專利名稱：用于蛋白質表達的具有未修飾和修飾核苷酸的組合的rna的制作方法
用于蛋白質表達的具有未修飾和修飾核苷酸的組合的RNA本發明涉及多核糖核苷酸，特別是信使RNA，其包含未修飾和修飾核苷酸的組合，用于蛋白質表達和這種RNA用于治療疾病和診斷程序的應用。信使RNA(mRNA)是聚合體，其由主要以腺苷、胞苷、尿苷和鳥苷作為核苷的磷酸核苷結構単元而構建，其作為中間載體將遺傳信息從細胞核中的DNA引入細胞質中，在此其被翻譯為蛋白質。因此其適于作為基因表達的替代物。細胞中生物化學過程的說明和人類基因組的說明已掲示缺陷型基因與疾病之間的聯系。因此通過基因治療治愈由缺陷型基因引起的疾病的愿望由來已久。預期很高，但對此的嘗試卻常常失敗。第一個基因治療方法包括將缺陷型或缺損型基因的完整DNA在載體中引入細胞核，從而實現完整基因的表達，因此提供缺失或缺損型蛋白質。這些嘗試常常不成功，并且不太成功的嘗試伴有明顯的副作用，特別是腫瘤發生提高。 此外，存在由于蛋白質缺少或蛋白質缺陷引起的疾病，而其不可歸因于遺傳缺陷。在這種情況下，還對通過給予DNA在體內生成相關蛋白質給予考慮。在代謝中產生影響并由于病理學或非病理學原因被破壞或抑制的因子的提供也可被零或低副作用的核酸治療而影響。mRNA對于治療遺傳性疾病從而治療導致疾病的基因缺陷的應用也已被提出。其中的優勢是mRNA僅必須被引入細胞的細胞質，而不必被插入細胞核中。插入細胞核非常困難和低效；此外，如果載體或其部分被整合到基因組中，則被改變的染色體DNA存在相當的風險。同然，可顯示體外轉錄的信使RNA事實上可在哺乳動物的組織中得到表達，但在利用mRNA治療疾病的嘗試中產生了進ー步的障礙。mRNA穩定性的缺乏具有哺乳動物組織中所需蛋白質不能被以足量利用的影響。進ー步明顯的劣勢源于mRNA引起相當的免疫學反應的事實。假設這些強烈的免疫反應通過結合Toll型受體如TLR3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-I而產生。為防止免疫學反應，WO 2007/024708提出利用其中四分之一的核糖核苷酸被修飾核苷酸取代的RNA。特別是，考察了在尿苷完全被假尿苷取代時mRNA如何行為。發現這種RNA分子具有明顯減少的免疫原性。但是，這些產物的生物學活性還不足以進行成功的治療。此外，發現其中兩種或更多種類型的核苷酸完全被修飾替代的RNA序列很難制成或根本無法制成。為能夠為身體提供必要的或有益的蛋白質和/或提供核酸以治療由于缺失的或缺陷型蛋白質引起的疾病，需要具有可轉染細胞的可利用的核酸，其在細胞中足夠長時間地保持穩定并提供足量的蛋白質，從而避免過度頻繁的施藥。但是同時，這種核酸必須不導致明顯程度的免疫學反應。因此本發明的目的是提供這樣的劑其適用于治療缺陷型或缺損型基因引起的疾病或缺失或缺損型蛋白質引起的疾病；或可體內產生必要的或有益的蛋白質，其引起顯著減少的免疫應答或不引起免疫應答，在生理環境中穩定，即在給予后不立即降解，并且總體上適于作為治療劑。進一歩，本發明的目的是提供這樣的劑用于治療可被蛋白質的體內生成積極影響的疾病。該問題由權利要求I限定的多核糖核苷酸解決。特別適合的是mRNA，其編碼蛋白質或蛋白質片段，所述蛋白質或蛋白質片段的缺陷或缺失不利于身體或其表達有利于身體。當下文使用術語“多核糖核苷酸”或“ mRNA”時，除非上下文另外陳述，應始終假定其為編碼與疾病或缺失有關的蛋白質或蛋白質片段——如上所述——或編碼有益或支持身體的蛋白質或蛋白質片段的多核糖核苷酸或mRNA。已令人驚訝地發現，如果應用既包含未修飾核苷酸也包含修飾核苷酸的RNA，上述問題可由核糖核酸或多核糖核苷酸(下文也一般被稱為RNA)解決，特別是由信使RNA(mRNA)解決，重要的是，預定含量的尿苷和胞苷核苷酸分別以修飾形式存在。進ー步，已令人驚訝地觀察到，其中兩種類型的核苷酸分別部分被修飾核苷酸替代的RNA顯示高翻譯和轉染效力，即RNA比已知RNA所可能的轉染更多的細胞，并且每個細胞產生更多的編碼蛋白質。