促進健康的組合物及制備方法

專利名稱：促進健康的組合物及制備方法
促進健康的組合物及制備方法本發明涉及促進健康的產品及其制備方法的領域。變異鏈球菌(Streptococcus mutans)在齲齒發展中扮演關鍵作用。細菌將可發酵糖轉化為有機酸，并因此產生酸性微環境。有機酸能夠使牙釉質去礦物質，并因此造成或促進齲損傷。此外，變異鏈球菌生成非水溶性葡聚糖基質。此葡聚糖基質會支持蝕斑的發展及黏附以及支持變異鏈球菌黏附在牙齒表面上。另外，已顯示在齲損傷中亦經常發現其它細菌，但總是與變異鏈球菌一起。因此，目前認為變異鏈球菌是齲損傷發展所必須。不斷需要能夠防止齲損傷發展的療法。在本文中，本發明旨在表明可作用于變異鏈球菌以避免、停止或減緩齲損傷發展的療法。本發明亦_在表明用于此類療法的制備方法。過去，曾就控制齲損傷測試整個系列療法，特別地為了避免或至少延緩其出現。本領域技術人員特別地熟悉用于控制齲齒及與齲齒相關微生物的傳統化學療法，如它們用于牙膏和/或漱ロ劑和/或其它牙齒保健產品中。然而，另外亦嘗試通過其它微生物或其產品控制與齲相關的微生物，特別地已嘗試減少它們在牙齒上或在口腔中的量，或影響生齲性。 此類方法描述于例如W02006/027^5 Al中。然而，缺點在于消費者通常不喜歡或立法者完全禁止口腔保健產品中使用活微生物。此外，活微生物可能因代謝物而影響含有其的產品的ロ感和/或外觀；此影響可能不是用于控制齲損傷的每ー種產品所期望的。此外，在設計用于控制齲損傷的產品中的活生物的用途限制所述產品的架存期。因此，多種技術領域中非常普遍嘗試使用無代謝活性的微生物(特別地凍干微生物)而不是活微生物。然而，現在的問題是此類微生物在適合它們的條件下(例如當其進入合適的水性介質中時)，可能回復至代謝活性狀態。因此，無代謝活性微生物的用途需要嚴格限制含有它們的產品的可能的組成。因此，已在完全不同技術領域中嘗試用已破壞的微生物而不是活的或代謝活性微生物制備產品。因此，例如WO 01/95741 Al顯示用于促進腸內平衡的食物，該食物產品包含無活力的乳桿菌(LactcAacillus)。通過熱處理，例如通過巴斯德消毒法或殺菌法，能夠使乳桿菌無活力。然而，所述文獻亦提及由熱處理造成的損失微生物的ー些健康促進作用的風險，否則所述健康促進作用能夠實現。雖然文獻指出能夠“選擇性”去除這些健康促進作用，但實質上文獻并未教導在熱處理微生物期間如何能避免損失所需健康促進作用的任何內容。因此鑒于所述文獻，本領域技術人員不能夠以有意義方式預測或猜測何種健康促進作用會因微生物的熱處理而損失及何種不會。特別地，不能夠預測或估計抗生齲性作用是否因熱處理而失去。因此，本發明目的是表明用于控制齲損傷的療法，特別地用于避免或延緩齲損傷的發展的療法。特別地，期望保證療法帶來所需效果。期望其制備簡單并廉價，且如果可能， 避免以上所述缺點或將其減至較低程度。因此，根據本發明，提出生產對變異鏈球菌具有特異性結合能力的非活性乳桿菌制劑的方法，所述方法包括以下步驟i)將對變異鏈球菌具有特異性結合能力的乳桿菌或乳桿菌混合物的細胞的懸浮液，以0. 5至2°C /分鐘的溫度變化，從低于40°C的起始溫度加熱至75至85°C的巴斯德消毒溫度，其中特異性結合
a)耐受熱處理和/或
