通過用巖藻黃質和石榴油酸的組合激活去乙酰化酶Sirtuin來延緩衰老過程的方法

專利名稱：通過用巖藻黃質和石榴油酸的組合激活去乙酰化酶Sirtuin來延緩衰老過程的方法
技術領域：
本發明涉及ー種用于延緩哺乳動物受試者的衰老過程的組合物。本發明還涉及ー種用于激活Sirtuin酶(一種去こ酰化酶)的組合物。
背景技術：
Sirtl是ー種使有助于細胞調節的蛋白質脫こ酰基的酶。Sirtuin-l (Sirtl)參與使壽命與脂肪組織相關聯的分子機制。Sirtl在動物脂肪沉積中具有關鍵性的調控作用，其參與脂肪生成，并促進白色脂肪細胞中的脂肪動員。Sirtuin-I調控若干支配脂肪代謝的轉錄因子，包括過氧化物酶體增埴物-激活物受體-Y (PPAR- Y )、叉頭框(fork-head-box)轉錄因子和脂聯素(adiponectin)。Sirtl的激活通過抑制脂肪儲存過程中的轉錄因子之一 PPAR-Y來促進脂肪動員。Sirtl抑制脂肪細胞中的脂質積聚。Sirtuin基因顯著地抑制DNA不穩定性，還使得DNA進行修復。衰老的部分原因是衰老細胞不能象我們較年輕時那樣在每個新細胞中完整地復制DNA。這會產生DNA碎片，所述碎片通過加速個體細胞的死亡來引起衰老。有證據將Sirtl與衰老聯系在一起。體內脂肪的主要類型是白色脂肪組織(WAT)，其作用是以甘油三酯(TG)細胞內微滴的形式儲存能量并且分泌數種細胞因子(脂肪因子)，所述細胞因子通過影響其他組織和器官諸如腦、肌肉和肝的功能來調控總能量平衡。脂肪因子包括瘦素(Ieptin)、脂聯素、內脂素(visfatin)、抵抗素(resistin)、白介素(IL)-6和腫瘤壞死因子-a (TNFa )，它們調控能量代謝、胰島素敏感性和心血管健康。當需要能量時，儲存的TG經脂肪分解途徑的
激活而被水解。TG儲存和利用的協調受到蛋白質化合物家族-圍脂滴蛋白(periIipins)
的調控，圍脂滴蛋白包覆TG微滴并允許或阻止接近脂肪分解酶。另ー種類型脂肪是褐色脂肪組織(BAT)，其主要功能是燃燒TG釋放的(脂解)脂肪酸以生成熱能(“無寒戰”產熱)，尤其在新生兒中在出生后進入寒冷環境中的最初幾小時期間作為保護性措施。隨著人的成熟，BAT儲庫的尺寸顯著減小，其在遍布全身的小袋內存在于成人中，并分布在WAT沉積物內。褐色脂肪組織存在于人類中直至第八個十年。白色和褐色脂肪組織之間的功能差異在于僅褐色脂肪被裝備用于快速氧化來自脂肪儲庫的脂解產物。WAT由填充有單個脂滴的單泡細胞構成，而BAT由脂肪快速氧化引起的多泡脂質儲存構成。活性BAT也在很大程度上受神經支配。BAT的實驗性去神經支配產生許多類似白色脂肪細胞的單泡細胞。BAT細胞比白色脂肪組織的細胞小，并且BAT見于特征性的部位。在人類中BAT可見于頸部血管和肌肉附近，鎖骨和腋窩之下，肋間血管周圍，氣管和食管之間，在主動脈旁區中以及在腎周和腎上區中。在肩胛間區中的褐色脂肪逐漸減少直至30歲，之后急劇減少。在新生兒中BAT以體重的相對大的量(2-5% )存在，并且通常認為其隨著衰老而萎縮，可能轉化成白色脂肪組織。BAT的減少與無寒戰產熱的能力減弱以及WAT積累(例如，向心性肥胖)和總體重増加的易感性相平行。脂肪組織的研究表明，基于形態學表現，隨著老化，BAT的活性越來越低，所述形態學表現不同于新生兒或適冷的嚙齒類動物中BAT的形態學表現。還存在證據表明，在男性中，取決于不利大氣條件，諸如暴露于寒冷，BAT會更為明顯和更具活性。例如，已經發現在戶外生活的芬蘭人的體內較廣泛地分布BAT。飲食和年齡對BAT有重大影響。熱量限制(CR)已經顯示防止在數種組織諸如肝、心臟和骨骼肌中與年齡相關的的線粒體功能和生物合成的喪失，并且防止BAT中與年齡相關的線粒體功能的下降，可能與線粒體生物合成的較少損害有關。從事先接受40% CR飲食持續12個月的24月齡雄性和雌性大鼠獲得的BAT線粒體與來自自由采食的老年(24個月)和幼年出個月)大鼠的線粒體相比較。就脂肪含量和脂肪細胞數目而言，與老年的自由采食大鼠相比，老年的受限制大鼠顯示BAT尺寸減小。在幼年個體中，褐色脂肪細胞含有大量線粒體，并且密集受到交感神經系統的神經支配。這些神經末梢將去甲腎上腺素釋放到脂肪細胞的周圍環境中，在此去甲腎上腺素激活G-蛋白-偶聯的β-腎上腺素能受體，該受體觸發激活解偶聯蛋白I(UCPl)的代謝事件。Sirtl的激活誘導UCPl的表達。UCPl是BAT的標志分子。解偶聯蛋白I是褐色脂肪細胞的獨特特征，其允許環境因素(例如，寒冷)、食物以及內源性刺激經由代謝激素例如糖皮質激素通過激活副交感和交感神經系統來生成能量。UCPl存在于線粒體的內膜中，在此解偶聯蛋白I將燃料的氧化與產生三磷酸腺苷(ATP)解偶聯，引起無寒戰產熱。UCPl水平増加可以被認為與活性BAT同義。機體(包括BAT和WAT)的代謝功能很大程度上取決于細胞的“發電站”，線粒體。通過Sirtuin蛋白家族維持有活力的線粒體，該類蛋白在進化中高度保守，具有保護細胞存活的單一功能。簡單生物體的Sirtuin,例如酵母中的Sir2,和哺乳動物的Sirtuin,即哺乳動物Sirtl-7蛋白在處于熱量限制(CR)飲食、不利環境條件例如惡劣和寒冷的天氣、以及冬眠時是上調的。