Rsvf蛋白組合物和其制作方法

專利名稱：Rsv f 蛋白組合物和其制作方法
RSV F蛋白組合物和其制作方法相關申請本申請要求2009年7月15日提交的美國專利申請第61/225，805號以及2010年I月12日提交的美國專利申請第61/294，426號的權益。上述申請的全部說明通過參考納入本文。
背景技術：
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺炎病毒屬(Pneumovirus)中的包膜不分節負鏈RNA病毒。其為兒童出生后第一年中細支氣管炎和肺炎的主要原因。RSV還引起重復感染包括嚴重下呼吸道疾病，其可在任何年齡發作，特別是在老年人或心臟、肺或免疫系統受損的人中。為了感染宿主細胞，與其他包膜病毒如流感病毒和HIV —樣，副粘病毒如RSV需要病毒膜與宿主細胞膜融合。對于RSV，保守融合蛋白(RSV F)通過偶聯不可逆的蛋白重折疊和膜并置來融合病毒和細胞膜。在基于副粘病毒研究的現有模型中，所述RSV F蛋白最初折疊為亞穩態“融合前”構型。進入細胞時，所述融合前構型經歷重折疊且構型變化為其穩定的“融合后”構型。RSV F蛋白由mRNA翻譯為約574個氨基酸的蛋白，稱為匕。Ftl的翻譯后加工包括通過內質網中的信號肽酶移除N端信號肽。轉運高爾基體內的細胞蛋白酶(特別是弗林蛋白酶(furin))還在兩個位置(約109/110和約136/137)切割F。。該切割導致短干擾序列移除并產生兩種仍彼此相關的亞基，稱為Fl (約50kDa ；C端；約為殘基137-574)和F2 (約20kDa #端；約為殘基1-109)。F1在N端含疏水性融合肽以及2個兩性七肽重復區(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜結構域。3個F1-F2異源二聚體在病毒粒子中組裝為F1-F2同源三聚體。 還未獲得但需要針對RSV感染的疫苗。生產疫苗的一種可能方法為基于純化的RSV F蛋白的亞基疫苗。然而，此方法需要純化的RSV F蛋白為長期穩定的單一形式和構型，在疫苗批次之間保持一致且方便純化。RSV F蛋白可被截短，例如通過缺失跨膜結構域和胞質尾，以使其表達為可能可溶的胞外域。此外，盡管RSV F蛋白最初翻譯為單體，但該單體切割并組裝為三聚體。RSV F蛋白為切割的三聚體形式時會暴露所述疏水性融合肽。不同三聚體如可溶性胞外域三聚體上的所述暴露疏水性融合肽可彼此結合，形成玫瑰花結型。所述疏水性融合肽也可與來自例如用于表達重組可溶RSV F蛋白的細胞的脂質和脂蛋白結合。由于RSV F蛋白加工、構造和重折疊的復雜性，難以獲得純化的、均質的免疫原性制備物。因此，需要改善RSV F蛋白組合物和制作RSV F蛋白組合物的方法。發明概述本發明涉及含一種或多種RSV F多肽的免疫原性組合物，和某些遺傳改造的RSV F蛋白和編碼該遺傳改造的RSV F蛋白的核酸。一方面所述RSV F蛋白可溶。例如，該RSV F蛋白可缺失跨膜區域和胞質尾。在一些方面，所述可溶RSV F含一種或多種的I) 一或兩個弗林蛋白酶切割位置的一種或多種突變，2)融合肽的一種或多種突變，3)p27接頭的一種或多種突變，4)含添加的寡聚化序列，和5)含提供蛋白酶切割位置的添加的氨基酸序列。在其他或替代的方面，所述RSV F蛋白為單體、三聚體或單體和三聚體的組合。所述三聚體可為單分散性或為玫瑰花結形式。在額外或替代方面，所述RSV F蛋白可為融合前構型、中間構型或融合后構型。在一個方面，所述免疫原性組合物含一種或多種呼吸道合胞病毒F(RSV F)多肽，其中氨基酸 100-150 用氨基酸序列 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO :91或SEQ ID NO :92替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述免疫原性組合物含RSV F多肽，其中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO: 12替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一個方面，所述免疫原性組合物含RSV F多肽，其中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述免疫原性組合物含RSV F多肽，其中氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID N0:9替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述免疫原性組合物含RSV F多肽，其中RSV F含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2的氨基酸23-99和151-524。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在一個方面，所述免疫原性組合物含選自下組的多肽SEQ ID NO :49、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ IDNO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQID NO 43, SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 5USEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO:55、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ IDNO 62, SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQID NO 69, SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89和SEQ ID NO :93。在一些實施方式中，省略所述信號肽和/或HIS標記。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在一方面，所述免疫原性組合物含SEQ ID NO :68或其中省略所述信號肽和任選所述 HIS 標記的 SEQ ID NO :68。在另一方面，所述免疫原性組合物含選自下組的多肽SEQ ID NO :49、SEQ ID NO 71和其中省略所述信號肽和任選所述HIS標記的任何上述序列。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在優選實施方式中，所述免疫原性組合物會包括佐劑。所述佐劑優選鋁鹽、水包角鯊烯乳液(如MF59)、苯并萘啶化合物、磷脂化合物(如E6020)、小分子免疫增強劑或任何上述的任何兩種或更多的組合。本發明的另一方面包括重組RSV F多肽。所述RSV F形式可為單體、三聚體、三聚體玫瑰花結或單體和三聚體的組合。所述重組多肽可包括異源寡聚化結構域、表位或信號肽。所述異源寡聚化結構域優選來自流感血凝素，來自SARS刺突，或來自HIV gp41、NadA、改良的GCN4、或天冬氨酸轉氨甲酰酶(ATCase)的三聚結構域。
在一個方面，所述重組RSV F多肽的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 12,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :91 或 SEQ ID NO :92替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述重組RSV F多肽中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID NO: 12替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一個方面，所述重組RSV F多肽中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID NO :9、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 ；SEQ IDNO 8,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述重組RSV F多肽中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID N0:9替代。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在一個方面，所述重組多肽選自下組SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO 5U SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO:57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ IDNO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQID NO 70, SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :93及其任何組合。任選地，省略所述信號肽和/或HIS標記。在一些實施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。另一方面包括編碼任何上述多肽的核酸。所述核酸可為自復制RNA分子。本發明的另一方面為含編碼RSV F多肽的自復制RNA的免疫原性組合物。所述免疫原性組合物可包括遞送系統。本發明的另一方面包括通過給予任何所述免疫原性組合物來誘導對RSV F免疫應答的方法。本發明涉及制備組合物的方法以及含RSV F蛋白如可溶性RSV F胞外域多肽的組合物，包括免疫原性組合物。所述RSV F胞外域多肽可為單一形式，如未切割單體、未切割三聚體、切割三聚體或切割三聚體的玫瑰花結。所述RSV F胞外域多肽也可為兩種或更多形式，例如處于平衡的兩種或更多形式如未切割單體和未切割三聚體之間的平衡。本發明提供數種優點。例如，將所述組合物給予對象時，免疫原性組合物中存在的單一所需形式的RSV F提供了更易預測的免疫應答，且配制到疫苗中時提供更一致的穩定性和其他物理和化學特性。在一個方面，本發明是生產含經切割RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法。所述方法包括a)提供含一種或多種蛋白酶切割位置的未切割RSV F蛋白胞外域多肽，其切割時產生F1和F2片段，和b)用蛋白酶或識別所述蛋白酶切割位置或多個位置的蛋白酶切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。通常，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該宿主細胞生成氨基酸101-氨基酸161位沒有被切割(如106-109和131-136位的弗林蛋白酶切割位置沒有被切割)的所述多肽。在一些實施方式中，純化a)中提供的未切割RSV F蛋白胞外域多肽。a)中提供的所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽可包括完整融合肽或改變的融合肽(如缺失的融合肽或突變的融合肽)。a)中提供的所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽包括完整融合肽時，步驟b)中的切割導致形成三聚體的玫瑰花結。a)中提供的所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽包括改變的融合肽時，步驟b)中的切割導致形成三聚體。所述方法還可包括任選的步驟純化通過切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽生成的玫瑰花結或三聚體。在優選的實施方式中，按所述方法生成的經切割RSV F蛋白胞外域多肽基本不含脂質和脂蛋白。
在另一個方面，本發明是生產含未切割RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體組合的組合物的方法。所述方法包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；和b)從所述生物材料中純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體或三聚體。通常，所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該宿主細胞生成氨基酸101-氨基酸161位沒有被切割(如106-109和131-136位的弗林蛋白酶切割位置沒有被切割)的所述多肽。在一些實施方式中，所述未切割RSVF蛋白胞外域多肽的氨基酸序列還包括改變的胰蛋白酶切割位置，且胰蛋白酶沒有在氨基酸101-氨基酸161之間的位置切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。在另一個實施方式中，所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列還包括改變的融合肽。在一些實施方式中，純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體。在其他實施方式中，純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體。在其他實施方式中，純化可能處于動態平衡的未切割RSV F蛋白胞外域單體和三聚體的混合物。在優選的實施方式中，按所述方法生成的經切割RSV F蛋白胞外域多肽基本不含脂質和脂蛋白。在另一方面，本發明是生產含切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體組合的組合物的方法。所述方法包括a)提供含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改變的融合肽；和幻從所述生物材料中純化切割的RSV F蛋白胞外域多肽。在一些實施方式中，純化切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體。在其他實施方式中，純化切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體。在其他實施方式中，純化可能處于動態平衡的切割的RSV F蛋白胞外域單體和三聚體的混合物。在優選的實施方式中，按所述方法生成的經切割RSV F蛋白胞外域多肽優選基本不含脂質和脂蛋白。在另一個實施方式中，純化含已改變融合肽的切割的RSV F蛋白胞外域三聚體。在其他方面，本發明提供用本發明方法生產的組合物，包括免疫原性組合物。附圖簡要說明圖I顯示野生型RSV F (

圖1A)和移除跨膜結構域與胞質尾且在C末端任選地添加了 HIS6標記的胞外域構建(圖IB)的示意圖。為了清楚起見，殘基編號涉及野生型A2株系RSV F，從N端信號肽開始，且其在含氨基酸缺失的構建中沒有改變。示意圖中的標記為信號序列或信號肽(sp)。圖IA是RSV F蛋白的示意圖，顯示信號序列或信號肽(SP)、p27接頭區、融合肽(FP) ,HRA結構域(HRA) ,HRB結構域(HRB)、跨膜區(I'M)和胞質尾(CT)。所述胞外域的C末端邊界可變化。圖IB為RSV F胞外域構建的總體示意圖，描述與圖IA的示意圖共有的特征，并包括任選的HIS6標記(HIS TAG)。弗林蛋白酶切割位置位于氨基酸109/110和136/137位。圖IC還顯示RSV F(野生型)的氨基酸100-150的氨基酸序列(SEQ ID NO 108)和其中一個或兩個弗林蛋白酶切割位置和/或融合肽區域突變或缺失的數種蛋白(Furmt-SEQ ID NO 3 ；FurdeI-SEQ ID NO 4 ；Furx-SEQ ID NO 6 ；Furx R113Q,K123N, K124N-SEQ ID NO 5 ；Furx R113Q, K123Q, K124Q-SEQ ID NO :92 ；Delp21 furx-SEQID NO 7 ；Delp23 furx-SEQ ID NO 8 ；Delp23 furdel-SEQ ID NO :9 ;N 末端弗林蛋白酶(Furin) -SEQ ID NO :10 ;C 末端弗林蛋白酶-SEQ ID NO :11 ;融合肽缺失 I-SEQ ID NO :12 ;和Xa因子-SEQ ID NO:13)。在圖IC中，符號表示該位置的氨基酸缺失。圖2顯示從氨基酸488到RSV F (野生型)的TM區起始的羧基末端的氨基酸序列(SEQ ID NO :94)和數種含添加的蛋白酶切割位置的蛋白(SEQ ID NOS :95-100)。在圖2中，符號表示該位置沒有氨基酸。圖3為用尺寸排阻色譜法的電泳凝膠的色譜圖和圖像，顯示RSV F單體(3)的純化。圖4A-4F顯示編碼pT7_TC83R-FL. RSVF (A317)自復制RNA分子的質粒的核苷酸序列(SEQ ID NO :101)，所述分子編碼呼吸道合胞病毒F糖蛋白(RSV-F)。編碼RSV-F的核苷酸序列有下劃線。圖5為數種RSV株系的F蛋白氨基酸序列比對。用Corpet, Nucleic AcidsResearch，1998，16 (22) =10881-10890公開的算法獲得所述比對，使用默認參數(Blossum62符號對照表，缺口開放罰分12，缺口延伸罰分A2，A2株系的F蛋白(登錄號AF035006)(SEQ ID NO :102) ;CP52，CP52株系的F蛋白(登錄號AF013255) (SEQ ID NO :103) ;B，B株系的 F 蛋白(登錄號 AF013254) (SEQ ID NO :104) ;long，long株的 F 蛋白(登錄號 AY911262)株系(SEQ ID NO :105)，和 18537 株系，18537 株系的 F 蛋白(登錄號 Swiss Prot P13843)(SEQ ID NO :106)。還顯示共有 F 蛋白序列(SEQ ID NO :107)圖6顯示來自選擇RSV F抗原純化的尺寸排阻(SEC)色譜圖的相關區域。含指示抗原的主峰用星號表示，Superdex P20016/60柱(GE醫療保健公司(GE Healthcare))的保留時間用毫升數表示。在校準柱上，約47mls、65mls和77mls的保留時間分別對應于柱空體積、RSV F三聚體保留和RSV F單體保留。在圖6A中，未切割的Delp23 Furdel( A p23Furdel)構建純化自約77mls的單體峰值。用胰蛋白酶處理未切割的Delp23 Furdel RSVF抗原時，蛋白可形成玫瑰花結，其在約47mls的SEC空體積中 遷移(圖6B)。RSV F融合肽缺失的經切割三聚體種類純化自約65mls保留時間的三聚體峰值(圖6C)而未切割的Delp21Furx構建(A p21 Furx)純化自約77mls的單體峰值(圖6D)。圖7顯示選擇的RSV F抗原的典型EM圖。圖7A顯示胰蛋白酶處理前RSVFAp23(Delp23)的EM圖。圖7A中的拐杖形狀與融合后的三聚體構型一致，其并未總是在未切割的Ap23(Delp23)Furdel構建中觀察到。所述A p23 (Delp23) Furdel構建用胰蛋白酶處理并從SEC柱的空體積中純化并通過EM觀察時，發現所述蛋白采用玫瑰花結構型(圖7B)。從SEC柱的所述三聚體峰中純化RSV F融合肽缺失構建時觀察到單分散的拐杖形狀，與融合后三聚體一致(圖7C)。圖7D所示為三種制備物AP21 (Delp21)furx RSV F(標記為單體)、融合肽缺失RSV F (標記為三聚體的泳道)和純化的RSV F玫瑰花結(標記為玫瑰花結)。所述凝膠含數個GE全范圍標準(分子量標準標注在該凝膠左側)的泳道,而RSV F片段的近似保留時間表示在該凝膠的右側。
圖8A-8C表示棉鼠中RSV F胞外域多肽的單體(未切割的Ap21 (Delp21) furx)、三聚體的玫瑰花結(切割的A P23(DelP23) Furdel)和三聚體(融合肽缺失)為免疫原性。抗RSV F IgG和中和抗RSV抗體的血清效價在第一次疫苗接種后2周(2wpl)、第一次疫苗接種后3周(3wpl)和/或弟_■次疫苗接種后2周(2wp2)測量。發明詳述本發明涉及呼吸道合胞病毒F(RSV F)多肽和/或蛋白、含RSV F多肽和/或蛋白的免疫原性組合物、生產RSV F多肽和/或蛋白和含RSV F多肽和/或蛋白的組合物的方法以及編碼RSV F多肽和/或蛋白的核酸。總體上，所述免疫原性組合物包括含突變(如氨基酸取代、缺失或插入)的RSV F多肽和/或蛋白，其能提供有益的特征，如一種或多種的I)穩定融合前或中間(非融合后)構型，2)減少或消除融合肽的暴露，3)改善穩定性(如減少聚集和/或降解)，和4)更緊密地組裝活性F1/F2病毒蛋白。這些特征為免疫原性組合物和免疫原性組合物的加工提供了優點。例如，如本文所述，RSV F蛋白的非融合后構型(即融合前構型、中間構型)可以是更好的免疫原并引發更好的中和抗體應答。例如通過引起弗林蛋白酶切割位置的突變或缺失來減少或消除所述融合肽的暴露，能降低所述多肽的疏水性并有助于純化，還能減少或消除RSV F蛋白與給予所述蛋白的對象的細胞膜的結合。給予對象所述組合物時，改善的蛋白穩定性有助于生產免疫原性組合物，其中所述蛋白聚集或降解的傾向降低，這提供了更有預測性的免疫應答。最終，突變的RSV F多肽或蛋白通過例如缺失全部或部分所述p27接頭區而與F1/F2病毒蛋白類似，其可引發更好的中和抗體應答。本發明的其他優點如本文所述。本發明還涉及制備含RSV F蛋白，具體是含RSV F胞外域多肽的組合物的方法，并涉及含RSV F蛋白的組合物，包括免疫原性組合物。所述RSV F胞外域多肽優選為單一形式或為已知形式之間的動態平衡。定義本文所用“群體”表示組合物中存在多于一種RSV F多肽或蛋白。所述群體可為基本均質，其中幾乎所有RSV F多肽或蛋白為基本相同(如相同氨基酸序列、相同構型)、異質或具有需要程度的均質性(如至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%的所述RSV F多肽或蛋白是融合前構型、融合后構型、單體、三聚體。)所述RSV F蛋白的“融合后構型”為三聚體，特征為存在含3HRB和3HRA區域的六螺旋束。所述RSV F蛋白的“融合前構型”的構型特征是含包括3HRB區域的三螺旋的三聚體。
