專利名稱：Hbv反義抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及可用于調節基因表達并從而治療疾病的反義寡核苷酸，特別是用于治療動物(包括人類)的こ型肝炎病毒(HBV)和こ型肝炎病毒相關病癥的反義寡聚體。更具體地，本發明的實施方案涉及用于治療動物的HBV的具有修飾的核苷的反義寡聚體，更具體地，所述反義寡聚體包含具有2' 0-4' C-亞甲基橋接的糖類的核苷和具有本文另外所述的其它橋接的糖類的核苷，也稱作鎖定的核酸(LNA)，其用于治療動物的HBV，更具體地，用于治療人類的HBV。
背景技術：
こ型肝炎是腸胃外地(通過污染物，諸如血液和血液制品、污染的針頭)、性地傳播 的病毒病，并從受感染的或攜帯者母體垂直傳播給她們的后代。在世界上該疾病通常是垂直傳播的那些地區中，在低年齡時產生高比例的受感染個體，變成こ型肝炎的慢性攜帯者。據世界衛生組織估計，世界上超過20億人已經被感染，毎年有約400萬急性病例，毎年有100萬人死亡，有3. 5-4億慢性攜帯者。大約25%的攜帯者死于慢性肝炎、肝硬化或肝癌，幾乎75%的慢性攜帯者是亞洲人。こ型肝炎病毒是僅次于煙草的第二最重要的致癌物，造成所有原發性肝癌中的60%-80%。HBV的傳染性是HIV的100倍。こ型肝炎病毒感染是ー個持續的醫學問題，這是因為，象任何快速復制的傳染物一祥，存在持續的突變，所述突變幫助HBV的一些亞群變成耐受現有的治療方案。在目前，沒有用于治療受到HBV感染的人的有效治療劑，它們在體內產生對病毒的血清轉換，或它們在遭受こ型肝炎病毒感染的人中實現抗原的90%減少(與治療之前的基線數目相比)。目前，美國肝臟病研究協會(AASLD)和歐洲肝臟研究協會(EASL)推薦的慢性HBV感染的治療劑包括干擾素a (INF α )、聚こニ醇化的干擾素a _2a (Peg_IFN2a)、恩替卡韋和替諾福韋。但是，典型的干擾素療法是48周，并產生嚴重的且使人厭惡的副作用，且在已經停止治療以后24周，HBeAg血清轉換范圍是僅27_36%。HBsAg的血清轉換甚至更低——在治療停止以后立即觀察到僅3%，在5年后向上增加至12%。核苷和核苷酸治療劑恩替卡韋和替諾福韋可成功地減少病毒載量，但是HBeAg血清轉換率和HBsAg損失率甚至低于使用IFNa治療劑得到的相應值。也使用其它類似的治療劑，包括拉米夫定(3TC)、替比夫定(LdT)和阿德福韋，但是對于核苷/核苷酸治療劑，一般而言，抗藥性的出現會限制治療效果。因而，本領域需要發現和開發新的抗病毒治療劑。更具體地，需要新的抗-HBV治療劑，其能夠增加HBeAg和HBsAg血清轉換率。這些血清標志物會指示HBV感染的免疫學控制，并導致提高的預后，即肝病的預防和向肝硬化的進展、肝衰竭的預防、肝細胞癌(HCC)的預防、肝病有關的移植的預防和死亡的預防。最近的臨床研究已經發現了血清轉換與HBeAg的降低(Fried等人(2008)Hepatology 47:428)和 HBsAg 的降低(Moucari 等人(2009) Hepatology 49:1151)之間的關聯。抗原水平的降低可能已經允許HBV感染的免疫學控制，因為認為高水平的抗原會誘發免疫耐受性。目前用于HBV的核苷療法能夠急劇降低HBV的血清水平，但是對HBeAg和HBsAg水平幾乎沒有影響。反義療法與核苷療法的差別在于，它可以直接地靶向抗原的轉錄物，從而降低血清HBeAg和HBsAg水平。因為在HBV感染后產生多個重疊的轉錄物，也存在單個反義寡聚體減少HBV DNA (除了 HBeAg和HBsAg 二者以外)的機會。反義療法是遺傳障礙或感染的一種治療形式。當已知特定基因的遺傳序列是特別疾病的原因時，無論所述基因是原始哺乳動物基因、癌基因，還是來自傳染性生物體的基因(諸如來自細菌物種的基因、來自真菌的基因、來自寄生物的基因或來自病毒的基因)，可能合成核酸(DNA、RNA或化學類似物)的鏈，所述鏈會結合由所述基因產生的信使RNA (mRNA)并滅活它，從而有效地將該基因“關閉”。這是因為，mRNA必須單鏈化才能被翻譯。或者，所述鏈可能靶向結合前-mRNA上的剪接位點，并修飾mRNA的外顯子內容物[I]。如果具有相同序列(例外是，RNA中的U對應DNA中的T)的RNA形式被翻譯成或可翻譯成蛋白，DNA單鏈序列經常被稱作有義鏈(或正(+ )義鏈)，互補鏈被稱作反義鏈(或負(_)義鏈)。 在DNA雙鏈內的有些區域編碼基因(它們經常是指定表達的或翻譯的蛋白中的氨基酸次序的指令)以及調節序列、剪接位點、非編碼內含子和其它區域。對于要表達由DNA編碼的蛋白的細胞，DNA的一條鏈充當用于合成RNA的互補鏈的模板。模板DNA鏈被稱作轉錄鏈，它的序列與mRNA轉錄物互補或成反義，其具有與原始雙鏈DNA的有義序列相同的序列。因為DNA是雙鏈的，與反義序列互補的鏈被稱作非轉錄鏈或有義鏈，且具有與mRNA轉錄物相同的序列(例外是，DNA序列中的T核苷堿基被RNA序列中的U核苷堿基替代)。與從DNA轉錄的RNA互補的核酸被稱作“反義”寡核苷酸，因為它的堿基序列與基因的信使RNA (mRNA，S卩“有義”序列)互補。因而，具有5’-AAGGTC-3’的有義序列的DNA編碼區會被轉錄生成具有5’ -AAGGUC-3’的有義序列的mRNA，所以所述有義序列的反義寡聚體會具有序列3’ -UUCCAG-5’(如果它包含RNA核苷堿基)或3’_TTCCAG_5’(如果所述反義寡聚體包含DNA核苷堿基)。目前，反義療法的主要焦點涉及長度為大約20個核苷酸/核苷的寡聚體或寡核苷酸的應用，所述寡聚體或寡核苷酸合成為與負責靶蛋白的表達或翻譯的特定“有義”(5’至3’方向)DNA或mRNA序列互補。在導入細胞中以后，所述反義寡核苷酸會通過Watson-Crick結合與它的對應mRNA序列雜交，形成異源雙鏈體。形成雙鏈體以后，由結合的mRNA的序列編碼的蛋白的翻譯受到抑制。存在寡核苷酸/mRNA雙鏈體阻礙后續翻譯的幾種機理。幾種不同的反義劑的被最廣泛地接受的解釋涉及涉及遍在酶RNA酶H對異源雙鏈體中的mRNA的降解。RNA酶H被吸引至異源雙鏈體，并切割結合的mRNA，同時保持寡核苷酸序列完整，這允許所述寡核苷酸繼續尋找和結合對應的mRNA序列。通過反義療法(其可以單獨地發生，或與RNA酶H活性結合地發生)實現的翻譯抑制的一些其它被接受的解釋包括、但不限于阻斷適當的核糖體裝配(這使得核糖體復合物失去翻譯能力)、阻斷RNA剪接和/或阻礙mRNA的適當輸出。被生物體用于控制基因表達(通過限制翻譯)的表面上単獨的方式稱作基因干擾，其涉及“沉默”祀基因的短RNA序列的采用。這些短RNA序列稱作小干擾RNA或siRNA。RNA干擾是ー個古老的遺傳過程，其中可以關閉靶向的基因，即生產某些蛋白的“藍圖”。已知稱作Dicer的酶在RNA干擾中起關鍵作用。Dicer是ー種核糖核酸酶,其識別雙鏈RNA分子，并將它們切割成約20-25個核苷酸長的短dsRNA，所述短dsRNA通常具有在3’末端上的雙堿基突出端。由Dicer產生的小dsRNA片段然后同化成大多蛋白復合物，它們引導dsRNA分子到達細胞中的目標地，在這里它們結合它們的靶mRNA序列并關閉基因。該復合物稱作RNA誘導的沉默復合物(RISC)。RISC具有ー種催化組分argonaute，它是在mRNA的序列與siRNA引導鏈的序列互補的情況下能夠降解信使RNA (mRNA)的內切核酸酶。因此，Dicer、RISC和siRNA基因沉默系統是許多基礎性的生物學事件的必需步驟，所述事件包括基因組重排、干細胞分化、腦發育和病毒防御。令人感興趣地，已經確定，小dsRNA (siRNA)的大小是它們的功能的決定因素。如果dsRNA太大或太小，它們使它不能進入RISC復合物中，所以不會發生基因沉默。反義寡聚體與siRNA的差別在于幾個方面，最重要的是，反義寡聚體是單鏈的。它們也是合成的，通常沿著磷酸酯主鏈被修飾，且經常在選定的核苷堿基位置中。在反義療法領域，化學修飾的核苷向核酸分子中、特別是向核糖核酸分子(RNA)中 的導入，會提供克服外源地遞送的天然RNA或DNA分子固有的體內穩定性和生物利用度的潛在限制的有力工具。例如，化學修飾的核酸分子的應用，可以使更低劑量的特定核酸分子實現給定的治療效果，因為化學修飾的核酸分子傾向于具有更長的血清半衰期。此外，某些化學修飾可以提高核酸分子的生物利用度，這通過靶向特定細胞或組織和/或提高核酸分子的細胞攝取來實現。因此，即使化學修飾的核酸分子的活性比天然核酸分子降低(例如當與所有RNA核酸分子相比較時)，由于提高的分子穩定性和/或遞送，修飾的核酸分子的總活性可以大于天然分子。ー種有用的化學修飾稱作鎖定的核酸(LNA)，其會在ー個或多個RNA或DNA核苷部分處導入2' 0-4' C-亞烷基橋，其中所述亞烷基橋是C^6亞烷基橋，更具體地是2' 0-4; C-亞甲基橋。在被宿主細胞攝取以后，當LNA摻入反義RNA或DNA寡聚體中吋，已經證實，它們會極大地增加反義RNA或DNA分子的穩定性，并從而極大地增加反義RNA或DNA的生物利用度。可以導入反義RNA或DNA寡聚體中來增加反義寡聚體的穩定性和生物利用度的其它有用的化學修飾包括硫代磷酸酯鍵或磷酸三酯鍵，它們取代單個RNA或DNA核苷酸之間的天然存在的磷酸ニ酯鍵。
發明內容
在本發明的第一個實施方案中，提供了ー種藥物組合物，其包含根據本發明的RNA或DNA寡聚體或其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或酯以及藥學上可接受的稀釋劑，所述RNA或DNA寡聚體與通過引用并入本文中的下述DNA序列的對應RNA轉錄物基本上互補CCTGC了GGTGGCTCCAGTTC (SEQ ID NO: 1};
AGAGTCTAGACTCGTGGTGGAOTCTCTCAATTTTCTAGGGG (SEQ ID N0:2);TCGATGTGTCTGCGGCGmTATCA了 (SEQ ID NO: 3|
CATCCTGC了GCTATGCCTCA了CTTCTT {SEQ ID NO: 4): CAAGGTATGTTGCCCGT {SEQ