令人感興趣的是，CR飲食是唯一已經證明的延長生物體壽命的方式，所述生物體從細菌至人類。在模型生物體例如酵母、果蠅(Drosophila fly)、線蟲或嚙齒類動物中的研究提示兩種進化途徑可能増加壽命(a)修復編碼生命的遺傳物質，以及(b)節約代謝活動以使維持生命的代謝的附帶傷害和消耗效應最小化。Sirtuin酶,例如Sirtl和Sirt3,通過從蛋白質移除こ酰基來發揮它們的功能。脫こ酰作用導致在細胞代謝中蛋白質的作用失活，并且防止基因過表達，從而使細胞進入冬眠狀態(較少的消耗和更多的修復時間)，因此潛在地増加了其壽命。細胞以與磷酸化/去磷酸化類似的方式利用こ酰化/去こ酰化來激活或失活蛋白質。脫こ酰作用的機制受Sirtl-7蛋白之間的相互作用調控，這些蛋白的功能是煙酰胺(NAD)依賴性的。通常，Sirtuin的激活伴有NAD水平的升高。去こ酰作用的NAD依賴機制調控代謝并維持細胞的壽命。NAD及其還原形式NADH之間的比率與熱量攝取相關。NADH水平増加意味著熱量攝取較多，因為食物中的能量轉換成NADH，然后NADH用于生成ATP形式的能量。另ー方面，在CR飲食中出現NAD/NADH比率的增加。已經廣泛研究了通過給予熱量限制飲食或白藜蘆醇來激活Sertl，并且已經將、Sirtl與衰老相關聯。研究者已經比較了用具有各種限制以及高劑量或低劑量白藜蘆醇的飲食飼養的小鼠。較高劑量的白藜蘆醇直接增加Sirtuin或Sirtl的水平。發現白藜蘆醇預防小鼠的肥胖以及年齡相關的心血管衰退。它還對年齡相關的狀況具有數種積極的作用，諸如改善的平衡和運動協調，較少的白內障，較好的骨厚度、密度和礦物含量。延緩衰老過程，減少年齡相關的疾病，并且實際上延長生命。已經發現較低劑量的白藜蘆醇對Sirtuin基因顯示相同的作用。Sirtuins的激活抑制過氧化物酶體增殖物-激活受體Y ,PPAR-Y ,并且減少脂肪形成，以及觸發WAT的脂解和損耗。相反，抑制Sirtuins増加WAT的形成。減少WAT延長了小鼠 的壽命，此發現提示了在哺乳動物中將熱量限制與生命延長聯系起來的可能分子途徑。Sirt3-5的線粒體定位特別重要，原因在于線粒體功能障礙與哺乳動物衰老和代謝病有夫，所述代謝病包括糖尿病，神經變性疾病和癌癥。Sirt3在褐色脂肪組織中表達，并且據報道Sirt3的脫こ酰基酶活性是誘導BAT及其標志物解偶聯蛋白I (UCP-I)所必需的。Sirt3調控線粒體功能，其過表達加快呼吸，同時減少活性氧類別的產生。在人群研究中，Sirt3基因內的多態性(保護有價值基因的機制)已經與壽命相關聯。BAT解偶聯蛋白I在小鼠骨骼肌中的異位表達和UCPl在小鼠或人白色脂肪細胞中的誘導促進脂肪酸氧化和對肥胖的抵抗。褐色脂肪組織在調控人類的能量平衡中的重要性不可低估。一方面，已經發現BAT預防肥胖癥；另一方面，其抗肥胖機制通過Sirtl-7蛋白的増加獨特地發揮作用并與其相關，所述Sirtl-7蛋白延長壽命。已經發現少至40-50克的活性BAT可使代謝率增加20-25%。此BAT量相當于低于O. I %的平均人體重量。每天能量消耗相差20%可導致在保持體重和以每年20千克的速率増加體重之間的差異。此發現與人體的衰老尤其相關，因為普通成人在25歲以后每年増加O. 45kg (I lb)，并且在25歲以后每年丟失O. 2kg (O. 5 lb)肌肉和骨質量。植物酚類物質，包括植物抗毒素(phytoalexin)，即葡萄皮中存在的白藜蘆醇，可以刺激Sirtuin酶，其接下來可以延緩衰老過程并且還可以調控代謝過程。在采用脂肪細胞的體外實驗中，白藜蘆醇可以影響數種脂肪形成轉錄因子和酶的表達，例如下調過氧化物酶體增殖物-激活受體PPART Y、C/EBP a、SREBP-Ic, FAS、HSL, LPL基因，并上調負責線粒體活性的基因，即Sirt3、UCPl和Mfn2 (線粒體融合蛋白(Mitofusin) 2)的表達。這些體外發現表明白藜蘆醇可以通過在成熟過程中的前脂肪細胞中直接影響細胞活力和脂肪形成和在脂肪細胞中誘導凋亡來改變脂肪量，因此可以應用于治療肥胖癥。然而，天然化合物如白藜蘆醇和其他植物酚類物質在調控代謝方面和作為抗肥胖化合物的潛在作用由于其主要在體外和動物研究中所表現出的不良胃腸吸收、組織生物利用度而被削弱。另外，白藜蘆醇可提高心血管疾病風險因子(高半胱氨酸)的血液水平，而量大的一些酚類化合物，例如，茶多酚可能與肝臟毒性有夫。

發明內容
在美國肥胖個體的患病率在1960年和2000年之間幾乎增加了兩倍，并且可用的藥理學和營養干預沒有減慢這種趨勢。巖藻黃質/石榴籽油的各種示例性實施方案提供了一種增強肥胖癥復原及其代謝后果的安全和有效的方法，所述實施方案由標準化的植物提取物構成，所述方法通過下述步驟來實現防止與年齡相關的BAT損耗，
