使用甘丙肽再靶向內肽酶治療癌癥的方法

專利名稱：：使用甘丙肽再靶向內肽酶治療癌癥的方法使用甘丙肽再靶向內肽酶治療癌癥的方法本專利申請依據35U.S.C.§119(e)要求于2009年8月14日提交的第61/233，937號美國臨時專利申請(將其通過引用整體并入本文)的優先權。癌癥是超過100種疾病的組群，在所述疾病中一組細胞顯示不受控制的生長(超出正常限制的細胞分裂)。在大多數情況下，癌細胞形成一團稱為腫瘤的細胞，盡管在某些癌癥如白血病中，細胞不形成腫瘤。腫瘤可以是惡性的或良性的。此外，惡性腫瘤(或癌癥)包括具有異常遺傳物質的細胞并且通常經歷快速不受控制的細胞生長，侵襲并且破壞鄰近組織，并且有時通過淋巴液或血液擴散至身體的其它位置(即，轉移)。癌癥與死亡的高發生率相關，因為如果不終止癌癥在整個身體中的侵襲和轉移，那么癌細胞將侵襲生命器官，并且導致器官的功能障礙，最終導致死亡。癌癥的惡性性質使它們區別于良性腫瘤，所述良性腫瘤通常緩慢生長并且具有自限性，不侵襲或轉移，這樣，它們通常不威脅生命。在局部、局域或遠距離階段上的癌癥被認為是侵襲性的。僅在少數幾層細胞中發現的非常早期的癌癥(稱為原位癌)被認為是非侵襲性的。癌癥是它們的病因和生物學有很大不同的不同種類的疾病。癌癥可由多種單獨作用或組合作用的因素引起。某些癌癥由外部因素例如煙草、飲食、某些化學藥品、輻射和病毒引起。其它癌癥由內部因素例如激素、免疫狀況和固有的遺傳突變引起。從暴露于引發癌癥的因素至疾病可被檢測通常經歷10年或更多年的時間。癌癥通常通過與腫瘤相似的細胞的類型來分類，因此，組織假定為腫瘤的來源。癌是衍生自上皮細胞的惡性腫瘤。該組代表最常見的癌癥，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結腸癌的常見形式。肉瘤是衍生自結締組織或間充質細胞的惡性腫瘤。胚細胞瘤通常是與未成熟或胚胎組織相似的惡性腫瘤。此類腫瘤中的許多腫瘤在兒童中最常見。淋巴瘤和白血病是衍生自造血(形成血液的)細胞的惡性腫瘤。最后，生殖細胞腫瘤是衍生自全能細胞的腫瘤。在成人中，最常見地見于睪丸和卵巢中；在胎兒、嬰兒和幼兒中，最常見地見于身體中線，特別地在尾骨的尖端。癌癥是美國的第二大死亡原因，據估計在1998年發生1，2，600例新病例和564，800例死亡。在過去的50年中，癌癥的死亡率一直在穩定上升，主要歸因于因吸煙引起的肺癌死亡率的大大上升。癌癥在所有年齡的人中發生，但其發生在45歲以上的人中極大地增加。然而，癌癥是美國35至65歲的人的第一大死因，并且其也是15歲以下美國兒童中的非事故死亡的第一大原因。男性因癌癥而具有比女性更高的死亡率，并且黑人具有任何主要人種組的最高癌癥死亡率。在美國，男性發生癌癥的終生危險為約1/2，女性具有約1/3的終身風險。隨著預期的心臟病和中風引起的死亡的持續減少，癌癥到2010年將成為整個美國人口的總體上第一大死因。癌癥的診斷通常需要由病理學家對組織活檢樣本進行組織學檢查，雖然惡性腫瘤的最初指標可以是癥狀或放射攝影影像異常。一旦被診斷，通常通過手術、化學療法、放射療法或靶向療法如免疫療法、激素療法或血管生成抑制劑療法來治療癌癥。治療的選擇取決于腫瘤的位置和分級及疾病的分期，以及患者的一般健康狀況(體力狀態)。此外，取決于癌癥的類型和分期，可同時組合或相繼使用這些類型的癌癥治療的兩種或更多種治療。雖然完全除去癌癥而不損害身體的其余部分是治療的目的，但目前治療癌癥的方法只獲得有限的成功。關于手術，這部分歸因于個別或少數癌細胞侵襲鄰近組織或轉移至遠距離部位的傾向性，從而限制局部手術治療的功效。化學療法和放射療法的功效通常受到對身體正常組織的毒性和損傷的限制。雖然靶向療法具有前景，但正如它們的名稱所暗示的，這類治療通常特異于一種特定類型的癌癥。因此，對于癌癥的治療高度期望可靶向癌細胞(無論它們的位置如何)的化合物和方法。此外，可靶向目前無靶向療法的特定類型的癌癥的化合物和方法也是高度期望的。