b)耐受蛋白酶處理和/或C)是鈣-依賴性的和/或d)發生在介于4. 5及8.5間的pH范圍，和/或e)在唾液存在下發生，ii)將溫熱懸浮液在巴斯德消毒溫度下保持20至40分鐘的時間，iii)將步驟ii)中保持的懸浮液以0. 5至2°C /分鐘的溫度變化冷卻至低于40°C 的最終溫度。在WO 2006/027265 Al中公開了此類乳桿菌，為本發明的公開內容的目的，將所述文獻全部內容以引用的方式并入本文中。令人驚奇的是，已顯示在根據本發明方法的步驟中描述的溫和條件下的通過巴斯德消毒的手段，通過根據本發明所選擇的乳桿菌能夠成功制備完全或基本沒有活的、代謝活性的乳桿菌微生物，但仍對變異鏈球菌具有特異性結合能力的制劑。因此，根據本發明制備的制劑適合于發揮抗生齲性作用，并因此作為預防和/或處理齲的療法是有用的。術語 “齲”及“齲損傷”能夠在本發明范圍中互換使用且指特征在于在牙齒上或牙齒中發展的軟化斑，并進行性地導致牙齒壞死的慢性感染病。通過已知方法能夠診斷齲；本領域技術人員能夠就此目的參照例如 Angmar-Mansson 與 tenBosch 的論文，Adv. Dent. Res. 7 (1993)，70 至79。就本發明目的而言，術語“控制齲”或“控制齲損傷”包括齲的預防。因此，口腔中應沒有變異鏈球菌的人亦可因此而從根據本發明制備的其它組合物受益，只要這些組合物結合隨機引入的變異鏈球菌細胞并以此方式促進后者的移除。就本發明的目的而言，術語“齲的治療”亦包括向罹患齲的患者施用根據本發明制備的組合物，用于減少變異鏈球菌細胞的數量的目的，及如果是合適的，用于完全去除來自口中，特別地來自包括牙齒及牙齒間空隙的整個口腔的變異鏈球菌的目的。至于結合變異鏈球菌的能力，根據本發明所選擇的微生物是高度熱穩定的。這允許維持而不會失去WO 2006/027265 Al中所描述的活的乳桿菌細胞的結合變異鏈球菌的健康促進作用，甚至在根據本發明的巴斯德消毒后。此點特別不尋常，因為對于微生物原則上預期巴斯德消毒吋，微生物的大量(例如)蛋白質將變性，及其它細胞成份會溶解或破壞， 以致微生物的健康促進作用通常在巴斯德消毒后喪失。事實上，以上所提及的W001/95741 Al僅顯示盡管經過巴斯德消毒，對于某些乳桿菌仍可能維持對腸道菌群的健康促進作用。 然而，就結構、含量及用途而言，口腔完全不同于腸道，因此本領域技術人員無法將最后提及文件的發現應用于本發明。因此，根據本發明的其它方面，指示對變異鏈球菌具有特異性結合能力的乳桿菌組合物，該組合物通過根據本發明的制備方法是可獲得的或得到。此類組合物實現根據本發明的制備方法的以上所述優點，特別地其適用于制備供人身體使用的抗生齲性產品。乳桿菌細胞優選地選自類干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)菌株細胞或這些的混合物。因此用乳桿菌菌株，特別地類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的菌株的純培養物懸浮液，但也用兩種、三種、四種、五種、六種、 七種或更多種菌株的混合物能夠進行根據本發明的制備方法。對于根據本發明方法特別優選的是W02006/027^5 Al中說明的乳桿菌屬種及菌株，特別地具有以下DSMZ編號之一的那些DSMZ16667、DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670, DSMZ 16671, DSMZ 16672 及 DSMZ 16673，每ー個于2004年8月26日保存于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen,Mascheroder Weg lb, Brunswick,德國)。至チ在本發明范圍中提及的乳桿菌細胞，此至少優選地理解為意指剛才所提及菌株及兩種、三種、四種、五種、六種或七種上述菌株的混合物的細胞。