此外，根據本發明修飾的RNA比由本領域狀態已知的RNA或未修飾的RNA的活性更長。 根據本發明所述的RNA實現的優勢未修飾和完全修飾的RNA均不可得到。已發現，如果mRNA中修飾尿苷和胞苷核苷酸的含量均被具體限定并且為至少5%和不高于50%，可實現免疫-原性減少以及穩定性増加。如果應用無修飾的mRNA，其極具免疫原性，而當全部尿苷和胞苷核苷酸均以修飾形式存在吋，生物學活性對于以治療為目的的應用過低，而不具備可能性。其中修飾核苷酸的含量極高的RNA可在非常艱難的條件下生成或根本不能生成。因此，已確定，僅包含替代尿苷的假尿苷和僅包含修飾胞嘧啶和/或修飾腺苷的核苷酸混合物不能生成任何RNA序列。但是令人驚訝地，根據本發明所述的方式修飾的RNA序列可被容易地生成，并具有合理的效カ。此外，已發現，修飾的性質至關重要。根據本發明修飾的mRNA顯示低免疫原性，并具有長壽命。已發現，根據本發明所述的RNA的穩定性與之前應用的核酸相比得到顯著提高。因此，已確定，根據本發明所述的mRNA在轉染后10天可被檢測到比未修飾的RNA高10倍的量。増加的壽命以及高轉染率首先使根據本發明所述的mRNA能用于治療目的，因為高穩定性和由此而來的長壽命使其能夠在較長的時間間隔下完成給藥，因此其也可被患者接受。因此，根據本發明，提供了用于治療目的的特別有利的劑。根據本發明所述的RNA滿足如下需要被置于治療所用的產物上作為RNA其僅需被引入細胞質，無需被引入細胞核以發揮其活性，整合到基因組中的危險不存在，根據本發明所述的修飾類型很大程度地防止免疫反應，此外修飾防止RNA迅速降解。因此用根據本發明所述的RNA能夠在組織中產生或重新產生生理學功能，例如恢復已經由于缺陷型或缺損型基因而喪失的體內功能，從而治療缺陷型或缺損型基因引起的疾病。進一歩，已令人驚訝地發現，根據本發明所述的多核糖核苷酸可有利地影響疾病，原因是蛋白質在體內生成，其可直接或間接對病程造成影響。因此，根據本發明，也可提供這樣的多核糖核苷酸其編碼在總體情況或具體情況下有益于和支持身體的因子，例如生長因子、血管發生因子、刺激因子、誘導因子、酶或其他生物活性分子。以下描述和附圖對本發明進行更詳細的說明。圖I顯示不同核苷酸修飾對不同mRNA的免疫原性和穩定性的影響。圖IA是對給予具有不同修飾核苷酸的各種RNA后的TNF- α水平作圖的圖。未修飾和高達25%單修飾的RNA導致這種RNA的高炎性標記水平，并顯示高免疫原性，而對于根據本發明雙修飾的RNA，炎性標記以可耐受量存在。圖IB和IC顯示人類細胞和小鼠細胞中以多種方式修飾的mRNA的生物學活性(轉染效カ和表達)，為紅色熒光蛋白質(RFP)的陽性細胞的百分率和每個細胞的RFP量。該圖顯示，未修飾、單修飾和完全修飾的RNA編碼的蛋白質僅可被檢測到較低的百分含量，而根據本發明部分雙修飾的RNA由于其較高的穩定性生成明顯較高的蛋白質量。圖2顯示多修飾(multiply modified)mRNA較高的穩定性和較長的表達持續時間。圖2A和2B分別顯示對不同的修飾和未修飾mRNA的表達持續時間作圖的圖。圖2C顯示未修飾RNA、單修飾(singly modified) RNA和多修飾RNA的RNA免疫沉淀數據。圖2D顯示對體內靜脈內給藥后不同mRNA的免疫原性作圖的圖。數據顯示，根據本發明雙修飾的RNA呈現高穩定性和低免疫原性的組合。圖3顯示SP-B條件性缺陷型小鼠的中的修飾SP-B mRNA的氣管內氣溶膠應用后得到的多個測試結果。圖3A顯示用未修飾RNA和多修飾RNA治療的小鼠的肺的生物發光 圖像。明顯可見的是，5天后僅根據本發明修飾的RNA仍表達足量的蛋白質，而未修飾RNA的表達在3小時后就已經很低。圖3B顯示將通量相對于轉染后時間作圖的圖。明顯可見，根據本發明所述的修飾延長了表達持續時間。圖3C顯示SP-B mRNA的用藥計劃。圖3D顯示呈現將用修飾mRNA治療的小鼠與用對照mRNA治療的小鼠的存活率進行比較的圖，用根據本發明所述的RNA治療的小鼠的存活率顯著更長。