在減少白色脂肪組織的情況下，増加褐色脂肪組織的體積，以及延 緩衰老過程。各種示例性實施方法涉及增效混合物在制備用于通過激活Sirtuin家族蛋白的至少ー個成員來延緩哺乳動物受試者的衰老過程的藥劑中的用途。所述增效混合物包含(a)有效量的巖藻黃質，巖藻黃質的藥學上可接受的鹽，或它們的混合物；和(b)有效量的石榴油酸。各種示例性實施方案涉及巖藻黃質和石榴油酸的增效混合物在制備用于激活Sirtuin家族蛋白的至少ー個成員的藥劑中的用途。各種實施方案涉及巖藻黃質和石槽油酸的增效混合物在制備用于使細胞進入冬眠狀態的藥劑中的用途，所述藥劑通過激活選自由Sirtl和Sirt3蛋白組成的組的至少ー種蛋白質而使蛋白質脫こ酰基,從而使細胞進入冬眠狀態。各種實施方案涉及巖藻黃質和石榴油酸的增效混合物在制備用于激活選自由Sirt3、Sirt4和Sirt5組成的組的至少ー種線粒體蛋白的藥劑中的用途。各種實施方案涉及巖藻黃質和石榴油酸的增效混合物在制備用于激活線粒體UCP-I蛋白的藥劑中的用途。各種示例性實施方案涉及巖藻黃質和石榴油酸的增效混合物在制備用于延緩衰老過程，和進ー步治療非酒精性脂肪性肝病，増加能量消耗率，或増加褐色脂肪組織的體積和/或減少白色脂肪組織的體積的藥劑中的用途。各種示例性實施方案涉及增效混合物在制備用于通過使蛋白脫こ酰基而使細胞進入冬眠狀態來延緩哺乳動物受試者的衰老過程的藥劑中的用途，其中所述增效組合包含巖藻黃質和石榴油酸。各種實施方案涉及ー種通過激活Sirtuin家族蛋白的至少ー個成員，來改善哺乳動物受試者的身體成分的方法，其中所述激活包括向所述受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合。巖藻黃質/石榴籽油的各種示例性實施方案涉及基于其組分的相加和增效作用的組合物。第一個組分是巖藻黃質。巖藻黃質可以提取自，例如，褐色海藻(裙帶菜(Undaria pinnatifida),褐藻綱(Phaeophyceae))。在各種示例性實施方案中，這樣的提取物包含O. I重量％至10重量％的巖藻黃質,優選O. 5至5重量更優選O. 6至I. O重量％，最優選O. 8重量％。在各種示例性實施方案中，褐色海藻提取物另外包含ω3_脂肪酸。褐色海藻中的主要脂肪酸是η-3脂肪酸諸如ω-3 18:3_α-亞麻酸和ω-3 20:5 二十碳五烯酸。基于相加作用的組合物的第二個組分是石榴油酸。石榴油酸可以作為純化合物被包含，或石榴油酸可以作為石榴油的組分被包含。如果石榴油酸作為石榴油的組分被包含，則石榴油一般含有50-90%石榴油酸，優選60-80%的石榴油，更優選70%的石榴油。石榴油提取自，例如，石槽籽(石槽(Punica granatum),石槽科(Punicaceae))。石槽油酸是9-順式，11-反式共軛亞麻酸(9c，lit，13c-CLNA)并且構成石榴籽油的主要組分。巖藻黃質/石槽籽油的各種示例性實施方案涉及ー種通過激活Sirtuin家族蛋白的至少ー個成員來延緩哺乳動物受試者的衰老過程的方法。激活Sirtuin家族蛋白的至少一個成員包括向受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合的步驟。所述受試者可以是人或動物。Sirtuin家族蛋白被激活的成員可以是選自由Sirt3、Sirt4和Sirt5組成的組的至少一種線粒體蛋白。巖藻黃質/石榴籽油的各種示例性實施方案涉及一種通過激活選自由Sirtl和Sirt3蛋白組成的組的至少一種蛋白來延緩哺乳動物受試者的衰老過程的方法。Sirtl或Sirt3蛋白的激活引起蛋白的脫乙酰化，使細胞進入冬眠狀態。巖藻黃質/石槽籽油的各種不例性實施方案涉及一種通過向受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合，從而通過激活線粒體UCP-I蛋白來延緩哺乳動物受試者的衰老過程的方法。巖藻黃質/石槽籽油的各種不例性實施方案涉及一種通過向受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合，來增加受試者褐色脂肪組織的體積并減少白色脂肪組織的體積的方法。巖藻黃質/石槽籽油的各種不例性實施方案涉及一種通過向受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合，聯合至少一種ω -3脂肪酸，從而通過激活Sirtuin家族蛋白的至少一個成員來延緩哺乳動物受試者的衰老過程的方法。所述ω-3脂肪酸可以來源于褐藻。在某些實施方案中，巖藻黃質和ω-3脂肪酸兩者都可來源于褐藻提取物。在一些實施方案中，巖藻黃質可以是合成產生的，ω-3脂肪酸可以來源于褐藻提取物。在其他實施方案中，合成產生的巖藻黃質可以與褐色海藻的提取物組合，其中褐色海藻的提取物含有與ω-3脂肪酸組合的天然產生的巖藻黃質。在巖藻黃質/石榴籽油的各種示例性實施方案中，石榴油酸是作為純化的化合物使用的。在某些實施方案中，石榴油酸是作為石榴油的組分加入的。石榴油含有50-90 %石榴油酸，優選60-80 %石榴油，更優選70 %石榴油。在巖藻黃質/石榴籽油的各種示例性實施方案中，所述巖藻黃質和石榴油酸的增效組合包含a)下列的至少一種天然產生的巖藻黃質；合成產生的巖藻黃質；包含巖藻黃質的褐色海藻提取物；和包含巖藻黃質和至少一種源于褐藻的ω-3脂肪酸的褐色海藻提取物；b)下列的至少一種天然產生的石榴油酸；合成產生的石榴油酸；以及包含石榴油酸的石榴籽油；以及c)任選地，至少一種ω -3脂肪酸。