本領域技術人員將理解，除以上所提及的菌株中的ー種的細胞外，在根據本發明方法中亦能夠采用突變體或衍生細胞系，該突變體或衍生細胞保留特異性結合變異鏈球菌的能力。乳桿菌細胞優選地具有對血清型c (DSMZ 20523)和/或血清型e (NCTC10923)和 /或血清型F(NCTC 11060)變異鏈球菌的特異性結合能力。突變體，特別地以上所提到的乳桿菌菌株中的ー種的突變體，具有一或多種永久可遺傳修飾，通常為其核酸的修飾。此類修飾通常亦涵蓋諸如轉換或顛換的點突變， 但亦包括核酸的ー個或多個堿基的缺失、插入及添加，由此修飾核酸并導致偏離正常情況的基因產物的基因表達和/或轉錄和/或翻譯，或失活。突變能夠自發地發生或另外由諸如，例如化學劑的活性劑或輻射的作用引發。選擇及獲得突變體及衍生細胞系的萬法在例如 Sambrook, "Molecularc丄oning, a laooratory manual，，，Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (2001)中及 Ausubel, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience NY, (1989)中所描述。 技術人員能夠在WO 2006/027265 Al中發現其它信息。就本發明的目的而言，“特異性結合”或“特異性結合能力”是針對變異鏈球菌而言，意指根據本發明所用的乳桿菌細胞，或根據本發明經過巴斯德消毒的細胞與變異鏈球菌結合，但并不會與通常大量出現在口腔中的大多數或全部的剰余的微生物結合。根據本發明所選擇的微生物優選地不與唾液鏈球菌(Str印tococcus salivarius)、唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcus salivarius thermophilusノ、口腔鏈球囷(Streptococcus oralis)、緩征鏈球菌(Streptococcus mitis)禾ロ/或血鏈球囷(Streptococcus sanguinis)結合。根據本發明所用的乳桿菌細胞優選地不與唾液鏈球菌嗜熱亞種API 50CH(Streptococcus salivarius ssp. thermophilus API 50CH, Biomerieux,法國)、ロ 腔鏈球菌DSMZ 20066、口腔鏈球菌DSMZ 20395、口腔鏈球菌DSMZ 20627、緩癥鏈球菌DSMZ U643和/或血鏈球菌DSMZ 20567結合。當根據本發明所用的乳桿菌細胞不與鏈球菌屬以外的屬的細菌結合時(亦即例如不與葡萄球菌屬的細胞結合吋)其同樣是優選的。特別優選地，它們不與表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis) DSMZ 1798和/或表皮葡萄球菌DSMZ 20044結合。為測試結合能力，本領域技術人員可如W02006/027^5 Al中所述進行處理，通過將以上所提及細菌與根據本發明所選擇的乳桿菌，或根據本發明經過巴斯德消毒的它們的剰余物，以3:1的體積比混合，并觀察由乳桿菌造成的任何凝集。適宜方法述于以上所提及的WO說明書的實施例3中。因此，優選的是根據本發明的方法，其中在第一步驟中，將ー或多種優選的乳桿菌菌株，特別地如上所述的類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌及優選的菌株DSMZ 16667、DSMZ16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、DSMZ16671、DSMZ 16672 及 DSMZ 16673 中的一或多種及特別優選地至少DSM16671和/或一種突變體或衍生細胞系的細胞，在懸浮液中以從0. 