如本文所用，“RSV F胞外域多肽”表示主要含成熟RSV F蛋白的胞外部分的RSVF蛋白多肽，其具有或不具有所述信號肽(如約氨基酸I到約氨基酸524，或約氨基酸22到約氨基酸524)但缺失天然產生的RSV F蛋白的跨膜結構域和胞質尾。如本文所用，“切割的RSV F胞外域多肽”指在約101/102-約160/161的一個或多個位置上切割而產生兩個亞基的RSV F胞外域多肽，其中一個所述亞基包括F1，另一個亞基包括F2。如本文所用，“C末端未切割的RSV F胞外域多肽”指在約101/102-約131/132的一個或多個位置上切割且在約132/133-約160/161的一個或多個位置上沒有切割而產生兩個亞基的RSV F胞外域多肽，其中一個所述亞基包括F1,另一個亞基包括F2。如本文所用，“未切割的RSV F胞外域多肽”指在約101/102-約160/161的一個或多個位置上沒有切割的RSV F胞外域多肽。未切割的RSV F胞外域多肽可為例如單體或三聚體。
如本文所用，“融合肽”表示RSV F蛋白的氨基酸137-154。如本文所用，“改變的融合肽”表示其中一種或多種氨基酸獨立地被替換或缺失的融合肽，包括替換或缺失137-154位的所有氨基酸。含“改變的融合肽”的經切割RSV F胞外域多肽優選不形成玫瑰花結。如本文所用，“純化的”蛋白或多肽是重組或合成生產，或由其天然宿主產生的蛋白或多肽，其從所述重組或合成生產系統或天然宿主的其他組分中分離出，從而相對于組合物中存在的其他大分子組分，所述蛋白的含量明顯高于粗品中存在的量。通常，純化的蛋白質的均質性至少約50%，更優選至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或基本均質。如本文所用，“基本不含脂質和脂蛋白^示在SDS PAGE凝膠上觀察蛋白和/或多肽(如RSV F多肽)的純度和用UV280吸收或BCA分析測量總蛋白含量，并用磷脂酶C試驗(Wako，編號433-36201)測量脂質和脂蛋白含量時，質量上至少約95 %不含脂質和脂蛋白的組合物、蛋白或多肽。如本文所用，“改變的弗林蛋白酶切割位置”表示天然產生的RSV F蛋白中約106-109位和約133-136位上的氨基酸序列，所述序列被弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶識別并切割，但在未切割的RSV F蛋白胞外域多肽中含一種或多種氨基酸替換、一種或多種氨基酸缺失、或一種或多種氨基酸替換和一種或多種氨基酸缺失的組合，從而含改變的弗林蛋白酶切割位置的RSV F胞外域多肽分泌自細胞，該細胞生成在所述改變的弗林蛋白酶切割位置未切割的所述多肽。適用于本發明的RSV F蛋白胞外域特征在本文中參考具體氨基酸描述，所述氨基酸由來自所述A2株系的RSV F蛋白序列(SEQ ID NO 1)中的氨基酸位置鑒別。RSV F蛋白胞外域可具有來自所述A2株系或任何其他所需株系的F蛋白的氨基酸序列。使用非A2株系的株系F蛋白胞外域時，所述F蛋白的氨基酸編號參考所述A2株系的F蛋白的編號，需要時插入缺口。這可通過對任何所需RSV F蛋白和所述株系A2的F蛋白序列進行比對實現，如本文所示的來自所述A2株系、CP52株系、B株系、long株、和所述18537株系的F蛋白。參見圖 5。優選用 Corpet，Nucleic Acids Research, 1998,16(22) : 10881-10890 公開的算法進行序列比對，使用默認參數(Blossum 62符號對照表，缺口開放罰分12，缺口延伸罰分2)。本發明提供可溶性RSV F多肽和蛋白、和含所述可溶性RSV F多肽和蛋白的免疫原性組合物、以及含編碼所述可溶性RSV F多肽和蛋白的核酸(如自復制RNA分子)的組合物。所述RSV F多肽(如胞外域多肽)可為任何需要的形式如單一形式，例如未切割單體、未切割三聚體、切割三聚體或切割三聚體的玫瑰花結。所述RSV F胞外域多肽也可為兩種或更多形式，例如處于平衡中的兩種或更多形式如未切割單體和未切割三聚體之間的平衡。本發明提供數種優點。例如，免疫原性組合物中存在RSV的單一需要形式，或已知形式之間的動態平衡提供了更易預測的配制、可溶性和穩定性，將所述組合物給予對象時還提供了更易預測的免疫應答。所述RSV F胞外域多肽優選為單一形式，如未切割單體、未切割三聚體、切割三聚體、切割三聚體的玫瑰花結或為這些形式的子集之間的動態平衡(如未切割單體和未切割二聚體之間的平衡)。 在本發明的一個方面，所述RSV F多肽和蛋白為融合前構型。所述融合前構型的表位可更好地引發能識別并中和天然病毒粒子的抗體。在本發明的一個實施方式中，免疫原性組合物包括融合前構型的呼吸道合胞病毒F糖蛋白群體。在本發明的另一方面，免疫原性組合物包括呼吸道合胞病毒F糖蛋白群體，所述糖蛋白與分離的RSV F糖蛋白相比不利于融合后構型。本發明還提供含多肽的免疫原性組合物，所述多肽展示的表位存在于呼吸道合胞病毒F糖蛋白的融合前或中間融合構型，但在所述糖蛋白的融合后構型中缺失。F糖蛋白RSV的F糖蛋白通過病毒包膜和宿主細胞質膜之間的融合指導病毒穿入。其為I型單次跨膜整合蛋白，具有四個一般結構域N末端ER-移位信號序列(SS)、胞外域(ED)、跨膜結構域(TM)和胞質尾(CT)。CT含單一棕櫚酰化半胱氨酸殘基。RSV分離物之間F蛋白的序列高度保守，但不斷進化(7)。與大多數副粘病毒不同，RSV中的F蛋白可介導獨立于其他病毒蛋白的進入和多核體形成(其他副粘病毒中除了 F外通常需要HN)。hRSV F的mRNA翻譯為稱作Ftl的574氨基酸前體蛋白，其在N末端包含信號肽序列，該序列在內質網中由信號肽酶移除。轉運高爾基體中細胞蛋白酶(具體為弗林蛋白酶)在兩個位置(氨基酸109/110和136/137)切割Ftl，移除短糖基化干擾序列并產生兩個亞基，稱為F1 (約50kDa ；C末端；殘基137-574)和F2 (約20kDa ；N末端；殘基1-109)(參見例如圖I)。F1在N端含疏水性融合肽以及兩個疏水性七肽重復區(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜結構域(參見例如圖I)。所述F1-F2異源二聚體在病毒粒子中組裝為同源三聚體。RSV以單一血清型存在，但具有兩個抗原亞組A和B。所述兩組的F糖蛋白約90%相同。所述A亞組、所述B亞組或兩組的組合或混合可用于本發明。所述A亞組的示例序列為 SEQ ID NO 1(A2 株系；GenBank GI :138251 ；Swiss Prot P03420)，所述 B 亞組為 SEQID NO :2(18537 株系；GI :138250 ；Swiss Prot P13843)。SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 均為574氨基酸序列。A2株系中的信號肽為氨基酸1-21，但18537株系中其為1_22。兩個序列中，所述TM結構域來自約氨基酸530-550，但或者報道為525-548。
SEQ ID NO : II MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE 6061 LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLN 120121 NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVS 180181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVN 240241 AGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV 300301 VQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV 360361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDOQMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT 420421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP 480481 LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLS 540541 LIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN 574SEQ ID NO :2I MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIE 6061 LSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTIN 120121 TTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVS 180181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVN 240241 AGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV 300301 VQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKV 360361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDOQMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKT 420421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDP 480481 LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLS 540541 LIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK 574本發明可使用任何所需的RSV F氨基酸序列，如氨基酸序列SEQ ID NO :1或2，或與SEQ ID NO :1或2有相同性的序列。通常其與SEQ ID NO :1或2有至少75%相同性，如與SEQ ID NO :1或2有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。所述序列可天然地存在于RSV中。本發明使用全部或部分F蛋白胞外域時，其可包括⑴含SEQ ID NO 1的約氨基酸22-525的多肽。(ii)含SEQ ID NO 2的約氨基酸23-525的多肽。(iii)含與⑴或(ii)有至少75%相同性(如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%相同性)的氨基酸序列的多肽。 (iv)含⑴、(ii)或(iii)的片段的多肽，其中所述片段含至少一種F蛋白表位。所述片段通常至少約100個氨基酸長度，如至少約150、至少約200、至少約250、至少約300、至少約350、至少約400、至少約450個氨基酸長度。所述胞外域可為具有或沒有所述信號肽的Ftl形式，或可包括彼此結合的兩種分離的肽鏈(如F1亞基和F2亞基)，例如所述亞基可通過二硫橋連接。因此，約氨基酸101-約氨基酸161的全部或部分如氨基酸110-136可在所述胞外域中缺失。因此全部或部分所述胞外域可包括(V)與所述第一多肽鏈結合的第一肽鏈和第二肽鏈，其中所述第一肽鏈含與SEQID NO :1的約氨基酸22-約氨基酸101或SEQ ID NO 2的約氨基酸23-約氨基酸101有至少75%相同性(如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%相同性)的氨基酸序列，且所述第二肽鏈含與SEQ ID NO :1的約氨基酸162-約525或SEQ ID NO 2的約氨基酸162-525有至少75%相同性(如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%相同性)的氨基酸序列。(vi)與所述第一多肽鏈結合的第一肽鏈和第二肽鏈，其中所述第一肽鏈含包括SEQ ID NO 1的約氨基酸22-約氨基酸101或SEQ ID NO 2的約氨基酸23-約氨基酸109的片段的氨基酸序列，且所述第二肽鏈含SEQ ID NO 1的約氨基酸162-約氨基酸525或SEQ ID NO :2的約氨基酸161-約氨基酸525的片段。一種或兩種所述片段包括至少一種F蛋白表位。所述第一肽鏈中的片段通常為至少20個氨基酸長度，如至少30、至少40、至少 50、至少60、至少70、至少80個氨基酸長度。所述第二肽鏈中的片段通常為至少100個氨基酸長度，如至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450個氨基酸長度。(vii)通過弗林蛋白酶消化(i)、(ii)、(iii)或(iv)可獲得的分子。因此本發明所用的氨基酸序列可天然存在于RSV F蛋白中(如缺失TM和CT的可溶性RSV F蛋白，約為SEQ ID NO : I或2的氨基酸522-574)，和/或其相對天然RSV序列可具有一種或多種(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30種)單一氨基酸突變(插入、缺失或替換)。例如，已知突變F蛋白消除其弗林蛋白酶切割序列，從而阻止細胞內加工。在某些實施方式中，所述RSV F蛋白缺失TM和CT (約為SEQ ID NO :1或2的氨基酸522-574)并含相對天然RSV序列的一種或多種(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30種)單一氨基酸突變(插入、缺失或替換)。弗林蛋白酶切割、胰蛋白酶切割和融合肽突變RSV F多肽或蛋白可含有防止一個或兩個所述弗林蛋白酶切割位置(即SEQ IDNO 1和2的氨基酸109和136)切割的一種或多種突變。這些突變可阻止所述可溶性多肽或蛋白的聚集并因此有助于純化，如果所述RSV F蛋白在細胞表面表達如由病毒復制子表達(如a病毒復制子顆粒)，或如果所述RSV F蛋白是病毒樣顆粒的組分，所述突變可阻止細胞之間的融合。這些突變單獨或與本文所述其他突變結合也可穩定所述融合前構型中的蛋白。合適的弗林蛋白酶突變的示例包括SEQ ID NO :1或2氨基酸殘基106-109替換為 RARK(SEQ ID NO77)、RARQ(SEQ ID NO:78)、QAQN(SEQ ID NO 79)或 IEGR(SEQ ID NO 80)。或者或此外，SEQ ID NO :1或2的氨基酸殘基133-136可替換為RKKK(SEQ ID NO :81)、A A AR、QNQN (SEQ ID NO :82)、QQQR (SEQ ID NO :83)或 IEGR (SEQ ID NO :80)。(A 表示所述氨基酸殘基缺失。)如果需要，這些突變可與本文所述其他突變組合，如所述P27區域(SEQ ID NO :1或2的氨基酸110-136)的突變，包括所述p27區域全部或部分的缺失。如果需要，這些弗林蛋白酶切割突變可與本文所述其他突變組合，如胰蛋白酶切割突變和融合肽突變。合適的胰蛋白酶切割突變示例包括SEQ ID NO :1或2的約101位-161位的任何賴氨酸或精氨酸殘基的缺失，或任何所述賴氨酸或精氨酸殘基被非賴氨酸或精氨酸的氨基酸替換。例如，所述P27區域(SEQ ID NO :1或2的約氨基酸110-136)中的賴氨酸和/或精氨酸殘基可被替代或缺失，包括所述P27區域全部或部分的缺失。替代或除了所述弗林蛋白酶切割突變，RSV F多肽或蛋白在所述融合肽區域可包含一種或多種突變(SEQ ID NO :1或2的氨基酸137和153)。例如，此區域可全部或部分
缺失。 在具體實施方式
中，所述RSV F多肽或蛋白如SEQ ID NO USEQ ID NO 2的氨基酸殘基100-150的序列，或其可溶性胞外域為(Furmt)TPATNNRARKELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKKKFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO 3)(Furdel) TPATNNRARQELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ IDNO 4)(Furx)TPATNNQAQNELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO:6)(Furx R113Q, K123N, K124N) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 5)(Furx R113Q, K123Q, K124Q))TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 92)(Delp21 Furx) TPATNNQAQN---------------------QNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ
ID NO 7)(Delp23 Furx) TPATNNQAQN-----------------------QNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ
ID NO 8)(Delp21 furdel) TPATNNRARQ---------------------QNQQQRFLGFLLGVGSAIAS (SE
Q ID NO 109)(Delp23 furdel) TPATNNRARQ-----------------------QQQRFLGFLLGVGSAIAS (SE
Q ID NO 9)(N 末端弗林蛋白酶)TPATNNRARRELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 10)(C 末端弗林蛋白酶)TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 11)(融合肽缺失 I)TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR---------SAIAS(SEQ
ID NO 12)，(融合肽缺失 2) TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR------GVGSAIAS (SEQ
ID NO :91)，或(Xa 因子)TPATNNIEGRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKIEGRFLGFLLGVGSAIAS(SEQ IDNO 13);其中符號表示該位置的氨基酸缺失。除了弗林蛋白酶切割和融合肽突變以外或者，可溶性RSV F多肽或蛋白如缺失所述跨膜區和胞質尾的那些可含一種或多種寡聚序列。存在寡聚序列時，優選三聚序列。本領域已知合適的寡聚序列，包括例如酵母GCN4亮氨酸拉鏈蛋白的卷曲螺旋、T4噬菌體次要纖維蛋白(fibritin)的三聚化序列(“折疊子(foldon) ”)和流感HA的三聚體結構域。這些和其他合適的寡聚序列在本文中更詳細地描述。在具體實施方式
中，所述RSV F多肽或蛋白的羧基末端序列起始于480位，其為(GCN)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE(SEQ ID NO 14)(HA)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEK(SEQID NO 15)(理想螺旋)PLVFPSDEFDASISQINEKINQILAFIRKIDELLHNIN(SEQ ID NO :16)(短 foldon)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEffVLLSTFL(SEQ ID NO: 17);或(長foldon) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO 18)除了弗林蛋白酶切割突變、融合肽突變和添加的寡聚序列的任何組合以外或者，含跨膜區域的RSV F多肽或蛋白可含有提供蛋白酶切割位置的添加的氨基酸序列。這種類型的RSV F多肽或蛋白可通過在細胞表面表達而生成，并在用合適的蛋白酶從細胞表面切割后以可溶形式回收。通常，提供蛋白酶切割位置的氨基酸序列位于所述跨膜結構域氨基末端(SEQ ID NO :1或2的氨基酸525)的約60個氨基酸、約50個氨基酸、約40個氨基酸、約30個氨基酸、約20個氨基酸、約10個氨基酸內，或基本與之毗鄰。本領域熟知許多可被市售蛋白酶切割的合適氨基酸序列。例如，凝血酶切割序列LVPR(SEQ ID N0:75)、Xa因子切割序列IEGR和腸激酶切割序列DDDDK (SEQ ID NO :76)。這些氨基酸序列可導入RSV F多肽。在具體實施方式