ID NO: 5}: TGTATTCCCATCCCATC (SEQ ID NO; 6); CCTATGGGAGTGGGCCTCAG (SEQID NO: 7): TGGCICAGTTTACTAGTGC (SEQ ID NO: 8) GGGCTTTCCCCCACTGT {SEQID NO: 9} TCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT (SEQ ID NO: 10)；CGCACCTCTCTTTACGCGG (SEQ ID NO: 11); GGAGTGTGGATTCGCAC iSEQ ID NO
12}: if GAAGAAGAACTCCCTCGCCT (SEQ 丨D NO: 13};其中所述反義 RNA 或 DNA 分子包含多個修飾的核苷和/或核苷酸。
在本發明的第二個實施方案中，提供了ー種藥物組合物，其包含根據本發明的RNA或DNA寡聚體或其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或酯以及藥學上可接受的稀釋劑，所述RNA或DNA寡聚體與通過引用并入本文中的下述DNA序列的對應RNA轉錄物基本上互補
GAGAGAAGTCCACCAC (SEQ ID NO: 14) TGAGAGAAGTCCACCA (SEQ tD NO:15)GAGGCATAGCAGCAGG (SEQ ID NO: 16): TGAGGCATAGCAGCAG (SEQ ID NO: 17);GATGAGGCATAGCAGC {SEQ ID NO: 18) GATGGGATGGGAATAC (SEQ ID NO: 19};GGCCCACTCXCATAGG <SEQ ID NO 20)； AGGCCCACTCCCATAG {SEQ ID NO 21);或
CTGAGGCCCACTCCCA (SEQ ID NO; 22);其中所述反義RNA或DNA分子包含多個修飾的核苷和/或核苷酸。一個實施方案提供了一種反義寡聚體或其鹽、溶劑化物、水合物或酷，其用于減少哺乳動物細胞或生物體中的こ型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反義寡聚體是長度為10-26個核苷的連續序列，且具有如式I所示的序列
5’ -LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-N1-P-LNAr-P-LNArS,(式 I)
其中LNA是鎖定的核酸；P是選自下述的核苷間連接磷酸ニ酷、磷酸三酷、硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、H-膦酸酯或烷基膦酸酯連接，所述連接是在LNA和鄰近的N之間，或在N和鄰近的N之間，或在N和鄰近的LNA之間，或在LNA和鄰近的LNA之間，從式(I)序列的5’至3’方向；且其中N選自G、C、A、T、U或Z核苷單元；n和r和p和q各自獨立地是選自1、2或3的整數；1和m各自獨立地是1-22的整數；且
其中Z選自肌苷、N7-甲基肌苷、N7-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黃苷、ニ氫尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脫氮鳥苷、7-乙基-7-脫氮鳥苷、N4-甲基胞苷、N4-こ基胞苷。特定實施方案提供了如本文所述的反義寡聚體，其中所述寡聚體的至少4個核苷單元可以是LNA單元。在有些實施方案中，所述LNA是具有2' -O-烷基-4' C連接的鎖定的核酸単元，其中所述烷基可以是取代的或未取代的C^6烷基。在其它實施方案中，至少2個在連續核苷序列的核苷單元之間存在的核苷間連接是硫代磷酸酯核苷間連接。在ー些有關的實施方案中，在反義寡聚體的連續核苷序列的核苷單元之間存在的所有核苷間連接都可以是硫代磷酸酯核苷間連接。
在ー些具體的實施方案中，η、P、r和q各自獨立地是1或2，且I和m各自獨立地是2、3、4、5或6，且在ー些具體的實施方案中，n、p、r和q各自獨立地是1，且I和m各自獨立地是6。在其它具體的實施方案中，提供了一種反義寡核苷酸，其中所述序列可以是SEQ ID NO 14、16、16 或 20 中的任ー個。在具體實施方案中，上述的反義寡聚體可以與SEQ ID NO. 1_13中的任ー個基本上互補，且所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒，且所述細胞或生物體可以是人。在有關的具體實施方案中，所述こ型肝炎病毒可以是人地理學基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D (地中海地區、中東、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。在具體實施方案中，上述的反義寡聚體可以具有與SEQ ID NO. 14_22中的任ー個基本上互補的序列，且所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒且所述細胞或生物體可以是人。在有關的具體實施方案中，所述こ型肝炎病毒可以是人地理學基因型中的任ー種A(歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D (地中海地區、中東、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。ー個具體的實施方案提供了ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染的藥物制劑，其包含有效量的如上所述的任意核酸反義寡聚體或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或酯以及藥學上可接受的稀釋劑。這樣的藥物制劑的反義寡聚體可以與SEQ ID NO:1-13中的任ー個基本上互補，或可以具有與SEQ ID NO 14-22中的任ー個基本上互補的序列，且可以另外包含藥學上可接受的載體。本發明的另ー個實施方案提供了ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的任意藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而治療所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關病癥。在有關的實施方案中，所述哺乳動物是人，所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關病癥是來自人こ型肝炎病毒的こ型肝炎病毒感染。更具體地，所述人こ型肝炎病毒可以是人地理學基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南);D (地中海地區、中東、印度);E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。
有關的實施方案提供了ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的任意藥物組合物施用給如上所述的有此需要的哺乳動物，其中所述人こ型肝炎病毒相關病癥可以是黃疸、肝癌、肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭、彌散性肝細胞炎性疾病、噬血細胞綜合征或血清性肝炎。在有關的實施方案中，所述方法可以另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進行。在其它有關的實施方案中，所述額外治療劑可以是HBV劑、HCV劑、化學治療劑、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑或免疫抑制劑。
在特別有關的實施方案中，所述額外HBV劑可以是干擾素a-2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-Ι (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復制抑制劑；第二種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋(ETV);富馬酸替諾福韋雙索酯(TDF);替比夫定(LdT);阿德福韋；或HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。在其它特別有關的實施方案中，所述額外HCV劑可以是干擾素a _2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的);利巴韋林；HCV RNA復制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列)；HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；或HCV單克隆或多克隆抗體治療劑。另ー個實施方案提供了一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBVDNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的藥物組合物施 用給有此需要的哺乳動物，從而與治療之前哺乳動物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原。在有些實施方案中，所述哺乳動物可以是人，所述こ型肝炎病毒可以是人こ型肝炎病毒。更具體地，所述人こ型肝炎病毒可以是人地理學基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C(東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南);D (地中海地區、中東、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亞);G (美國、法國)；或H (中美洲)。