行(同上)。可使用這些和其它已知點擊化學反應來在體外將載體部分連接至抗體。Agard 等(2004，J Am Chem Soc 126:15046-47)證明在過氧乙酸化 N-疊氮乙酰基甘露糖胺存在下在CHO細胞中表達的重組糖蛋白導致在糖蛋白的碳水化合物中生物并入相應N-疊氮乙酰基唾液酸。疊氮基衍生化糖蛋白與生物素化環辛炔特異性反應形成生物素化糖蛋白，而無疊氮基部分的對照糖蛋白保持未標記(同上)。Laughlin等(2008, Science 320:664-667)使用類似技術對與過氧乙酰化N-疊氮乙酰基半乳糖胺一起孵育的斑馬魚胚胎中的細胞表面聚糖進行代謝標記。疊氮基衍生化聚糖與二氟化環辛炔(DIFO)試劑反應，從而允許在體內觀測聚糖。狄爾斯-阿爾德反應已用于分子的體內標記。Rossin等(2010，Angew Chem IntEd 49:3375-78)報導帶有反式環辛烯(TCO)反應性部分的腫瘤定位抗TAG72 (CC49)抗體與111In標記四嗪DOTA衍生物之間在體內52%的產率。向帶有直腸癌異種移植物的小鼠施用TCO標記的CC49抗體，接著I天后注射經過111In標記的四嗪探針(同上)。放射性標記探針與腫瘤定位抗體的反應產生放射性在腫瘤中的顯著定位，如通過注射放射性標記探針三小時后對活小鼠的SPECT成像所證實，其中腫瘤肌肉比為13:1(同上)。結果證實TCO與四嗪標記分子的體內化學反應。使用標記部分的生物并入的抗體標記技術進一步公開于美國專利No. 6，953，675中(所述專利的實施例部分以引用的方式并入本文)。所述“修飾(landscaped)”抗體制備成在糖基化位點上具有反應性酮基。所述方法包括在包含糖或糖前驅體的酮衍生物的培養基中表達用編碼在CHl或Vk結構域中具有一個或多個N-糖基化位點的抗體的表達載 體轉染的細胞。酮衍生化糖或前驅體包括N-乙酰丙酸基甘露糖胺和N-乙酰丙酸基海藻糖。隨后使經過修飾的抗體與包含酮反應性部分(如酰肼基、肼基、羥胺基或氨基硫脲基)的試劑反應形成經過標記的祀向分子。連接于經過修飾的抗體的示例性試劑包括螯合劑(如DTPA)、大藥物分子(如阿霉素-葡聚糖)和含有酰基-酰肼的肽。修飾技術不限于產生包含酮部分的抗體，而且可替代地用于在抗體或其它生物分子上引入點擊化學反應性基團，如硝酮、疊氮化物或環辛炔。點擊化學反應的修改形式適合于在體外或體內使用。反應靶向分子可通過化學偶聯或通過生物并入形成。靶向分子(如抗體或抗體片段)可用疊氮基部分、經過取代的環辛炔或炔基或者硝酮部分活化。如果靶向分子包含疊氮基或硝酮基，那么相應可靶向構建體將包含經過取代的環辛炔或炔基，并且反之亦然。所述活化分子可通過在活細胞中進行代謝性并入來產生，如上文所論述。或者，將所述部分化學與生物分子偶聯的方法在本領域中是熟知的，并且可利用任何所述已知方法。治療劑和診斷劑
在某些實施方案中，本文公開的靶向分子或可靶向構建體可連接于一種或多種治療劑和/或診斷劑。治療劑優選選自由以下組成的組放射性核素、免疫調節劑、抗血管生成劑、細胞因子、趨化因子、生長因子、激素、藥物、前藥、酶、寡核苷酸、促細胞凋亡劑、干擾RNA、光敏治療劑、細胞毒性劑(其可為化學治療劑或毒素)和其組合。所使用的藥物可具有選自由以下組成的組的藥學性質抗有絲分裂、抗激酶、烷基化、抗代謝物、抗生素、生物堿、抗血管生成、促細胞凋亡劑和其組合。所使用的示例性藥物包括但不限于5-氟尿卩密唳、阿普利唳(aplidin)、阿扎利平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、蒽環霉素、苯達莫司汀(bendamustine)、博來霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚蟲素_1 (bryostatin-1)、白消安(busulfan)、卡奇霉素、喜樹堿、卡鉬、10-輕基喜樹堿、卡莫司汀(carmustine)、西樂德(Celebrex)、苯丁酸氮芥、順鉬(CDDP)、Cox_2抑制劑、伊立替康(CPT-11), SN-38、卡鉬、克拉屈濱(cladribine)、喜樹堿、環磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪(dacarbazine)、多西紫杉醇(docetaxel)、更生霉素(dactinomycin)、道諾霉素(daunorubicin)、阿霉素、2_ 批咯啉基阿霉素(2P-D0X)、氰基-嗎啉基阿霉素、葡糖苷酸阿霉素、葡糖苷酸表柔比星、雌氮芥、表鬼白毒素、雌激素受體結合劑、依托泊苷(VP 16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3’，5’ -0- 二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟達拉濱(f Iudarabine)、氟他胺(flutamide)、法尼基蛋白轉移酶抑制劑、吉西他濱(gemcitabine)、輕基脲、伊達比星(idarubicin)、異環磷酰胺、L-天冬酰胺酶、來那度胺(Ienolidamide)、甲酰四氫葉酸、洛莫司汀(Iomustine)、氮芥(mechlorethamine)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、6_巰基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、絲裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、諾維本(navelbine)、亞硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、噴司他丁(pentostatin)、PSI-341、雷洛昔芬(raloxifene)、司莫司汀(semustine)、鏈佐星(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉酹(taxol)、替莫唑胺(temazolomide) (DTIC的水性形式)、反鉬(transplatinum)、沙利度胺(thalidomide)、硫鳥嘌呤、塞替派(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓撲替康、尿11密唳氮芥、長春瑞濱(vinorelbine)、長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)和長春花生物喊(vinca alkaloids)。