梭菌毒素例如肉毒毒素(BoNT)、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/Cl、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G以及破傷風神經毒素(TeNT)抑制神經元傳遞的能力正被用于許多治療禾口美容應用中，參見例如WilliamJ.Lipham,CosmeticandClinicalApplicationsofBotulinumToxin(Slack,Inc.，2004)。作為藥物組合物的商購可得的梭菌毒素包括BoNT/A制劑，例如BOTOX(AllerganJnc.,Irvine,CA)>DYSPORT/RELOXIN,(BeaufourIpsen,PortonDown,England)、NEURONOX(Medy-Tox,Inc.,Ochang-myeon,SouthKorea)BTX-A(LanzhouInstituteBiologicalProducts,China)禾口XEOMIN(MerzPharmaceuticals,GmbH.，Frankfurt,Germany)；以及BoNT/B制劑，例如，MY0BL0C/NEUR0BL0C(SolsticeNeurosciences,Inc.SanFrancisco,CA)。例如，BOTOX目前在一個或多個國家被批準用于下列適應癥失弛緩癥、成人痙攣狀態(adultspasticity)、肛門裂、背痛、眼瞼痙攣、夜磨牙癥、頸肌張力障礙、特發性震顫、眉間皺紋(glabellarlines)或運動過度面部皺紋(hyperkineticfaciallines)、頭痛、半面痙攣、膀胱的活動過度、多汗癥、青少年腦癱、多發性硬化、肌陣攣障礙(myoclonicdisorder)、鼻唇皺紋(nasallabiallines)、痙攣性發音困難(spasmodicdysphonia)、斜視和VII神經障礙。梭菌毒素治療通過中斷用于將神經遞質分泌入突觸間隙的胞吐過程來抑制神經遞質釋放。該中斷最終通過包含酶促結構域的梭菌毒素輕鏈的細胞內遞送來實現，所述輕鏈在所述酶促結構域中切割胞吐過程所必需的SNARE蛋白。制藥工業極其期望使梭菌毒素療法的用途超出其目前的肌肉松弛應用，擴展至治療其它疾病例如多種基于感覺神經的疾病如慢性疼痛、神經原性感染和泌尿生殖器疾病以及基于非神經障礙例如胰腺炎和癌癥。目前被利用于擴展基于梭菌毒素的治療的一個方法包括修飾梭菌毒素以便經修飾的毒素對于非梭菌毒素靶細胞具有改變的細胞靶向能力。該再靶向能力通過用靶向性結構域(顯示對于存在于非梭菌毒素靶細胞中的非梭菌毒素受體的選擇性結合活性)替代梭菌毒素的天然存在的靶向性結構域來實現。對靶向性結構域的此類修飾導致能夠選擇性結合存在于非梭菌毒素靶細胞的非梭菌毒素受體(靶受體)(被再靶向)。具有對于非梭菌毒素靶細胞的靶向性活性的經修飾的梭菌毒素可結合存在于非梭菌毒素靶細胞上的受體，轉移進入細胞質，然后對非梭菌毒素靶細胞的SNARE復合物發揮其蛋白水解作用。在本質上，通過選擇適當的靶向性結構域將包含酶促結構域的梭菌毒素輕鏈細胞內遞送至任何期望的細胞。本說明書公開了一類再靶向稱為靶向囊泡胞吐調節蛋白(TargetedVesicularExocytosisModulatingProtein)(TVEMP)的非梭菌毒素受體的經修飾的梭菌毒素、包含TVEMP的組合物和用于治療患有癌癥的個體的方法。TVEMP是重組產生的蛋白質，其包含靶向性結構域以及梭菌毒素的轉位結構域和酶促結構域。選擇靶向的結合存在于目的靶癌細胞上的受體的能力。梭菌毒素轉位結構域和酶促結構域用于將酶促結構域遞送入靶細胞的細胞質，在所述細胞質中其切割其同源SNARE底物。SNARE蛋白切割中斷胞吐作用，其中細胞內囊泡中包含的物質通過囊泡膜與外細胞膜的融合從細胞排出的細胞分泌和排泄的過程。該中斷阻止細胞的許多重要過程，包括但不限于跨膜蛋白(包括細胞表面受體和信號轉導蛋白)的插入；細胞外基質蛋白至細胞外隙的運輸；蛋白質(包括生長因子、血管生成因子、神經遞質、激素和參與細胞通訊的任何其它分子)的分泌；和物質(包括廢物、代謝產物和其它不想要的或有害分子)的排除。這樣，胞吐中斷嚴重地影響了細胞代謝，并且最終影響細胞存活力。因此減少或抑制細胞的胞吐的治療性分子削弱了細胞存活的能力。基于該假定，本文中公開的TVEMP經設計靶向癌細胞，其中酶促結構域的隨后轉移通過SNARE蛋白切割中斷胞吐，從而削弱癌細胞存活的能力。