在具體實施方案中，提供了一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBV DNA的量和HBV抗原的量的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而與治療之前哺乳動物中HBV DNA的量和HBV抗原的量相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原，其中與施用反義寡聚體之前的量相比，DNA的量減少了 90%。在有關的方法中，所述HBV抗原可以是HBsAg，或可以是HBeAg，更具體地，可以充分地減少HBV抗原的量以導致血清轉換，所述血清轉換定義為血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在(如果監測HBeAg作為血清轉換的決定因子)，或者定義為血清HBsAg不存在(如果監測HBsAg作為血清轉換的決定因子)，所述存在和不存在由商業ELISA系統的目前可得到的檢測限確定。在更具體的實施方案中，如上所述的方法可以另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進行。在特別有關的實施方案中，所述額外治療劑可以是HBV劑、HCV劑、化學治療劑、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑和免疫抑制齊U。在更特別有關的實施方案中，所述額外HBV劑可以是干擾素a-2b、干擾素a_2a和干擾素alphacon-Ι (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復制抑制劑；第ニ種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋；或HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)，且所述額外HCV劑可以是干擾素a-2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列);HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；或HCV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。另ー個實施方案提供了一種用于促進受HBV感染的哺乳動物的こ型肝炎病毒的血清轉換的方法，所述方法包括將治療有效量的如上所述的藥物組合物施用給受こ型肝炎感染的哺乳動物；監測HBeAg + HBeAb在哺乳動物血清樣品中的存在，或監測HBsAg在哺乳動物血清樣品中的存在，以致于血清樣品中HBeAg的不存在+ HbeAb的存在(如果監測HBeAg作為血清轉換的決定因子)或血清樣品中HBsAg的不存在(如果監測HBsAg作為血清轉換的決定因子)(所述存在和不存在由商業ELISA系統的目前檢測限確定)，指示哺乳動物的血清轉換。對于本文所述的任意實施方案，所述實施方案提供了一種治療こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關病癥的方法、一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBVDNA的量和HBV抗原的量的方法或一種用于促進受HBV感染的哺乳動物的こ型肝炎病毒的血清轉換的方法，其中所述方法包括施用本文所述的反義寡聚體、施用反義寡聚體，無論是單獨地還是組合地，也無論存在于藥物制劑中還是簡單地存在于稀釋劑中，所述施用可以是ロ服的、□腔的、直腸的、腸胃外的、腹膜內的、真皮內的、透皮的或氣管內的給藥。
通過參照下面的詳細描述，并參照附圖，可以更容易地理解本發明的前述特征，在附圖中
圖I是HBV感染的自然史的簡圖。圖2是被視作HBeAg陽性的具有代償疾病的HBV患者的簡圖。圖3是被視作HBeAg陰性的具有代償疾病的HBV患者的簡圖。圖4是HBV轉錄的示意圖，它顯示了由HBV基因組編碼的主要轉錄物(包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依賴性的DNA聚合酶(逆轉錄酶活性)、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴)、轉錄物的相對長度以及大、中和小S蛋白轉錄物的重疊區。也指示了 HBV DNA的+和-鏈。圖5顯示了對比來自HBV的多個基因型的基因組DNA的序列之間的同一性百分比的計算生物學分析，其按照HBV基因組區域進行繪制。圖6是已經鑒別出的不同HBV地理學基因型的表。具體實施方案的詳細描述
定義.如在本說明書和附隨的權利要求書中所使用的，下述術語應當具有指出的含義，除非上下文另有要求
本文使用的術語“有效量”是指，包括核酸寡聚體的藥物或藥品或藥劑的量，其會引起組織、系統、動物或人的生物學或醫學應答，所述應答是例如研究人員或臨床醫師所追求的。此外，術語“治療有效量”是指，與尚未接受這樣的量的對應受試者相比，導致下述效果的任意量改善的治療，愈合，預防或改善疾病、障礙或副作用，或疾病或障礙的進展速率降低。該術語在它的范圍內也包括有效地增強正常生理功能的量。本文使用的術語“基本上互補”是指，使用標準的Watson-Crick堿基對A_T、A_U和G-C，所述反義寡聚體序列具有與它的靶有義序列完全互補的序列。另外，術語基本上互補包括使用非標準的Watson-Crick堿基對，反義寡聚體序列與它的靶有義序列完全互補，所述非標準的Watson-Crick堿基對包括、但不限于G:U、I:U、I:A、I:C、X:A、X:C、R:C、R:T、R:U、m7I:U、m7I-A、m7I:C、m7G:U、m7G:C、m5U:A、5-FU:A、5-FT:A、m5C:G、D:A、Ψ:Α 和 Ψ :C0本文使用的G是鳥苷，I是肌苷，A是腺苷，C是胞苷，U是尿苷，T是胸苷，X是黃苷，R是利巴韋林，m7G是N7-甲基鳥苷，m7I是N7-甲基肌苷，5FU是5-氟尿苷，5FT是5-氟胸苷，D是ニ氫尿苷，m5U是5-甲基尿苷，m5C是5-甲基胞苷，和Ψ是假尿苷。術語“基本上互補”也包括這樣的反義寡聚體其在序列中具有ー個或多個合成的核苷堿基，所述核苷堿基表現出與DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷堿基的假互補性。導致與天然核酸序列的假互補性的核苷堿基的實例包括2_氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷(nA)、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷(sT)、7-烷基-7-脫氮鳥嘌呤或7-烷基-7脫氮鳥苷(7al-7daG)和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷(N4_alC ;其中烷基=甲基或こ基)。非Watson-Crick堿基對nA:T和A: sT是穩定的堿基對，7-烷基-7-脫氮鳥嘌呤與C配對(7al-7daG:C)以及N4-烷基胞嘧啶與G配對(N4_alC:G)也是穩定的。當所有4個合成的核苷堿基nA、sT、7al-7daG和N4_alC都摻入給定的ASO中時，得到的ASO序列在很大程度上沒有ニ級結構，且會結合具有假互補性的靶核酸。在本發明的實施方案中，ー個或 多個合成的核苷堿基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之間產生ー個或多個非Watson-Crick “假互補的”堿基對。應當理解，具有ー個或多個假互補的堿基從而與靶核酸序列上的核苷堿基形成一個或多個假堿基對的AS0，被視作與靶核酸序列基本上互補。術語“基本上”，諸如當用于短語“基本上具有SEQ ID NO X的序列的寡核苷”中吋，在本文中用于表示，可以與書寫的SEQ ID NO X的互補序列堿基配對的任意序列，但是其可以在序列中含有ー個或多個合成的核苷堿基，所述核苷堿基表現出與DNA或RNA靶核酸序列中的天然存在的核苷堿基的假互補性。導致與天然核酸序列的假互補性的核苷堿基的實例包括2_氨基腺嘌呤或2-氨基腺苷(nA)、2-硫代胸腺嘧啶或2-硫代胸苷(sT)、7_烷基-7-脫氮鳥嘌呤或7-烷基-7脫氮鳥苷(7al-7daG)和N4-烷基胞嘧啶或N4-烷基胞苷(N4-alC ;其中烷基=甲基或こ基)。非Watson-Crick堿基對nA:T和A: sT是穩定的堿基對，7-烷基-7-脫氮鳥嘌呤與C配對(7al-7daG:C)以及N4-烷基胞嘧啶與G配對(N4_alC:G)也是穩定的。當所有4個合成的核苷堿基nA、sT、7al-7daG和N4_alC都摻入給定的ASO中時，得到的ASO序列在很大程度上沒有ニ級結構，且會結合具有假互補性的靶核酸。在本發明的實施方案中，ー個或多個合成的核苷堿基可以存在于ASO序列中，在ASO和靶核酸序列之間產生ー個或多個非Watson-Crick “假互補的”堿基對。應當理解，具有ー個或多個假互補的堿基從而與靶核酸序列上的核苷堿基形成一個或多個假堿基對的AS0，被視作基本上具有書寫的SEQ ID NO X的序列，其針對給定的靶核酸序列。本文使用的術語“核酸寡聚體”是指，包含至少2個且不超過100個連貫地連接的共價結合的核苷或核苷酸單元的核酸分子。每個單獨的核苷或核苷酸單元可以包含核糖或脫氧核糖，因而所述寡聚體可以包含核糖和脫氧核糖的組合。可以連接核酸寡聚體中的核苷酸或核苷，使得所述寡聚體包含傳統的磷酸ニ酯連接，或者所述寡聚體可以包含ー個或多個磷酸三酯連接、膦酸酯連接、烷基膦酸酯連接、硫代磷酸酯連接或ニ硫代磷酸酯連接。另外，所述核酸寡聚體可以包含一個或多個修飾的核苷，包括2’ 0-4’ C連接的核苷，且額外地或替代地，所述核酸寡聚體可以包含ー個或多個具有在2’ -位的其它修飾的核苷，所述其它修飾包括2’ -O-烷基修飾諸如2’ -O-甲基修飾、2’ -O-こ基修飾或其它2’ -修飾。本文使用的術語LNA (鎖定的核酸)包括具有在核苷糖單元的2’ -位和4’ -位之間的化學連接的核酸単體(即如果根據普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法進行描述，核酸單體的呋喃糖具有2’ 0-4’ C連接或4’ C-2’ 0連接)，包括但不限于如下描繪的(A) a -L-亞甲基氧基(4，-CH2-0-2，) LNA、(B) ^ -D-亞甲基氧基(4，-CH2-0_2，) LNA、(C)亞乙基氧基(4’ -(CH2)2-0-2J ) LNA、⑶氨基氧基(4’ -CH2-O-N(R)-2’ ) LNA 和(E)氧基氣基(4’ _CH2_N (R) _0_2 ’ ) LNA。