在此公開的各種實施方案涉及一種通過激活Sirtuin家族蛋白的至少一個成員來改善哺乳動物受試者的身體成分的方法，其中所述激活步驟包括向所述受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合。在各種實施方案中，改善身體成分包括通過用所述增效組合治療，在哺乳動物受試者中增加褐色脂肪組織的體積并減少白色脂肪組織的體積。在此公開的各種實施方案涉及一種激活脂肪組織中的Sirtl的方法，其中所述激活可以通過使脂肪組織與有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合接觸而在體外或體內進行。在各種實施方案中，增效組合物包含50wt. %的褐色海洋植物的提取物，所述提取物 包含30重量％的海洋植物油和O. I重量％至10重量％，優選O. 5至5重量％，更優選O. 6至I. O重量％，最優選O. 8重量％的巖藻黃質；和50wt. %的石榴籽油，所述石榴籽油包含60-80重量％，優選70重量％的石榴油酸。
在巖藻黃質/石榴籽油的各種示例性實施方案中，所述巖藻黃質和石榴油酸的增效組合可以通過向所述受試者局部應用或經胃腸外施用所述增效組合來施用。在各種不例性實施方案中，包含O. I重量％至10重量％巖藻黃質,優選O. 5至5重量％，更優選O. 6至I. O重量％，最優選O. 8重量％巖藻黃質的褐色海洋植物的提取物可以以所述組合物的約25至75重量％的量存在；并且石榴籽油可以以所述組合物的約25至75重量百分比的量存在。當經口服時，褐色海洋植物油的提取物以足夠提供Img至50mg巖藻黃質/天，優選2. O至15. Omg巖藻黃質/天,更優選2. O至5. Omg巖藻黃質/天的量存在。石榴籽油以足夠提供I至IOOOmg石榴油酸/天的量存在。在巖藻黃質/石榴籽油的各種示例性實施方案中，巖藻黃質和石榴油酸的增效組 合可以通過向受試者經口服施用所述增效組合來施用。盡管優選口服，巖藻黃質/石榴籽油可以經口服、局部或經胃腸外施用。巖藻黃質/石榴籽油適用于人類、寵物動物和工業動物。


為了更充分地理解本發明的巖藻黃質/石榴籽油的性質和期望目的，結合附圖參考以下詳細說明，在附圖中圖I顯示了蛋白質印跡(Western Blot)研究的結果,該結果證明Xanthigen 、巖藻黃質和石榴籽油對細胞Sirtl水平的影響；圖2A是褐色海洋植物提取物的HPLC色譜圖；圖2B是巖藻黃質參比標準品的HPLC色譜圖；圖3顯示Xanthigen (艾克西珍TM)對患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的肥胖受試者的肝臟脂肪含量和正常肝臟脂肪含量(NLF)作用的圖表。
具體實施例方式在一個16周、雙盲、隨機化、安慰劑對照的臨床研究中，評價了包含巖藻黃質、ω-3脂肪酸和石榴油的組合物。將巖藻黃質/石榴油組合物與單獨的巖藻黃質、單獨的石榴籽油或橄欖油安慰劑進行比較。在不改變生活方式的前提下，每天的飲食攝取量為1800千卡(中度限制的飲食)。在進入研究時和每周一次持續16周對110名非糖尿病絕經前肥胖女性評價攝食量數據、身體成分、能量消耗率(EER)和血樣分析結果，這110名女性包括肝臟脂肪含量超過11 % -非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的72名女性(η = 72)和肝臟脂肪含量低于6.5% -正常肝臟脂肪(NLF)的38名女性(η = 38)。巖藻黃質/石槽籽油以200mg —天三次(TID)(總的日劑量包括2. 4mg巖藻黃質和210mg石榴籽油)的量施用16周，與接受安慰劑的志愿者相比，引起體重、腰圍(僅NAFLD組)、身體和肝臟脂肪含量、肝臟酶(僅NAFLD組)、血清甘油三酯和C-反應蛋白在統計學上的顯著降低。在研究中，體重減輕以及身體和肝臟脂肪含量減少在具有NLF的患者中比在具有NAFLD的患者中出現得早。與接受安慰劑的志愿者相比，在肥胖受試者中巖藻黃質/石榴籽油顯著地增加了 EER。與單獨服用巖藻黃質相比，石榴籽油通過激活巖藻黃質誘導的EER增加以及改善患者的臨床和總體健康狀態，產生了意想不到的效果。公開的組合物在肥胖非糖尿病女性中增加EER，促進體重減輕，減少身體的特別是肝臟的脂肪含量，并且改善肝臟功能。補充給藥在具有NAFLD的肥胖女性中是特別有益的，而且還改善具有NLF的女性的健康狀況。與石榴籽油聯合給藥的巖藻黃質可以被認為是在肥胖受試者中提高身體代謝、肥胖控制和正常化代謝和生化參數的一種有前途的食物補充劑。公開的組合物含有作為褐色海洋植物提取物的組分存在的巖藻黃質，和作為石榴籽油的組分存在的石槽油酸。該組合物極大地提高細胞中Sirtuin酶的表達(即Sirtl表達)。該組合物具有比單獨的巖藻黃質實質上更大的作用。由巖藻黃質/石榴油酸組合物引起的Sirtl表達的極大提高是出人意料的，因為石榴油酸單獨不會增強Sirtl表達；事實上，石榴油酸抑制Sirtl表達。由巖藻黃質/石榴油酸組合物引起的Sirtl激活以多種方式影響機體。首先，sirtl的激活誘導UCPl的表達。