所使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、a毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)(例如抗腫瘤核糖核酸酶(onconase))、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素_A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素。所使用的免疫調節劑可選自細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、群落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、紅細胞生成素、血小板生成素和其組合。特別適用者為淋巴毒素，如腫瘤壞死因子(TNF);造血因子，如白介素(IL);群落刺激因子，如粒細胞群落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF);干擾素，如干擾素-a、干擾素-P或干擾素-Y ;和干細胞生長因子，如稱為“SI因子”者。細胞因子包括生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨酰基人生長激素和牛生長激素；副甲狀腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和黃體生成素(LH);肝生長因子；前列腺素；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；0B蛋白；腫瘤壞死因子-a和-0 ;苗勒管抑制物質(mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO);神經生長因子，如NGF-P ;血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，如TGF-a和TGF-0 ;胰島素樣 生長因子-I和-II ;紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子；干擾素,如干擾素-a、-0和-Y ;群落刺激因子(CSF)，如巨噬細胞-CSF (M-CSF);白介素(IL)，如IL_1、IL-I a、IL_2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8, IL-9、IL-10、IL-IU IL-12 ;IL_13、IL-14、IL-15, IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit-配體或FLT-3、血管抑素、血小板反應蛋白、內皮抑素、腫瘤壞死因子和LT。所使用的趨化因子包括狀見^5、]\ ^ 、]\0 1-0、]\0 1-3和IP-10。適用于治療患病組織的放射性同位素包括但不限于mIn、mLU、212Bi、213Bi、211At、62Cu,67Cu,90Y, 1251 , 131 1 , 32P,33P,47Sc, 111Ag,67Ga,142Pr,153Sm,161Tb,166Dy, 166Ho,186Re, 188Re,189Re,212Pb、223Ra' 225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109PcU 143Pr、149Pm' 169Er、194Ir、198Au、199Au 和211Pb。治療性放射性核素優選具有20至6，OOOkeV范圍內的衰變能，優選對于俄歇發射體在60至200keV范圍內，對于P發射體在100_2，500keV范圍內，并且對于a發射體在4，000-6, OOOkeV范圍內。適用P粒子發射核素的最大衰變能優選為20_5，OOOkeV,更優選為100-4，OOOkeV,并且最優選為500-2，500keV。隨俄歇發射粒子實質上衰變的放射性核素也是優選的。例如 Co-58、Ga-67、fo-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-lll、Sb-119、1-125、Ho-161、0s-189m和Ir-192。適用P粒子發射核素的衰變能優選為〈1，OOOkeV，更優選為〈lOOkeV，并且最優選為<70keV。隨著a粒子產生而實質上衰變的放射性核素也是優選的。所述放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。