因此，本發明的方面提供了包含TVEMP的組合物，所述TVEMP包含靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域和梭菌毒素酶促結構域。用于此類組合物的開發的TVEMP描述于例如Steward,L.E.等人，ModifiedClostridialToxinswithEnhancedTranslocationCapabilitiesandAlteredTargetingActivityForNon-ClostridialToxinTargetCells，第11/776，075號美國專利申請(2007年7月11日)；Dolly,J.0.等人，ActivatableClostridialToxins，第11/8,475號美國專利申請(2007年7月27日)；Foster,K.Α.等人，FusionProteins，第WO2006/059093號國際專利公布(2006年6月8日)；和Foster，K.Α.等人，Non-CytotoxicProteinConjugates，第WO2006/059105號國際專利公布(2008年6月8日)(將所述每一個專利通過引用并入本文)。包含TVEMP的組合物可以是藥物組合物。除TVEMP以外，此類藥物組合物還可包括藥用載體、藥用組分或兩者。本發明的其它方面提供了治療哺乳動物的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的哺乳動物施用治療有效量的包含TVEMP的組合物的步驟，所述TVEMP包含靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域和梭菌毒素酶促結構域，其中組合物的施用減輕與癌癥相關的癥狀。預期可使用本文中公開的任何TVEMP，包括在例如Meward，同上Q007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO2006/059093(2006)；和Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中公開的TVEMP。公開的方法提供了用于治療癌癥的安全、價廉、基于門診患者的治療。本發明的其它方面提供了治療哺乳動物的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的哺乳動物施用治療有效量的包含TVEMP的組合物，所述TVEMP包含靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域、梭菌毒素酶促結構域以及外源蛋白酶切割位點，其中組合物的施用減輕與癌癥相關的癥狀。設想可使用本文中公開的任何TVEMP，包括在例如Meward，同上(2007)；Dolly,同上(2007)；Foster,同上，W02006/059093(2006)；和Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中公開的TVEMP。本發明的其它方面提供了TVEMP在制造用于治療有此需要的哺乳動物的癌癥的藥物中的用途，其中TVEMP包含靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域和梭菌毒素酶促結構域并且其中給哺乳動物施用治療有效量的藥物減輕與癌癥相關的癥狀。設想可使用本文中公開的任何TVEMP，包括例如例如Meward，同上(2007)；Dolly，同上(2007)；Foster，同上，WO2006/059093(2006)；和Foster，同上，W02006/059105(2006年6月8日)中公開的TVEMP0本發明的其它方面提供了TVEMP在治療有此需要的哺乳動物的癌癥中的應用，所述應用包括給哺乳動物施用治療有效量的TVEMP的步驟，其中TVEMP包含靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域、梭菌毒素酶促結構域并且其中TVEMP的施用減輕與癌癥相關的癥狀。