5至 2°C的溫度變化，從低于40°C的起始溫度加熱至從75至85°C的巴斯德消毒溫度；在第二步驟中，將其維持于巴斯德消毒溫度下20至40分鐘(巴斯德消毒時間)且其中在隨后第三步驟中，使懸浮液以從0. 5至2°C的溫度變化冷卻至低于40°C的最終溫度。在步驟i)中的巴斯德溫度優選78至80°C，特別優選80°C。以此巴斯德消毒溫度， 快速并因此節能而安全地實現破壞根據本發明選擇的乳桿菌細胞，同時相較于活乳桿菌細胞的非巴斯德消毒培養物損失很少結合能力。巴斯德消毒時間優選25至35分鐘且特別優選30分鐘。已顯示特別地相較于乳桿菌細胞的活培養物，用78至80°C (優選80°C)的巴斯德消毒溫度，快速破壞根據本發明所選擇的乳桿菌細胞與變異鏈球菌的結合能力的較小的損失的組合是可能的。當步驟i)或iii)中的溫度變化是0. 8至1. 2°C每分鐘，優選1°C /分鐘時，其同樣是優選的。以此方式，能夠有利地保持在短時間內升溫達到巴斯德消毒溫度，以節省能量， 從而沒有破壞乳桿菌細胞或不得不接受變異鏈球菌結合能力的大量損失的風險。特別優選也是根據本發明的方法，其中在第一步驟中，將ー或多種優選的乳桿菌菌株，特別地如上所述的類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌及優選的菌株DSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、DSMZ16671、DSMZ 16672 及 DSMZ 16673 中的一或多種及特別優選地至少DSM16671和/或一種突變體或衍生細胞系的細胞在懸浮液中以0. 8至 1. 2°C，優選的1で的溫度變化，從40°C以下的起始溫度加熱至從78至80°C，優選80。C的巴斯德消毒溫度；在第二步驟中，將其維持于巴斯德消毒溫度下25至35分鐘(巴斯德消毒時間)且其中在隨后第三步驟中，將該懸浮液以從0. 8至1. 2°C，優選1°C的溫度變化冷卻至低于40°C的最終溫度。根據本發明巴斯德消毒的細胞優選地是在后指數生長期。在根據本發明的制備方法的步驟i)中，特別優選使用來自起初允許指數生長，但其中葡萄糖濃度降至不大于ImM 葡萄糖的數值的培養基的細胞。此處，優選使用其葡萄糖濃度已降至不大于ImM葡萄糖的數值不超過Ih的細胞，否則根據本發明制備方法的產物(即步驟iii的結果)，如合適，如下文所描述的洗滌步驟或噴霧干燥步驟的產物的特異性結合變異鏈球菌的能力將開始喪失。此外，根據本發明的方法優選地包括洗滌步驟，其中使步驟(iii)獲得的懸浮液離心，以濃縮巴斯德消毒的細胞，用水處理因此得到的濃縮細胞，并再次離心，以再次濃縮細胞。所得濃縮細胞是作為干物質含量為10至30% (以重量計)，優選地從18至22% (以重量計)的物質存在。根據本發明特別優選的方法是此類方法，所述方法除了步驟i)及iii)以外(特別地應用于上文描述的乳桿菌菌株DSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、 DSMZ 16671、DSMZ 16672及DSMZ 16673或突變體或細胞系或類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的菌株中的ー種，或兩種、三種、四種、五種、六種或七種的混合物)及如果合適洗滌以外，包括以下步驟iv)處理步驟iii)所獲得的懸浮液，優選地以用于制備噴霧干燥混合物的載體洗滌，載體選自由堿金屬硫酸鹽及堿土金屬硫酸鹽，優選地硫酸鈉、硫酸鉀或硫酸鈣及這些硫酸鹽的兩種或多種的混合物，選擇的載體的量使得噴霧干燥混合物的干物質含量達10至30% (以重量計)，及ν)步驟iv)所得到的噴霧干燥混合物的噴霧干燥。