適用a粒子發射放射性核素的衰變能優選為2，000-10, OOOkeV,更優選為 3，000-8, OOOkeV,并且最優選為 4，000-7, OOOkeV0 其它潛在適用放射性同位素包括 nC、13N、150、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、lcl3Ru、lcl5Ru、107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho,199Aiu57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se JcilTU225AcJ6BiN169Yb 等。治療劑可包括光敏劑或染料。熒光組合物(如熒光染料)和其它色原體或對可見光敏感的染料(卟啉)已用于通過將適合光引導至病變來檢測和治療病變。在療法中，此稱為光輻射、光線療法或光動力療法。參見Jori等(編著)，PH0T0DYNAMIC THERAPYOF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985) ；van den Bergh, Chem.Britain(1986) ,22:430。此外，已將單克隆抗體與光活化染料偶合以供達成光線療法。參見 Mew 等，J. Immunol. (1983)，130:1473 ;同上，Cancer Res. (1985), 45:4380 ；Oseroff 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986)，83:8744 ;同上，Photochem. Photobiol.(1987), 46:83 ； Hasan 等，Prog. Clin. Biol. Res. (1989)，288:471 ;Tatsuta 等，LasersSurg. Med. (1989), 9:422 ;Pelegrin 等，Cancer (1991)，67:2529。皮質類固醇激素可增加其它化學治療劑的有效性，并且因此其常用于組合治療中。潑尼松(Prednisone)和地塞米松(dexamethasone)是皮質類固醇激素的實例。.在某些實施方案中，可使用抗血管生成劑，如血管抑素、baculostatin、血管生成抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白、抗胎盤生長因子(PlGF)肽和抗體、抗血管生長因子抗體(如抗VEGF和抗P1GF)、抗Flk-I抗體、抗Flt-I抗體和肽、抗Kras抗體、抗cMET抗體、抗MIF(巨噬細胞遷移抑制因子)抗體、層粘連蛋白肽、纖維連接蛋白肽、纖 溶酶原活化因子抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素-12、IP-10、Gro-^、血小板反應蛋白、2-甲氧基雌二醇、多育曲菌素(proliferin)相關蛋白、羧酰胺三唑、CM101、馬力馬司他(Marimastat)、戍聚糖多硫酸鹽、血管位蛋白_2、干擾素-a、除莠霉素A(herbimycin A)、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺(Linomide)、沙利度胺、己酮可可堿(pentoxifylline)、染料木素(genistein)、TNP-470、內皮抑素、紫杉醇、尖吻蝮毒肽(accutin)、血管抑素、西多福韋(cidofovir)、長春新堿、博來霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四環素(minocycline)。治療劑可包含任何寡核苷酸，如siRNA。熟練技術人員將認識到，任何SiRNA或干擾RNA物質都可連接至可靶向構建體以供遞送到靶組織。針對多種標靶的許多siRNA物質在本領域中是已知的，并且在所主張的方法和組合物中可利用任何所述已知siRNA。有可能使用的已知siRNA物質包括對以下具有特異性者=IKK-Y (美國專利7，022，828) ;VEGF、Flt-I 和 Flk_l/KDR(美國專利 7，148，342) ；Bcl2 和 EGFR(美國專利7，541，453) ;0^20(美國專利7，550，572);轉導蛋白(P )樣蛋白3 (美國專利7，576，196)；KRAS(美國專利7，576，197);碳酸酐酶II (美國專利7，579，457);補體組分3(美國專利7，582，746);白介素-I受體相關激酶4 (IRAK4)(美國專利7，592，443);存活素(美國專利7，608，7070);超氧化物歧化酶I (美國專利7，632，938) ;MET原癌基因(美國專利7，632，939);淀粉樣蛋白P前驅體蛋白(APP)(美國專利7，635，771) ;IGF-IR(美國專利7，638，621) ;ICAM1 (美國專利7，642，349);補體因子B(美國專利7，696，344)；p53(7, 781，575)和載脂蛋白B (7，795，421)，各參考專利的實施例部分以引用的方式并入本文。其它siRNA物質可從已知商業來源獲得，如Sigma-Aldrich (StLouis,MO)、Invitrogen(Car Isbad,CA)、Santa Cruz Biotechnology (SantaCruz, CA)、Ambion (Austin, TX)、Dharmacon (Thermo Scientific, Lafayette, CO)、Promega (Madison, WI)、Mirus Bio (Madison, WI)和 Qiagen (Valencia, CA)以及許多其它來源。siRNA物質的其它可公開獲得的來源包括位于斯德哥爾摩生物信息學中心(StockholmBioinformatics Centre)的 siRNAdb 數據庫、MIT/ICBP siRNA 數據庫、位于博得研究院(Broad Institute)的 RNAi 聯合 shRNA 文庫(RNAi Consortium shRNA Library)和位于NCBI的探針數據庫(Probe database)。例如,在NCBI探針數據庫中存在30，852種siRNA物質。熟練技術人員將認識到，對于任何目標基因，或者siRNA物質已進行了設計，或者其可容易地使用可公開獲得的軟件工具進行設計。任何所述siRNA物質都可使用主題DNL復合物進行遞送。本領域中已知的示例性siRNA物質列于表I中。盡管siRNA是作為雙鏈分子遞送，但為簡單起見，表I中僅示出有義鏈序列。表I.示例性siRNA序列