設想可使用本文中公開的任何TVEMP，包括例如Meward等人，(2007)；Dolly，同上Q007)；Foster等人，WO2006/059093(2006)；和Foster等人，WO2006/059105(2006年6月8日)中公開的TVEMP。附圖簡述圖1顯示中樞和周圍神經無的神經遞質釋放和梭菌毒素中毒的當前范例的示意圖。圖IA顯示中樞和周圍神經元的神經遞質釋放機制的示意圖。釋放過程可描述為包括兩個步驟1)囊泡停靠(vesicledocking)，其中包含神經遞質分子的囊泡的囊泡結合SNARE蛋白與位于質膜上的膜結合SNARE蛋白結合；和2)神經遞質釋放，其中囊泡與質膜融合并且神經神經遞質分子被外排。圖IB顯示中樞和周圍神經元的破傷風和肉毒毒素的中毒機制的示意圖。該中毒過程可被描述為包括4個步驟1)受體結合，其中梭菌毒素結合梭菌屬受體系統并且起始中毒過程；2)復合物內化，其中在毒素結合后，包含毒素/受體系統復合物的囊泡被胞吞入細胞；幻輕鏈轉位(translocation)，其中多個事件被認為發生，包括例如囊泡的內PH的改變，包含梭菌毒素重鏈的HN結構域的通道孔的形成，梭菌毒素輕鏈與重鏈的分離以及活性輕鏈的釋放和4)酶促靶修飾，其中梭菌毒素的激活輕鏈蛋白水解切割其靶SNARE底物，例如，SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白，從而阻止囊泡停靠和神經遞質釋放。圖2顯示天然存在的梭菌毒素的結構域組織。輕鏈形式描繪了包括酶促結構域、轉位結構域和靶向性結構域的氨基至羧基線性組織。位于轉位結構域與酶促結構域之間的雙鏈環區域被描繪為雙SS掛件(bracket)。該區域包含內源雙鏈環蛋白酶切割位點，該切割位點當被天然存在的蛋白酶例如，內源梭菌毒素蛋白酶或環境中產生的天然存在的蛋白酶蛋白水解切割時，將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式。在單鏈形式上方，描繪了梭菌毒素結合結構域的HCC區域。該區域包括三葉草結構域，所述結構域在氨基至羧基的線性組織中包含α-折疊、β4/β5發夾轉角、β-折疊、β8/β9發夾轉角和Y-折疊。圖3顯示具有位于氨基末端的靶向性結構域的TVEMP。圖3Α描繪了包括靶向性結構域、轉位結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、和酶促結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。當用P蛋白酶蛋白水解切割時，將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式。圖3Β描繪了包括靶向性結構域、酶促結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、和轉位結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。當用P蛋白酶蛋白水解切割時，毒素的單鏈形式被轉變成雙鏈形式。圖4顯示具有位于其它兩個結構域之間的靶向性結構域的TVEMP。圖4Α描繪了具有包括酶促結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、靶向性結構域和轉位結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。當用P蛋白酶蛋白水解切割時，將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式。圖4Β描繪了具有包括轉位結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、靶向性結構域和酶促結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。當用P蛋白酶蛋白水解切割后，將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式。圖4C描繪了具有包括酶促結構域、靶向性結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、和轉位結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。