本文使用的LNA化合物包括、但不限于在糖的4’和2’位之間具有至少一個橋的化合物，其中每個橋獨立地包含I個或2-4個連接的基團，所述基團獨立地選自^[C(R1)(R2) ] n_、_C (R1) =C (R2) -、-C (R1) =N-> -C (=NR1) -、-C (=0) -、-C (=S) -、-O-、-Si (R1) 2_、-S (=0)x-和-N(R1)-;其中x是0、1或2 ;n是1、2、3或4 ;每個RjPR2獨立地是H、保護基、羥基、C「C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C2tl芳基、雜環基團、取代的雜環基團、雜芳基、取代的雜芳基、C5-C7·脂環基團、取代的C5-C7脂環基團、鹵素、OJp NJ1J2'SJp NyCOOJ1、酰基(C(=0)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(^)2-J1)或 sulfoxyl (SbO)-J1);且每個 J1 和 J2 獨立地是H、C1-C12 烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-Cm芳基、取代的C5-C2tl芳基、酰基(C(=0)-H)、取代的酰基、雜環基團、取代的雜環基團、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保護基。在LNA的定義內包括的具體4’ C- 2’ 0橋的實例包括HC(R1) (R2)Jn-, -[C(R1)(R2) L-O^-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-橋。在 LNA 的定義內包括的其它橋是4，_CH2_2，、4，_ (CH2) 2_2，、4，_ (CH2) 3_2，、4，_CH2_0_2，、4，_ (CH2)2U,、4，_CH2_0_N (R1) _2，和4’ -CH2-N(R1)-O^'-橋，其中每個R1獨立地是H、保護基或C1-C12烷基。根據本發明，在LNA的定義內還包括這樣的LNA :其中，核糖基糖環的2’ -羥基連接至所述糖環的4’碳原子上，從而形成亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)連接，以形成二環糖部分。所述連接可以是橋接2’氧原子和4’碳原子的亞甲基(-CH2-)基團，術語亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)LNA用于二環部分上；在亞乙基在該位置的情況下，使用術語亞乙基氧基(4’-CH2CH2-0-2’)LNA。在本文使用的LNA的含義內，也包括a-L-亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’)，即亞甲基氧基(4’ -CH2-0-2’ ) LNA的一種異構體。本文使用的術語“2' -0-烷基-4' C連接”表示，在鎖定的核酸(LNA)中的2’ -0-4’ -C (或4’ C-2’ 0，如果根據普遍接受的寡核苷酸的5’至3’方向性命名法進行描述)化學連接或橋。所述烷基連接可以是取代的或未取代的烷基，其中本文使用的“烷基”表示-[C(R1) (R2) ]n_，其中n是1、2、3、4、5或6 ;每個R1和R2獨立地是H、保護基、羥基、C1-C12 烷基、取代的 C1-C12 烷基、C2-C12 烯基、取代的 C2-C12 烯基、OJ1'NJ1J2'SJ1'N3AOOJ1、酰基(C(=0)-H)，且每個J1和J2獨立地是=HX1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保護基。本文使用的術語“HBV”是指哺乳動物乙型肝炎病毒，包括人乙型肝炎病毒。該術語包括乙型肝炎病毒(特別是人乙型肝炎病毒)的地理學基因型以及乙型肝炎病毒的地理學基因型的變異株。本文使用的“乙型肝炎相關病癥”或“HBV相關病癥”是指，乙型肝炎感染、暴露或疾病會惡化、造成、有關、伴隨或引起的任意疾病、生物學狀況、醫學狀況或事件。術語乙型肝炎相關病癥包括黃疸、肝癌、肝炎癥、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭、彌散性肝細胞炎性疾病、噬血細胞綜合征、血清性肝炎、HBV病毒血癥和具有癥狀的病癥，所述癥狀可以包括下述的任一項或全部流感樣疾病、虛弱、疼痛、頭痛、發熱、食欲缺乏、腹瀉、黃疸、惡心和嘔吐、在身體的肝區的疼痛、泥色或灰色大便、全身瘙癢和深色尿，并伴有乙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒抗原存在的陽性檢測，或對乙型肝炎病毒抗原特異性的抗體的存在的陽性檢測。本發明的反義寡核苷酸(ASO)可以以非溶劑化物形式和溶劑化物形式存在。術語‘溶劑化物’在本文中用于描述分子復合物，其包含本發明的化合物和一種或多種藥學上可接受的溶劑分子(例如乙醇)。當所述溶劑是水時，采用術語‘水合物’。藥學上可接受的溶劑化物包括水合物和其它溶劑化物，其中結晶的溶劑可以同位素地替換，例身D2O, d6-丙酮、d6-DMS0。
在本發明要求保護的化合物的范圍內，包括式(I)化合物的所有立體異構體、幾何異構體和互變異構形式，包括表現出超過一類異構現象的化合物和它們中的一種或多種的混合物。本發明的ASO可以作為前藥施用。因而，本文所述的ASO的某些衍生物(它們本身可能幾乎不具有或不具有藥理學活性)在施用到身體中或上時，通過例如水解裂解，可以轉化成具有希望的活性的、與SEQ ID NO: 1-13基本上互補的AS0。這樣的衍生物稱作‘前藥，。根據具體反義核酸寡聚體的性質，可以使用任意常規方法將ASO施用給宿主，所述方法能夠導致希望的靶細胞中靶病毒轉錄物、病毒基因組量或載量的減少。因而，可以將反義寡聚體摻入到用于治療性施用的多種制劑中。更具體地，本發明的反義寡聚體可通過與適當的藥學上可接受的載體或稀釋劑組合制成藥物組合物，且可制成固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑及氣霧劑。如此，反義寡聚體的施用可以以多種方式完成，包括口服的、口腔的、直腸的、腸胃外的、腹膜內的、真皮內的、透皮的或氣管內的給藥等。在藥物劑型中，ASO可以單獨地施用，或與其它藥學活性劑適當結合地以及聯合地施用。下述的方法和賦形劑僅僅是示例性的，絕不是限制性的。本文所述的ASO可以與常規的藥用載體、賦形劑等(例如，甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、交聯羧甲纖維素鈉、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂等)聯合施用。如果需要的話，所述藥物組合物也可以含有小量無毒的輔料，諸如潤濕劑、乳化劑、增溶劑、PH緩沖劑等(例如，醋酸鈉、檸檬酸鈉、環糊精衍生物、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鹽、三乙醇胺油酸鹽等)。對于口服制劑，ASO可單獨應用，或與適當添加劑聯合應用，以制成片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑，例如，與下述添加劑聯合應用常規添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；粘合劑如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；潤滑劑如滑石粉或硬脂酸鎂；和如果需要的話，稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑和矯味劑。可以如下將ASO制成注射用制劑通過將ASO溶解、懸浮或乳化在水性溶劑或非水溶劑(如植物油或其它相似油、合成脂族酸甘油酯、高等脂族酸酯或丙二醇)中，并且如果需要的話，使用常規添加劑如增溶劑、等滲劑、助懸劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑。例如，可以如下制備藥學上可施用的液體組合物將至少一種ASO和任選的藥學佐劑溶解、分散或以類似方式分布在載體(例如，水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、二醇類、乙醇等)中，以形成溶液或混懸液。可以制備常規形式的注射劑，作為液體溶液或混懸液，作為乳劑，或呈適合在注射前溶解或懸浮于液體中的固體形式。在這樣的腸胃外組合物中含有的ASO的百分比高度地依賴于其具體性質以及ASO活性和受試者的需要。但是，可以采用活性成分占溶液的0. 01%至10%的百分比，如果所述組合物是將在以后稀釋至上述百分比的固體，則可以更高。在某些實施方案中，所述組合物包含在溶液中的約0. 2-2%的活性劑AS0。