中，起始于488位到所述TM區域的所述RSV F多肽或蛋白的序列示于圖2。按照本發明使用的免疫原性多肽通常經分離或純化。因此，其不與通常天然存在(若可以)的分子結合。例如，本發明使用的F蛋白不采用RSV病毒粒的形式(盡管其可為人工病毒粒的形式，如病毒體或VLP)。通常通過在重組宿主系統中表達來制備多肽。盡管可使用任何合適的方法，其(如RSV胞外域)生成通常是通過在合適的重組宿主細胞中表達編碼所述胞外域的重組構建體。合適的重組宿主細胞包括例如，昆蟲細胞(如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)、家香蛾(Bombyx mori)、果妮(Drosophila melanogaster)、草地貪夜蛾(Spodoptera fugiperda)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni))、哺乳動物細胞(如人、非人靈長類、馬、牛、羊、狗、貓和嚙齒類(如倉鼠))、禽類細胞(如雞、鴨、鵝)、細菌(如大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)和鏈球菌屬(Streptococcus spp.))、酵母細胞(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)、多形漢森酵母(Hansenual polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica))、四膜蟲細胞(如嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila))或其組合。本領域已知許多合適的昆蟲細胞和哺乳動物細胞。合適的昆蟲細胞包括例如，Sf9細胞、Sf21細胞、Tn5細胞、Schneider S2細胞和High Five細胞(源自親本粉紋夜蛾BTI-TN-5B1-4細胞系的克隆分離物(英杰公司(Invitrogen))) 合適的哺乳動物細胞包括例如，中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎細胞(HEK293細胞，通常由剪切的腺病毒5型DNA轉化成)、NIH-3T3細胞、293-T細胞、Vero細胞、HeLa 細胞、PERC. 6 細胞(ECACC 保藏號 96022940) ,Hep G2 細胞、MRC-5 (ATCC CCL-171)、WI-38 (ATCC CCL-75)、胎獼猴肺細胞(ATCC CL-160)、Madin-Darby 牛腎(“MDBK”)細胞、Madin-Darby 狗腎(“MDCK”)細胞(如 MDCK (NBL2)、ATCC CCL34;或 MDCK 33016,DSM ACC2219)、幼倉鼠腎(BHK)細胞如BHK21-F、HKCC細胞等。合適的禽類細胞包括例如，雞胚胎干細胞(如EBX 細胞)、雞胚胎成纖維細胞、雞胚胎生殖細胞、鴨細胞(如，例如在Vaccine27 :4975-4982(2009)和 W02005/042728 中描述的 AGE1. CR 和 AGE1. CR. pIX 細胞系(專業生物基因公司(ProBioGen)))、EB66細胞等。
合適的昆蟲細胞表達系統如桿狀病毒系統為本領域技術人員已知，描述于例如Summers 和 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)。桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法以藥盒形式購自加利福尼亞州圣迭戈的英杰公司等。禽類細胞表達系統也為本領域技術人員已知，描述于例如美國專利號5，340，740 ；5，656，479 ;5，830，510 ;6，114，168 ;和 6，500，668 ;歐洲專利號 EP 0787180B ;歐洲專利申請號EP03291813. 8 ;W0 03/043415 ;和WO 03/076601。相似地，細菌和哺乳動物細胞表達系統也為本領域已知，描述于例如Yeast Genetic Engineering (《酵母遺傳工程》)(Barr等編著，1989)倫敦，巴特沃思公司(Butterworths)。編碼RSV F蛋白胞外域的重組構建體可用常規方法在合適的載體中制備。昆蟲或哺乳動物細胞中用于重組蛋白表達的許多合適載體為本領域熟知且常用。合適的載體可含許多組分，包括但不限于一種或多種下述組分復制起點；可選的標記基因；一種或多種表達控制元件如轉錄控制元件(如啟動子、增強子、終止子)，和/或一種或多種翻譯信號；和選擇的宿主細胞(如哺乳動物起源的或來自異源哺乳動物或非哺乳動物物種)中用于靶向分泌途徑的信號序列或前導序列。例如，為了在昆蟲細胞中表達，使用合適的桿狀病毒表達載體如PFastBac (英杰公司)生產重組桿狀病毒顆粒。所述桿狀病毒顆粒經擴增，用于感染昆蟲細胞以表達重組蛋白。為了在哺乳動物細胞中表達，使用會驅動所述構建體在所需哺乳動物宿主細胞(如中華倉鼠卵細胞)中表達的載體。RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合適的方法純化。例如，本領域已知通過免疫親和層析純化RSV F胞外域多肽的方法。Ruiz-Arguello等，J. Gen. Virol. ,85 3677-3687 (2004)。本領域已知純化所需蛋白的合適方法，包括沉淀和各種類型的色譜如疏水相互作用、離子交換、親和、螯合和尺寸排阻。可用兩種或更多這些或其他合適方法實現合適的純化方案。如果需要，所述RSV F蛋白胞外域多肽可包括有助于純化的“標記”，如表位標記或HIS標記。該標記的多肽可通過螯合層析或親和層析方便地從例如條件培養基中純化。所述RSV F多肽也可通過在對象細胞中表達其編碼核酸而原位生成。例如，通過表達本文所述的自復制RNA。除了所述RSV序列，多肽可包括額外序列。例如，多肽可包括有助于純化的序列(如聚His序列)。相似地，為了表達的目的，F蛋白的天然前導肽可替換為不同的肽。例如，參考文獻6使用蜂毒素前導肽取代該天然肽。
多肽的形式和構型本發明包括含本文公開的RSV F多肽和蛋白的任何形式和構型的免疫原性組合物，包括本文公開的RSV F多肽和蛋白的形式和構型的任何所需組合。所述RSVF多肽可為單體，或所述RSV F蛋白可為含3種單體多肽的三聚體。三聚體可為單分散或例如由于單獨三聚體的融合肽之間的相互作用，其可為玫瑰花結的形式。免疫原性組合物可包括多肽，所述多肽為單體、三聚體、單體和三聚體的組合(如動態平衡中)、三聚體的玫瑰花結和上述任何組合。此外，如本文進一步描述，所述RSV F蛋白可為融合后構型、融合前構型或中間構型。所述RSV F蛋白可為融合前構型、融合后構型或中間構型。所述RSV F蛋白的“融合后構型”被認為是天然RSV F的低能量構型，是特征為存在含3HRB和3HRA區域的6螺旋束的三聚體。電子顯微鏡下所述融合后構型具有特有的“拐杖”或“高爾夫球座”形狀。所述RSV F蛋白的“融合前構型”的構型特征是含包括3HRB區域的卷曲螺旋的三聚體。融合前構型中沒有暴露所述融合肽，因此融合前構型通常不形成玫瑰花結，且電子顯微鏡下具有“棒棒糖”或“球和莖”形狀。在一些方面，所述RSV F蛋白在所述融合后構型中。例如，所述融合后構型中所述RSV F蛋白可為單分散三聚體的形式，或為包含融合后三聚體的玫瑰花結形式。在一些實施方式中，所述RSV F多肽為單體。在一些實施方式中，所述RSV F多肽為三聚體。在其他方面，所述RSV F蛋白在所述融合前構型中。不希望受任何具體理論的限制，認為RSV F蛋白的融合前構型或中間形式可含與在天然RSV病毒粒上表達的RSV蛋白上相同的表位，并因此提供引發中和抗體的優點。本發明的一些方面使用不利于所述F蛋白的融合后構型的多肽。在從所述融合前構型向所述融合后構型轉變中，所述多肽(全部或部分)優選展示所述融合前F蛋白的表位或中間構型的表位。這些多肽在融合前狀態可為天然或突變的F蛋白，在中間構型中可為天然或突變的F蛋白，或可為天然或突變的蛋白群體，其中不利于所述融合后構型或其被優先排除。在某些情況下，所述天然或突變的蛋白可與一種或多種額外分子結合，所述分子協助維持上述一種狀態中的多肽如優選結合所述融合前構型或中間構型的單克隆抗體。此外，所述多肽可為天然F蛋白衍生物。該衍生物包括含天然F蛋白的一種或多種片段的多肽、含天然F蛋白(或其片段)和異源序列的融合多肽以及含具有一種或多種突變的天然F蛋白序列的多肽。這些(或其他)修飾可能不利于所述融合后構型。不利于所述融合后構型的示例性方法包括穩定所述融合前構型、穩定所述中間構型、使所述融合后構型去穩定或增加引起所述融合后構型的一種或多種步驟的激活屏障。在另一實施方式中，本發明為展示至少一種表位的多肽，所述表位特異于所述融合前構型F蛋白或中間構型F蛋白。特異于所述融合前構型F蛋白或中間構型F蛋白的表位為融合后構型中不存在的表位。優選所述至少一種表位穩定存在，例如所述表位在溶液中穩定存在至少12小時、至少I天、至少2天、至少4天、至少6天、至少I周、至少2周、至 少4周或至少6周。所述多肽在融合前狀態、中間狀態或狀態群體中可為天然或突變的F蛋白，所述狀態群體中所述融合后狀態含量不足或百分比低于分離的天然F蛋白，或其可為天然F蛋白的衍生物。該衍生物包括含天然F蛋白的一種或多種片段的多肽、含天然F蛋白(或其片段)和異源序列的融合多肽以及含具有一種或多種突變的天然F蛋白序列的多肽。這些(或其他)修飾可能將F蛋白氨基酸序列穩定為其融合前構型、將F蛋白氨基酸序列穩定為中間構型、使F蛋白氨基酸序列的融合后構型不穩定、增加引起F蛋白氨基酸序列的融合后構型轉變的能量屏障，或上述兩種或更多的組合。所述F蛋白的TM和/或CT結構域 對穩定所述融合前構型很重要(8)。因此這些結構域可在本發明的免疫原中有效保留。由于可溶性免疫原中可能不需要包括跨膜結構域，但TM的功能效應可通過其他方法實現。例如，副流感病毒5的F蛋白的融合前和后表現已被詳細研究(6)，該作者通過融合異源三聚結構域與ED的C末端來穩定ED的融合前結構。寡聚化結構域本發明的另一實施方式中，所述組合物可包括含第一結構域和第二結構域的多肽(如重組多肽)，其中(i)所述第一結構域含所述RSV F蛋白(如全部或部分的RSV胞外域)，和(ii)所述第二結構域含異源寡聚化結構域。所述第二結構域允許所述多肽的寡聚化，從而有助于所述第一結構域采用融合前狀態或中間狀態。所述多肽優選為寡聚體，具體為三聚體。本領域技術人員可獲得各種寡聚化結構域。這些氨基酸序列能形成與其他多肽(相同或不同)中的寡聚化結構域(相同或不同)相互作用的結構，從而所述多種多肽可結合(通常為非共價)以形成寡聚體如三聚體。例如，HIV的F蛋白的三聚化(即gpl60)是通過將其融合到天然為穩定三聚體(9)的大腸桿菌天冬氨酸氨甲酰基轉移酶(ATCase)的催化亞基上獲得。因此ATCase的該亞基可用于本發明。相似地，HIV(IO)和PIV5的F蛋白(6)的三聚化是通過將其胞外域融合到GCNt上獲得。因此本發明所用的寡聚化結構域可包括酵母GCN4亮氨酸拉鏈蛋白的卷曲螺旋(11)。通過使用來自T4噬菌體次要纖維蛋白的三聚化序列(‘折疊子’ )(GSGYIPEAPRDGQ AYVRKDGEffVLLSTFL-SEQ ID NO 19)獲得來自A型流感病毒HA蛋白的胞外域三聚化(12)。因此本發明所用的寡聚化結構域可包括該折疊子。天然產生的蛋白寡聚體(異源寡聚體和同源寡聚體)以各種不同方式結合，如通過結合不同單體中的￠-片層、通過結合不同單體中的a-螺旋、通過結合疏水性表面區域等。蛋白寡聚化中涉及的一種常見結構基序為卷曲螺旋結構域。所述卷曲a-螺旋結構基序自身可形成螺旋，且2、3、4或5個a -螺旋可彼此圍繞形成左手超螺旋，稱為“卷曲螺旋”，盡管已設計人工右手超螺旋(13-19)。所述卷曲螺旋結構域的簡單性使其成為設計具有確定寡聚化狀態的嵌合蛋白的普遍選擇(16)。在卷曲螺旋結構中，所述a -螺旋通過沿著各螺旋一側形成非極性條的疏水殘基相互作用，且該條兩邊的側鏈之間還可有穩定的靜電相互作用。在a-螺旋的abcdefg七殘基重復序列中，用殘基a和d處的疏水側鏈和主要位于殘基e和g的任何靜電相互作用定義所述非極性條。位置a最常見為Leu、Ile或Ala且位置d通常為Leu或Ala。殘基e和g通常為Glu或Gln,位置g也主要為Arg和Lys。位置b、c和f常為帶電殘基，因為這些殘基與溶劑接觸。然而該常見七殘基模式有例外，且所述七殘基中有時存在Pro殘基。所述例外常具有功能性意義包括例如，使所述寡聚化結構域不穩定以使其重折疊并重排，如發生在所述F蛋白中。
本領域已知數百種卷曲螺旋結構域序列，且任何合適的序列可用作本發明的寡聚化結構域，只要其保留與其他卷曲螺旋結構域寡聚化的能力且其沒有破壞所述多肽中其他結構域的功能。優選使用的卷曲螺旋結構域存在于細胞外(20)且天然作為寡聚化結構域。作為使用天然卷曲螺旋結構域的替代，可使用人工卷曲螺旋結構域(21，22)。由于卷曲螺旋結構域的高重復結構，所述結構域特別適于計算機建模，因為各氨基酸殘基的主鏈部分可參數化而不是將殘基的各主鏈部分作為具有其自身變量的單獨單元。結構域(b)可包括亮氨酸拉鏈序列或丙氨酸拉鏈序列(23)。本發明的多肽中所用的卷曲結構域優選是形成三聚體的結構域，從而本發明的所述多肽也可組裝為三聚體。優選的卷曲螺旋結構域取自細菌跨膜蛋白。跨膜蛋白的優選子集為粘附素(即介導與其他細胞或表面粘附的細胞表面蛋白)、具體為非菌毛粘附素(如寡聚卷曲螺旋粘附素，或‘Oca’家族)。本發明使用的具體序列包括參考文獻24公開的序列，來自小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)粘附素YadA、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)粘附素 NadA、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhal is)表面蛋白UspA2,和其他粘附素如來自流感嗜血桿菌埃及生物型(Haemophilus influenzaebiogroup aegyptius)的 HadA 粘附素等(參考文獻 24 的 SEQ ID NO 28-31 和 42-58)。此 夕卜，所述真核熱休克轉錄因子具有可分別表達的卷曲螺旋三聚化結構域，因此將其用于本發明。具有卷曲螺旋區域的多肽的氨基酸序列中，所述a -螺旋的七殘基重復區的性質說明所述卷曲螺旋結構域的界線可以一定精確度確定，但其中卷曲螺旋排列可視為終止的精確殘基不能絕對準確地獲知。然而，缺乏絕對精確性不是實施本發明的問題，因為常規測試可揭示所述卷曲螺旋是否需要任何具體的可能有疑問的氨基酸殘基。即便如此，本發明不需要絕對精確地獲知所述界線，因為本發明的唯一基本要求是所述卷曲螺旋結構域以使所述多肽與其他卷曲螺旋結構域寡聚化而不破壞所述多肽中的其他結構域功能的方式行使功能。在左手3螺旋中發現本發明可用的另一類寡聚化結構域，稱為膠原螺旋(25)。這些3螺旋形成序列包括基本三肽重復序列1Gly-2Xaa-3Xaa,其中2Xaa常為Pro,且3Xaa常為4-羥基脯氨酸。盡管該基序稱為“膠原”螺旋，但在膠原以外的許多蛋白內都有發現。因此，所述寡聚化結構域可為含序列基序1Gly-2Xaa-3Xaa的多重復的序列，所述基序折疊形成螺旋結構，其可與其他多肽鏈中的相應螺旋結構寡聚化。膠原還提供另一類寡聚化結構域。參考文獻26描述了 X型膠原的非膠原結構域I(NCl)中發現的基序，且該基序可用于形成三聚體和更高級的多體而沒有3螺旋。所述三聚結合具有高度熱穩定性而沒有分子間二硫鍵。因此，所述寡聚化結構域可含NCl序列。其他寡聚化結構域可源自寡聚TM蛋白的跨膜結構域。由于這些通常為親脂性的，所以位于其TM區域外側的疏水殘基可被帶電殘基替代以提供可溶的結構域。本領域已知通過蛋白工程改造使跨膜結構域增溶的方法，例如參考文獻27。所述方法也用于GCN4，其中所述七殘基重復位置“a”和“d”替換為異亮氨酸(11) KQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA(SEQ ID NO :20)。用于所述寡聚化結構域的合適卷曲螺旋序列通常為20-35個氨基酸長度，如23-30個氨基酸殘基長度。本發明所用的寡聚化結構域通常可維持寡聚化結構而不需要形成單體間二硫橋，但含二硫鍵連接單體的寡聚體不排除在本發明以外。或者或此外，為了使用寡聚化結構域以穩定F蛋白為其融合前構型，可使用突變。例如，參考文獻28報道了猿病毒5或亨德拉病毒中F蛋白的F2亞基保守區域中的突變可影響所述融合前構型的穩定性。在一些情況中，也可使用低pH以有利于所述融合前構型。HRB結構域三聚體的穩定化
在本發明另一優選方面，所述HRB結構域三聚體穩定化可能不利于所述F蛋白的融合后構型。在所述融合前和可能的中間形式中所述HRB結構域形成3鏈卷曲螺旋。如以上部分所討論，由于其簡單性，卷曲螺旋已被作為蛋白之間分子間相互作用的模式系統和長程分子內相互作用(即三級折疊相互作用)的模式系統而廣泛研究。這些研究有助于指導可用于穩定所述三聚卷曲螺旋形式中HRB結構域的方法。例如，所述七殘基重復區的a和/或d位置的一種或多種殘基可替換為有利于形成穩定三聚卷曲螺旋的殘基如Ile殘基。此外，雖然次優選，但可刪除e和g位置的不利離子相互作用或可添加e和g位置的有利離子相互作用。用于操作的所述HRB結構域的優選區域為P484-N517之間的七殘基重復區。用于革巴向以突變的a和d殘基的優選示例為F488、1492、V495、1499、S502、1506、S509、L512和V516。特別優選絲氨酸殘基，因為將所述親水殘基替換為疏水殘基會穩定所述卷曲螺旋的疏水核心。另一優選的靶標為具有較小疏水殘基的苯丙氨酸，其能更好地包裝入所述核心如異亮氨酸。HRA結構域三聚體的去穩定化在本發明另一優選方面，去所述HRA結構域三聚體去穩定化可能不利于所述F蛋白的融合后構型。在所述融合后和可能的一種或多種中間形式中所述HRA結構域形成3鏈卷曲螺旋。例如，所述七殘基重復區的a和/或d位置的一種或多種殘基可替換為不利于形成穩定三聚卷曲螺旋的殘基。此外，雖然次優選，但可刪除e和g位置的有利離子相互作用或可添加e和g位置的不利離子相互作用。所選的突變優選對所述融合前構型的HRA結構域的穩定性影響最小，其可基于融合前和融合后形式的PIV5F蛋白的可用晶體結構建模。其他修飾除了上述修飾，還可設計基于所述hRSV F蛋白的分子建模的修飾，所述建模基于融合前和融合后形式的PIV5F蛋白的可用晶體結構。可進行突變以去穩定化所述融合后構型如所述HRA和HRB結構域的6HB折疊或穩定化所述融合前構型如所述融合前構型中的HRA折疊。此外，可提高引起所述融合后構型的轉變的能量屏障。雖然本領域技術人員會理解穩定所述起始構型或去穩定所述最終構型可具有提高能量屏障的影響，但可引入自身影響所述轉變狀態的其他修飾。作為另一個例子，HRB結構域N末端氨基酸(約氨基酸449-482，優選V459-F483)用作使所述HRB結構域從所述F蛋白三聚體的一側移動到另一側的“系繩”，從而該HRB結構域可參與所述融合后構型的6HB中。一種或多種這些氨基酸的缺失會影響或完全阻止所述HRB結構域參與所述F蛋白的融合后構型的6HB折疊中(參見圖3)。此外，可穩定所述融合前構型中所述系繩和所述F蛋白之間的相互作用以阻止所述系繩離開從而使所述HRB結構域參與所述6HB折疊。可進行的穩定化突變的例子為所述融合前構型中所述系繩和該系繩接觸的所述F蛋白部分之間的半胱氨酸橋。另一例子是所述融合前構型中HRA的穩定化(殘基T50-Y306)。同樣，基于同源F蛋白的晶體結構，可通過用大小相似的疏水殘基替換包埋的親水或離子殘基來穩定所述疏水核心。也可在表面或核心內引入半胱氨酸橋。此外，如用溶菌酶突變體的大量晶體結構分析所證明的，所述疏水核心或蛋白相對剛硬，因此引入孔可預見地去穩定化所述溶菌酶突變體。相似地，重包裝所述融合前構型中F蛋白的核心以消除任何天然孔可穩定融合前或中間形式的F蛋白，因此不利于所述融合后構型。制備組合物的方法 本發明涉及制備組合物的方法，以及含RSV F蛋白具體為可溶性RSV F胞外域多肽的組合物，包括免疫原性組合物。所述RSV F胞外域多肽優選為單一形式，如未切割單體、未切割三聚體、切割三聚體、切割三聚體的玫瑰花結或為這些形式的子集之間的動態平衡(如未切割單體和未切割三聚體之間的平衡)。本發明提供數種優點。例如，如本文所述，本發明提供生產組合物的方法，所述組合物含主要需要形式的RSV F蛋白，或單一需要形式的RSV F蛋白如未切割單體、未切割三聚體、切割三聚體、切割三聚體的玫瑰花結、這些形式的子集之間的動態平衡(如未切割單體和未切割三聚體之間的平衡)或需要形式的RSV F蛋白混合物。這些組合物類型可用于各種用途，如生產可用于生產疫苗的免疫原性組合物。免疫原性組合物中存在RSV F的單一需要形式，或已知形式之間的動態平衡提供了更易預測的配制、可溶性和穩定性，將所述組合物給予對象時還提供了更易預測的免疫應答。在宿主細胞中通過常規重組表達生產RSV F蛋白胞外域多肽時，該宿主細胞生產期間所述多肽在分泌到培養基之前在約109/110位和約136/137位的弗林蛋白酶切割位置被切割。所述宿主細胞對所述多肽的切割允許RSV F蛋白胞外域多肽重折疊，這導致所述疏水融合肽的暴露。因此，由于存在暴露的融合肽，所述切割的RSV F蛋白胞外域多肽形成玫瑰花結并與源自所述宿主細胞和培養基的脂質和脂蛋白結合。實際上，在昆蟲細胞中生成并根據HIS6標記純化的經切割RSV F胞外域的電子顯微鏡檢查顯示所述多肽具有與融合后形式一致的拐杖形狀并結合似乎是殘留的細胞碎片。因此，玫瑰花結和其他形式以及RSV F蛋白胞外域多肽構型的高純度制品不易通過宿主細胞中常規重組表達獲得。生產切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在一個方面，本發明是制備含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法。總體上，所述方法涉及提供未切割的RSV F蛋白胞外域多肽且隨后切割其以產生F1亞基和F2亞基。如本文所述，未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地純化并用合適的方法如尺寸排阻色譜法從污染脂質和脂蛋白中分離。不希望受任何具體理論的限制，認為疏水融合肽不在所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽中暴露，因此所述未切割多肽不與脂質和脂蛋白污染物結合。