當用P蛋白酶蛋白水解切割后，將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式。圖4D描繪了具有包括轉位結構域、靶向性結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、和酶促結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。當用P蛋白酶蛋白水解切割后，將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式。圖5顯示具有位于羧基末端的靶向性結構域的TVEMP。圖5A描繪了具有包含酶促結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、轉位結構域和靶向性結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。在用P蛋白酶蛋白水解切割后，毒素的單鏈形式被轉變成雙鏈形式。圖5B描繪了具有包括轉位結構域、包含外源蛋白酶切割位點(P)的雙鏈環區域、酶促結構域和靶向性結構域的氨基至羧基線性組織的TVEMP的單鏈多肽形式。在用P蛋白酶進行蛋白水解切割后，將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式。詳述癌癥是指哺乳動物身體中細胞的不受控制的生長，這樣其本質上為影響身體用于控制細胞生長的調控機制的疾病。為了正常細胞轉化成癌細胞，必須改變調節細胞生長和分化的基因。遺傳改變可在從完整染色體的獲得或丟失至影響單個DNA核苷酸的突變的許多水平上發生。癌細胞基因型的巨大目錄是一起指示惡性生長的細胞生理學的6個必要改變的表現1)生長信號的自足性；幻對生長抑制性(抗生長)信號的不敏感性；幻程序化細胞死亡(細胞凋亡)的逃脫；4)無限的復制潛能力)持續的血管生成；以及6)組織侵襲和轉移。Hanahan和Weinberg,TheHallmarksofCancer,Cell100(1):57_7(K2000)。癌細胞顯示生長信號的自足性的一個方式是癌基因的表達。癌基因可以是以不適當的高水平表達的正常基因，或具有新的性質的改變的基因。在任一種情況下，這些基因的表達都通過多種方式促進由癌細胞顯示的細胞生長的惡性表型。許多細胞可在細胞之間產生分泌性因子如激素，其促進有絲分裂，其作用取決于接受組織或細胞的信號轉導。因此，當刺激受體細胞上的激素受體時，信號從細胞的表面傳導至細胞核以在細胞核水平上產生基因轉錄調控的某些改變。某些癌基因本身為信號轉導系統的部分，或本身為細胞和組織的信號受體，從而控制對此類激素的敏感性。癌基因通常產生促分裂原，或在蛋白質合成中參與DNA的轉錄，這產生了負責產生所述產物以及細胞使用和與其相互作用的生化藥劑的蛋白質和酶。通常為癌基因的靜止對應物的原癌基因的突變可改變它們的表達和功能，從而增加所述產物蛋白質的量或活性。當這發生時，原癌基因變成癌基因，并且該轉變擾亂了細胞的細胞周期調控的正常平衡，從而使得不受控制的生長成為可能。癌癥的概率不能通過從基因組除去原癌基因(即使這是可能的)而降低，因為它們對于生物體的生長、修復和動態平衡是至關重要的。只有當它們突變時，生長的信號才變得過度。因此，抑制癌細胞的細胞生長信號的治療策略具有提供治療癌癥的強有力工具，所述癌癥因癌基因表達而顯示生長信號的自足性。此外，許多癌細胞表達生長因子受體和激活此類受體的配體(自分泌回路)。在正常組織中，一種類型的細胞表達生長因子受體并且另一種類型產生配體(旁分泌回路)以試圖維持動態平衡。癌細胞通過表達配體和受體獲得生長的自足性。癌細胞顯示對生長抑制性(抗生長)信號的不敏感性的一種方式是對腫瘤抑制基因的表達的抑制。腫瘤抑制基因是抑制癌細胞的細胞分裂、存活或其它性質的基因。腫瘤抑制基因通常因促進癌癥的遺傳改變而失能。通常，許多基因的改變是將正常細胞轉化成癌細胞所必需的。一般而言，腫瘤抑制基因是被細胞應激或DNA損傷激活的轉錄因子。