ASO劑可以用于通過吸入來施用的氣霧劑制劑中。本發明的ASO可配制到加壓的可接受的推進劑中，所述推進劑例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。對于吸入遞送，可以將ASO配制為液體溶液，混懸液，氣霧噴射劑或干粉，并裝載到合適的給藥用分配器中。存在幾種類型的藥物吸入裝置一噴霧器吸入器、計量劑量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。噴霧器裝置會產生高速空氣流，其造成治療劑(它們配制成液體形式)噴灑為霧，所述霧被遞 送至患者的呼吸道中。MDI通常是包裝了壓縮氣體的制劑。在致動后，所述裝置通過壓縮氣體釋放出量過的量的治療劑，從而提供施用一定量藥劑的可靠方法。在通過DPI裝置呼吸過程中，DPI會分配自由流動的粉末形式的治療劑，所述粉末可以分散在患者的吸氣氣流中。為了實現自由流動的粉末，用諸如乳糖等賦形劑配制治療劑。量過的量的治療劑以膠囊的形式儲存，并在每次致動時分配。此外，ASO劑可通過與多種基質(如乳化基質或水溶性基質)混合而制成栓劑。本發明的ASO可通過栓劑經直腸施用。栓劑可包括在體溫融化、但在室溫固化的賦形劑，如可可脂、碳蠟及聚乙二醇。一般而言，通過用于類似用途的ASO劑的被接受的給藥模式中的任一種，施用治療有效量的提供的ASO劑。反義寡聚體(即，活性成分)的實際量取決于多種因素，諸如要治療的疾病的嚴重性、受試者的年齡和相對健康、使用的ASO的功效、給藥途徑和形式、以及其它因素。所述藥物組合物可以每天施用超過I次，諸如每天I次或2次。在具體實施方案中，所述ASO藥物制劑每周施用I次或2次，根據需要持續24、36或48周或更長的療程，以有效地治療HBV感染，包括減少病毒載量、減少病毒抗原、產生血清轉換、支持受試者免疫應答和/或降低HBV DNA水平和正常化丙氨酸轉移酶(ALT)水平。可提供用于口服或直腸給藥的單位劑型，如糖漿劑、酏劑和混懸液，其中每個劑量單元(例如一茶匙、一湯匙、一個片劑或一粒栓劑)含有預定量的組合物，所述組合物含有一種或多種抑制劑。類似地，用于注射或靜脈內給藥的單位劑型可包含在組合物中的抑制劑，所述組合物作為在無菌水、生理鹽水或其它藥學上可接受的載體中的溶液。本文使用的術語“單位劑型”是指，適合作為用于人及動物受試者的單元劑量的物理上離散的單位，每個單位含有預定量的本發明化合物，其計算為與藥學上可接受的稀釋齊U、攜帶者或媒介物聯合足可產生希望的作用的量。本發明的新穎單位劑型的規范取決于應用的具體化合物及欲達到的效果和在宿主中與每種化合物相關的藥效學。藥學上可接受的賦形劑(如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑)是公眾易于獲得的。此夕卜，藥學上可接受的輔料(如PH調節劑及緩沖劑、張度調節劑、穩定劑、濕潤劑等)是公眾易于獲得的。本領域技術人員會容易地理解，劑量水平可隨具體的ASO劑、遞送媒介物的性質等而變化。本領域技術人員通過多種方法易于確定給定的ASO的優選劑量。用于施用本文所述的ASO治療劑的遞送方法的實例，以及藥物制劑、溶劑化物、水合物、鹽和酯的細節，是本領域技術人員眾所周知的，且描述在文獻中。使用將ASO劑導入靶細胞中的任意方便的方法，可以將有效量的ASO抑制劑導入革巴細胞中。方法包括根據本領域可得到的標準方案，使用諸如lipofectamine、聚陽離子胺(諸如精胺、精脒)等試劑，以及包括電穿孔、顯微注射、脂質體包囊和更多的方法。在有些情況下，對于ASO向靶細胞中的攝入而言，沒有外源劑是必需的。將有效量的ASO劑導入哺乳動物細胞中，會導致HBV靶基因表達的調節(即降低)，導致HBV載量的減少、HBV DNA的減少、正常化的ALT活性、血清轉換、治愈和提高的免疫應答。 最后，制劑和劑量的選擇取決于多種因素，諸如給藥模式和藥品的生物利用度。本發明的方法可以在任意哺乳動物細胞中起作用，其中代表性的目標哺乳動物細胞包括，但不限于下述動物的細胞有蹄類動物(ungulates)或有蹄(hooved)動物,例如，牛、山羊、豬、綿羊等；嚙齒類動物，例如，倉鼠、小鼠、大鼠等；兔形目動物，例如，兔；靈長類動物，例如，猴、狒狒、人等；和類似的動物。所述ASO組合物可以有利地與其它抗病毒劑聯合地和/或替代地組合和/或使用，所述其它抗病毒劑是治療劑或預防劑，且不同于主題化合物。所述組合物也可以有利地與藥劑聯合地組合和/或使用，所述藥劑治療經常與病毒感染(其對本發明的化合物敏感)有關的病癥，諸如抗-HCV劑或免疫抑制劑。在某些實施方案中，與主題組合物的聯合施用會增強這樣的藥劑的效能。因此，當與其它抗病毒劑聯合地組合或施用時，本發明的化合物在某些實施方案中的使用劑量可以小于當單獨使用時預期的量，或小于聯合治療的計算量。本發明的ASO和ASO組合物也可以與增強身體的免疫系統的藥劑一起使用，包括低劑量的環磷酰胺、胸腺刺激素、維生素和營養補劑(例如，抗氧化劑，包括維生素A、C、E、￠-胡蘿卜素、鋅、硒、谷胱甘肽、輔酶Q-IO和紫錐花屬)和疫苗，例如，免疫刺激復合物(ISC0M)，其包括組合了抗原的多聚體呈現和佐劑的疫苗制劑。如本領域技術人員會理解的，劑量取決于要治療的疾病狀態的嚴重性和應答性，和持續數天至數月的療程，或直到實現治愈或實現疾病狀態的減少。通過測量患者體內的ASO活性劑積累，可以計算出最佳劑量方案。最佳劑量可以隨單個寡核苷酸的相對功效而變化。一般而言，可以基于在體外和在體內動物模型中發現有效的EC50來估測它。一般而言，劑量是0.01 yg至I g/kg體重，可以每天給藥I次或多次，每周I次，每月I次，或每年I次，或甚至每2-10年I次，或連續輸注數小時至數個月。基于測量的藥物在體液或組織中的停留時間和濃度，可以估測給藥的重復率。在成功的治療以后，可能希望使患者經歷維持療法，以預防疾病狀態的復發。更具體地，療程會持續大約48周，每周給藥I次，作為皮下注射，劑量為約0. 01 Ii g/kg體重至約I g/kg體重。本發明的實施方案涉及一種藥物組合物，其包含至少一種本發明的反義寡聚體作為活性成分。應當理解，根據本發明的藥物組合物包括稀釋劑，并任選地包含藥用載體，且所述藥物組合物任選地包含其它化合物，諸如化療化合物、抗炎化合物、抗病毒化合物、鎮痛藥、NSAID、麻醉品、抗生素、抗真菌化合物、抗寄生蟲化合物和/或免疫調節化合物。本發明的寡核苷酸可以“原樣”使用，或以多種藥學上可接受的鹽的形式使用。本文使用的術語“藥學上可接受的鹽”表示這樣的鹽所述鹽保留本文鑒別出的寡核苷酸的希望的生物活性，并表現出微小的不希望的毒理學效應。這樣的鹽的非限制性實例可以用有機氨基酸和用金屬陽離子(諸如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘、鈉、鉀等)或用從氨、N，N- 二芐基亞乙基-二胺、D-葡糖胺、四乙基銨或亞乙基二胺得到的陽離子形成的堿加成鹽形成。在本發明的一個具體實施方案中，所述寡核苷酸可以是前藥形式。寡核苷酸(在它們的天然形式時，其通常具有通過磷酸二酯主鏈連接的單個核苷酸)通常與基本上去質子化的磷酸根氧一起在PH 7存在，所以是帶負電荷的分子。因為細胞膜在性質上是親脂的，與中性的或親脂的等效物相比，寡核苷酸的細胞攝取經常會減少。一種解決方案是，使用前藥方案(參見例如 Crooke, R. M. (1998), Crooke, S. T. Antisense research andApplication. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131,第 103-140 頁)。藥學上可接受的粘合劑和佐劑也可以構成配制的藥物的一部分。本發明的藥物組合物包括、但不限于溶液、乳劑和含有脂質體的制劑。這些組合物可以從多種組分制備，所述組分包括、但不限于預形成的液體、自乳化固體和自乳化半固體。通過載體介導的遞送，可以增強ASO組合物向組織的遞送，所述載體包括、但不限于 陽離子型脂質體、環糊精、卟啉衍生物、支鏈樹枝狀聚合物、聚乙烯亞胺聚合物、納米顆粒和微球(Dass, C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27) 根據制藥工業眾所周知的常規技術，可以制備本發明的藥物制劑，其可以方便地呈現在單位劑型中。這樣的技術包括使活性成分與藥用載體或賦形劑相締合的步驟。一般而言，如下制備制劑使活性成分與液體載體或粉碎的固體載體或二者均勻地且密切地締合，然后，如果必要的話，使產物成形。本發明的組合物可以配制成許多可能的劑型中的任一種，例如，但不限于、片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟凝膠劑和栓劑。本發明的組合物也可以配制為在水性介質、非水性介質或混合介質中的混懸液。水性混懸液可以另外含有增加混懸液粘度的物質，所述物質包括，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述混懸液也可以含有穩定劑。本發明的化合物也可以與活性藥品相綴合，所述活性藥品例如阿司匹林、布洛芬、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗細菌藥或抗生素和抗癌藥。另外，本發明的ASO序列可以與藥品一起施用，或與藥品聯合地單獨地施用，作為聯合治療，所述藥品可用于治療癌癥、炎癥、疼痛、細菌、真菌感染和/或寄生物感染、酒精中毒、物質濫用、糖尿病，或者所述藥品可用于治療其它病毒感染諸如HIV、HCV等。乙型肝炎病毒感染存在兩種一般類型急性的和慢性的。已經經歷HBV感染的受試者也可以恢復，并變成無癥狀的攜帶者。當暴露于乙型肝炎病毒的人開始出現病毒性肝炎的征象和癥狀時，發生急性乙型肝炎。稱作潛伏期的該時段平均是90天，但是可以短至45天，或長至6個月。對于大多數人而言，該感染會造成輕度至中度的不適，但是會自行消失，因為身體的免疫應答會成功地戰勝病毒。但是，有些人，特別是免疫系統受損的人，諸如遭受AIDS、接受化學療法、服用免疫抑制藥物或服用類固醇的人，具有非常嚴重的問題(作為急性HBV感染的結果)，并發展成更嚴重的病癥，諸如暴發性肝衰竭。