噴霧干燥法是使待干燥的物質暴露于極其嚴苛條件且特別地達例如70°C至 200°C的溫度。即使從根據本發明所選擇的乳桿菌細胞中亦無法知道它們是否能承受噴霧干燥期間的嚴苛條件而不顯著損失對變異鏈球菌的特異性結合能力。而且，根據本發明在步驟iv)中使用大量載體吋，原本預期負責進ー步結合變異鏈球菌的乳桿菌表面的結構將被變性或損壞。令人驚奇的是，現已顯示在所選擇的條件下步驟iii)中所得的懸浮液的噴霧干燥而基本不損失對變異鏈球菌的結合能力是可能的。根據本發明的噴霧干燥及根據本發明制備的噴霧干燥的組合物的ー些優點因而特別值得注意相較于簡單的巴斯德消毒法，根據本發明的噴霧干燥允許獲得非粘性或吸濕性的組合物。在本文內容中，吸濕性意指在20°C的溫度及50%的相対濕度下露天儲存12 個月時間，組合物的重量増加不超過2%。因此，根據本發明制備的組合物因而特別適用于在干燥產品中加工；其將不會因吸收水或特別地黏性而不利地影響這些產品的性質。此外，根據本發明的制備方法使得能夠制備自由流動的根據本發明的組合物。能夠特別容易地貯存和加工顆粒狀的、自由流動的組合物，且能夠將它們摻入很多種產品中同時能夠非常精確地量取劑量。因此，相較于步驟iii)后直接獲得的懸浮液，通過根據本發明的噴霧干燥方法獲得的根據本發明的組合物能夠以經濟重要的規模摻入更廣泛的產
ロロ丨曰ψ ο步驟iv)中的特別優選的載體是硫酸鈉。載體(特別優選硫酸鈉)的量優選為步驟iii)所采用懸浮液的干物質的倍數。用于步驟ν)噴霧干燥的噴霧干燥混合物在此情況下將含有約20% (以重量計)的總干燥物質。 優選在從180至250°C的用于干燥的噴霧干燥氣體的氣體進ロ溫度及來自從70至 100°C，優選85°C的用于干燥的區域(通常為噴霧塔)的氣體出口溫度下，在欲干燥的物質的噴霧干燥氣體的反應區中的平均滯留時間為從10至60秒，優選20至40秒下進行步驟 ν)的噴霧干燥。此外，本領域技術人員能夠進ー步自提供于WO 01/25411 Al中的信息取得關于噴霧干燥的指導。此文獻通常描述適用于制備噴霧干燥的酶產品的噴霧干燥方法。令人驚奇的是，現已顯示即使在根據本發明優選的更高溫度下進行噴霧干燥而基本不損失對變異鏈球菌的結合能力是可能的。這無法由W001/2M11 Al預期，特別地由于所述文獻未描述巴斯德消毒后操作噴霧干燥步驟的單個實例且由于本領域技術人員認為文獻關于噴霧干燥對于其所主張的極多種類別酶的適合性是推測性的。因此，根據本發明的特別優選的方法是這樣的ー種方法，其中(i)在第一步驟中，將ー或多種優選的乳桿菌菌株，特別地類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌及優選如上所述的菌株 DSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ 16670、DSMZ 16671、DSMZ 16672及DSMZ 16673中的ー種或多種且特別優選至少DSM 16671和/或在后指數生長期中的一種突變體或衍生細胞系的細胞，在懸浮液中以從0. 8至1. 2°C，優選1°C 的溫度變化，從低于40°C的起始溫度加熱至從78至80°C，優選80°C的巴斯德消毒溫度，及隨后，(ii)在巴斯德溫度下將懸浮液維持25至35分鐘，且優選30分鐘，及隨后，(iii)將懸浮液以0. 