圖3E顯示免疫染色，其中可見用根據本發明所述的編碼SP-B的RNA可重建SP-B缺陷型小鼠的SP-B。圖3F顯示，由半定量蛋白質印跡分析得到的在無細胞BALF上清液中的蛋白質分布。圖3G和H顯示根據3C治療的小鼠的肺組織學制備物和支氣管肺泡灌洗制備物的圖像。當已接受對照RNA的小鼠的肺和灌洗制備物顯示SP-B缺陷常見的肺損傷時，用根據本發明所述的RNA治療的小鼠的制備物無病理。圖31顯示關于肺隨時間的耐受性的圖。在根據本發明所述的RNA的治療下，肺功能保持較長的時間，而在用對照RNA治療的動物中發現肺損傷。圖4顯示將未修飾和不同修飾的mRNA產生的RFP的熒光強度相對于時間作圖的圖。與未修飾mRNA相比，修飾mRNA較晚被翻譯并且強度較弱。圖5顯示對用不同mRNA治療的小鼠的炎性標記作圖的三個圖。明顯可見,根據本發明修飾的RNA不導致炎性反應，而未修飾RNA導致強烈的免疫反應。圖6顯示對用根據本發明所述的不同mRNA治療的小鼠的不同典型肺參數作圖的圖。該參數為組織弾性(HL)、組織阻尼(GL)、組織慣性、呼吸道阻力(Rn)和肺組織組成Eta(GL/HL)。對于根據本發明所述的RNA，沒有參數比陽性對照組更差。圖7在圖中顯示不同修飾mRNA的表達能力，在該圖中對具有不同含量的修飾核苷酸的mRNA的RFP陽性細胞的百分含量作圖。比較顯示，僅根據本發明修飾的mRNA在人類細胞以及及同樣在小鼠細胞中均導致持久表達，而非根據本發明修飾的mRNA以較低的程度表達。圖8在圖中顯示不同修飾mRNA的表達能力，在該圖中對具有不同修飾核苷酸的mRNA的RFP陽性細胞的百分含量作圖。比較顯示，僅根據本發明修飾的mRNA在人類細胞以及同樣在小鼠細胞中均導致持久表達，而非根據本發明修飾的mRNA以較低的程度表達。
圖9顯示凍干的根據本發明所述的RNA的穩定性。圖IOA顯示對不同修飾核苷酸的轉染效力作圖的圖。明顯可見，其中10%尿苷核苷酸和10%胞苷核苷酸以及任選地5%進ー步核苷酸被修飾的RNA實現最高的轉染效力。圖IOB顯示對具有不同修飾核苷酸的RNA的TNF-α生成——作為免疫學反應標記——作圖的圖。這些是各自用SygmRNA轉染的人類PBMC的ELISA結果。除非另外說明，修飾率各自為10%。明顯可見，其中5至50%之間的尿苷核苷酸和胞苷核苷酸修飾的RNA與未修飾的RNA相比具有明顯降低的免疫原性。
圖11顯示多個測試的結果，由其測定根據本發明修飾的編碼EPO的mRNA的穩定性和免疫原性。圖11 (a)顯示在給予以不同方式修飾的編碼EPO的mRNA后14天可檢測到的促紅細胞生成素含量。明顯可見，14天后注入根據本發明修飾的mRNA的小鼠中的EPO含 量比未治療的小鼠高4. 8倍，但也比用未修飾的RNA治療的小鼠高4. 8倍，并且仍比用單修飾的RNA治療的小鼠高2. 5倍。 圖11 (b)顯示在給予具有不同修飾的編碼EPO的mRNA后14天和28天的紅細胞壓積值。該圖清楚顯示，用根據本發明修飾的mRNA治療的小鼠具有的明顯較高的紅細胞壓積值。在圖11(c)的圖中，對免疫學反應的一般性因子的生成作圖。發現在給予未修飾mRNA下所有四種炎性標記全部提高，而在給予根據本發明修飾的RNA下免疫學反應幾乎不可檢測到。圖11 (d)的圖顯示IFN-α和IL-12的相應值，其也是炎性標記。在此同樣發現根據本發明修飾的mRNA實際上不引起免疫學反應，與未修飾mRNA形成對比。圖12顯示對在一周兩次給予根據本發明修飾的SP-B mRNA (B)或在28天一周兩次給予根據本發明修飾的SP-B mRNA (C)或在對照組給予修飾EGFPLucmRNA (A)的三組小鼠的存活率作圖的圖。發現只有小鼠被給予SP-B mRNA(BX)才能存活。不提供SP-B mRNA,則小鼠死亡(A)。圖13顯示給予未修飾的SP-B mRNA、根據本發明修飾的SP-B mRNA或SP-B質粒DNA后8小時小鼠支氣管肺泡灌洗的細胞因子水平。