通常DNA損傷將引起自由飄移的遺傳物質以及其它征兆的存在，并且可觸發導致腫瘤抑制基因激活的酶和途徑。此類基因的功能是阻止細胞周期的進展以進行DNA修復，從而防止突變傳遞至子代細胞。因此，抑制癌細胞中的細胞分裂信號的治療策略具有提供強有力的治療癌癥的工具的潛能，所述癌癥因腫瘤抑制基因表達的抑制而顯示對生長抑制性信號的不敏感。癌細胞逃避程序化細胞死亡(細胞凋亡)的一種方式是對細胞存活信號(抗細胞凋亡信號)的持續暴露。誘導細胞存活或細胞死亡的信號由質膜中的傳感器(即死亡受體)和由細胞內傳感器提供。細胞內傳感器監控細胞的健康和響應檢測異常如DNA損傷、癌基因作用、存活因子不足或缺氧，它們激活死亡途徑。因此，當它們具有DNA損傷、激活的癌基因或缺氧(在腫瘤的中心)，癌細胞應當遭受細胞凋亡。幾種類型的癌細胞依賴通過自分泌回路遞送的存活信號來抵抗由存在于這些細胞中的DNA損傷觸發的細胞凋亡信號。這些自分泌回路由癌細胞通過表達生長因子配體和它們的同源受體來建立。因此，抑制由癌細胞產生的細胞存活信號的治療策略具有提供強有力的治療癌癥的工具的潛力，所述癌癥過度激活抗細胞凋亡信號。事實上，文獻中存在激素和/或生長因子的撤除可產生癌細胞的細胞凋亡(因為存活與細胞凋亡信號之間的平衡被恢復)的證據。癌細胞的另一個獲得的能力是腫瘤細胞的無限復制潛能。癌細胞通過維持端粒的完整性和逃避因侵蝕端粒的連續倍增而引起的危機狀態克服了增殖的限制。癌細胞過表達端粒酶，該端粒酶維持端粒的大小并且允許無限復制潛能。而另一個重要步驟是將膜遞送至質膜以完成有絲分裂過程的能力。當細胞在腫瘤內增殖時，它們也面臨其它挑戰，如有限的氧和營養物的供給，這可誘導細胞凋亡。因此為了能夠維持生長和增殖，腫瘤需要促進現有血管的生長以及新血管的生長(在成熟組織中受到高度調控的過程)。癌細胞分泌促血管生成因子以激活內皮細胞中的受體。此外，隔離在細胞外基質中的促血管生成因子可通過由腫瘤細胞分泌的蛋白酶進行的基質降解獲得釋放。血管生成的抑制是經驗證的治療性靶，因為幾種批準的藥物靶向該途徑(作為癌癥和其它促血管生成疾病的治療)。最后，腫瘤細胞獲得侵襲鄰近組織和轉移至遠距離位置的能力。為了實現該能力，腫瘤細胞首先可以能夠通過改變粘著蛋白和整聯蛋白的表達來改變它們的粘著能力。更重要地，為了能夠遷移，癌細胞必須能夠降解它們周圍的細胞外基質。癌細胞以分泌性因子或膜錨定的蛋白酶的形式過表達基質降解蛋白酶并且下調蛋白酶抑制劑的表達。由于不受控制的細胞生長是所有癌癥的根本原因，因此可減少或阻止不受控制的細胞生長的化合物和方法將是癌癥的有效治療。本說明書公開了可減少或阻止由癌細胞顯示的不受控制的細胞生長的化合物和方法。新型再靶向內肽酶部分地包括結合結構域和酶促結構域。結合結構域將再靶向內肽酶導向正在表達所述結合結構域的同源受體的特定癌細胞類型。酶促結構域的內肽酶活性性通過切割適當的靶SNARE蛋白抑制胞吐，從而中斷胞吐以及受體和膜至質膜的遞送。阻止癌細胞的胞吐在治療上是有用的，因為中斷可以例如1)阻止由癌細胞產生的促進有絲分裂的分泌性生長因子的釋放；或幻阻止受體至癌細胞的質膜的遞送，這可干擾癌細胞接受癌癥促進信號例如接受生長刺激信號或細胞存活信號的能力，后者在通過使平衡向癌細胞的細胞凋亡傾斜來消除癌細胞中是有用的；3)阻止膜至質膜的遞送，從而終止只可在凈獲得膜以產生子代細胞的情況下才發生的有絲分裂的9過程；4)通過抑制腫瘤細胞或細胞外基質的促血管生成因子的釋放減少血管生成力)通過抑制蛋白酶的釋放和通過干擾粘附蛋白和整聯蛋白的轉換來抑制侵襲和轉移。因此，雖然當前市售的癌癥治療劑一次只靶向一個途徑，從而只部分有效，并且允許癌細胞獲得對該治療的抗性，通過抑制胞吐、受體遞送和膜遞送進行的基于TEVMP的療法利用單一藥物靶向幾個途徑，從而遞送更強的對腫瘤細胞的沖擊，從而變得更加有效。此外，當正常細胞不增殖并且不太依賴于存活信號時，它們不受該療法影響。本發明的方面部分地提供了TVEMP。如本文中所使用的，“TVEMP”意指包含靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域和梭菌毒素酶促結構域的任何分子。用于實施本發明的方面的示例性TVEMP公開于例如Steward,同上，(2007)；Dolly,同上(2007)；Foster,同上，WO2006/059093(2006)；Foster，同上，WO2006/059105(2006年6月8日)中。