當人最初遭受急性感染、但是隨后不能戰勝感染時，發生慢性乙型肝炎。該疾病變成慢性還是完全消退，主要取決于受感染的人的年齡。約90%的在出生時受到感染的嬰兒會發展成慢性疾病。但是，隨著人老化，慢性感染的風險降低，所以20%-50%的兒童和小于10%的少年或成年人會從急性感染發展成慢性感染。慢性HBV感染是本發明的實施方案的主要治療目標，盡管本發明的ASO組合物也能夠治療HBV相關病癥，諸如炎癥、纖維化、肝硬化、肝癌、血清性肝炎和其它。如圖I所示，總結了 HBV感染的自然史，如果患者在幼童時期接觸HBV，該兒童在將來形成免疫耐受性的機會是95%，且所述病癥會發展成慢性肝炎；然而，如果成年患者接觸HBV,所述病癥將來變成慢性的機會僅是5%。慢性HBV感染存在4個階段。第一階段是免疫耐受期，這時表現出微小的肝臟纖維化和炎癥，伴有高HBV DNA和正常的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平。第二階段是免疫清除期，這時肝臟的活動性炎癥可通過組織學檢查觀察到，其還可以包括波動的ALT活性水平和波動的HBV DNA水平。隨后可能是第三個不活動的帶病原狀態階段，這時受感染的受試者可能在組織學檢查中表現出輕度肝炎和微小纖維化。也報道了第四個階段，稱作HBV的復活。該最后一個階段的特征在于，肝臟的活動性炎癥，這通過活組織檢查觀察到，盡管乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性和抗-HBeAg陽性。慢性HBV疾病具有幾種類型。第一種類型稱作HBeAg陽性的或“野生型”HBV感染，其被表征為抗-HBeAg陰性的，且表現出〉20,000 IU/mL O IO5拷貝/mL)的HBV DNA的量。第二種類型稱作HBeAg陰性的或“突變型核心"HBV感染，其被表征為抗-HBeAg陽性的，且表現出>2，000 IU/mL O IO4拷貝/mL)的HBV DNA的量。在圖2和3中，顯示了這兩類慢性HBV感染和歷史上推薦的治療方案。圖2顯示了表現出HBeAg陽性的或“野生型’MBV感染的患者的分類和歷史上推薦的治療。在左邊，是具有小于20，000 IU/mL (<105拷貝/mL)的HBV病毒DNA水平的患者，其中沒有推薦治療，但是進行監測，以確保HBV DNA水平沒有增加。在右邊，是具有>20，000IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。對于這些患者，每3_12個月監測具有正常丙氨酸轉移酶(ALT)活性的患者的ALT活性的任何變化，并考慮進行活組織檢查(取決于年齡)。治療表現出升高的ALT活性的患者至血清轉換，盡管實際上，現有的HBV治療劑使小于20-30%的患者實現了血清轉換。目前推薦的HBV治療劑包括恩替卡韋(ETV)和富馬酸替諾福韋雙索酯(TDF)和peg-干擾素，作為首選。 圖3顯示了表現出HBeAg陰性的或“突變型核心”HBV感染的患者的分類和歷史上推薦的治療。在左邊，是具有小于2，000 IU/mL (<104拷貝/mL)的HBV病毒DNA水平的患者，其中沒有推薦治療，但是進行監測，以確保JfflV DNA水平沒有增加。在右邊，是具有彡2，000 IU/mL的HBV病毒DNA水平的患者。對于這些患者，監測具有正常丙氨酸轉移酶(ALT)活性的患者的ALT活性的任何變化，并考慮進行活組織檢查。治療表現出升高的ALT活性的患者至HBsAg血清轉換，如果可能的話，使用目前推薦的HBV治療劑，包括恩替卡韋(ETV)和富馬酸替諾福韋雙索酯(TDF)和peg-干擾素，作為首選。遭受急性HBV感染的患者會針對病毒抗原產生劇烈的、多克隆的和多特異性的細胞毒性的T淋巴細胞(CTL)應答，而慢性感染的患者具有弱的或不可檢測的CTL應答。當活化弱的HBV-特異性的免疫應答(其強度足以破壞HBV感染的肝細胞)時，發生肝炎。關于引起T細胞低應答性或耐受性的機理知之甚少，但是有人認為，它可能涉及下述機理陰性選擇(新生兒);免疫學忽略；諸如調節性T細胞(Tregs)等共刺激分子的周邊無反應性或缺少；耗盡(PD-1的增量調節)。所有這些提議的機理的一個共同因素是，在患者中持續的高抗原水平。HBV抗原HBeAg是一種分泌型、非顆粒形式的HBV核心蛋白。HBV抗原HBeAg和HbcAg共有基本氨基酸序列，所以表現出在T細胞水平的交叉反應性。病毒裝配或復制不需要HBeAg，盡管研究表明，慢性感染的建立可能需要它們。HBeAg-陰性突變體對新生兒的感染經常導致暴發性急性感染，而不是慢性HBV感 染(Terezawa等人(1991) Pediatr. Res. 29:5),而WHeAg-陰性突變體對幼土撥鼠的感染會導致遠遠更低的慢性WHV感染率(Cote等人(2000) Hepatology 31:190)。HBeAg可能通過滅活核心特異性的T細胞(通過刪除或克隆無反應)而起耐受原的作用(Milich等人(1998) J. Immunol. 160:8102)。在抗病毒療法和HBeAg血清轉換以后，在HBV病毒載量和抗原的減少與T細胞對抑制性受體程序化死亡-I (PD-1 ;也稱作roCDl，是活化的T細胞的一種負調節劑)的表達的降低之間存在正相關(Evans等人(2008) Hepatology 48:759)。HBV表面抗原或HBsAg是傳染性的HBV病毒顆粒的包膜蛋白，但是也作為非傳染性的顆粒分泌，其血清水平是HBV病毒顆粒的1000倍。受感染的人或動物中的HBsAg的血清水平可以高達 1000 li g/mL(Kann 和 Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiologyand Microbial Infections,第9版.745)。在急性HBV感染中，HBsAg在血清中的半衰期(或血清t,)是8. 3天(Chulanov等人(2003) J. Med. Virol. 69: 313)。骨髓樹突細胞對HBsAg的內化，會抑制共刺激分子(即B7)的增量調節，并抑制T細胞刺激能力(den Brouw等人(2008) Immunology 126:280)，在HBsAg存在下，來自慢性感染的患者的樹突細胞也表現出共刺激分子的表達、IL-12的分泌和T細胞的刺激中的缺陷(Zheng等人(2004) J.Viral Hepatitis 11:217)。來自CHB患者的HBsAg特異性的⑶8細胞表現出改變的四聚體結合。這些⑶8細胞不是無反應性的，但是可能具有賦予部分耐受性或忽略的TCR拓撲學(Reignat等人(2002)J. Exp. Med. 195:1089)。此外，在Peg-IFNa 2a治療期間，在第24周時〉I log的血清HBsAg降低，具有持久的病毒學應答(SVR——定義為在治療后I年時通過PCR不可檢測的HBV DNA)的高預測值(92%) (Moucari 等人(2009) Hepatology 49:1151)。由于重疊的傳播途徑，許多人已經暴露于乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)，更少的人群是兩種病毒的慢性感染者，特別是在諸如亞洲等HBV地方性流行的地區。據估測，多達10%的HCV感染者也可能具有HBV，同時20%的HBV感染者可能受到HCV的共同感染。但是，尚未較好地研究在HBV-HCV共同感染的個體中的乙型肝炎或乙型肝炎的治療。HCV和HBV似乎抑制彼此的復制(盡管并非所有研究都已經觀察到該相互作用)的事實，使得治療復雜化。因此，完全抑制HBV的治療可能潛在地允許HCV再度出現，或反之亦然。因此，本發明的ASO化合物可以有利地用于治療被HBV和HCV感染的患者。丙型肝炎(HCV)的示例性的治療選項包括干擾素，例如，干擾素a _2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-1。使用聚乙二醇化的干擾素(連接到聚乙二醇部分上的干擾素，所述部分會顯著改善它的藥代動力學特性)，可以實現更低頻率的干擾素給藥。還已經證實，干擾素a _2b(聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)和利巴韋林的聯合治療對于某些患者群體而言是有效的。目前處于開發中的其它藥劑包括HCV RNA復制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列)、HCV反義劑、HCV治療疫苗、HCV蛋白酶抑制劑、HCV解螺旋酶抑制劑和HCV抗體治療齊[J(單克隆的或多克隆的)。本發明的實施方案提供了與SEQ ID NO: 1_13中的任一個基本上互補的ASO化合物，它們用于治療被HBV和HCV感染的受試者，其中所述ASO化合物與HCV劑聯合施用。所述HCV劑可以在與ASO化合物相同的藥物制劑中施用，或可以在單獨的制劑中施用。此外，所述HCV化合物可以與ASO HBV化合物同時地施用，或可以單獨地施用，使得HBV ASO化合物和HCV劑各自的劑量在患者體內在時間上重疊。在有關的實施方案中，所述HCV劑可以選自干擾素a-2b、干擾素a _2a和干擾素alphacon-1 (聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復制抑制劑(例如，ViroPharma的VP50406系列);HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；和HCV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。在另一個實施方案中，本發明的HBV ASO化合物可以與第二種HBV治療劑聯合地 施用給被HBV感染的患者，其中所述第二種HBV治療劑可以在與HBV ASO化合物相同的藥物制劑中施用，或可以在單獨的制劑中施用。