盡管巖藻黃質基于對UCPl的誘導而具有公認的減輕體重的性質，但巖藻黃質與石榴籽油的組合極大地增強了 Sirtl激活，因此比單獨巖藻黃質更強烈地增強UCPl表達。巖藻黃質/石榴油酸組合物對UCPl的增強還通過解偶聯細胞代謝中的步驟導致能量消耗率(EER)增加。巖藻黃質/石榴油酸還增強褐色脂肪組織(BAT)中的Sirt3表達，并且Sirt3的脫乙酰酶活性誘導BAT及其標志物解偶聯蛋白-I的水平升高。巖藻黃質，單獨或聯合石榴油酸，上調WAT中UCPl基因的表達，從而促進KK-Ay小鼠中白色脂肪組織的減少和體重的顯著減輕。巖藻黃質，單獨或聯合石榴油酸，還抑制脂肪細胞分化和脂質積聚，由此抑制甘油-3-磷酸脫氫酶活性。此外，巖藻黃質/石榴油酸還增強褐色脂肪組織(BAT)中的Sirt3表達，并且Sirt3的脫乙酰酶活性誘導BAT及其標志物解偶聯蛋白-I的水平升高。已知甘油-3-磷酸脫氫酶與身體質量指數、WAT和血液葡萄糖有關。與相匹配的對照相比，發現甘油-3-磷酸脫氫酶敲除小鼠具有較低的身體質量指數，WAT重量減少40%，并具有較低的空腹血糖。巖藻黃質另外的降血脂性質源于下調過氧化物酶體增殖物-激活受體-Y (PPART- Y )，其負責成脂基因的表達。膳食石榴籽油顯著地減少血清TG(—種促進肥胖和WAT的主要體脂)水平。石榴的石榴油酸已經顯示抑制Λ-9脫飽和酶(脂肪代謝的一種酶)，這是石榴籽油減少肝TG積累作用背后的可能機制。褐藻ω-3脂肪酸可能提供另外的機制以減少血清和肝臟TG濃度，其原因是據報道ω-3促進肝臟脂肪酸β_氧化。這種降血脂機制可通過巖藻黃質與ω-3脂肪酸的共同給藥進一步加強，這可以增加肝臟中膳食ω-3脂肪酸的量。所公開組合物的主要機制是由于與單獨使用的巖藻黃質或石榴油相比，其對能量消耗率(EER)和相關的代謝和臨床效應的出人意料的效果。通過間接測熱法在患者中測量能量消耗率(EER)。用電化學氧傳感器測量氧，并且用紅外線二氧化碳傳感器(阿美特克(Ametec) 二氧化碳分析儀)測量二氧化碳。在每次測量前，用O2和CO2氣體混合物校準儀器。計算氧消耗(O2)和二氧化碳產生(CO2)的速率，并且以Imin的間隔打印出來。由O2和CO2值得到能量消耗。與用單獨的巖藻黃質或石榴籽油/石榴油酸補充相比，補充所公開的巖藻黃質/石榴籽油組合物增加了 EER，尤其是在具有非酒精性脂肪肝疾病或NAFLD的肥胖受試者中，而且在具有正常肝臟脂肪含量或NFL的受試者中也是如此。單獨巖藻黃質的最小有效劑量為2. 4mg。較低的巖藻黃質劑量I. 6mg盡管本身無效,但當補充以石槽籽油(200mg/天)、時，顯示EER出人意料的顯著增加(P < O. 05)和其他臨床益處。因此，施用兩個200mg膠囊，每個包含O. Smg巖藻黃質和IOOmg石榴籽油，是有效的。使用較高劑量的石榴籽油進一步增加了 EER。這些結果提示石榴籽油對巖藻黃質誘導的EER增加具有觸發和增效的劑量依賴性作用。單獨施用石榴籽油/石榴油酸對EER沒有作用。
巖藻黃質/石榴籽油組合物的臨床研究證明石榴油與巖藻黃質聯合增效性發揮作用，產生巖藻黃質的EER-刺激作用。如在表4(以下進一步詳細討論)中所見，單獨巖藻黃質顯著地增加能量消耗率，而單獨石榴油對能量消耗率的作用很小或沒有作用。然而，巖藻黃質和石榴油的組合比單獨巖藻黃質實質上更多地增加能量消耗率。增效的巖藻黃質/石榴油組合還引起提高的代謝率、WAT損失和體重減輕。增效的巖藻黃質/石榴油組合還產生較小的腰臀比(WHR)并使身體的自穩功能正常化，如正常化的血壓和炎癥指標例如C-反應蛋白或CRP所證明的那樣。臨床研究提供了 Sirtl-7蛋白激活的證據，其通過增加BAT維持身體成分和代謝功能獲益，并且還延緩WAT隨衰老過程的WAT積聚。巖藻黃質/石榴籽油組合物可以加強或削弱UCP-I蛋白表達，這將反映在該組合物對BAT生物發生和Sirtuin蛋白激活的影響上。如前述，具有NAFLD的肥胖患者以及具有NFL的那些患者受益于巖藻黃質/石榴籽油組合物，他們的肝臟和內臟脂肪減少，血漿氧化型LDL減少，以及體內炎性過程減少，例如，血清CRP水平降低，血清CRP水平與胰島素抵抗、代謝綜合征和2型糖尿病的發生正相關。巖藻黃質/石榴籽油組合物針對復雜的代謝紊亂提供了營養基因組方法，其作用于機體的基因組、表觀基因組和蛋白質組。這種多重的營養基因組機制防止過多體脂的常見復發(振動效應(yo-yo effect))，確保肥胖癥的恢復。巖藻黃質/石榴籽油組合物調控BAT和WAT以及脂肪因子包括瘦素、脂聯素、內脂素、抵抗素、白介素(IL)-6和TNF，這些脂肪因子再影響能量代謝、胰島素敏感性、心血管健康和全身健康。在其廣泛的作用機制下，巖藻黃質/石榴籽油組合物具有減少肝臟甘油三酯含量的器官特異性效應。巖藻黃質/石榴籽油組合物所觀察到的正常血壓效應，這可能表明在肥胖個體中所述組合物廣泛的自穩機制，其歸因于體重、身體和肝臟脂肪含量的顯著減輕，血清TG、炎癥標志物和肝臟酶的減少。脂聯素是一種WAT脂肪細胞來源的細胞因子，在CNS中作用以控制自主功能、能量和心血管內穩態，引起接受巖藻黃質/石榴籽油組合物的研究群體中的正常血壓效應。巖藻黃質/石榴籽油組合物刺激脂聯素，其發揮在臨床研究中見到的自穩效應。