如本文進一步所述，未切割的RSV F蛋白胞外域可進行切割以產生F1和F2M基，其可被純化為三聚體、三聚體的玫瑰花結、或三聚體與三聚體的玫瑰花結的混合物。未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合適的方法生產。例如，通過在生產所述RSV F蛋白胞外域多肽時在不含活性弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶的宿主細胞中重組生成。可用各種方法實現該生產方法，如在進行突變以防止弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶表達(有條件或完全地“敲除”)的重組宿主細胞中生產，和降低或防止弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶在所述宿主細胞中表達的各種方法，例如用RNA干擾或其他相似方法，或用所述蛋白酶的抑制劑在宿主細胞中抑制弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶活性。未切割的RSV F蛋白胞外域多肽優選用編碼RSV F蛋白胞外域的構建體的重組表達生產，其中所述弗林蛋白酶切割位置的氨基酸序列被改變，從而所述RSVF蛋白胞外域多肽由生成所述未切割多肽的宿主細胞分泌。所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合適的宿主細胞生產，例如昆蟲細胞(如埃及伊蚊、苜蓿銀紋夜蛾、家蠶蛾、果蠅、草地貪夜蛾和粉紋夜蛾)、哺乳動物細胞(如人、非人靈長類、馬、牛、羊、狗、貓和嚙齒類(如倉鼠))、禽類細胞(如雞、鴨、鵝)、細菌(如大腸桿菌、枯草桿菌和鏈球菌屬)、酵母細胞(如釀酒酵母、白色念珠菌、麥芽糖假絲酵母、多形漢森酵母、脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、季也蒙畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母)、四膜蟲細胞(如嗜熱四膜蟲)或其組合。本領域熟知許多合適的昆蟲細胞和哺乳動物細胞。合適的昆蟲細胞包括例如，Sf9細胞、Sf21細胞、Tn5細胞、Schneider S2細胞和High Five細胞(源自親本粉紋夜蛾BTI-TN-5B1-4細胞系的克隆分離物(英杰公司(Invitrogen)))。合適的哺乳動物細胞包括例如，中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、人胚胎腎細胞(HEK293細胞，通常由剪切的腺病毒5型 DNA轉化成)、NIH-3T3細胞、293-T細胞、Vero細胞、HeLa細胞、PERC. 6細胞(ECACC保藏號96022940)、H印 G2 細胞、MRC-5 (ATCC CCL-171)、WI-38 (ATCC CCL-75)、胎獼猴肺細胞細胞(ATCC CL-160)、Madin-Darby 牛腎(“MDBK”)細胞、Madin-Darby 狗腎(“MDCK”)細胞(如MDCK(NBL2)、ATCC CCL34 ;或1 0( 33016,DSM ACC 2219)、幼倉鼠腎(BHK)細胞如BHK21-F、HKCC細胞等。合適的禽類細胞包括例如，雞胚胎干細胞(如EBx 細胞)、雞胚胎成纖維細胞、雞胚胎生殖細胞、鴨細胞(如，例如在Vaccine27 :4975-4982(2009)和W02005/042728中描述的AGE1. CR和AGE1. CR. pIX細胞系(專業生物基因公司(ProBioGen) ))、EB66細胞
坐寸o合適的昆蟲細胞表達系統如桿狀病毒系統為本領域技術人員已知，描述于例如Summers 和 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)。桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統的材料和方法以藥盒形式購自加利福尼亞州圣迭戈的英杰公司等。禽類細胞表達系統也為本領域技術人員已知，描述于例如美國專利號5，340，740 ；5，656，479 ;5，830，510 ;6，114，168 ;和 6，500，668 ;歐洲專利號 EP 0787180B ;歐洲專利申請號EP03291813. 8 ；W0 03/043415 ;和冊03/076601。相似地，細菌和哺乳動物細胞表達系統也為本領域已知，描述于例如Yeast Genetic Engineering(《酵母遺傳工程》)(Barr等編著，1989)倫敦，巴特沃思公司(Butterworths)。通常，改變未切割的RSV F蛋白胞外域的氨基酸序列以防止在約109/110位和約136/137位的弗林蛋白酶切割位置切割，但其含天然產生或引入的蛋白酶切割位置，切割時產生F1亞基和F2亞基。例如，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可具有改變的氨基酸序列以防止在約109/110位和約136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其從約101位到約161位含天然產生或引入的蛋白酶切割位置。本領域普通技術人員可容易地設計并構想會使宿主細胞生產并表達未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的各種具體的氨基酸序列，包括沒有在約109/110位和約136/137位的弗林蛋白酶切割位置切割的氨基酸序列。通常，獨立替換或缺失約109/110位和約136/137位的弗林蛋白酶切割位置部分或鄰近其的一種或多種氨基酸。已知適于阻止RSV F蛋白胞外域多肽切割的一些氨基酸替代和缺失。例如，抑制109/110切割的R108N、R109N、R108N/R109N的替換，抑制136/137切割的K131Q替換或131-134位氨基酸的缺失已在 Gonzalez-Reyes 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,98 :9859-9864(2001)中描述。已描述含氨基酸替換R108N/R109N/K131Q/R133Q/R135Q/R136Q的未切割的RSV F胞外域多肽。Ruiz-Arguello 等，J. Gen. Virol.，85 :3677687 (2004)。如本文詳細描述，導致所述 RSV F胞外域多肽從未切割的宿主細胞中分泌的額外RSV F蛋白氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，如改變約106-109位和約133-136位的氨基酸序列。所述改變的弗林蛋白酶切割位置在約106-109位含至少一種氨基酸替換或缺失，和在約133-136位含至少一種氨基酸替換或缺失。相似地，含蛋白酶切割位置(如天然產生或引入的)的未切割RSV F蛋白胞外域多肽的各種具體氨基酸序列可能存在并可被容易地設計和構想，所述序列切割時產生含F1的第一亞基和含F2的第二亞基。例如，從約101位到約161位的RSVF蛋白的氨基酸序列含胰蛋白酶切割位置，且一種或多種所述胰蛋白酶切割位置可被胰蛋白酶切割以生成F1和F2亞基。如果需要，一種或多種合適的蛋白酶識別位置可被引入所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如約101位到約161位之間。所引入的蛋白酶識別位置可用所述合適的蛋白酶切割以產生F1和F2亞基。將蛋白酶識別位置引入未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的 氨基酸序列時，優選所述位置被不切割天然產生的RSV F蛋白胞外域的蛋白酶識別。本發明這方面的方法包括a)提供含蛋白酶切割位置的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，其切割時產生F1和F2亞基，和b)用識別所述蛋白酶切割位置的蛋白酶切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。通常，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該細胞生成在約106-109位和約131-136位的弗林蛋白酶切割位置沒有被切割的多肽。所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可純化到需要的程度。例如，所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可作為基本未加工(如未加工或僅澄清)或者部分或基本純化的形式的細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基提供。在具體例子中，所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在選自下組的細胞條件培養基中提供昆蟲細胞條件培養基、哺乳動物細胞條件培養基、禽類細胞條件培養基、酵母細胞條件培養基、四膜蟲細胞條件培養基、和其組合。通常優選純化所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如純化為至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或基本均質。如本文所述，未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地從脂質和脂蛋白中純化，而常規生產的RSV F蛋白的切割形式與脂質和脂蛋白污染物共純化。因此，提供純化的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽時，本方法可用于容易地生產含切割的RSV F蛋白胞外域而基本不含脂質或脂蛋白的組合物。本領域熟知并常用蛋白酶切割多肽的合適方法。通常，待切割的多肽與足量的蛋白酶在適于切割所述多肽的條件(如pH、多肽和蛋白酶濃度、溫度)下結合。許多合適的蛋白酶可市售獲得，且已知許多蛋白酶進行多肽切割的合適條件。如果需要，切割的RSV F蛋白胞外域多肽可在蛋白酶切割后純化。本方法的一個實施例中，提供含完整融合肽的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，如137-154位氨基酸都未替換或缺失的未切割RSV F蛋白胞外域多肽。在一些實施方式中，純化所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。切割所提供含完整融合肽的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割導致已切割RSV F蛋白胞外域多肽三聚體形成玫瑰花結。如果需要，所述玫瑰花結可用任何合適的方法如尺寸排阻色譜進一步純化。本方法的另一實施例中，提供含已改變融合肽的未切割RSV F蛋白胞外域多肽，如約137-152氨基酸、約137-153氨基酸、約137-145氨基酸或約137-142氨基酸缺失的未切割RSV F蛋白胞外域多肽。還描述了其他合適的融合肽缺失，如137-146位氨基酸的缺失。Ruiz-Arguello 等，J. Gen. Virol. ,85 :3677-3687 (2004)。 在一些實施方式中，純化所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。切割所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割導致已切割RSV F蛋白胞外域多肽形成三聚體。如果需要，所述三聚體可用任何合適的方法如尺寸排阻色譜進一步純化。在本方法的具體實施例中，所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽含至少一種選自furdel和delp23 furdel的多肽(如均質胰蛋白酶可切割的furdel、均質胰蛋白酶可切割的delp23 furdel或胰蛋白酶可切割的furdel和胰蛋白酶可切割的delp23 furdel的混合物)。例如用胰蛋白酶切割所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割導致形成RSV F蛋白胞外域多肽的切割三聚體、切割三聚體的玫瑰花結或切割三聚體和切割三聚體的玫瑰花結的組合。如果需要，所述切割三聚體和/或切割三聚體的玫瑰花結可用任何合適的方法如尺寸排阻色譜進一步純化。生產未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在另一方面，本發明是生產含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法。總體上，本方法涉及提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，如細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基，然后純化所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。如本文所述，已發現純化的未切割RSV F蛋白胞外域多肽單體能自我結合以形成未切割單體，以及存在未切割單體和未切割三聚體的混合物或未切割單體和未切割三聚體之間的平衡。不希望受任何具體理論的限制，認為所述平衡有利于所述單體，但濃縮溶液中所述平衡會移向所述三聚體。本發明這方面的方法包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，如細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基jPb)從所述生物材料中純化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體的組合。在一些實施方式中，純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、或純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體、或純化單體和
三聚體。通常，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該細胞生成約101位-約161位沒有被切割(包括106-109位和131-136位的弗林蛋白酶切割位置)的多肽。在更具體的實施方式中，含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料包括至少一種選自下組的多肽furmt、furdel> delp21 furx、delp23 furx、delp21 furdel> delp23 furdel 和可用 Xa 因子切割的Xa因子構建體。在一些實施方式中，所述RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，且約101位-約161位之間的其他蛋白酶切割位置(如胰蛋白酶切割位置)被改變或缺失以阻止蛋白酶(如胰蛋白酶)切割。例如，已知胰蛋白酶在賴氨酸和精氨酸殘基之后切割。在某些優選實施方式中，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，約101位和約161位之間存在的一種或多種賴氨酸和/或精氨酸殘基(如所有賴氨酸和精氨酸殘基)缺失或被非賴氨酸或精氨酸的氨基酸替換，所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該細胞生成約101位和約161位之間沒有切割的多肽，且所述RSVF蛋白胞外域多肽在約101位和約161位之間沒有被胰蛋白酶切割。用千分之一體積的胰蛋白酶溶液(牛血漿胰蛋白酶在25mM Tris pH7. 5,300mM NaCl中稀釋為lmg/ml濃度；消化反應中的最終質量比胰蛋白酶RSV F胞外域為0. 001 I ;胰蛋白酶以10-15BAEE單位/毫克蛋白使用)在37°C處理lmg/ml RSV F蛋白胞外域多肽溶液(在25mM Tris pH7. 5,300mM NaCl中稀釋)I小時的時候，所述RSV F蛋白胞外域多肽優選沒有被胰蛋白酶切割。如果需要，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽(如含改變的弗林蛋白酶切割位置的多肽和含改變的弗林蛋白酶切割位置和改變的胰蛋白酶切割位置的多肽)還可含改變的融合肽，如未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，其中例如約氨基酸137-152缺失、約氨基酸137-154缺失、約氨基酸137-145缺失或約氨基酸137-142缺失。還描述了其他合適的融合肽缺失，如137-146位氨基酸的缺失。Ruiz-Arguello等，J. Gen. Virol. ,85 3677-3687(2004)。在具體實施方式
中，本發明包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，如細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基，其中所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，約101位和約161位之間存在的一種或多種賴氨酸和精氨酸殘基缺失或被非賴氨酸或精氨酸的氨基酸替換，所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該細胞生成約101位和約161位之間沒有切割的多肽，且所述RSVF蛋白胞外域多肽在約101位和約161位之間沒有被胰蛋白酶切割；和b)從所述生物材料中純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體的組合。在更具體的實施例中，含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料包括至少一種選自下組的多妝Furx、Furx R113Q K123N K124N、delp21 furx 和 delp23furx。在其他具體實施方式
中，本方法包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，其中所述融合肽經突變(如至少部分所述融合肽缺失)，如細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基；和b)從所述生物材料中純化所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該細胞生成約101位-約161位沒有被切割(包括106-109和131-136位的弗林蛋白酶切割位置上)的多肽。如果需要，具有改變的弗林蛋白酶切割位置的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽還在約101位和約161位之間含改變或缺失的其他蛋白酶位置(如胰蛋白酶切割位置)以防止蛋白酶(如胰蛋白酶)切割。例如，約101位和約161位之間存在的一種或多種賴氨酸和/或精氨酸殘基(如所有賴氨酸和精氨酸殘基)缺失或被非賴氨酸或精氨酸的氨基酸替換，且所述RSV F蛋白胞外域多肽在約101位和約161位之間沒有被胰蛋白酶切割。 所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體以及單體和三聚體的組合可純化到需要的程度。通常優選純化所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體或三聚體，例如純化為至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、至少約95 %或基本均質。如本文所述，未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地用例如尺寸排阻色譜法從脂質和脂蛋白中純化。因此，本方法可用于容易地生產含切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體的組合而基本不含脂質和脂蛋白的組合物。在一個實施例中，所述方法包括提供昆蟲細胞條件培養基、哺乳動物細胞條件培養基、禽類細胞條件培養基、酵母細胞條件培養基、四膜蟲細胞條件培養基或其組合。在一些實施方式中，純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體。在其他實施方式中，純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體。在其他實施方式中，純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體和三聚體。