所述第二種HBV治療劑可以可以與ASO HBV化合物同時地施用，或可以單獨地施用，使得HBV ASO化合物和HBV治療劑各自的劑量在患者體內在時間上重疊。在有關的實施方案中，所述HBV治療劑可以選自干擾素a _2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚乙二醇化的和未聚乙二醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復制抑制劑；第二種HBV反義化合物；HBV治療疫苗；HBV預防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋JPHBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。圖4是HBV轉錄的示意圖，它顯示了由HBV基因組編碼的主要轉錄物(包括前核心蛋白和核心蛋白、RNA-和DNA-依賴性的DNA聚合酶(逆轉錄酶活性)、X蛋白和大、中和小S蛋白以及聚腺苷酸尾巴)、轉錄物的相對長度以及大、中和小S蛋白轉錄物的重疊區。也指示了 HBV DNA的+和-鏈。圖5顯示了對比來自HBV的多個基因型的基因組DNA的序列之間的同一性百分比的計算生物學分析，其按照HBV基因組區域進行繪制。如圖5所示，鑒別出了在所述序列中具有100%同一性的多個區域，特別是聚合酶和大、中和小S蛋白轉錄的區域。圖6是不同地理學HBV基因型的表。如該表所示，存在8個已經分類的不同的地理學HBV基因型，它們的基因組DNA相差大約8%。除了它們的地理學分布差異之外，HBV基因型也可以在臨床史和它們對干擾素療法的應答方面存在差異。使用擴展的計算生物學分析，與在圖5中所例證的類似，分析了約2300個序列，并令人驚訝地鑒別出13個在不同基因型之間具有>95%同一性的序列。該分析已經允許設計單個反義寡聚體序列，它們各自靶向在多種轉錄產物和HBV基因組區域(在基因型之間)中具有>95%同一性的保守序列。因而，發明人已經令人驚訝地且意外地鑒別出單個ASO序列關閉多種轉錄產物的方法，且相同的單個ASO也在所有地理學HBV基因型之間具有增加的活性。這樣的方案考慮到一種藥物組合物，所述組合物包含單個ASO序列作為活性化合物，且所述組合物具有比現有HBV療法極大增加的效能，將嚴重地限制HBV株的形成抗性的能力，并將導致90%或更大的病毒載量減少，這通過HBV DNA和HBV抗原HBeAg和HBsAg的存在予以證實。本發明的藥物組合物因而將為遭受慢性HBV感染的患者提供一種改善的治療性處理，所述處理能夠提供完全血清轉換，并最終導致慢性HBV感染的完全治愈。這樣的方案也會減輕HBV相關肝病，諸如肝硬化、肝細胞癌(HCC)和纖維化和炎癥，導致更少的肝移植需求，并幫助預防死于肝病。另外，除了極大提高的病毒載量減少以外，本發明的ASO會提供其它益處。認為HBeAg具有免疫抑制作用，認為HBsAg會促進T細胞耗 竭。因此，使用本發明的ASO的治療，會通過降低HBeAg和HBsAg水平來支持患者的免疫應答，允許免疫系統更好地控制感染。也預見到，肝中HBV抗原呈遞的減少，將有助于使HBV感染發作(flare-up)的程度最小化(免疫系統恢復的結果)，它們都會增加完全治愈慢性HBV感染的機會。提供了用于減少靶細胞中的乙型肝炎病毒基因組量的方法和組合物。在主題方法中，以足以減少靶細胞中病毒基因組的量的方式，抑制幾種特異性HBV靶蛋白中的任一種的表達，例如，通過將反義RNA抑制劑導入靶細胞中。也提供了用于實踐主題方法的藥物組合物。主題發明的實施方案可以用于多種用途，包括治療遭受病毒介導的疾病狀況(例如，HBV介導的疾病狀況)的受試者。這樣的病癥包括、但不限于肝的纖維化和炎癥、肝硬化和肝細胞癌(肝癌)。本發明的一個實施方案提供了一種反義寡聚體(AS0)，其用于治療哺乳動物(包括人類)的HBV感染，其中所述ASO與SEQ ID NO: 1_13中的任一個基本上互補，且可以有效地降低病毒載量或抗原水平至少40%、更優選至少50%、更優選至少60%、更優選至少70%、更優選80%和最優選90%。所述ASO可以包含至少2個修飾的核苷，包括鎖定的核酸(LNA)單元，其中所述LNA單元具有2’ 0-烷基-4’ C連接，導致在修飾的LNA核苷摻入ASO序列中的ASO位置處的二環糖。本發明的反義寡聚體是單鏈寡核苷酸，其包含核苷類似物(諸如LNA)或核苷酸類似物(諸如硫代磷酸酯)，它們形成反義寡核苷酸的連續核酸序列的一部分。反義寡聚體的序列由連續的核苷酸或核苷序列組成。本文使用的術語“反義”是指這樣的核酸寡核苷酸序列當從5’ -端至3’ -端看時，其包含與DNA的有義鏈基本上互補的序列，即，所述反義寡核苷酸具有與DNA的有義鏈(也稱作編碼鏈)相反的序列朝向(從5’至3’ _)，所以所述反義寡聚體與給定的DNA編碼區或基因的有義鏈基本上互補。在本發明的上下文中，與術語“寡聚體”可互換地使用的術語“寡核苷酸”(或簡稱“寡物”)表示，通過2個或更多個核苷酸的共價連接形成的分子。當用于本發明的寡核苷酸(也稱作單鏈寡核苷酸)的上下文中時，在一個實施方案中，術語“寡核苷酸”可能具有例如10-26個核苷酸，更具體地，本發明的寡核苷酸可能具有12-20個核苷酸，或更具體地
14-18個核苷酸。術語“核苷酸”表示這樣的分子其具有3種組分，即雜環含氮堿基(有時稱作核苷堿基，包括嘧啶和嘌呤堿基)、戊糖(核糖或脫氧核糖)和磷酰基(磷酸酯、硫代磷酸酯、膦酸酯等)，實例包括但不限于=DNA核苷酸諸如脫氧腺苷_5’_單磷酸(dAMP)、脫氧鳥苷-5’- 二磷酸(dGDP)、脫氧胸苷-5’ -三磷酸(dTTP)和脫氧胞苷-5’ -三磷酸(dCTP)，和RNA核苷酸諸如腺嘌呤-5’ -單磷酸(AMP)、胞苷-5’ - 二磷酸(⑶P)、肌苷-5’ -單磷酸(IMP)、尿苷-5’ -三磷酸(UTP)和鳥苷-5’ -三磷酸(GTP)。本文使用的核苷酸包括磷酸酯類似物諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、H-膦酸酯或烷基膦酸酯類似物。應當認識到，在某些方面，術語核苷堿基也可以用于表示天然存在的或非天然存在的核苷酸一在這方面，術語核苷堿基和核苷酸可以在本文中可互換地使用。核苷堿基包括、但不限于鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、5，6- 二氫尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胸腺嘧啶、N7-甲基鳥嘌呤、N7-甲基肌苷、5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶以及其它。本文提供的寡聚體化合物可以包含一種或多種單體，包括核苷或核苷酸，其具有修飾的糖部分。例如，可以以許多方式修飾核苷的呋喃糖基糖環，所述方式包括、但不限于添加取代基、橋接2個未成對的環原子以形成鎖定的核酸(LNA)。在某些實施方案中，寡聚體化合物包含一個或多個單體，所述單體是LNA。在某些這樣的實施方案中，LNA包括、但不限于如下描繪的(A) a-L-亞甲基氧基(4’ -CH2_0_2’ )LNA、(B) 3-D-亞甲基氧基(4，-CH2-0_2，) LNA、(C)亞乙基氧基(4，-(CH2)2H ) LNA、(D)氨基氧基(4，-CH2-O-N (R)-2’ ) LNA 和(E)氧基氨基(4，-CH2-N (R)-0-2 ’ ) LNA。
權利要求
1.一種反義寡聚體或其鹽、溶劑化物、水合物或酷，其用于減少哺乳動物細胞或生物體中的こ型肝炎病毒DNA和HBV抗原的量，其中所述反義寡聚體是長度為10-26個核苷的連續序列,且包含如式I所示的序列5’ -LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-N1-P-LNAr-P-LNArS,(式 I) 其中 LNA是鎖定的核酸； P是選自下述的核苷間連接磷酸ニ酷、磷酸三酷、硫代磷酸酷、ニ硫代磷酸酷、H-膦酸酷或烷基膦酸酯連接，所述連接是在LNA和鄰近的N之間，或在N和鄰近的N之間，或在N和鄰近的LNA之間，或在LNA和鄰近的LNA之間，從式(I)序列的5’至3’方向；且其中 N選自G、C、A、T、U或Z核苷單元； η和r和P和q各自獨立地是選自1、2或3的整數； I和m各自獨立地是1-22的整數；且 其中Z選自肌苷、N7-甲基肌苷、N7-甲基胍、5-甲基尿苷、5-甲基-胞苷、5-氟尿苷、5-氟胸苷、黃苷、ニ氫尿苷、假尿苷、2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、7-甲基-7-脫氮鳥苷、7-乙基-7-脫氮鳥苷、N4-甲基胞苷、N4-こ基胞苷。
2.根據權利要求I或2所述的反義寡聚體，其中所述寡聚體的至少4個核苷單元是LNA単元，且其中存在于連續核苷序列的核苷單元之間的至少2個核苷間連接P是硫代磷酸酯核苷間連接，且所述LNA是具有2, -O-烷基-4' C連接的鎖定的核酸単元，其中所述烷基是取代的或未取代的(；_6烷基。
3.根據權利要求I或2所述的反義寡聚體，其中存在于連續核苷酸序列的核苷酸單元之間的所有核苷酸間連接是硫代磷酸酯核苷酸間連接。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的反義寡聚體，其中所述反義寡聚體包含與SEQIDNO. 1-13中的任ー個基本上互補的序列。
5.根據權利要求1-3中任一項所述的反義寡聚體，其中所述反義寡聚體基本上包含SEQ ID NO. 14-22中的任ー個的序列。
6.根據權利要求1-3中任一項所述的反義寡聚體，其中所述反義寡聚體包含與SEQIDNO. 1-13中的任ー個基本上互補的序列，且其中所述こ型肝炎病毒是人こ型肝炎病毒，且所述細胞或生物體是人。
7.根據權利要求5所述的反義寡聚體，其中n、p、r和q各自獨立地是I或2，且I和m各自獨立地是2、3、4、5或6。
8.根據權利要求7所述的反義寡核苷酸，其中n、p、r和q各自獨立地是I，且I和m各自獨立地是6。