巖藻黃質/石榴籽油組合物的機制導致由脂肪細胞產生的另一種脂肪因子瘦素的水平下降。巖藻黃質/石榴籽油組合物導致的脂聯素與瘦素比率的增加與體重減輕、BAT與WAT比率的增加以及改善和節省的代謝能量過程相關。已經顯示在空腹血漿中特定脂肪酸的存在可對炎性標志物的水平具有顯著的影響。例如，較低的α-亞麻酸含量與較高的CRP相關，而高血漿η-3脂肪酸含量與較低的促炎標志物水平和較高的抗炎標志物水平相關。盡管石榴油酸(PA)在結構上與亞麻酸和亞油酸相關，但其具有截然不同的作用機制。例如，被給予除PA之外的共軛亞油酸或共軛亞麻酸異構體混合物飲食的動物發生胰島素抵抗和脂肪肝，盡管體重顯著減輕。服用巖藻黃質/石榴籽油組合物的個體減少WAT，這種作用可能涉及參與甘油三酯代謝的蛋白，即脂肪細胞中的圍脂滴蛋白，其活性與UCPl改變的活性和增加的BAT有關。
圍脂滴蛋白基因編碼圍脂滴蛋白，該蛋白包覆細胞內脂滴并且調控脂肪細胞中的脂解作用。脂滴蛋白的圍脂滴蛋白(PAT)家族在哺乳動物中包括5個成員圍脂滴蛋白、月旨肪分化相關蛋白(ADRP)、47kDa的尾連蛋白(TIP47)、S3-12和0ΧΡΑΤ。圍脂滴蛋白存在于進化上遠緣的生物體中，包括昆蟲、粘菌類和真菌。這些蛋白在結構和結合細胞內脂滴的能力方面是類似的，所述結合是組成型的或響應于代謝刺激，例如，進出脂滴的增加的脂質流量。位于脂滴表面，圍脂滴蛋白控制對其他蛋白(脂肪酶)以及對脂滴核內的脂質酯類的接近。圍脂滴蛋白可以與對于脂滴生物合成重要的細胞器相互作用。已發表的研究強調了圍脂滴蛋白作為脂解作用的調節劑的重要性，所述研究證明圍脂滴蛋白在脂肪細胞中的過表達導致脂解減少，以及圍脂滴蛋白敲除小鼠顯示基礎脂解水平增加和抗肥胖的證據。圍脂滴蛋白的脫磷酸化形式限制接近脂滴，阻止脂質動員。當激素發出信號需要代謝能量時，脂質必須被帶出儲庫，并被轉運至可氧化脂肪酸以產生能量的組織。為此，酶腺苷酸環化酶被激活并且依次導致圍脂滴蛋白的cAMP-依賴性 蛋白激酶(PKA)磷酸化。圍脂滴蛋白的磷酸化形式允許胞液中的脂肪酶移動至脂滴，并且水解TG，釋放脂肪酸和甘油。本發明的巖藻黃質/石榴籽油組合物由于Sirtl-7級聯的營養基因組激活而具有廣泛的代謝活性，減少WAT以利于BAT，改善能量消耗率，改善葡萄糖耐量，減少炎癥標志物，降低血壓，減輕體重并改善個體的總體健康狀態。如以上所討論，Sirtuin酶,例如Sirtl和Sirt3，通過從蛋白移除乙酰基而發揮它們的功能。脫乙酰作用導致在細胞代謝中的所述蛋白作用的失活并且防止基因過表達，從而使細胞進入冬眠狀態并延長其壽命。巖藻黃質/石榴籽油組合物通過延緩原發的衰老(增加壽命)，并通過降低慢性退行性疾病的發病率發揮針對繼發衰老的保護效應來增加肥胖的復原。綜上所述，巖藻黃質/石榴籽油組合物類似熱量限制(CR)飲食的效應。然而，大多數人不太可能愿意在他們整個生存期的大部分時間內保持減少30%的飲食，即使它意味著更多健康的歲月。為此原因，巖藻黃質/石榴籽油組合物作為CR模擬物特別有利，提供與CR相同的有益效果，無須過多節食。不需要大幅度減少食物攝取，巖藻黃質/石榴籽油組合物有利地影響免疫功能和激素概況，尤其是減少葡萄糖/能量流的那些。不受任何理論的約束，本發明人確信巖藻黃質/石榴籽油組合物通過發揮廣泛的調節性自穩機制來增加對衰老過程的抵抗。胰島素抵抗是隨著衰老碳水化合物代謝障礙增加的重要原因之一。這些變化的機制已經部分地被闡明。體力活動的減少和全身尤其是腹部和肝臟脂肪的增加是尤其重要的發病機制。骨骼肌中葡萄糖載體4(GLUT-4)水平和胰島素樣生長因子I (IGF-I)血清水平的變化可以是與脂肪組織無關的機制。可與衰老過程中胰島素抵抗相關的其他機制涉及瘦素和脂聯素血清水平或線粒體能量代謝變化和飲食中高級葡萄糖終產物水平。許多研究提示在高于60歲的人中β細胞功能下降。可以在負荷試驗中尤其是利用延長的靜脈內葡萄糖輸液檢測年齡相關的β細胞功能缺陷。缺陷的機制是胰島素加工、胰島素分泌、胰島素釋放動力學中的異常，同時伴有較低的胰島素分泌能力，不能適當地增加胰島素釋放，以及隨年齡增加的胰島素抵抗。這些致病變化與內臟脂肪沉積的增加和其他機制相關，諸如β細胞結構缺陷，葡萄糖和腸降血糖素感知減弱和復制/再生過程的缺陷性進程。另外，開發脂肪器官的可塑性的可能性，將白色脂肪組織中的白色脂肪細胞轉變成非典型的褐色脂肪細胞并增加它們中的產熱被認為是增加人能量消耗的另一潛在靶標。