8至1. 2°C，優選1°C的溫度變化冷卻至低于40°C的最終溫度，隨后如上所述以水洗滌并通過離心得到從10至30% (以重量計)，優選從18至22% (以重量計)的干燥物質含量，及隨后，(iv)以用于制備噴霧干燥混合物的載體處理懸浮液，載體是選自硫酸鈉、硫酸鉀及硫酸鈣及其中兩種或多種的混合物，且特別優選硫酸鈉，選擇載體用量使得噴霧干燥混合物的干燥物質含量為從10至30% (以重量計)，及隨后，(ν)由步驟(iv)中得到的含有載體的懸浮液進行噴霧干燥，所述噴霧干燥是在從 180至250°C的用于干燥的噴霧干燥氣體的氣體進ロ溫度及從70至100°C，優選85°C的用于干燥的區域(通常噴霧塔)的氣體出ロ溫度下，在欲干燥的物質的噴霧干燥氣體的反應區域中的平均滯留時間為從10至60秒，優選從20至40秒下進行。此方法實現本發明的以上所述優點。根據本發明的乳桿菌組合物具有對變異鏈球菌的特異性結合能力，通過步驟i) 至iii)及任選地iv)至ν)的方法能夠獲得或已得到的該組合物被優選地摻入用于人體中的產品。當用于人體，特別地通過引入口腔和/或與牙齒接觸吋，實際可能使用根據本發明的組合物實施齲預防。根據本發明的產品方便地包含根據本發明的組合物，其量足以與變異鏈球菌結合和/或獲得抗生齲性作用。此量取決于所述產品性質及其藥學型式。特別地，該量亦取決干與變異鏈球菌可能的結合或可能的抗生齲性作用的特定所需程度。取決于產品，本領域技術人員通過常規實驗手段將輕易確定滿足作用的所需程度、產品性質及藥學型式的根據本發明組合物的量。特別地，本領域技術人員將考慮到能夠用根據本發明組合物涂覆的或能夠通過混合摻入此組合物的產品。 根據本發明的產品優選地選自食品產品，包括高檔食品產品、飲料產品、半成品、 口腔衛生產品、化妝產品及醫藥產品。相關產品描述于W02006/027^5 Al中。特別優選的產品是ロ香糖、牙膏、漱ロ劑及錠劑。以下參照實施例描述本發明，但該等實施例并不旨在限制權利要求的保護范圍。實施例1: 一般制備方法在37°C下，于適宜水性營養培養基中培養具有對變異鏈球菌的特異性結合能力的乳桿菌細胞，其中特異性結合a)耐受熱處理和/或b)耐受蛋白酶處理和/或C)是鈣依賴性的和/或d)在介于4. 5及8.5間的pH范圍中發生，和/或e)在唾液存在下發生，適宜營養培養基含有葡萄糖、酵母提取物、TweenSO及鹽類。以補料分批操作呈水性懸浮液培養。一旦營養培養基的葡葡糖含量降至ImM以下，或此時間點后至多1小時，則將懸浮液加熱至從75至85°C，優選地從78至80°C的巴斯德消毒溫度。在本文內容中，以從0. 5 至1. 2°C /分鐘，優選從0. 8至1. 2°C /分鐘的溫度變化加熱該懸浮液。將熱懸浮液維持于巴斯德消毒溫度20至40分鐘，優選25至35分鐘且特別優選 30分鐘。
隨后將懸浮液冷卻至40°C以下。在本文內容中，溫度變化為從0. 5至2°C /分鐘， 優選從0.8至1.2°C /分鐘。隨后通過離心將冷懸浮液濃縮至從10至30% (以重量計)的干物質含量。將如此獲得的濃縮物重懸浮于水中并通過離心再次濃縮至從10至30% (以重量計)的干物質含量。 總共進行至多8次的重懸浮與濃縮。最后，獲得干物質含量為從10至30% (以重量計)的經洗滌的生物量。如實施例開始所述，生物量仍保留對變異鏈球菌的特異性結合能力。生物量本身可被摻入食品中，包括高檔食品、飲料、半成品、口腔衛生產品、化妝產品或醫藥產品中，為使產品能夠控制齲或支持先前已經存在的控制齲的能力。