生產具有已改變融合肽的切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在一個方面，本發明是制備含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法，所述多肽含改變的融合肽。宿主細胞中表達不含改變的弗林蛋白酶位置切割位置的RSV F蛋白胞外域多肽時，所述宿主細胞加工所述多肽，部分通過在約109/110位和約136/137位的弗林蛋白酶位置切割所述多肽以產生F1和F2亞基。加工的多肽可分泌到所述培養基中且可作為結合的F1-F2亞基(如二硫化物結合的F1和F2亞基)回收，其可通過聚集暴露的融合肽來形成三聚體的玫瑰花結。含改變的融合肽的RSV F蛋白胞外域多肽可在宿主細胞中生成并作為結合的F1-F2亞基分泌，且優選不聚集為玫瑰花結或與脂質或脂蛋白污染物聚集。不希望受限于任何特定的理論，認為由于所述改變的融合肽不介導聚集，所述多肽不形成玫瑰花結或與脂質和脂蛋白污染物結合。本發明這方面的方法包括a)提供含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，其中所述多肽含改變的融合肽(如至少部分所述融合肽缺失)，如細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基；和幻從所述生物材料中純化切割的RSV F蛋白胞外域多肽。所述純化的經切割RSV F蛋白胞外域多肽可純化為切割三聚體、切割三聚體的玫瑰花結或切割三聚體和切割三聚體的玫瑰花結的混合物。含已改變融合肽的合適的RSV F蛋白胞外域多肽在約109/110和約136/137含有可切割的弗林蛋白酶切割位置，還含有本文所述的改變的融合肽。例如，本方法中可用缺失約137-152氨基酸、缺失約137-153氨基酸、缺失約137-145氨基酸、缺失約137-146氨基酸、缺失約137-142氨基酸的RSV F蛋白胞外域多肽。在具體實施例中，含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；至少包括所述融合肽缺失I。所述切割的RSV F蛋白胞外域多肽(如切割三聚體或切割三聚體和切割三聚體的玫瑰花結的混合物)可純化到需要的程度。通常優選純化所述切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如純化為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或基本均質。如本文所述，含已改變融合肽的切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地用例如尺寸排阻色譜法從脂質和脂蛋白中純化。因此，本方法可用于容易地生產含切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體、切割三聚體的玫瑰花結或切割三聚體和切割三聚體的玫瑰花結的組合而基本不含脂質和脂蛋白的組合物。生產具有C末端弗林蛋白酶突變的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在另一方面，本發明是制備含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法和制備切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法。不希望受限于任何具體理論，認為C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在約109/110位的弗林蛋白酶切割位置而不是約136/137位的弗林蛋白酶切割位置被生產所述蛋白的細胞切割，其作為結合F2亞基的F1亞基被分泌到培養基中。還認為所述疏水融合肽不在C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽中暴露，因此C末端未切割的多肽不與脂質和脂蛋白污染物結合。如本文進一步所述，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域還可被切割以產生結合F2亞基的F1亞基，其中氨基末端為110位-約161位。所述F1和F2亞基，可被純化為三聚體、三聚體的玫瑰花結或三聚體和三聚體的玫瑰花結的混合物。
通常，改變C末端未切割的RSV F蛋白胞外域的氨基酸序列以防止在約136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其含天然產生或引入的蛋白酶切割位置，切割時產生F1亞基和F2亞基，所述F1亞基中氨基末端從110位到約161位。例如，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可具有改變的氨基酸序列以防止在約136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其從約101位到約161位含一種或多種天然產生或引入的蛋白酶切割位置。在具體實施例中，改變所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列以防止在約136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其在約109/110位含天然產生的弗林蛋白酶切割位置。本領域普通技術人員可容易地設計并構想會使宿主細胞生產并表達C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的各種具體的氨基酸序列，包括沒有在約136/137位的弗林蛋白酶切割位置切割的氨基酸序列。通常，獨立替換或缺失約136/137位的弗林蛋白酶切割位置部分或鄰近其的一種或多種氨基酸。本文描述了防止約136/137位切割的合適的氨基酸替代和缺失。例如，可使用K131Q替代、131-134位的氨基酸缺失或K131Q/R133Q/R135Q/R136Q替代，這些各自抑制136/137上的切割。在某些實施方式中，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在約133-136位包括至少一種氨基酸替代或缺失。相似地，含蛋白酶切割位置(如天然產生或引入的)的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的各種具體氨基酸序列可能存在并可容易地設計和構想，所述序列切割時產生含F1的第一亞基和含F2的第二亞基。例如，從約101位到約161位的RSV F蛋白的氨基酸序列含胰蛋白酶切割位置，且一種或多種所述胰蛋白酶切割位置可被胰蛋白酶切割以生成F1和F2亞基。如果需要，一種或多種合適的蛋白酶識別位置可引入所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如約101位到約161位之間。所引入的蛋白酶識別位置可用所述合適的蛋白酶切割以產生F1和F2亞基。將蛋白酶切割位置引入C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列時，優選所述位置被不切割天然產生的RSV F蛋白胞外域的蛋白酶識別。C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合適的方法生產。優選的方法是通過編碼RSV F蛋白胞外域的構建體的重組表達，其中約136/137位的弗林蛋白酶切割位置的氨基酸序列被改變，從而所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽由生成約136/137位的弗林蛋白酶切割位置沒有被切割的多肽的宿主細胞分泌。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽優選由將其生成為結合F2亞基的F1亞基的宿主細胞分泌，其中F1亞基的氨基末端為132位-約161位，而不是137位。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用本文所述任何合適的宿主細胞生成。本發明這方面的一種方法包括a)提供含136/137位弗林蛋白酶切割位置改變的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主細胞，該細胞以結合含F1的亞基但136/137位沒有被切割的F2片段的形式生產所述多肽，和b)用在約101-161位之間的位置切割RSV F蛋白胞外域的蛋白酶切割所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，從而生產所述組合物。在具體實施方式
中，步驟b)包括用在約101-132位、或約132-161位或約110-132位之間的位置切割RSV F蛋白胞外域的蛋白酶切割所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。或者或此外，在一些實施方式中，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在136/137位含改變的弗林蛋白酶切割位置，條件為該改變的弗林蛋白酶切割位置不缺失氨基酸131-134.在具體實施例中，含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；至少包括所述N末端弗林蛋白酶多肽。

所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可純化到需要的程度。例如，所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可在基本未加工(如未加工或僅澄清)或者部分或基本純化形式的細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基中提供。在具體例子中，所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在選自下組的細胞條件培養基中提供昆蟲細胞條件培養基、哺乳動物細胞條件培養基、禽類細胞條件培養基、酵母細胞條件培養基、四膜蟲細胞條件培養基、和其組合。通常優選純化所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如純化為至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或基本均質。如本文所述，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地從脂質和脂蛋白中純化，而常規生產的RSV F蛋白的切割形式與脂質和脂蛋白污染物共純化。因此，提供純化的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽時，本方法可用于容易地生產含切割的RSV F蛋白胞外域而基本不含脂質或磷脂的組合物。本領域熟知并常用蛋白酶切割多肽的合適方法。通常，待切割的多肽與足量的蛋白酶在適于切割所述多肽的條件(如pH、多肽和蛋白酶濃度、溫度)下結合。許多合適的蛋白酶可市售獲得，且已知許多蛋白酶進行切割的合適條件。如果需要，所述RSV F蛋白胞外域多肽可在蛋白酶切割后純化。本方法的一個實施例中，提供含完整融合肽的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，如137-154位氨基酸都未被替換或缺失的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。本方法的另一實施例中，提供含已改變融合肽的C末端未切割的RSVF蛋白胞外域多肽，如約137-152氨基酸、約137-153氨基酸、約137-145氨基酸或約137-142氨基酸缺失的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。還描述了其他合適的融合肽缺失，如137-146位的氨基酸缺失。Ruiz-Arguello 等，J. Gen. Virol. ,85 :3677-3687(2004)。在一些實施方式中，純化所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。切割所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割引起已切割RSV F蛋白胞外域多肽形成三聚體。如果需要，所述三聚體可用任何合適的方法如尺寸排阻色譜進一步純化。在本方法的具體實施例中，所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽至少含所述N末端弗林蛋白酶多肽(圖I)。例如用胰蛋白酶切割所提供的C末端未切割的RSVF蛋白胞外域多肽，且切割引起RSV F蛋白胞外域多肽的切割三聚體、切割三聚體的玫瑰花結或切割三聚體和切割三聚體的玫瑰花結的組合的形成。如果需要，所述切割三聚體和/或切割三聚體的玫瑰花結可用任何合適的方法如尺寸排阻色譜進一步純化。本發明這方面的另一方法包括a)提供含在136/137位含改變的弗林蛋白酶切割位置的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料如細胞裂解物、細胞勻漿或細胞條件培養基，且所述可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以結合含F1的亞基但136/137位沒有被切割的F2片段的形式生成該多肽的細胞，條件為該改變的弗林蛋白酶切割位置不缺失氨基酸131-134 ;和b)從所述生物材料中純化所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，從而生產所述組合物。所述Fl亞基的氨基末端優選為約110位-約132位。所述匕亞基的氨基末端更優選為約110位。所述F1亞基的氨基末端特別優選不在137位。在具體實施例中，含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；至少包括所述N末端弗林蛋白酶多肽。如果需要，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽還在約101位和約161位之間含改變或缺失的其他蛋白酶位置(如胰蛋白酶切割位置)以防止蛋白酶(如胰蛋白酶)切割。例如，約101位和約161位之間存在的一種或多種賴氨酸和/或精氨酸殘基(如所有賴氨酸和精氨酸殘基)缺失或被非賴氨酸或精氨酸的氨基酸替換，且所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在約101位和約161位之間沒有被胰蛋白酶切割。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可含本文所述的完整融合肽或改變的融合肽。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽如單體、三聚體以及單體和三聚體的組合可純化到需要的程度。通常優選純化所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體或三聚體，例如純化為至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或基本均質。如本文所述，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地用例如尺寸排阻色譜法從脂質和脂蛋白中純化。因此，本方法可用于容易地生產含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽如單體、三聚體或單體和三聚體的組合而基本不含脂質和脂蛋白的組合物。在本發明的具體實施例中，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽至少含所述N末端弗林蛋白酶多肽(圖I)。在一個實施例中，所述方法包括提供昆蟲細胞條件培養基、哺乳動物細胞條件培養基、禽類細胞條件培養基、酵母細胞條件培養基、四膜蟲細胞條件培養基或其組合。在一些實施方式中，純化C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體。在其他實施方式中，純化C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體。在其他實施方式中，純化C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體和三聚體。自復制RNA本文所述RSV-F多肽可通過在對象細胞中表達編碼該多肽的重組核酸來生產。能給予對象以引起RSV-F多肽生產的優選核酸為自復制RNA分子。本發明的自復制RNA分子是基于RNA病毒的基因組RNA，但缺失編碼一種或多種結構蛋白的基因。所述自復制RNA分子能經翻譯生成所述RNA病毒的非結構蛋白和自復制RNA編碼的異源蛋白。所述自復制RNA通常含至少一種或多種選自下組的基因病毒復制酶、病毒蛋白酶、病毒解旋酶和其他非結構性病毒蛋白，還含有5’-和3’-末端順式激活復制序列和(如果需要)編碼所需氨基酸序列(如蛋白、抗原)的異源序列。引導所述異源序列表達的亞基因組啟動子可包括在所述自復制RNA中。如果需要，所述異源序列可與所述自復制RNA中的其他編碼區域在框內融合和/或可在內部核糖體進入位點(IRES)的控制下。
本發明的自復制RNA分子可設計成使所述自復制RNA分子不能誘導感染性病毒顆粒的生成。這可通過例如省略所述自復制RNA中的一種或多種編碼結構蛋白的病毒基因實現，所述蛋白是病毒顆粒生成所必需的。例如，所述自復制RNA分子基于a病毒如辛德畢斯病毒(SIN)、西門利克森林病毒和委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)時，可省略一種或多種編碼病毒結構蛋白如衣殼或包膜糖蛋白的基因。如果需要，本發明的自復制RNA分子可設計成誘導減毒或強毒的感染性病毒顆粒的生成，或生成能進行一輪后續感染的病毒顆粒。自復制RNA分子在甚至無任何蛋白下遞送到脊椎動物細胞時，能通過其自身(或其自身的反義拷貝)轉錄引導生成多種子RNA。所述自復制RNA遞送到細胞后能直接翻譯，且該翻譯提供RNA依賴性RNA聚合酶，所述酶然后從該遞送RNA中生成轉錄本。因此所遞送RNA引導多種子RNA的生成。這些轉錄本相對所遞送RNA為反義且可自身翻譯以提供基因產物的原位表達，或可轉錄以進一步提供與該遞送RNA同義的轉錄本，其經翻譯提供編碼的RSV F多肽的原位表達。實現自復制的一種合適系統為使用基于a病毒的RNA復制子。這些+鏈復制子在遞送到細胞后翻譯以得到復制酶(或復制酶-逆轉錄酶)。這些復制酶翻譯為自切割產生復制復合物的聚蛋白，所述復合物形成所述+鏈遞送RNA的基因組-鏈拷貝。這些-鏈轉錄本可自我轉錄以進一步得到所述+鏈親本RNA的拷貝和得到編碼所述RSV-F多肽的亞基因組轉錄本。因此所述亞基因組轉錄本的翻譯引起所述感染細胞原位表達RSV-F多肽。合適的a病毒復制子可使用來自辛德畢斯病毒、西門利克森林病毒、東部馬腦炎病毒、委 內瑞拉馬腦炎病毒等的復制酶。因此優選的自復制RNA分子編碼⑴可從所述自復制RNA分子轉錄RNA的RNA依賴性RNA聚合酶和(ii)RSV-F多肽。所述聚合酶可為a病毒復制酶例如包括a病毒蛋白nsP40盡管除了所述非結構復制酶聚蛋白，天然a病毒基因組還編碼結構病毒體蛋白，但本發明中基于a病毒的自復制RNA分子優選不編碼a病毒結構蛋白。因此所述自復制RNA可引導細胞中基因組RNA拷貝的自我生成，但不引導含RNA的a病毒病毒體的生成。不能生成這些病毒體說明所述自復制RNA分子不像野生型a病毒，其自身不能以感染形式永存。野生型病毒永存必需的a病毒結構蛋白在本發明的自復制RNA中缺失，且他們的位置被編碼所需基因產物的基因占據，從而所述亞基因組轉錄本編碼所需要的基因產物而不是所述結構a病毒病毒體蛋白。因此本發明有用的自復制RNA分子可具有兩個開放閱讀框。第一(5')開放閱讀框編碼復制酶；第二(3')開放閱讀框編碼RSV-F多肽。在一些實施方式中，所述RNA可具有額外的(下游)開放閱讀框如編碼其他需要的基因產物。自復制RNA分子可具有與所述編碼的復制酶相容的5'序列。在一個方面，所述自復制RNA分子源自或基于a病毒。在其他方面，所述自復制RNA分子源自或基于非a病毒的病毒，優選正鏈RNA病毒，更優選小RNA病毒、黃病毒、風疹病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼狀病毒或冠狀病毒。合適的野生型a病毒序列已知且可從序列保藏所如馬里蘭州羅克維爾的美國典型培養物保藏中心(American TypeCulture Collection)獲得。合適的a病毒的代表示例包括奧拉病毒(ATCC VR-368)、貝巴魯病毒(ATCC VR-600, ATCC VR-1240)、犰狳病毒(ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒(ATCCVR_64、ATCC VR-1241)、東方馬腦脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis virus)(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒(ATCC VR-924)、格塔病毒(ATCC VR-369、ATCCVR-1243)、克澤拉格齊病毒(ATCC VR-927)、馬亞羅(Mayaro) (ATCC VR-66)、馬亞羅病毒(ATCC VR-1277)、米德爾堡病毒(Middleburg) (ATCC VR-370)、穆坎博病毒(ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆病毒(Ndumu) (ATCC VR-371)、皮春納病毒(ATCC VR-372、ATCCVR-1245)、羅斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、西門利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德比斯病毒(ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、托納特(ATCC VR-925)、特里尼蒂病毒(ATCC VR-469)、烏納病毒(ATCC VR-374)、委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(ATCCVR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西馬腦脊髓炎病毒(ATCC VR-70, ATCC VR-125U ATCC VR-622, ATCC VR-1252)、沃達羅河病毒(ATCC VR-926)和 Y-62-33(ATCC VR-375)。所述自復制RNA可與遞送系統關聯。