實施例I.巖藻黃質/石榴油酸混合物對Sirtl表達的作用細胞培養研究巖藻黃質/石榴油酸混合物對小鼠細胞中Sirtl表達的作用。購自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)(羅克維爾，馬里蘭州)的小鼠3T3-L1前脂肪細胞在補充有2mM谷氨酰胺(GIBCO BRL公司，格蘭島，紐約)，I %青霉素/鏈霉素(10000單位青霉素/mL和IOmg鏈霉素/mL)和10%胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基(Dubecco' s modified Eagle' s medium) (DMEM) (GIBCO BRL 公司)中在 37°C在增濕的5% CO2氣氛中培養。為了使3T3-L1前脂肪細胞分化，將細胞接種至6孔培養板(2X 104/mL)并如上所述進行培養。匯合(定義為第O天)后兩天，細胞在含有I. 7 μ M胰島素、O. 5mM 3-異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)和12. 7 μ M地塞米松(DEX)的分化培養基中在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中孵育48h。然后用含有10% FBS和胰島素(1.7μΜ)且含有或不含有(10、50和100 μ g/mL)巖藻黃質提取物、Xanthigen 或石槽籽油的DMEM更換培養基,并且每兩天更換 為新鮮培養基。12天后，收獲細胞，然后提取總蛋白用于蛋白質印跡分析。在小鼠細胞中Sirtl表達的此研究中使用的巖藻黃質提取物是裙帶菜(Undariapinnatifica)完整植物的提取物。該提取物含有O. 8重量％的巖藻黃質和30重量％的海洋植物油。巖藻黃質提取物的脂肪酸組成示于表2。使用的巖藻黃質提取物可進一步含有(10. Owt. %的棕櫚油。在此研究中使用的石榴籽油含有70wt. %石榴油酸，并且是石榴(Punica granatum)植物的種子的提取物。在此研究中使用的Xanthigen ,即巖藻黃質/石榴油酸混合物，含有50wt. %的巖藻黃質提取物和50wt. %的石榴籽油。通過向在冰上30min的細胞團添加100 μ L金裂解緩沖液(50mM Tris-HCl, pH7. 4 ；ImM NaF ；150mM NaCl ；ImM EGTA ;lmM 苯甲基磺酰氟；I % NP-40 和 10 μ g/mL 亮抑酶肽)，然后以10，OOOXg在4°C離心30min,提取總蛋白進行蛋白質印跡分析。通過Bio-Rad蛋白測定法(Bio-Rad Laboratories,慕尼黑，德國)測量總蛋白。樣品(50yg蛋白)與含有 0.3M Tris-HCKpH 6. 8)，25% 2-巰基乙醇，12%十二烷基硫酸鈉(SDS), 25mM EDTA,20%甘油和0. 1%溴酚藍的5X樣品緩沖液混合。混合物在100°C煮沸5min，并在20mA的恒定電流下加樣至10% SDS-聚丙烯酰胺小型凝膠。電泳后，使用轉移緩沖液將凝膠上的蛋白電轉移至固定膜上(PVDF ；Millipore公司，貝德福德，馬薩諸塞州)，轉移緩沖液由25mMTris-HCl (pH8. 9)，192mM甘氨酸和20%甲醇構成。用含有20mM Tris-HCl的封閉溶液封閉膜，然后用一抗進行免疫印跡，所述一抗包括Sirtl和β_肌動蛋白的抗體(TransductionLaboratories,列克星敦，肯塔基州)。印跡用PBST緩沖液漂洗3次，每次lOmin。然后印跡與辣根過氧化物(HRP)-偶聯二抗(Zymed Laboratories,舊金山，加利福尼亞州)的
I 5000稀釋液孵育，然后再次用PBST緩沖液洗滌3次。轉移的蛋白用增強化學發光檢測試劑盒(ECL ；Amersham Pharmacia Biotech,白金漢郡,英國)顯影。如圖I中所示，與3T3-L1前脂肪細胞相比，在分化的3T3-L1脂肪細胞中Sirtl蛋白的表達顯著降低。另一方面，用巖藻黃質提取物和Xanthigen 處理顯著增加分化的3T3-L1脂肪細胞中的Sirtl蛋白水平，而如表I中所見，用石榴籽油處理沒有作用。對于3T3-L1前脂肪細胞和分化的脂肪細胞的蛋白質印跡結果的比較表明在不添加xanthigen、巖藻黃質或石槽籽油的條件下,3T3-L1前脂肪細胞中的Sirtl水平為分化的脂肪細胞中的Sirtl水平的約280% (2. 8vs. I. O)，如表I中所示。在不添加Xanthigen 、巖藻黃質或石榴籽油時的分化的3T3-L1脂肪細胞在這些實驗中用作對照。對于已經用巖藻黃質處理的分化的3T3-L1脂肪細胞的蛋白質印跡結果表明巖藻黃質將分化的脂肪細胞中的Sirtl水平提高至幾乎前脂肪細胞中的Sirtl水平(2. 4-2. 7vs. 2. 8)。提高的量不依賴劑量(10微克/ml，50微克/ml和100微克/ml得到類似的結果)。對于已經用石榴籽油處理的分化的3T3-L1脂肪細胞的蛋白質印跡結果與使用巖藻黃質所示結果非常不同。用石榴籽油處理實際上抑制分化的3T3-L1脂肪細胞中的Sirtl水平，相對于對照組中的Sirtl水平而言(O. 0-0. 4vs. I. 8)。提高的量似乎是劑量依賴性的(在用10微克/ml石榴籽油處理的細胞中觀察到一些Sirtl活性，而在用50-100微克/ml石榴籽油處理的細胞中觀察不到Sirtl活性)。因此，巖藻黃質和石榴籽油對于分化細胞中的Sirtl激活具有相反的效應。用包含50wt. %裙帶菜提取物(含有0.8wt. %巖藻黃質)和50wt. %石槽籽油的混合物(Xanthigen)處理極大地提高了分化3T3-L1脂肪細胞中的Sirtl水平。用Xanthigen處理的分化脂肪細胞中的Sirtl水平已經增加至前脂肪細胞中的Sirtl水平的220-243%之間(6. 2-6. 8vs. 2. 8)，并且在對照組中的Sirtl水平的6倍之上。提高的量不依賴于劑量(10微克/ml，50微克/ml和100微克/ml得到類似的結果)。