結果顯示，與氣管內給予未修飾的mRNA或質粒DNA——各自導致炎性標記IFN Y和IL-12顯著增加——相反，在給予根據本發明修飾的SP-B mRNA下，炎性標記與未治療的組或全氟碳治療組相比實際上沒有増加。圖14顯示在重復給予根據本發明修飾的mEPO mRNA后得到的紅細胞壓積值。結果顯示，重復給予根據本發明修飾的mEPO mRNA被良好地耐受，并且造成紅細胞壓積持久升聞。圖15顯示與鈦植入體溫育的細胞的熒光素酶表達，該鈦植入體被提供有包含不同形式的根據本發明修飾的RNA的涂層。發現根據本發明修飾的RNA——其被包含在已施加于鈦板上的延遲釋放的聚合物涂層中并且逐漸自其釋放——沒有喪失其活性。圖16顯示施加于鈦植入體上、包含修飾mRNA的涂層的熒光素酶表達。發現根據本發明修飾的mRNA的蛋白質表達與未處理的RNA相比大幅提高，但也高于質粒DNA。圖17A和17B分別顯示具有微RNA 142_3p的微RNA結合位點的mRNA的RFP-陽性細胞的相對含量和相對RFP表達。發現具有微RNA結合位點的RNARFP-陽性細胞的含量較低，并且包含相應微RNA 142-3p的細胞中的編碼蛋白質的表達明顯較低。圖18顯示通過并入編碼RFP的微RNA結合位點修飾的RNA的序列。以灰色背景顯示RFP序列。帶有間隔序列(無背景)的微RNA 142-3p的微RNA結合位點的四倍串聯重復(淺灰色背景)具有下劃線。根據本發明，提供了具有部分多修飾核苷酸、部分多修飾mRNA、IVT mRNA的多核糖核苷酸分子和該RNA分子用于生成治療由于缺陷型或缺損型基因引起的疾病或治療通過 體內提供蛋白質如因子、刺激因子、誘導因子或酶緩解或治愈的疾病的藥物的應用。在進ー步的實施方式中，將根據本發明所述的mRNA與靶結合位點、靶向序列和/或與微RNA結合位點結合，從而使所需mRNA的活性僅存在于相關的細胞中。在進ー步的實施方式中，將根據本發明所述的RNA與微RNA或shRNA下游的3，聚A尾部結合。在進ー步的實施方式中，提供了其作用持續時間已通過進ー步特定修飾被調節或延長的RNA。因此，本發明的主題是穩定性提高并且免疫原性降低的RNA。根據本發明所述的RNA可以本身已知的方式制成。通常，其通過轉錄編碼完整或所需的可對疾病或其中的引發疾病的缺失或缺陷形式產生影響的蛋白質的DNA而制成。在本發明的上下文中，應理解RNA意為如下任何多核糖核苷酸分子如果其進入細胞，則適于蛋白質或其片段表達；或可被翻譯為蛋白質或其片段。術語“蛋白質”在此包括任何種類的氨基酸序列——即各自通過肽鍵連接的兩種或更多種氨基酸的鏈，也包括肽和融合蛋白質。根據本發明所述的RNA包含編碼如下蛋白質或其片段的核糖核苷酸序列所述蛋白質或其片段在細胞中或細胞周圍的功能是需要或有益的，例如這樣的蛋白質，其缺失或缺損型形式引起疾病或病癥、其的提供可緩解或預防疾病或病癥或其可在細胞中或細胞周圍促進有益于身體的過程。通常，根據本發明所述的RNA包含完整蛋白質或其功能性變體的序列。進ー步，核糖核苷酸序列可編碼充當因子，誘導因子、調節因子、刺激因子或酶的蛋白質或其功能性片段，其中該蛋白質是其功能為治療疾病——特別是代謝疾病——或為啟動體內過程如新血管、組織等的形成所必需的蛋白質。在此，功能性變體被理解意為在細胞中可承擔如下蛋白質的功能的片段其在細胞中的功能是被需要的或其缺失或缺損型形式是致病的。此外，根據本發明所述的RNA還可具有進ー步的功能區和/或3’或5’非編碼區。3’和/或5’非編碼區可以是天然地在編碼蛋白質或其他有助于RNA穩定的人造序列的側翼的區域。本領域技術人員通過常規實驗可發現在各種情況下對此適合的序列。在優選的實施方式中，RNA包含m7GpppG帽、內部核糖體進入位點(IRES)和/或3’末端的多A尾部，特別是從而提高翻譯。RNA可具有促進翻譯的進ー步區域。根據本發明所述的RNA的關鍵是其修飾核苷酸的含量。根據本發明所述的穩定性提高和免疫原性降低的RNA通過將其中修飾胞苷核苷酸和修飾尿苷核苷酸的含量被設定的核苷酸混合物用于其生產而得到。