所述自復制RNA可和或不 和佐劑一起遞送。RNA遞送系統本發明的自復制RNA適于以各種形式遞送，如裸露RNA遞送或與有助于進入細胞的脂質、聚合物或其他化合物結合。本發明的自復制RNA分子可用任何合適的技術如通過直接注射、微注射、電穿孔、脂質轉染、生物裂解(biolystics)等引入祀細胞或對象。所述自復制RNA分子還可通過受體介導的胞吞作用導入細胞。參見例如美國專利第6,090,619號；Wu 和 Wu，J. Biol. Chem.，263 :14621(1988);和 Curiel 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 :8850 (1991)。例如，美國專利第6，083，741號公開了通過將核酸連接聚陽離子組分(如具有3-100個賴氨酸殘基的聚L賴氨酸)來導入外源核酸到哺乳動物細胞，所述聚陽離子組分自身偶聯整聯蛋白受體結合組分(如具有序列Arg-Gly-Asp的環肽)。本發明的自復制RNA分子可通過兩親物遞送入細胞。參見例如，美國專利號6，071，890。通常，核酸分子可形成具有陽離子兩親物的復合物。與該復合物接觸的哺乳動物能容易地將其吸收。所述自復制RNA可作為裸露RNA遞送(如僅作為RNA水溶液)，但為了增強進入細胞以及隨后的細胞間效應，所述自復制RNA優選與遞送系統如微粒或乳液遞送系統組合給予。本領域技術人員熟知大量遞送系統。所述遞送系統包括例如基于脂質體的遞送(Debs 和 Zhu (1993) WO 93/24640 ;Mannino 和 Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7)682-691 ；Rose 美國專利號 5，279，833 ；Brigham(1991)W0 91/06309 ;和 Feigner 等(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :7413-7414)，以及病毒載體的應用(如腺病毒(參見例如Berns 等(1995)Ann. NY Acad. Sci. 772 :95-104 ；Ali 等(1994)Gene Ther.I :367-384 ；和Haddada 等(1995)Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199(Pt 3) :297-306 for review)> 乳頭瘤病毒、逆轉錄病毒(參見例如 Buchscher 等(1992) J. Virol. 66(5)2731-2739 Johann等(1992) J. Virol. 66(5) :1635-1640(1992) ;Sommerfelt 等，(1990) Virol. 176 :58-59 ；Wilson 等(1989) J. Virol. 63 :2374-2378 ；Miller 等，J. Virol. 65 :2220-2224 (1991)；Wong-Staal 等，PCT/US94/05700,和 Rosenburg 和 Fauci (1993), FundamentalImmunology (《基礎免疫學》)，第三版Paul (編輯)紐約雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)和其參考文獻，和Yu等，Gene Therapy (《基因治療》)(1994)同上)、和腺伴隨病毒載體(參見 West 等(1987) Virology 160 :38-47 ；Carter ^ (1989)美國專利號 4，797，368 ；Carter 等 WO 93/24641 (1993) ；Kotin(1994)Human Gene Therapy (《人類基因治療》)5:793-801 ；Muzyczka(1994) J. Clin. Invst. 94 :1351 和 Samulski (同上)的 an overview ofAAV vectors (《AAV 載體概述》)；還參見 Lebkowski,美國專利號 5，173，414 ;Tratschin等(1985)Mol. Cell. Biol. 5(11) :3251-3260 ;Tratschin，等(1984)Mol. Cell. Biol.,
4:2072-2081 ；Hermonat 和 Muzyczka(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 :6466-6470 ；McLaughlin 等(1988)和 Samulski 等(1989) J. Virol. ,63 :03822-3828)等。三種特別有用的遞送系統是⑴脂質體(ii)非毒性和可生物降解聚合物微粒(iii)陽離子亞微米水包油乳液。脂質體 水環境下各種兩親性脂質能形成雙分子層以包埋含RNA的水核心形成脂質體。這些脂質可具有陰離子、陽離子或兩性離子親水頭基。從陰離子磷脂形成脂質體可追溯到上世紀六十年代，而形成陽離子脂質體的脂質從上世紀九十年代已開始研究。一些磷脂為陰離子型而其他為兩性離子型。合適類型的磷脂包括但不限于磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油和表20所列的一些有用的磷脂。有用的陽離子脂質包括但不限于二油酰-三甲基銨丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、I，2- 二油稀氧基-N,N 二甲基_3_氛基丙燒(DODMA) >1,2- 二亞油氧基-N,N- 二甲基_3_氛基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亞麻氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。兩性脂質包括但不限于酰基兩性脂質和醚基兩性脂質。有用的兩性脂質示例為DPPC、D0PC和十二烷基磷酸膽堿。所述脂質可為飽和或不飽和。脂質體可從單一脂質或脂質混合物形成。混合物可包括(i)陰離子脂質混合物(ii)陽離子脂質混合物(iii)兩性脂質混合物(iv)陰離子脂質和陽離子脂質混合物(V)陰離子脂質和兩性脂質混合物(Vi)兩性脂質和陽離子脂質混合物或(Vii)陰離子脂質、陽離子脂質和兩性脂質混合物。相似地，混合物可包括飽和和不飽和脂質。例如，混合物可包括DSPC(兩性、飽和)、DlinDMA(陽離子型、不飽和)和/或DMPG(陰離子型、飽和)。使用脂質混合物時，不是混合物中的所有組成脂質需要為兩親性，例如一種或多種兩親性脂質可與膽固醇混合。脂質的親水部分可PEG化(即通過聚乙二醇共價連接修飾)。這些修飾可增加穩定性并阻止所述脂質體的非特異性吸收。例如，脂質可用如Heyes等.(2005) J ControlledRelease 107 :276-287中公開的技術偶聯PEG。實施例中使用DSPC、DlinDMA、PEG-DMPG和膽固醇的混合物。本發明的單獨部分為含DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和膽固醇的脂質體。該脂質體優選包埋RNA，如例如編碼免疫原的自復制RNA。脂質體通常分為3組多室脂囊(MLV);小單室脂囊(SUV);和大單室脂囊(LUV)。MLV的各脂囊中具有多種雙分子層，形成許多分離的水性隔室。SUV和LUV具有包埋水核心的單一雙分子層；SUV通常直徑彡50nm，LUV直徑> 50nm。本發明所用的脂質體理想上為直徑范圍50-220nm的LUV。對于含不同直徑LUV群體的組合物(i)至少數量上有80%的直徑應為20-220nm，(ii)所述群體的平均直徑(Zav，強度)理想上為40_200nm，和/或(iii)所述直徑的多分散性指數應< 0. 2。本領域已知制備合適的脂質體的技術，例如參見Liposomes :Methods andProtocols (《脂質體方法和實驗方案》)，卷一 ！Pharmaceutical Nanocarriers Methods and Protocols (《藥物納米載體方法和實驗方案》)(Weissig編著)·哈馬那(Humana)出版，2009. ISBN 160327359X ；Liposome Technology(《脂質體技術》)，卷 I、II 和 III (Gregoriadis 編著)·英富曼醫療保健公司(Informa Healthcare), 2006 ;和Functional Polymer Colloids and Microparticles (《功能性聚合物膠質和微粒》)，卷4 (Microspheres,microcapsules & liposomes (微球、微囊和脂質體))·(Arshady 和 Guyot編著).辭塔斯圖書公司(Citus Books)，2002。一種有用的方法涉及混合(i)所述脂質的乙醇溶液(ii)所述核酸的水溶液和(iii)緩沖液，隨后混合、平衡、稀釋和純化(Heyes等·(2005) J Controlled Release 107:276-87·)。RNA優選包埋在所述脂質體中，且因此所述脂質體形成圍繞含RNA水性核心的外層。發現所述包埋可保護RNA不受RNA酶消化。所述脂質體可包括一些外部的RNA(如所述脂質體的表面)，但至少包埋一半的RNA(理想上為全部)。聚合微粒許多聚合物可形成微粒以包埋或吸收RNA。基本使用非毒性聚合物表明受體可安全的接受所述顆粒，而使用可生物降解聚合物表明所述顆粒可在遞送后代謝以避免長期留存。有用的聚合物還可進行滅菌，以輔助制備藥物級別制劑。合適的非毒性和可生物降解的聚合物包括但不限于 聚(α-羥酸入聚羥基丁酸、聚內酯(包括聚己內酯)、聚二卩惡烷酮、聚戊內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸源的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯酰胺和其組合。在一些實施方式中，所述微粒形成自聚U-羥酸)如聚(丙交酯)(“PLA”)、丙交酯和乙交酯的共聚物如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“？1^”)、和0，1^-丙交酯和己內酯的共聚物。有用的PLG聚合物包括那些丙交酯/乙交酯摩爾比范圍為例如20 80-80 20如 25 75,40 60,45 55,55 45,60 40,75 25。有用的 PLG 聚合物包括那些分子量為例如 5，000-200，OOODa,如 10，000-100，000,20, 000-70，000,40, 000-50，OOODa0所述微粒直徑理想上為0. 02 μ m-8 μ m。對于含直徑不同的微粒群的組合物，至少數量上80 %的直徑應為0. 03-7 μ m。本領域熟知制備合適的微粒的技術,例如參見Functional Polymer Colloidsand Microparticles (《功能性聚合物膠質和微粒》)，卷 4 (Microspheres, microcapsules& liposomes (微球、微囊和脂質體)).(Arshady和Guyot編著).辭塔斯圖書公司(CitusBooks), 2002 ；Polymers in Drug Delivery (《藥物遞送中的聚合物》)·(Uchegbu 和Schatzlein 編著)· CRC 出版社，2006.(具體第 7 章)和 Microparticulate Systems forthe Delivery of Proteins and Vaccines (《遞送蛋白和疫苗的微粒系統》)·(Cohen和Bernstein編著).CRC出版社，1996。為了有助于RNA的吸收，微粒可包括陽離子表面活性劑和 / 或脂質，如 O，Hagan 等· (2001) J Virology75 :9037-9043 ;和 Singh 等· (2003)Pharmaceutical Research 20 :247-251中所公開。制作聚合微粒的替代方法是通過模塑和固化如W02009/132206中所公開。本發明的微粒可具有40_100mV的ζ電勢。RNA可被所述微粒吸收，且該吸收通過在所述微粒中納入陽離子材料(如陽離子脂質)來促進。
水包油陽離子乳液已知水包油乳液能輔助流感疫苗如FLUAD 產品中的MF59 佐劑和PREPANDRIX 產品中的AS03佐劑。按照本發明的RNA遞送能利用水包油乳液，只要該乳液包括一種或多種陽離子分子。例如，陽離子脂質可包括在所述乳液中，以提供帶負電RNA能結合的帶正電液滴表面。所述乳液包含一種或多種油。合適的油包括來自例如動物(如魚)或植物來源的油。所述油理想上是可生物降解(可代謝)和生物相容的。植物油的來源包括堅果、種籽和谷物。最常見的花生油、大豆油、椰子油和橄欖油是堅果油的示例。可以使用例如獲自霍霍巴豆的霍霍巴油。種籽油包括紅花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常見的是玉米油，但也可以使用其它谷類的油，如小麥、燕麥、黑麥、稻、畫眉草、黑小麥等。可從堅果和種籽油開始，通過水解、分離和酯化合適物質制備甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是種籽油中天然產生。來自哺乳動物乳液的脂肪和油可代謝并因而可以使用。獲得動物來源純油所必需的分離、純化、皂化和其它方法的過程為本領域熟知。大多數魚類含有容易回收的可代謝油。例如，鱈魚肝油、鯊魚肝油和諸如鯨蠟的鯨油是可以用于本發明的幾種魚油的示例。通過生化途徑用5-碳異戊二烯單位合成許多支 鏈油，其總稱為萜類。也可采用鯊烯的飽和類似物鯊烷。包括鯊烯和鯊烷在內的魚油，易于從商業來源獲得，或可以通過本領域已知的方法獲得。其他有用的油為生育酚，特別是和角鯊烯結合。當乳液的油相包含生育酚時，可采用α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一種，但優選α -生育酚。可同時采用D_ α _生育酚和DL-α-生育酚。優選的α生育酚是DL-α生育酚。可使用包括角鯊烯和生育酚(如DL- α -生育酚)的油組合。乳液優選包含角鯊烯，其是一種支鏈不飽和萜類鯊魚肝油(C3tlH5tl ;[ (CH3)2C[=CHCH2CH2C (CH3)J2 = CHCH2-J2 ;2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳己烯；CAS RN 7683-64-9)。所述乳液中的油可包括油例如角鯊烯和至少一種其他油的組合。所述乳液的水性組分可為淡水(如w. f. I.)或可包括其他組分如溶質。例如，其可包括鹽以形成緩沖液，例如檸檬酸或磷酸鹽如鈉鹽。常用緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑；或檸檬酸緩沖劑。優選緩沖的水相，且緩沖液的濃度一般是5-20mM。所述乳液也包括陽離子脂質。優選此脂質為表面活性劑從而其有助于所述乳液的形成和穩定。有用的陽離子脂質通常含生理條件下帶正電的氮原子如叔胺或季胺。所述氮可在兩親性表面活性劑的親水頭基里。有用的陽離子脂質包括但不限于1，2_ 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、3' -[N-(Ni，N' -二甲基氨基乙基)_氨甲酰基]膽固醇(DC膽固醇)、二甲基雙十八烷基-銨(DDA如溴化物)、1，2-二肉豆蘧酰-3-三甲基-銨丙烷(DMTAP)、二棕櫚酰(C16:0)三甲基銨丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲基銨丙烷(DSTAP)。其他有用的陽離子脂質是苯扎氯銨(BAK)、氯化芐乙銨、溴棕三甲銨(其含十四烷基三甲基溴化銨和可能少量的十二烷基三甲基溴化銨和十六烷基三甲基溴化銨)、十六烷基氯化吡啶錨(CPC)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)、N，N'，N'-聚氧乙烯(10)-N-牛油-I，3-二氨基丙烷、十二烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、混合的烷基-三甲基-溴化銨、芐基二甲基十二烷基氯化銨、芐基二甲基十六烷基氯化銨、芐基三甲基甲醇銨、十六烷基二甲基乙基溴化銨、二甲基十八烷基溴化銨(DDAB)、甲基氯化芐乙銨、氯化十烴季銨、甲基混合的二燒基氯化銨、甲基二羊基氯化銨)、N, N- 二甲基-N_[2 (2-甲基-4-(1,1,3,3四甲基丁基)_苯氧基]-乙氧基)乙基]_苯甲燒_氯化銨(DEBDA)、二燒基二甲基銨鹽、[1-(2,
3-二油烯基氧基)-丙基]-N,N,N, 二甲基氯化銨、I, 2-二酸基-3-( 二甲基銨)丙燒(酸基=二肉豆蘧酰、二棕櫚酰、二硬脂酰、二油酰)、1，2_ 二酰基_3( 二甲基銨)丙烷(酰基=二肉豆蘧酰、二棕櫚酰、二硬脂酰、二油酰)、1，2_ 二油酰-3-(4'-三甲基-銨)丁酰-sn-甘油、1，2_ 二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油膽堿酯、(4'-三甲基銨)丁酸膽固醇)、N-烷基吡啶鹽(如溴化十六烷基吡啶和氯化十六烷基吡啶)、N-烷基哌啶鹽、雙陽離子波拉型電解質(C12Me6 ;C12BU6)、二烷基甘油基磷酸膽堿、溶血卵磷脂、L-α 二油酰磷脂酰乙醇胺、膽固醇半琥珀酸膽堿酯、脂聚胺，包括但不限于雙十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇-酰胺基精胺(DPPES)、脂聚-L (或D)-賴氨酸(LPLL、LPDL)、聚(L (或D)-賴氨酸偶聯N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有側接氨基的雙十二烷基谷氨酸酯((TGluPhCnN)、具有側接氨基的雙十四烷基谷氨酸酯(C14GIuCnN+)、膽固醇陽離子衍生物，包括但不限于膽固醇基-3 β -氧琥珀酰胺基乙烯基三甲基銨鹽、膽固醇基-3 β -氧琥珀酰胺基乙烯基-二甲基銨、膽固醇基-3 β -羧基酰氨基乙烯基三甲基銨鹽、和膽固醇基-3 β -羧基酰氨基乙烯基二甲基銨。其它有用的陽離子脂質在美國2008/0085870和美國2008/0057080中描述，其通過引用納入本文。 陽離子脂質優選可生物降解(可代謝)和生物相容的。除了所述油和陽離子脂質，乳液可包括非離子型表面活性劑和/或兩性表面活性齊U。所述表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨酯20和聚山梨酯80;以商品名DOWF ΑΧ 出售的環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)和/或環氧丁烷(BO)的共聚物，如直鏈ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重復的乙氧基(氧-1，2-乙二基)數量不同的辛苯聚醇，特別感興趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton) Χ-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰膽堿(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為芐澤表面活性劑)，如三乙二醇單月桂基醚(芐澤30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常稱為司盤)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和去水山梨糖醇單月桂酸酯。乳液中包含的優選表面活性劑是聚山梨酯80 (吐溫80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。所述乳液中可包括這些表面活性劑的混合物，如吐溫80/司盤85混合物或吐溫80/曲通-X100混合物。聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的組合也適用。另一種有用的組合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值為10-20的表面活性劑(如聚山梨酯80，HLB為15. O)和HLB值為1-10的表面活性劑(如去水山梨糖醇三油酸酯，HLB為I. 8)。最終乳液中油的含量(體積％ )優選為2-20%，如5-15%、6-14%、7_13%、8-12 %。約4-6 %或約9-11 %的角鯊烯含量特別有用。最終乳液中角鯊烯的含量(重量％ )優選在O. 001%和8%之間。例如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚山梨酯80)0. 2-4%，具體為O. 4-0. 6%,O. 45-0. 55%、約O. 5%或