實施例2: 口腔保健組合物的制備如實施例1中所描述地培養、巴斯德消毒并且洗滌根據本發明已定義的對變異鏈球菌具有特異性結合能力的類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的培養物。巴斯德消毒溫度是 80°C。巴斯德消毒時間是30分鐘。在每ー情況下溫度變化為從0.8至1.2°C/分鐘。通過添加水重懸浮第一次離心后得到的濃縮的懸浮液，形成干物質含量為5% (以重量計)的重懸浮液。將如此獲得的重懸浮液再次離心至干物質含量降至20% (以重量計)。用水性載體及調味劑處理如此獲得的經洗滌及濃縮的生物量。此得到用于控制齲的漱ロ液。以相同方式，獲得用 DSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ 16669、DSMZ16670、DSMZ 1667UDSMZ 16672或DSMZ 16673制備的經洗滌及濃縮的生物量。在每ー情況下同樣地用水性載體及調味劑處理此生物量以在每一情況下得到用于控制齲的漱ロ液。 通過將各種經洗滌及濃縮的生物量摻入ロ香糖基質、牙膏基質及錠劑基質中，并添加所需調味劑，生產用于控制齲的ロ香糖、牙膏及錠劑，而非漱ロ劑。實施例3 一般的噴霧干燥方法通過制備水性10至30%強度堿金屬和/或堿土金屬硫酸鹽溶液制備基本噴霧干燥溶液。將如實施例1所述獲得的經洗滌及濃縮的生物量重懸浮于四倍量的基本噴霧干燥溶液中，形成噴霧干燥混合物，以便從100単位體積生物量獲得500単位體積的噴霧干燥混合物。通過將噴霧干燥混合物引入噴霧干燥塔中進行噴霧干燥。在該噴霧干燥塔中填裝噴霧干燥氣體，該噴霧干燥氣體具有180至250°C的進入噴霧干燥塔的進ロ溫度及從70至 100°C的來自噴霧干燥塔的出ロ溫度。噴霧干燥混合物在該噴霧干燥塔中的平均滯留時間不超過60秒。如實施例1開始所述，所獲得的噴霧干燥的物質仍保留對變異鏈球菌的特異性結合能力。獲得的噴霧干燥物質本身可被摻入食品中，包括高檔食品的食品、飲料、半成品、ロ 腔衛生產品、化妝產品或醫藥產品，為使產品能夠控制齲或支持先前已經存在的控制齲的能力。實施例4 制備其它ロ腔保健組合物如實施例1中所描述地培養、巴斯德消毒并且洗滌根據本發明已定義的對變異鏈球菌具有特異性結合能力的類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌的培養物。巴斯德消毒溫度是 80°C。巴斯德消毒時間是30分鐘。在每ー情況下溫度變化為從0.8至1.2°C/分鐘。通過添加水重懸浮第一次離心后得到的濃縮的懸浮液，形成干物質含量為5% (以重量計)的重懸浮液。將如此獲得的重懸浮液再次離心至干物質含量降至20% (以重量計)。如實施例3所述的噴霧干燥方法隨后噴霧干燥重懸浮液。基本噴霧干燥溶液是 20%強度的硫酸鈉水溶液。進入噴霧塔中的噴霧干燥氣體的進ロ溫度是180-250°C。來自該噴霧塔的噴霧干燥氣體的出口溫度是70-100°C。在噴霧塔中噴霧干燥混合物的平均滯留時間是10秒。由此得到噴霧干燥物質。用水性載體及調味劑處理噴霧干燥物質。由此得到控制齲的漱ロ液。以相同方式，用 DSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ16669、DSMZ16670、DSMZ 16671、 DSMZ 16672或DSMZ 16673制備噴霧干燥物質。此物質同樣亦用水性載體及調味劑處理，以在每種情況下獲得控制齲的漱ロ液。通過將各物質摻入口香糖基質、牙膏基質及錠劑基質中并添加所需調味劑，生產控制齲的ロ香糖、牙膏及錠劑，而不是漱ロ液。
1權利要求