根據本發明所述的RNA優選地用包含未修飾以及修飾核苷酸的核苷酸混合物生產，其中5至50%的胞苷核苷酸和5至50%的尿苷核苷酸被修飾。包含腺苷和鳥苷的核苷酸可未被修飾。也可應用其中ATP和/或GTP中的一些也被修飾的核苷酸混合物，其中其含量應不超過20%，并且其中其含量——如存在——應優選在O. 5至10%的范圍內。因此，在優選的實施方式中，提供了具有5至50%修飾胞苷核苷酸和5至50%尿苷核苷酸和50至95 %未修飾胞苷核苷酸和50至95 %未修飾尿苷核苷酸的mRNA，并且腺苷和鳥苷核苷酸可以是未修飾的或部分修飾的，并且它們優選以未修飾形式存在。優選10至35%的胞苷和尿苷核苷酸是修飾的，特別優選修飾胞苷核苷酸的含量在7. 5至25%的范圍內并且修飾尿苷核苷酸的含量在7. 5至25%的范圍內。已發現，事實上，相對低的含量，例如分別僅10 %的修飾胞苷和尿苷核苷酸，在其為根據本發明所述的修飾的先決條件下可實現所需性質。核苷修飾的本質對mRNA的穩定性從而壽命和生物學活性具有影響。適當的修飾
在下表中顯不
權利要求
1.具有編碼蛋白質或蛋白質片段的序列的多核糖核苷酸，其中所述多核糖核苷酸包含未修飾和修飾核苷酸的組合，其中5至50%的尿苷核苷酸和5至50%的胞苷核苷酸分別為修飾的尿苷核苷酸和修飾的胞苷核苷酸。
2.具有編碼蛋白質或蛋白質片段的序列的多核糖核苷酸，其可得自核苷酸ATP、GTP、CTP和UTP的核苷酸混合物，其中5至50%的胞苷核苷酸和5至50%的尿苷核苷酸被修飾。
3.權利要求I或權利要求2所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述多核糖核苷酸是mRNAo
4.權利要求3所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述mRNA是體外轉錄的mRNA(IVTmRNA)。
5.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述RNA編碼蛋白質或蛋白質片段，所述蛋白質或蛋白質片段的缺陷或缺失可引起疾病，所述蛋白質或蛋白質片段可緩解、預防或治愈疾病或可有助于有益的或必要的功能。
6.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于15至30%，優選地7. 5至.25%的尿苷核苷和15至30%，優選地7. 5至25%的胞苷核苷被修飾。
7.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含至少兩種類型的修飾尿苷核苷和/或至少兩種類型的修飾胞苷核苷。
8.權利要求7所述的多核糖核苷酸,其特征在于至少一種類型的修飾尿苷核苷和/或胞苷核苷具有用于連接一個或多個功能載體的官能團，作為修飾。
9.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于修飾尿苷選自2-硫尿苷、.5-甲基尿苷、假尿苷、5-甲基尿苷5’ -三磷酸(m5U)、5_碘尿苷5’ -三磷酸(I5U)、4-硫尿苷5’ -三磷酸(S4U)、5_溴尿苷5’ -三磷酸(Br5U)、2’ -甲基-2’ -脫氧尿苷5’ -三磷酸(U2，m)、2’ -氛基-2’ -脫氧尿昔5’ - 二憐酸(U2，NH2)、2’ -疊氣基-2’ -脫氧尿昔5’ - 二磷酸(U2，N3)和2’ -氟-2，-脫氧尿苷5，-三磷酸(U2，F)。
10.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于修飾胞苷選自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、2-硫代-胞苷、2’ -甲基_2’ -脫氧胞苷5’ -三磷酸(C2’ m)、2’ -氨基-2’ -脫氧胞苷5’ -三磷酸(C2，NH2)、2’ -氟-2’ -脫氧胞苷5’ -三磷酸(C2，F)、5_碘胞苷5’-三磷酸(I5U)、5-溴胞苷5’-三磷酸(Br5U)和2’-疊氮基-2’-脫氧胞苷5’-三磷酸(C2，N3)。