9.根據權利要求5、7或8中任一項所述的反義寡核苷酸，其中所述序列進ー步選自SEQID NO 14、16、16 或 20 中的任ー個。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的反義寡聚體，其中所述HBV抗原是HBsAg。
11.根據權利要求1-9中任一項所述的反義寡聚體，其中所述HBV抗原是HBeAg。
12.根據權利要求1-11中任一項所述的反義寡聚體，其中所述こ型肝炎病毒選自人地理學基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲)；B (印度尼西亞、中國、越南)；C(東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南);D (地中海地區、中東、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亞);G (美國、法國)；或H (中美洲)。
13.ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染的藥物制劑，其包含有效量的根據權利要求1-12中任一項所述的核酸寡聚體或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或酯和藥學上可接受的稀釋劑。
14.ー種用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒的藥物制劑，其包含有效量的根據權利要求1-13中任一項所述的核酸寡聚體或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或酯和藥學上可接受的稀釋劑。
15.ー種根據權利要求1-14中任一項所述的用于治療哺乳動物的こ型肝炎病毒感染的藥物制劑，其另外包含藥學上可接受的載體。
16.ー種用于治療具有こ型肝炎病毒感染或こ型肝炎病毒相關病癥的哺乳動物的方法，所述方法包括將治療有效量的根據權利要求1-11中任一項所述的反義寡核苷酸或根據權利要求13-15中任一項所述的藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而治療所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關病癥。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述哺乳動物是人，其中所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關病癥是來自人こ型肝炎病毒的こ型肝炎病毒感染。
18.根據權利要求16或權利要求17所述的用于治療具有こ型肝炎病毒感染的哺乳動物的方法，其中所述人こ型肝炎病毒選自人地理學基因型中的任ー種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲)；B (印度尼西亞、中國、越南)；C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D(地中海地區、中東、印度);E (非洲);F (美洲土著人、波利尼西亞);G (美國、法國);或H (中美洲)。
19.根據權利要求16-18中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物是人，且其中所述こ型肝炎病毒感染或所述こ型肝炎病毒相關病癥是人こ型肝炎病毒相關病癥。
20.根據權利要求17-19中任一項所述的方法，其中所述人こ型肝炎病毒相關病癥選自下述的任ー種黃疸、肝癌、肝炎癥、肝纖維化、肝硬化、肝衰竭、彌散性肝細胞炎性疾病、噬血細胞綜合征或血清性肝炎。
21.根據權利要求16-20中任一項所述的方法，所述方法另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進行。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述額外治療劑選自HBV劑、HCV劑、化學治療齊U、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑和免疫抑制劑。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述額外HBV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復制抑制劑；第二種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋；和HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。
24.根據權利要求22所述的方法，其中所述額外HCV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復制抑制劑；HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；和HCV單克隆或多克隆抗體治療劑。
25.一種用于減少受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物中的HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在的方法，所述方法包括將治療有效量的根據權利要求1-12中任一項所述的反義寡核苷酸或有效量的根據權利要求13-15中任一項所述的藥物組合物施用給有此需要的哺乳動物，從而與治療之前哺乳動物中HBV DNA的量和/或HBV抗原的存在相比，減少所述こ型肝炎病毒感染和所述こ型肝炎抗原。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述哺乳動物是人，且其中所述こ型肝炎病毒是人こ型肝炎病毒。
27.根據權利要求25或權利要求26所述的方法，其中所述人こ型肝炎病毒選自人地理學基因型中的任一種A (歐洲西北部、北美洲、中美洲);B (印度尼西亞、中國、越南);C (東亞、韓國、中國、日本、波利尼西亞、越南)；D (地中海地區、中東、印度)；E (非洲)；F (美洲土著人、波利尼西亞)；G (美國、法國)；或H (中美洲)。
28.根據權利要求25-27中任一項所述的方法，其中與施用反義寡聚體之前的量相比，DNA的量減少了 90%。
29.根據權利要求25所述的方法，其中所述HBV抗原是HBsAg。
30.根據權利要求25或權利要求26所述的方法，其中所述HBV抗原是HBeAg。
31.根據權利要求25-27或29-30中任一項所述的方法，其中HBV抗原的存在被充分地減少以導致血清轉換，所述血清轉換定義為如果監測HBeAg作為血清轉換的決定因子，血清HBeAg不存在+血清HbeAb存在，或者定義為如果監測HBsAg作為血清轉換的決定因子，血清HBsAg不存在，所述存在和不存在由商業ELISA系統的目前可得到的檢測限確定。
32.根據權利要求25所述的方法，所述方法另外包括與額外治療劑組合地施用反義寡聚體，其中所述反義寡聚體和所述額外治療劑在単一制劑中一起施用，或在不同制劑中分開施用，且其中所述核酸寡聚體和所述第二種治療劑的施用并行地或相繼地進行。
33.根據權利要求28所述的方法，其中所述額外治療劑選自HBV劑、HCV劑、化學治療齊U、抗生素、止痛劑、非類固醇類抗炎(NSAID)劑、抗真菌劑、抗寄生蟲劑、抗惡心劑、止瀉劑和免疫抑制劑。
34.根據權利要求29所述的方法，其中所述額外HBV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)、利巴韋林；HBV RNA復制抑制劑；第二種反義寡聚體；HBV治療疫苗；HBV預防疫苗；拉米夫定(3TC);恩替卡韋；替諾福韋；替比夫定(LdT);阿德福韋；和HBV抗體治療劑(單克隆的或多克隆的)。
35.根據權利要求29所述的方法，其中所述額外HCV劑選自干擾素a_2b、干擾素a -2a和干擾素alphacon-1 (聚こニ醇化的和未聚こニ醇化的)；利巴韋林；HCV RNA復制抑制劑HCV反義劑；HCV治療疫苗；HCV蛋白酶抑制劑；HCV解螺旋酶抑制劑；和HCV單克隆或多克隆抗體治療劑。
36.一種用于促進受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物的血清轉換的方法，所述方法包括 將治療有效量的根據權利要求1-12中任一項所述的反義寡核苷酸或根據權利要求13-15中任一項所述的藥物組合物施用給受こ型肝炎病毒感染的哺乳動物； 監測HBeAg + HBeAb在哺乳動物血清樣品中的存在；或監測HBsAg在哺乳動物血清樣品中的存在，以致干，如果監測HBeAg作為血清轉換的決定因子，則血清樣品中HBeAg的不存在+HbeAb的存在，或者，如果監測HBsAg作為血清轉換的決定因子，則血清樣品中HBsAg的不存在，指示哺乳動物的血清轉換，所述存在和不存在由商業ELISA系統的目前可得到的檢測限確定。
37.根據權利要求16、25或36中任一項所述的方法，其中施用選自ロ服、口腔的、直腸的、腸胃外的、腹膜內的、真皮內的、透皮的或氣管內的給藥。
全文摘要
公開了反義寡聚體，其可用于調節乙型肝炎病毒感染，和用于治療動物(包括人類)的乙型肝炎病毒(HBV)和乙型肝炎病毒相關病癥。更具體地，公開了用于治療動物的HBV的具有修飾的核苷酸的反義寡聚體，更具體地，所述反義寡聚體包含2′O-4′C-亞甲基橋接的糖類和具有其它2’O-4’C橋接的糖類的核苷酸，也稱作鎖定的核酸(LNA)，其用于治療動物的HBV，更具體地，用于治療人類的HBV。
文檔編號A61K31/7115GK102762215SQ201080046632
公開日2012年10月31日 申請日期2010年10月15日 優先權日2009年10月16日
發明者R.哈馬泰克 申請人:葛蘭素集團有限公司