1.生產對變異鏈球菌具有特異性結合能力的非活性乳桿菌(Lactobacillus)組合物的方法，所述方法包括以下步驟i)將對變異鏈球菌具有特異性結合能力的乳桿菌或乳桿菌混合物的細胞的懸浮液以 0. 5至2°C /分鐘的溫度變化，從低于40°C的起始溫度加熱至75至85°C的巴斯德消毒溫度， 其中特異性結合a)耐受熱處理和/或b)耐受蛋白酶處理和/或c)是鈣-依賴性的和/或d)發生在介于4.5及8. 5間的pH范圍，和/或e)在唾液存在下發生， )將溫熱的懸浮液維持于巴斯德消毒溫度達20至40分鐘的時間，iii)將維持于步驟ii)的懸浮液以0.5至2°C/分鐘的溫度變化冷卻至低于40°C的最終溫度。
2.根據權利要求1的方法，其中乳桿菌細胞選自類干酪乳桿菌(LactcAacillus paracasei)、鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)或這些的混合物的菌株細胞。
3.根據權利要求2的方法，其中所述乳桿菌細胞選自類干酪乳桿菌或鼠李糖乳桿菌， 優選具有 DSMZ 號 DSMZ 16667、DSMZ 16668、DSMZ16669、DSMZ 16670、DSMZ 16671、DSMZ 16672及DSMZ 16673中的一種，或其突變體或衍生細胞系，所述突變體或衍生細胞系仍保留對變異鏈球菌的特異性結合能力。
4.根據前述權利要求中任ー項的方法，其中所述乳桿菌細胞具有對變異鏈球菌血清型 c (DSMZ 20523)和/或血清型e (NCTC 10923)和/或血清型F(NCTC 11060)的特異性結合能力。
5.根據前述權利要求中任ー項的方法，其中步驟i)的巴斯德消毒溫度是從78至 80 0C ο
6.根據前述權利要求中任ー項的方法，其中步驟i)和/或iii)的溫度變化是從0.8 至1.2°C /分鐘。
7.根據前述權利要求中任ー項的方法，其中步驟i)的懸浮液的介質包含不超過 IOmmol葡萄糖/升。
8.根據前述權利要求中任ー項的方法，其進ー步包括以下步驟(i v)用載體處理步驟iii)中所獲得的懸浮液以制備噴霧干燥混合物，所述載體選自堿金屬硫酸鹽及堿土金屬硫酸鹽，所選擇載體的量使得噴霧干燥懸浮液的干物質含量達到以重量計10至30%，(ν)噴霧干燥步驟iv)中所獲得的噴霧干燥混合物。
9.根據權利要求8的方法，其中噴霧干燥是在從180至250°C的用于干燥的噴霧干燥氣體的氣體進ロ溫度及從70至100°C，優選85°C的來自用于干燥的區域，通常噴霧塔的氣體出ロ溫度下，及反應區域中欲干燥的物質的噴霧干燥氣體的平均滯留時間從10至60秒， 優選從20至40秒下實現。
10.對變異鏈球菌具有特異性結合能力的乳桿菌組合物，其根據權利要求1-9中任一項的方法能夠獲得或已獲得。
11.用于人體的產品，其中所述產品包含根據權利要求10的乳桿菌組合物。
12.根據權利要求11的產品，其選自食品，包括高檔食品產品、飲料產品、半成品、口腔衛生產品、化妝產品及醫藥產品。
13.根據權利要求10的乳桿菌組合物在制備用于人體的抗生齲性產品中的用途。
14.用于齲預防和/或從人口腔移除變異鏈球菌的方法，所述方法包括將根據權利要求10的組合物和/或根據權利要求11至12的任一項的產品與人口腔接觸的步驟。
全文摘要
本發明涉及健康促進組合物及它們的制備方法的領域。
文檔編號A61K35/74GK102595937SQ201080050818
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月11日 優先權日2009年11月10日
發明者B·庫珀 申請人:巴斯夫歐洲公司