I.5-2%U. 8-2. 2%Λ. 9-2. I %、約 2%、或 O. 85-0. 95%、或約 I 去水山梨糖醇酯(如去水山梨糖醇三油酸酯)O. 02-2 %，具體約O. 5 %或約I %;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通x-100)O. 001-0. I %，具體為0.005-0.02% ;聚氧乙烯酯(如月桂醇聚醚9)0. 1-8%,優選O. 1-10%且具體為O. 1-1 %或約O. 5%0油和表面活性劑的絕對含量和其比例可在較廣范圍內變化而仍能形成乳液。技術人員可容易地改變組分的相對比例以獲得需要的乳液，但油和表面活性劑常用4 :1-5:1的重量比(油過量)。確保乳液的免疫刺激活性的重要參數，特別是在大型動物中，是油滴尺寸(直徑)。最有效的乳液液滴尺寸為亞微米范圍。所述液滴 尺寸適于為50-750nm。最常用的平均液滴尺寸小于250nm如小于200nm、小于150nm。平均液滴尺寸常用80_180nm。理想地，至少80% (數量)的乳液油滴直徑小于250nm，且優選至少90%。測量乳液中平均液滴尺寸和尺寸分布的儀器可市售獲得。這些通常使用動態光散射和/或單顆粒光學感應的技術如獲自顆粒尺寸系統公司(Particle Sizing Systems)的Accusizer 和Nicomp 系列儀器(美國圣塔色色拉)，或馬文儀器公司(Malvern Instruments)的Zetasizer 儀器(英國)，或厚利巴公司(Horiba)的顆粒尺寸分布分析儀(Particle Size DistributionAnalyzer instruments)(日本京都)。理想地，液滴尺寸分布(數量)僅有一個最大值而不是兩個最大值，即圍繞平均值(模式)分布有單一液滴群。優選的乳液的多分散性< O. 4如O. 3、0. 2或更小。含亞微米液滴和窄尺寸分布的合適乳液可通過使用微流化獲得。該技術通過幾何學固定的通道以高壓和高速推動輸入流組分來降低油滴平均尺寸。這些流接觸通道壁、室壁和彼此。造成的剪切力、沖擊力和空化力使液滴尺寸變小。可重復微流化步驟直至得到的乳液含所需平均液滴尺寸和分布。作為微流化的替代，加熱法可用于引起相轉化。這些方法還可提供顆粒尺寸分布緊密的亞微米乳液。優選的乳液可過濾滅菌，即其液滴可穿過220nm濾器。除了提供滅菌，這個過程還去除所述乳液中的任何大液滴。在某些實施方式中，所述乳液中的陽離子脂質是D0TAP。所述陽離子水包油乳液可含約O. 5mg/ml-約25mg/ml的D0TAP。例如，所述陽離子水包油乳液包含的DOTAP可為約
0.5mg/ml_ 約 25mg/ml、約 O. 6mg/ml_ 約 25mg/ml、約 O. 7mg/ml_ 約 25mg/ml、約 O. 8mg/ml_ 約25mg/ml、約 O. 9mg/ml_ 約 25mg/ml、約 I. Omg/ml-約 25mg/ml、約 I. lmg/ml-約 25mg/ml、約
1.2mg/ml_ 約 25mg/ml、約 I. 3mg/ml_ 約 25mg/ml、約 I. 4mg/ml_ 約 25mg/ml、約 I. 5mg/ml_ 約25mg/ml、約 I. 6mg/ml_ 約 25mg/ml、約 I. 7mg/ml_ 約 25mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 24mg/ml、約
0.5mg/ml_ 約 22mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 20mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 18mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約15mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 12mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 I Omg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 5mg/ml-約 2mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 I. 9mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 I. 8mg/ml、約 O. 5mg/ml-約 I. 7mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 I. 6mg/ml、約 O. 6mg/ml_ 約 I. 6mg/ml、約 O. 7mg/ml_ 約
1.6mg/ml、約 O. 8mg/ml_ 約 I. 6mg/ml、約 O. 5mg/ml、約 O. 6mg/ml、約 O. 7mg/ml、約 O. 8mg/ml、約 O. 9mg/ml、約 I. Omg/ml、約 I. lmg/ml、約 I. 2mg/ml、約 I. 3mg/ml、約 I. 4mg/ml、約 I. 5mg/ml、約 I. 6mg/ml、約 12mg/ml、約 18mg/ml、約 20mg/ml、約 21. 8mg/ml、約 24mg/ml 等。在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約0. 8mg/ml-約I. 6mg/ml DOTAPjn0. 8mg/ml> I. 2mg/ml> I. 4mg/ml 或 I. 6mg/ml。
在某些實施方式中，所述陽離子脂質為DC膽固醇。所述陽離子水包油乳液可含約O. lmg/ml-約5mg/ml的DC膽固醇。例如,所述陽離子水包油乳液包含的DC膽固醇可為約O. lmg/ml-約 5mg/ml、約 O. 2mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 3mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 4mg/ml_ 約5mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 62mg/ml_ 約 5mg/ml、約 lmg/ml-約 5mg/ml、約 I. 5mg/ml-約 5mg/ml、約 2mg/ml_ 約 5mg/ml、約 2. 46mg/ml-約 5mg/ml、約 3mg/ml_ 約 5mg/ml、約 3. 5mg/ml-約 5mg/ml、約 4mg/ml_ 約 5mg/ml、約 4. 5mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. lmg/ml-約4. 92mg/ml、約 O. lmg/ml-約 4. 5mg/ml、約 O. lmg/ml-約 4mg/ml、約 O. lmg/ml-約 3. 5mg/ml、約 O. lmg/ml-約 3mg/ml、約 O. lmg/ml-約 2. 46mg/ml、約 O. lmg/ml-約 2mg/ml、約 O. Img/ml-約 I. 5mg/ml、約 O . lmg/ml-約 lmg/ml、約 O. lmg/ml-約 O. 62mg/ml、約 O. 15mg/ml、約O. 3mg/ml、約 O. 6mg/ml、約 O. 62mg/ml、約 O. 9mg/ml、約 I. 2mg/ml、約 2. 46mg/ml、約 4. 92mg/ml等。在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約O. 62mg/ml-約4. 92mg/mlDC 膽固醇，如 2. 46mg/ml。在某些實施方式中，所述陽離子脂質為DDA。所述陽離子水包油乳液可含約O. lmg/ml-約5mg/ml的DDA。例如,所述陽離子水包油乳液包含的DDA可為約O. lmg/ml-約5mg/ml、約 O. lmg/ml-約 4. 5mg/ml、約 O. lmg/ml-約 4mg/ml、約 O. lmg/ml-約 3. 5mg/ml、約 O. lmg/ml-約 3mg/ml、約 O. lmg/ml-約 2. 5mg/ml、約 O. lmg/ml-約 2mg/ml、約 O. Img/ml-約 I. 5mg/ml、約 O. lmg/ml-約 I. 45mg/ml、約 O. 2mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 3mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 4mg/ml-約 5mg/ml、約 O. 5mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 6mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 73mg/ml-約 5mg/ml、約 O. 8mg/ml_ 約 5mg/ml、約 O. 9mg/ml_ 約 5mg/ml、約 I. Omg/ml-約 5mg/ml、約 I. 2mg/ml-約 5mg/ml、約 I. 45mg/ml_ 約 5mg/ml、約 2mg/ml_ 約 5mg/ml、約 2. 5mg/ml_ 約5mg/ml、約 3mg/ml-約 5mg/ml、約 3. 5mg/ml_ 約 5mg/ml、約 4mg/ml_ 約 5mg/ml、約 4. 5mg/ml-約5mg/ml、約I. 2mg/ml、約I. 45mg/ml等。或者,所述陽離子水包油乳液包含約20mg/ml、約 21mg/ml、約 21. 5mg/ml、約 21. 6mg/ml、約 25mg/ml DDA。在一個示例性實施方式中，所述陽離子水包油乳液包含約O. 73mg/ml-約I. 45mg/ml DDA,如I. 45mg/ml。導管或類似設備可用于將本發明的自復制RNA分子以裸露RNA或與遞送系統組合遞送到靶器官或組織。合適的導管在例如美國專利號4，186，745 ;5，397，307 ;5，547，472 ；5，674，192 ;和6，129，705中公開，其都通過引用納入本文。本發明包括使用合適的遞送系統如包埋或吸收有自復制RNA的脂質體、聚合微粒或亞微米乳液微粒來遞送編碼RSV-F多肽的自復制RNA分子，以例如單獨或結合其他大分子激發免疫應答。本發明包括吸收和/或包埋有自復制RNA分子的脂質體、微粒和亞微米乳液、及其組合。如實施例中進一步證明，與脂質體和亞微米乳液微粒結合的自復制RNA分子可有效地遞送到所述宿主細胞，且可引起針對所述自復制RNA編碼的蛋白的免疫應答。免疫原性組合物本發明提供免疫原性組合物。所述免疫原性組合物可包括單一活性免疫原性劑或數種免疫原性劑。例如，所述免疫原性組合物可包括單一形式(如單體、三聚體或玫瑰花結)或兩種或更多形式(如單體和三聚體的混合物或單體和三聚體之間的動態平衡)的RSV F多肽。所述免疫組合物可包括編碼RSV-F多肽的自復制RNA，且優選還包括合適的遞送系統如脂質體、多聚微粒、水包油乳液、及其組合。
本發明免疫原性組合物也可包含一種或多種免疫調節劑。一種或多種所述免疫調節劑優選包括一種或多種佐劑，例如兩種、三種、四種或更多佐劑。佐劑可包括THl佐劑和/或TH2佐劑，詳述見下。在另一個實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含多肽，所述多肽展示RSV-F糖蛋白融合前或中間融合構型中存在的表位，但不展示所述糖蛋白的融合后構型。在另一個實施方式中，本發明的免疫原性組合物包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽含完整或部分RSV F蛋白，且所述第二多肽含異源寡聚結構域。所述第一多肽可含RSV F蛋白胞外域。所述第二多肽可為來自流感血凝素的三聚結構域，來自 SARS刺突的三聚結構域，來自HIV gp41、NadA、改良的GCN4、或ATCase的三聚結構域。在一個方面，本發明是包含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，其生成是如本文所述通過提供未切割的RSV F蛋白胞外域多肽或C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽并切割它們以產生F1和F2亞基。在另一個方面，本發明是包含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體和/或單體的組合物，其生成是如本文所述通過提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，并從所述生物材料中純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、未切割的三聚體或未切割的單體和未切割的三聚體的組合(如混合物或動態平衡)。在一些實施方式中，所述RSV F蛋白胞外域多肽在約106-109位和約133-136位含改變的弗林蛋白酶切割位置，且如果需要還可含改變的融合肽。在其他實施方式中，所述RSV F蛋白胞外域在約106-109位和約133-136位含改變的弗林蛋白酶切割位置，在約101位和約161位之間含改變的胰蛋白酶切割位置，且如果需要還可含改變的融合肽。在另一個方面，本發明是包含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體和/或單體的組合物，其生成是如本文所述通過提供含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，并從所述生物材料中純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、未切割的三聚體或未切割的單體和未切割的三聚體的組合(如混合物或動態平衡)。在另一個方面，本發明是包含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，其生成是如本文所述通過提供含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改變的融合肽(如至少部分所述融合肽缺失)，并從所述生物材料中純化切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體。在另一個方面，本發明是包含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，其生成是如本文所述通過提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改變的融合肽(如至少部分所述融合肽缺失)，并從所述生物材料中純化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體。本發明的組合物優選適于給予哺乳動物對象如人，且包括一種或多種藥學上可接受的載體和/或賦形劑包括佐劑。對這類組分的充分討論參見參考文獻29。組合物通常是水性形式。當所述組合物是免疫原性組合物并給予哺乳動物如人時，其會引發免疫應答。所述免疫原性組合物可用于制備用于免疫哺乳動物的疫苗制劑。所述免疫原性組合物可包括單一活性免疫原性劑或數種免疫原性劑。例如,所述RSV F蛋白胞外域多肽可為單一形式(如未切割單體、切割單體、未切割三聚體、切割三聚體或切割三聚體的玫瑰花結)或兩種或更多形式(如未切割單體和未切割三聚體的混合物或未切割單體和未切割三聚體之間的動態平衡)。此外，所述組合物可包含RSV F蛋白胞外域多肽及一種或多種其他RSV蛋白(如G蛋白和/或M蛋白)和/或其可結合來自其他病原體的免疫原。該組合物可含有防腐劑，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗優選應基本無(即小于5yg/ml)含汞物質，如不含硫柳汞。更優選無汞的免疫原性組合物。特別優選不含防腐劑的免疫原性組合物。為了控制張度，優選包含生理性鹽如鈉鹽。優選氯化鈉(NaCl)，其濃度可為
l-20mg/ml。可以存在其它鹽，包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、二水合磷酸氫二鈉、氯化鎂、氯化鈣
坐寸ο 組合物的滲透壓通常為200m0sm/kg-400m0sm/kg,優選為240-360m0sm/kg,更優選為 290-310m0sm/kg。組合物可含有一種或多種緩沖劑。常用緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(具體是有氫氧化鋁佐劑)；或檸檬酸鹽緩沖劑。包含的緩沖劑一般是5-20mM。組合物的pH通常為5. 0-8. 1，更常為6. 0-8. O,例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。因此，本發明方法可包括在包裝前調整散裝疫苗pH的步驟。該組合物優選無菌。該組合物優選無熱原，如每劑量含有< 1EU(內毒素單位，標準量度)，優選每劑量< O. IEU0該組合物優選不含谷蛋白。人疫苗的給藥劑量體積一般為約O. 5ml,但可將一半劑量(即約O. 25ml)給予兒童。佐劑本發明的組合物含RSV-F多肽或編碼RSV-F多肽的核酸，其還可包含一種或多種佐劑，例如2種、3種、4種或更多佐劑，所述佐劑可用于提高接受所述組合物的患者體內引發的免疫應答(體液和/或細胞)。所述佐劑可包括THl佐劑和/或TH2佐劑。可以用于本發明組合物的佐劑包括但不限于 含礦物質的組合物。本發明中適合用作佐劑的含有礦物質的組合物包括礦物鹽，例如鈣鹽和鋁鹽(或其混合物)。本發明包括無機鹽，例如氫氧化物(如羥基氧化物)、磷酸鹽(如羥磷酸鹽、正磷酸鹽)、硫酸鹽等,或不同無機化合物的混合物,這些化合物可采用任何合適的形式(如凝膠、晶體、無定形等)，優選具有吸附性。鈣鹽包括磷酸鈣(如參考文獻38公開的“CAP”顆粒)。鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，也可將含有礦物質的組合物制成金屬鹽的顆粒(39)。鋁鹽佐劑詳述于下。 油乳液組合物(詳述見下)。適用作本發明佐劑的油乳液組合物包含角鯊烯-水乳液，如MF59 (5%角鯊烯、O. 5%吐溫80和O. 5%司盤85，用微流化床配制成亞微米顆粒)。 細胞因子誘導劑(詳述見下)。適用于本發明的細胞因子誘導劑包括toll樣受體7(TLR7)激動劑(如WO 2009/111337中公開的苯并萘啶化合物)。 皂苷(參考文獻74第22章)是在許多植物種類的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發現的留醇糖苷和三職糖苷的異質群。已廣泛研究了作為佐劑的來自阜樹(Quillaiasaponaria)Molina樹皮的阜苷。阜苷也可購自麗花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、滿天星(Gypsophilla paniculata)(婚紗花)和肥阜草(Saponaria officianalis)(阜根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21，以及脂質制劑如ISCOM。QS21以SHMULON(TM)出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術純化的特定組分，包括037、0317、0318、0321、0!^、0!1-8和職-(。所述皂苷優選QS21。生產QS21的方法在參考文獻40中公開。皂苷制劑也可以包含留醇，如膽固醇(41)。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復合物(ISCOM)的獨特顆粒(參考文獻74的第23章)。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM優選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻41-43中進一步描述了 ISC0M。41-43.任選地，所述ISCOM可以不含另外的去污劑(44)。關于開發基于皂苷的佐劑的綜述可以參見參考文獻45和46 脂肪佐劑(詳見下)包括水包油乳液、源自腸細菌脂多糖的改良的天然脂質As、磷脂化合物(如合成磷脂二聚體，E6020)等。 細菌ADP-核糖基化毒素(如大腸桿菌不耐熱腸毒素"L T"、霍亂毒素"CT"或百日咳毒素"PT")及其脫毒衍生物，如稱為LT-K63和LT-R72的突變毒素(47)。參考文獻48中描述了將脫毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑，參考文獻49中描述了將其用作胃腸道外佐劑。 生物粘附劑和粘膜粘附劑，如酯化透明質酸微球(50)或殼聚糖及其衍生物(51)。 由可生物降解和無毒材料(例如聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸內酯等)，優選丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直徑約100nm-150ym，更優選約200nm-30 μ m,或約500nm_10 μ m的顆粒),任選處理以具有帶負電表面(如用SDS處理)或帶正電表面(例如用陽離子去污劑如CTAB處理)。 脂質體(參考文獻74的第13和14章)。適用作佐劑的脂質體制劑的例子見參考文獻52-54所述。· ·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑(55)。該類制劑還包括聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯表面活性劑和辛苯糖醇的組合(56)，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑和至少一種另外的非離子表面活性劑如辛苯糖醇的組合(57)。優選的聚氧乙烯醚選自下組聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。 胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-異谷氨酸-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺("DTP-DPP"或"TheramideTM// )和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(I' -2' -二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。 由第一種革蘭氏陰性菌制備的外膜蛋白蛋白質體制劑與衍生自第二種革蘭氏陰性菌脂多糖制劑的組合，其中外膜蛋白蛋白質體和脂多糖制劑形成穩定的非共價連接佐劑復合物。這類復合物包括"IVX-908"，它是由腦膜炎奈瑟球菌外膜和脂多糖組成的復合物。 聚氧鐓(polyoxidonium)聚合物(58,59)或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。籲甲基肌苷5,-單磷酸酯("MMP" )(60)。 多聚羥化吡咯雙烷類化合物(61)，如下式化合物