梭菌毒素各自被翻譯為約150kDa的單鏈多肽，所述多肽隨后被天然存在的蛋白酶在二硫化物環內通過蛋白水解切割(圖1)。該切割在兩個形成二硫橋的半胱氨酸殘基之間產生的不連續雙鏈環區域內發生。該翻譯后加工產生雙鏈分子，所述分子包含通過兩條鏈之間的單個二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的約50kDa的輕鏈(LC)和約IOOkDa的重鏈(HC)。用于將單鏈分子轉變成雙鏈的天然存在的蛋白酶目前還不清楚。在某些血清型中，例如，BoNT/A(天然存在的蛋白酶)由細菌血清型內源產生并且切割在毒素被釋放進環境之前在細胞內發生。然而，在其它血清型中，例如，BoNT/E，細菌菌株似乎不產生能夠將毒素的單鏈形式轉變成雙鏈形式的內源蛋白酶。在這些情況下，毒素以單鏈毒素形式從細胞釋放，其隨后被環境中發現的天然存在的蛋白酶轉變成雙鏈形式。每一個成熟的雙鏈分子包含3個功能不同的結構域1)位于LC中的酶促結構域，其包括含有特異性靶向神經遞質釋放器的核心組分的鋅依賴性內肽酶活性的金屬蛋白酶區域；2)HC的氨基端半部分(Hn)內包含的轉位結構域，其促進LC從細胞內小囊泡至靶細胞的細胞質中的釋放；和3)在HC的羧基端半部分(H。)中發現的結合結構域，其決定毒素對位于靶細胞表面上的受體復合物的結合活性和結合特異性。D.B.Lacy和R.C.Stevens,SequenceHomologyandStructuralAnalysisoftheClostridialNeurotoxins,J.Mol.Biol.291:1091-1104(1999)。He結構域包含大小大致相同，被α-螺旋分隔，稱為HeN和Hcc亞域(subdomain)的兩個不同的結構特征。表1給出了示例性梭菌毒素中發現的每一個結構域和亞域的近似邊界區域。權利要求1.一種治療哺乳動物的癌癥的方法，所述方法包括給有此需要的哺乳動物施用治療有效量的組合物的步驟，所述組合物包括包含靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域以及梭菌毒素酶促結構域和外源蛋白酶切割位點的TVEMP，其中所述組合物的施用減輕與癌癥相關的癥狀。2.權利要求1所述的方法，其中所述TVEMP包含如下的線性氨基至羧基單鏈多肽順序1)梭菌毒素酶促結構域、外源蛋白酶切割位點、梭菌毒素轉位結構域、靶向性結構域，2)梭菌毒素酶促結構域、外源蛋白酶切割位點、靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域，3)靶向性結構域、梭菌毒素轉位結構域、外源蛋白酶切割位點和梭菌毒素酶促結構域、4)靶向性結構域、梭菌毒素酶促結構域、外源蛋白酶切割位點、梭菌毒素轉位結構域，5)梭菌毒素轉位結構域、外源蛋白酶切割位點、梭菌毒素酶促結構域和靶向性結構域，或6)梭菌毒素轉位結構域、外源蛋白酶切割位點、靶向性結構域和梭菌毒素酶促結構域。3.權利要求1所述的方法，其中所述靶向性結構域為甘丙肽靶向性結構域、PAR肽靶向性結構域、生長抑素肽靶向性結構域、神經降壓肽靶向性結構域、SLURP肽靶向性結構域或血管緊張素肽。4.權利要求3所述的方法，其中所述甘丙肽靶向性結構域為甘丙肽、甘丙肽信息相關肽(GMAP)、甘丙肽樣蛋白(GALP)或alarin。5.權利要求4所述的方法，其中所述甘丙肽靶向性結構域包括SEQIDNO82,SEQIDNO83,SEQIDNO84或SEQIDNO:85。6.權利要求4所述的方法，其中所述癌癥為神經母細胞瘤、惡性黑素瘤、口腔鱗狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌或嗜鉻細胞瘤。7.權利要求3所述的方法，其中所述PAR肽靶向性結構域為PARI肽、PAR2肽、PAR3肽、和PAR4肽。8.