權利要求
1.一種將治療劑遞送至靶細胞或組織的方法，其包括 a)施用包含針對疾病相關抗原的第一結合位點和針對半抗原的第二結合位點的靶向分子; b)施用包含所述半抗原和治療劑的可靶向構建體，其中所述半抗原結合所述靶向分子; 其中所述可靶向構建體包含多個拷貝的治療劑。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述靶向分子是DNL構建體。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述靶向分子是TF2。
4.根據權利要求I所述的方法，其中所述可靶向構建體是IMP453。
5.根據權利要求I所述的方法，其中所述治療劑是SN-38。
6.根據權利要求I所述的方法，其中多個拷貝的所述治療劑連接于所述可靶向構建體。
7.根據權利要求I所述的方法，其中所述第一結合位點結合選自由以下組成的組的抗原:碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp, CDUCDla, CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CXCR4、CXCR7、CXCLl2,HIF-I a、AFP、PSMA, CEACAM5、CEACAM6、B7、纖維連接蛋白的 ED-B、因子 H、FHL-U Flt_3、葉酸受體、GROB, HMGB-1、低氧誘導因子(HIF)、HMl. 24、胰島素樣生長因子-I (ILGF-I)、IFN-y、IFN-a、IFN-^、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP-lA、MIP_lB、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-95、NCA-90、la、HMl. 24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、肌腱蛋白、Le (y)、RANTES> TlOU TAC、Tn 抗原、湯姆森-弗里德里希抗原(Thomson-Friedenreichantigen)、腫瘤壞死抗原、TNF-a、TRAIL 受體(Rl 和 R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、補體因子 C3、C3a、C3b、C5a、C5和致癌基因產物。
8.根據權利要求I所述的方法，其中所述靶向分子是雙特異性抗體。
9.根據權利要求I所述的方法，其中所述靶向分子是通過對接鎖定(DNL)技術制備。
10.根據權利要求I所述的方法，其中所述第一結合位點選自由以下組成的組hRl、hPAM4、hA20、hA19、hIMMU31、hLLl、hLL2、hMu-9、hL243、hMN-14、hMN-15、hRS7、hMN-3、Abl24和 Abl25。
11.根據權利要求I所述的方法，其中所述治療劑選自由以下組成的組毒素、藥物、放射性核素、免疫調節劑、細胞因子、淋巴因子、趨化因子、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、siRNA、RNAi、光敏治療劑、抗血管生成劑和促細胞凋亡劑。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述藥物選自由以下組成的組氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱(gemcitabine)、三氮烯、葉酸類似物、蒽環霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼白毒素、鉬配位絡合物、長春花生物堿、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、激素拮抗劑、內皮抑素、紫杉酚、喜樹堿、SN-38、阿霉素(doxorubicin)、阿霉素類似物、抗代謝物、烷基化劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、HDAC抑制劑、促細胞凋亡劑、甲氨蝶呤和CPT-II。
13.根據權利要求11所述的方法，其中所述毒素選自由以下組成的組蓖麻毒素、相思豆毒素、a毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素_A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素(gelonin)、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素。