因此，即使巖藻黃質和石榴籽油對分化細胞中的Sirtl激活具有相反的效應，它們的組合比單獨巖藻黃質產生更大的Sirtl激活。此結果是出人意料的，因為單獨的石榴籽油不增強Sirtl水平，反而是抑制Sirtl激活。表I.巖藻黃質/石榴油酸混合物對Sirtl表達的作用
權利要求
1.一種延緩哺乳動物受試者的衰老過程的方法，所述方法包括 激活Sirtuin家族蛋白的至少一個成員，其中所述激活包括 向所述受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述施用包括施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合，其中所述巖藻黃質作為褐色海洋植物提取物的組分被施用。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述施用包括施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合，其中所述石榴油酸作為石榴籽油的組分被施用。
4.根據權利要求I所述的方法，其中所述激活包括激活選自由Sirtl和Sirt3蛋白組成的組的至少一種蛋白質；其中所述激活通過將蛋白質脫乙酰基使細胞進入冬眠狀態。
5.根據權利要求I所述的方法，其中所述激活包括激活選自由Sirt3、Sirt4和Sirt5組成的組的至少一種線粒體蛋白。
6.根據權利要求I所述的方法，其中所述激活進一步包括激活線粒體UCP-I蛋白。
7.根據權利要求I所述的方法，其中所述方法進一步包括使用所述增效組合治療非酒精性脂肪性肝病。
8.根據權利要求I所述的方法，其中所述方法進一步包括使用所述增效組合治療脂肪肝病癥。
9.根據權利要求I所述的方法，其中所述方法進一步包括使用所述增效組合提高能量消耗率。
10.根據權利要求I所述的方法，其中所述方法進一步包括通過使用所述增效組合治療來增加褐色脂肪組織的體積并減小白色脂肪組織的體積。
11.一種延緩哺乳動物受試者的衰老過程的方法，該方法包括 通過將蛋白質脫乙酰基使細胞進入冬眠狀態，其中所述將蛋白質脫乙酰基通過向所述受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合而實現。
12.根據權利要求I所述的方法，其中所述增效組合進一步包含至少一種ω-3脂肪酸。
13.根據權利要求I所述的方法，其中所述增效組合進一步包含來源于褐藻的至少一種ω-3脂肪酸。
14.根據權利要求I所述的方法，其中所述增效組合包含來源于褐藻的巖藻黃質和來源于褐藻的至少一種ω-3脂肪酸。
15.根據權利要求I所述的方法，其中所述增效組合包含合成生成的巖藻黃質和來源于褐藻的至少一種ω-3脂肪酸。
16.根據權利要求I所述的方法，其中所述增效組合包含 巖藻黃質，單獨或聯合海洋褐藻提取物；和 石榴油酸，單獨或聯合石榴籽油。
17.根據權利要求I所述的方法，其中所述增效組合包括 巖藻黃質和石榴油酸的所述增效組合； 其中所述巖藻黃質作為海洋褐藻的至少一種提取物的組分被包含；并且 其中所述石榴油酸作為石榴籽油的組分被包含。
18.根據權利要求I所述的方法，其中所述施用包括向所述受試者局部應用或經胃腸外施用所述增效組合。
19.根據權利要求I所述的方法，其中所述施用包括向所述受試者經口服施用所述增效組合。
20.根據權利要求I所述的方法，其中所述受試者是人。
21.—種改善哺乳動物受試者的身體成分的方法，所述方法包括 激活Sirtuin家族蛋白的至少一個成員，其中所述激活包括 向所述受試者施用有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合。
22.—種激活脂肪組織中的Sirtl的方法，所述方法包括 使所述組織與有效量的巖藻黃質和石榴油酸的增效組合接觸； 其中該增效組合物包含 · 50wt. %的褐色海洋植物提取物，所述提取物包含30wt. %的海洋植物油和0. 5至·5wt. %的巖藻黃質；以及 50wt. %的石榴籽油，所述石榴籽油包含60-80wt. %的石榴油酸。
23.根據權利要求I所述的方法，其中所述提取物包含30wt.%的海洋植物油和·0.8wt. %的巖藻黃質。
全文摘要
巖藻黃質/石榴籽油組合物描述出一種通過激活Sirtuin家族蛋白的至少一個成員從而延緩哺乳動物受試者的衰老過程的方法，其中所述激活步驟包括向所述受試者施用巖藻黃質和石榴油酸的增效組合。Sirtuin酶通過從蛋白質移除乙酰基來發揮其功能。脫乙酰作用導致在細胞代謝中蛋白質作用的失活并且防止基因過表達，從而使細胞進入冬眠狀態并延長其壽命。
文檔編號A61K31/202GK102630161SQ201080052452
公開日2012年8月8日 申請日期2010年9月17日 優先權日2009年9月18日
發明者V·帕德瑪, 保羅·M·弗勞爾曼, 米格爾·希門尼斯·德爾·里奧 申請人:珀利弗諾斯自然有限公司