11.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于其在5’末端具有m7GpppG帽和/或至少一個IRES和/或多A尾部。
12.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其用于轉錄體替代治療。
13.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含mRNA序列，所述mRNA序列編碼至少一種總體上或在特定情況下有益于和支持身體的因子。
14.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含RNA序列，所述RNA序列編碼生長因子、血管發生因子、刺激因子、誘導因子、酶或其他生物活性分子。
15.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，其特征在于其包含mRNA序列，所述RNA序列編碼表面活性蛋白B (SP-B)、EPO、ABCA3、BMP-2或其片段。
16.權利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含編碼SP-B的序列，用于治療新生兒呼吸窘迫綜合征。
17.權利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含編碼EPO的序列，用于治療EPO缺陷。
18.權利要求13所述的多核糖核苷酸，其包含至少一種編碼生長因子、血管發生因子、刺激因子、誘導因子或酶的序列，用于植入體的涂層。
19.前述權利要求中的一項所述的多核糖核苷酸，進一步包含至少一個靶序列或在靶細胞中不表達的內源微RNA的靶定序列。
20.權利要求8所述的多核糖核苷酸，其特征在于所述功能載體是靶序列、PEG基團和/或靶向配體。
21.藥物組合物，包含至少一種前述權利要求中的一項所述的RNA和藥學可接受的添加劑。
22.權利要求21所述的藥物組合物，其是氣管內和/或肺部給予的形式，或是施用于植入體上的層的形式。
23.權利要求22所述的藥物組合物，其另外包含用于在給予包含RNA的組合物前或期間給予的至少一種全氟碳。
24.權利要求23所述的藥物組合物，其包含全氟碳和S2U(a25)m5C(a25)SP-BmRNA。
25.植入體，其具有權利要求I至20中的一項所述的修飾RNA的涂層，所述修飾RNA在作為載體的延遲釋放的聚合物中。
26.權利要求25所述的植入體，其是牙齒植入體、髖內用假體，膝內用假體或脊椎融合體。
27.權利要求25或26所述的植入體，其中所述載體聚合物包含至少一種類型的修飾RNA。
28.權利要求25至27中的一項所述的的植入體，其中所述載體聚合物包含編碼至少一種對植入有益的蛋白質的RNA。
29.權利要求25至28中的一項所述的的植入體，其中所述載體聚合物包含編碼一種或多種生長因子和一種或多種血管發生因子的RNA。
30.篩選核苷酸序列從而測試免疫原性和表達性質的方法，其中使RNA序列接觸至少一種選自TLR3、TLR3、TLR8和解旋酶RIG-I的受體，并且測定結合能力。
全文摘要
本發明涉及具有編碼蛋白質或蛋白質片段的序列的多核糖核苷酸，其中該多核糖核苷酸包含未修飾和修飾核苷酸的組合，其中5至50％的尿苷核苷酸和5至50％的胞苷核苷酸為修飾的尿苷核苷酸和修飾的胞苷核苷酸。
文檔編號A61K48/00GK102695525SQ201080045543
公開日2012年9月26日 申請日期2010年7月30日 優先權日2009年7月31日
發明者C·魯道夫, M·柯爾曼 申請人:埃澤瑞斯公司