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述放射性核素選自由以下組成的組1(l3mRh、103Ru,105Rh,105Ru,107Hg,109Pd,109Pt,111Ag^111In,113mIn,119Sb,11C^121mTe,122mTe, 1251 , 125mTe,126I,1311、133I、13N、142Pr、143Pr、149Pm、152Dy、153Sm,150,161Ho、161Tb、165Tm, 166Dy、166Ho、167Tm^168Tm, 169Er,169Yb,177Lu,186Re,188Re, 189mOs,189Re, 192Ir,194Ir,197Pt,198Au,199Au,201TU 203Hg,211At,211Bi,211Pb,212Bi,212Pb,213Bi,215Po,217At,219Rn,221Fr, 223Ra, 224Ac, 225Ac, 225Fm,32P,33P,47Sc,51Cr,57Co,58Co,59Fe、62Cu、67Cu、67Ga、75Br、75Se、76Br、77As、77Br、80mBr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo 和 99mTc。
15.根據權利要求11所述的方法，其中所述酶選自由以下組成的組蘋果酸脫氫酶、 葡萄球菌核酸酶、S-V-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、a-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
16.一種組合物，其包含MP 453。
17.根據權利要求16所述的組合物，其進一步包含樹突。
18.根據權利要求16所述的組合物，其中所述組合物包含4至16個拷貝的I種治療劑。
19.根據權利要求18所述的組合物，其中所述治療劑選自由以下組成的組毒素、藥物、放射性核素、免疫調節劑、細胞因子、淋巴因子、趨化因子、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、siRNA、RNAi、光敏治療劑、抗血管生成劑和促細胞凋亡劑。
20.根據權利要求18所述的組合物，其中所述治療劑是喜樹堿。
21.根據權利要求18所述的組合物，其中所述治療劑是SN-38。
22.根據權利要求18所述的組合物，其中所述治療劑選自由以下組成的組的酶蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、S-V-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、a-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
23.根據權利要求18所述的方法，其中所述藥物選自由以下組成的組氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、吉西他濱、三氮烯、葉酸類似物、蒽環霉素、紫杉烷、C0X-2抑制劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物、抗生素、酶抑制劑、表鬼白毒素、鉬配位絡合物、長春花生物堿、取代脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、激素拮抗劑、內皮抑素、紫杉酚、喜樹堿、SN-38、阿霉素、阿霉素類似物、抗代謝物、烷基化劑、抗有絲分裂劑、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、mTOR抑制劑、熱休克蛋白(HSP90)抑制劑、蛋白酶體抑制劑、HDAC抑制劑、促細胞凋亡劑、甲氨蝶呤和CPT-II。
24.根據權利要求18所述的方法，其中所述毒素選自由以下組成的組蓖麻毒素、相思豆毒素、a毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素_A、美洲商陸抗病毒蛋白、白樹毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內毒素。
25.根據權利要求18所述的方法，其中所述放射性核素選自由以下組成的組1(l3mRh、103Ru,105Rh,105Ru,107Hg,109Pd,109Pt,111Ag^111In,113mIn,119Sb,11C^121mTe,122mTe, 1251 , 125mTe,126I,·1311、133I、13N、142Pr、143Pr、149Pm、152Dy、153Sm,150,161Ho、161Tb、165Tm, 166Dy、166Ho、167Tm^168Tm, 169Er、 169Yb,177Lu,186Re,188Re, 189mOs,189Re, 192Ir,194Ir,197Pt,198Au,199Au,201TU 203Hg,211At,211Bi,211Pb, 212Bi,212Pb,213Bi,215Po,217At,219Rn,221Fr, 223Ra, 224Ac, 225Ac, 225Fm,32P,33P,47Sc,51Cr,57Co,58Co, 59Fe、62Cu、67Cu、67Ga、75Br、75Se、76Br、77As、77Br、80mBr、89Sr、90Y、95Ru、97Ru、99Mo 和 99mTc。
全文摘要
本發明涉及用于治療劑的預靶向遞送的方法和組合物。在優選的實施方案中，所述預靶向方法包括a)施用具有第一結合位點的針對疾病相關抗原和可靶向構建體上的半抗原的雙特異性抗體；b)施用包含至少一種治療劑的可靶向構建體。在優選實施方案中，所述雙特異性抗體是通過所述對接鎖定(DNL)技術制備。在一更優選實施方案中，所述可靶向構建體包含一個或多個SN-38部分。
文檔編號A61K39/395GK102665757SQ201080052649
公開日2012年9月12日 申請日期2010年12月9日 優先權日2009年12月9日
發明者C·A·德索扎, C-H·張, D·M·戈德堡, W·J·麥克布萊德 申請人:免疫醫療公司