權利要求7所述的方法，其中所述PAR肽靶向性結構域包括SEQIDNO:86的氨基酸42-47、氨基酸42-55、氨基酸四-64或氨基酸1-64;SEQIDNO:87的氨基酸35-40、氨基酸35-48、氨基酸M-59或氨基酸1-59;SEQIDNO:88氨基酸39-44、氨基酸39-52、氨基酸26-60或氨基酸1-60；SEQIDNO89的氨基酸48-53、氨基酸48-61、氨基酸35-70或氨基酸1-70。9.權利要求7所述的方法，其中所述癌癥為前列腺癌、乳腺癌、子宮內膜癌、卵巢癌、肝癌、腎癌、腎癌、肺癌、結腸癌、胃癌、胃癌、胰腺癌、頭頸癌、膽囊癌、黑素瘤、骨肉瘤、膠質母細胞瘤、腦膜瘤或白血病。10.權利要求3所述的方法，其中所述生長抑素肽靶向性結構域為生長抑素肽或皮質抑素肽。11.權利要求10所述的方法，其中所述生長抑素肽靶向性結構域包括SEQIDN0:90的氨基酸99-116或SEQIDNO91的氨基酸137-154。12.權利要求10所述的方法，其中所述癌癥為上皮甲狀腺癌、神經內分泌癌、腦膜瘤，肺類癌腫瘤、神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、促腎上腺皮質激素細胞腺瘤、前列腺癌、上皮卵巢癌、腎細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、星形細胞瘤、GH-產生性垂體腺瘤、無功能垂體腺瘤、腸類癌腫瘤、胃泌素瘤、副神經節瘤、膠質母細胞瘤、口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌、嗜鉻細胞瘤或胰腺癌。13.權利要求3所述的方法，其中所述神經降壓肽靶向性結構域神經降壓肽或神經介素N。14.權利要求13所述的方法，其中所述神經降壓肽靶向性結構域包括SEQIDN0:92的氨基酸143-148或氨基酸151-163。15.權利要求13所述的方法，其中所述癌癥為前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、腺癌、鱗狀細胞癌、功能性垂體腺瘤或無功能垂體腺瘤。16.權利要求3所述的方法，其中所述SLURP肽靶向性結構域為SLURP-I或SLURP-2。17.權利要求16所述的方法，其中所述SLURP肽靶向性結構域包括SEQIDNO93的氨基酸23-101或SEQIDNO94的氨基酸23-95。18.權利要求16所述的方法，其中所述癌癥為結腸癌或皮膚癌。19.權利要求3所述的方法，其中所述血管緊張素肽靶向性結構域為血管緊張素。20.權利要求18所述的方法，其中所述血管緊張素肽靶向性結構域包括SEQIDNO95或SEQIDNO:96ο21.權利要求18所述的方法，其中所述癌癥為結腸癌、皮膚癌、宮頸癌、腦癌、肺癌、胰腺癌、腎細胞癌、泌尿生殖器癌或乳腺癌。22.權利要求1所述的方法，其中所述梭菌毒素轉位結構域為ΒοΝΤ/Α轉位結構域、ΒοΝΤ/Β轉位結構域、BoNT/Cl轉位結構域、BoNT/D轉位結構域、BoNT/E轉位結構域、BoNT/F轉位結構域、BoNT/G轉位結構域、TeNT轉位結構域、BaNT轉位結構域或BuNT轉位結構域。23.權利要求1所述的方法，其中所述梭菌毒素酶促結構域為ΒοΝΤ/Α酶促結構域、ΒοΝΤ/Β酶促結構域、BoNT/Cl酶促結構域、BoNT/D酶促結構域、BoNT/E酶促結構域、BoNT/F酶促結構域、BoNT/G酶促結構域、TeNT酶促結構域、BaNT酶促結構域或BuNT酶促結構域。24.權利要求1所述的方法，其中所述外源蛋白酶切割位點為植物木瓜蛋白酶切割位點、昆蟲木瓜蛋白酶切割位點、甲殼動物木瓜蛋白酶切割位點、腸激酶切割位點、人鼻病毒3C蛋白酶切割位點、人腸道病毒3C蛋白酶切割位點、煙草蝕紋病毒蛋白酶切割位點、煙草葉脈斑點病毒切割位點、枯草桿菌蛋白酶切割位點、羥胺切割位點或胱天蛋白酶3切割位點ο全文摘要本說明書公開了TVEMP、包含此類TVEMP的組合物和使用此類TVEMP組合物治療哺乳動物的癌癥的方法。文檔編號A61P35/00GK102573876SQ201080045282公開日2012年7月11日申請日期2010年8月13日優先權日2009年8月14日發明者B·P·S·杰克伊,D·G·斯特薩克思,E·費爾南德斯-薩拉斯,J·弗朗西斯,K·R·奧基,L·E·斯圖爾德,P·E·加里,S·甘沙尼,T·J·亨特,Y·莫利納申請人:阿勒根公司