權利要求
1.一種含一種或多種呼吸道合胞病毒F(RSV F)多肽的免疫原性組合物，其中氨基酸100-150 用氨基酸序列 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO:91 或 SEQ ID NO :92 替代。
2.如權利要求I所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述RSVF的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO : 12替代。
3.如權利要求I所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述RSVF的氨基酸100-150用氨基酸序列 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7 ；SEQ ID NO:8、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 1USEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。
4.如權利要求I所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述氨基酸100-150用氨基酸序 列 SEQ ID NO 9 替代。
5.如權利要求I或2所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述RSVF為單體、三聚體或單體和三聚體組合的形式。
6.如權利要求3或4所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述RSVF為單體、三聚體，玫瑰花結或其任何組合的形式。
7.如權利要求1-6中任一項所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述RSVF多肽是含所述RSV-F胞外域的可溶性多肽。
8.如權利要求1-6中任一項所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述RSVF含SEQ IDNO :1 或 SEQ ID NO 2 的氨基酸 23-99 和 151-524。
9.一種含選自下組的多肽的免疫原性組合物SEQ ID NO 49, SEQ ID NO :68、SEQ IDNO :71、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :57、SEQ IDNO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO85,SEQ ID NO86,SEQ ID NO87,SEQ ID NO 88,SEQ ID NO89,SEQ ID NO:93、省略信號肽和/或HIS標記的任何上述序列、及其組合。
10.如權利要求9所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述多肽為SEQIDNO 68或省略所述信號肽和任選所述HIS標記的SEQ ID NO :68。
11.如權利要求9所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述多肽選自下組SEQIDNO :49、SEQ ID NO 71和其中省略所述信號肽和任選所述HIS標記的任何上述序列。
12.如權利要求1-11所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還包含佐劑。
13.如權利要求12所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述佐劑選自下組鋁鹽、水包角鯊烯乳液、苯并萘啶化合物、磷脂化合物、小分子免疫增強劑和任何上述的組合。
14.一種重組呼吸道合胞病毒F多肽(RSV F)，其中氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID N0:9、SEQ ID NO 12, SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ IDNO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :91 或 SEQID NO 92 替代。
15.如權利要求14所述的重組RSVF，其特征在于，所述RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO 12替代。
16.如權利要求15所述的重組RSVF，其特征在于，所述RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。
17.如權利要求14所述的重組RSVF，其特征在于，所述氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO 9 替代。
18.如權利要求14或15所述的重組RSVF，其特征在于，所述RSV F為單體、三聚體或單體和三聚體組合的形式。
19.如權利要求16或17所述的重組RSVF，其特征在于，所述RSV F為單體、三聚體、三聚體的玫瑰花結或其組合的形式。
20.一種選自下組的重組多肽SEQ ID NO 49, SEQ ID NO :68、SEQ ID NO 7U SEQ IDNO 25, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQID NO 35, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO45,SEQ ID NO46,SEQ ID NO 47,SEQ ID NO48,SEQ ID NO50,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO 52, SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :57、SEQ IDNO 58, SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQID NO 64, SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO85,SEQ ID NO86,SEQ ID NO87,SEQ ID NO 88,SEQ ID NO89,SEQ ID NO:93、省略信號肽和/或HIS標記的任何上述序列、及其組合。
21.如權利要求14-20中任一項所述的重組多肽，其特征在于，所述重組多肽還包括異源寡聚化結構域、表位或信號肽。
22.如權利要求21所述的重組多肽，其特征在于，所述異源寡聚化結構域選自下組來自流感血凝素，來自SARS刺突，或來自HIV gp41、NadA、改良的GCN4、或天冬氨酸轉氨甲酰酶的三聚結構域。
23.—種編碼如權利要求14-21中任一項所述多肽的分離的核酸。
24.如權利要求23所述的分離的核酸，其特征在于，所述核酸是自復制RNA分子。
25.—種含如權利要求24所述的自復制RNA分子的免疫原性組合物。
26.如權利要求25所述的免疫原性組合物，其特征在于，所述組合物還包含遞送系統。
27.一種在對象中引起針對RSV F的免疫應答的方法，所述方法包括將如權利要求I -14中任一項所述的免疫原性組合物給予對象。
28.—種在對象中引起針對RSV F的免疫應答的方法，所述方法包括將如權利要求25所述的免疫原性組合物給予對象。
29.—種生產含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法，所述方法包括 a)提供含蛋白酶切割位置且切割時產生F1和F2亞基的未切割的RSVF蛋白胞外域多肽，所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列在106-109位和133-136位含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽獲自以未切割形式生成所述多肽的細胞；和 b)用切割所述蛋白酶切割位置的蛋白酶切割所提供的可溶性RSVF蛋白胞外域多肽，從而產生含切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽的組合物。
30.如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中提供的未切割的RSVF蛋白胞外域多肽在約101位-約161位的一個或多個位置被切割。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述提供的未切割的RSVF蛋白胞外域多肽在約106位-約142位的一個或多個位置被切割。
32.如權利要求29-32中任一項所述的方法，其特征在于，在a)中純化提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。
33.如權利要求29-32中任一項所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽含完整融合肽。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中的切割導致形成三聚體的玫瑰花結。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟c)純化所述三聚體的玫瑰花結。
36.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述三聚體的玫瑰花結的純化包括尺寸排阻色譜。
37.如權利要求29-32中任一項所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽含改變的融合肽。
38.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽中至少部分所述融合肽缺失。
39.如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述融合肽中缺失氨基酸137-153、氨基酸137-146、氨基酸137-145或氨基酸137-142。
40.如權利要求37-39中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中的切割導致形成三聚體。
41.如權利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法還包括步驟c)純化所述三聚體。
42.如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述三聚體的純化包括尺寸排阻色譜。
43.如權利要求29-42中任一項所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在昆蟲細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、酵母細胞、四膜蟲細胞或其組合中表達。
44.如權利要求29-43中任一項所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在細胞條件培養基中提供。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述細胞條件培養基中選自下組昆蟲細胞條件培養基、哺乳動物細胞條件培養基和其組合。
46.如權利要求29-36和41中任一項所述的方法，其特征在于，所述三聚體的玫瑰花結包括至少一種選自Furdel和Delp23 fur del多肽的F1和F2片段。
47.如權利要求29-46中任一項所述的方法，其特征在于，所述切割的RSVF蛋白胞外域多肽基本不含脂質和脂蛋白。
48.一種含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，所述組合物用如權利要求29-47中任一項所述的方法生產。
49.如權利要求48所述的組合物，其特征在于，所述組合物是免疫原性組合物。
50.一種生產含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體組合的組合物的方法，所述方法包括 a)提供含未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列在106-109位和133-136位含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以未切割形式生成所述多肽的細胞；和 b)從所述生物材料中純化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體或三聚體，從而生成所述組合物。
51.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述生物材料選自下組昆蟲細胞條件培養基或細胞裂解物、哺乳動物細胞條件培養基或細胞裂解物、禽類細胞條件培養基或細胞裂解物、酵母細胞條件培養基或細胞裂解物、四膜蟲細胞條件培養基或細胞裂解物和其組口 o
52.如權利要求50或51所述的方法，其特征在于，在b)中純化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽三聚體。
53.如權利要求50或51所述的方法，其特征在于，在b)中純化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體。
54.如權利要求50所述的方法，其特征在于，b)中的純化包括尺寸排阻色譜。
55.如權利要求50-54中任一項所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽還含改變的融合肽。
56.如權利要求50所述的方法，其特征在于，所述可溶性未切割的RSVF蛋白胞外域多妝含至少一種選自下組的多妝furmt、furdel、Delp21 furx、Delp23 furx、Delp21furdel、Delp23 furdel、和 Xa 因子構建體。
57.如權利要求50-56中任一項所述的方法，其特征在于，所述包括未切割RSVF蛋白胞外域多肽的組合物基本不含脂質和脂蛋白。
58.一種含可溶性未切割RSV F蛋白胞外域多肽單體或三聚體的組合物，所述組合物用如權利要求50-57中任一項所述的方法生產。
59.如權利要求58所述的組合物，其特征在于，所述組合物是免疫原性組合物。
60.一種生產含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體組合的組合物的方法，所述方法包括 a)提供含未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，其中所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改變的弗林蛋白酶切割位置，約101位-約161位之間存在的賴氨酸和精氨酸殘基缺失或由非賴氨酸或精氨酸的氨基酸替換，所述RSV F蛋白胞外域多肽獲自生成約101位-約161位之間沒有切割的所述多肽的宿主細胞，且所述RSV F蛋白胞外域多肽在約101位-約161位之間沒有被切割；和 b)從所述生物材料中純化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體的組合。
61.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述生物材料選自下組昆蟲細胞條件培養基或細胞裂解物、哺乳動物細胞條件培養基或細胞裂解物、禽類細胞條件培養基或細胞裂解物、酵母細胞條件培養基或細胞裂解物、四膜蟲細胞條件培養基或細胞裂解物和其組口 o
62.如權利要求60或61所述的方法，其特征在于，在b)中純化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽三聚體。
63.如權利要求60或61所述的方法，其特征在于，在b)純化中未切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體。
64.如權利要求60或61所述的方法，其特征在于，在b)中純化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體和未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體。
65.如權利要求60-64中任一項所述的方法，其特征在于，b)中的純化包括尺寸排阻色P曰。
66.如權利要求60-64中任一項所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽還含改變的融合肽。
67.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽含至少一種選自下組的多妝Furx、Furx R113Q K123N K124N、Delp21 furx 和 Delp23 furx。
68.如權利要求60-67中任一項所述的方法，其特征在于，所述包括未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的組合物基本不含脂質和脂蛋白。
69.一種含可溶性未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，所述組合物用如權利要求60-68中任一項所述的方法生產。
70.如權利要求69所述的組合物，其特征在于，所述組合物是免疫原性組合物。
71.—種生產含切割的RSV F蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體組合的組合物的方法，所述方法包括 a)提供含切割的RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改變的融合肽；和 b)從所述生物材料中純化切割的RSVF蛋白胞外域多肽。
72.如權利要求71所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽含缺失約137-152氨基酸、缺失約137-153氨基酸、缺失約137-145氨基酸、缺失約137-146氨基酸、或缺失約137-142氨基酸的氨基酸序列。
73.如權利要求71或72所述的方法，其特征在于，所述生物材料選自下組昆蟲細胞條件培養基或細胞裂解物、哺乳動物細胞條件培養基或細胞裂解物、禽類細胞條件培養基或細胞裂解物、酵母細胞條件培養基或細胞裂解物、四膜蟲細胞條件培養基或細胞裂解物和其組合。
74.如權利要求71-73中任一項所述的方法，其特征在于，在b)中純化切割的RSVF蛋白胞外域多肽三聚體。
75.如權利要求71-73中任一項所述的方法，其特征在于，在b)中純化切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體。
76.如權利要求71-73中任一項所述的方法，其特征在于，在b)中純化切割的RSVF蛋白胞外域多肽單體和切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚體。
77.如權利要求71-73中任一項所述的方法，其特征在于，b)中的純化包括尺寸排阻色P曰。
78.如權利要求71所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽至少含所述融合肽缺失多肽。
79.如權利要求71-78中任一項所述的方法，其特征在于，所述包括未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的組合物基本不含脂質和脂蛋白。
80.一種含可溶性未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，所述組合物用如權利要求71-79中任一項所述的方法生產。
81.如權利要求80所述的組合物，其特征在于，所述組合物是免疫原性組合物。
82.—種生產含RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法，所述方法包括 a)提供在133-136位含改變的弗林蛋白酶切割位置的RSVF蛋白胞外域多肽，且所述可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以結合含F1亞基但136/137位沒有被切割的F2片段的形式生成所述多肽的細胞；和 b)用在101位-161位之間的位置切割RSVF蛋白胞外域的蛋白酶切割所述提供的RSVF蛋白胞外域多肽，從而產生所述組合物。
83.如權利要求82所述的方法，其特征在于，在a)中純化所提供的RSVF蛋白胞外域多肽。
84.如權利要求82或83所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的RSVF蛋白胞外域多肽在昆蟲細胞、哺乳動物細胞、禽類細胞、酵母細胞、四膜蟲細胞或其組合中表達。
85.如權利要求82-84中任一項所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的RSVF蛋白胞外域多肽在細胞條件培養基、細胞提取物或其組合中提供。
86.如權利要求85所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽在選自下組的細胞條件培養基中提供昆蟲細胞條件培養基、哺乳動物細胞條件培養基、禽類細胞條件培養基、酵母細胞條件培養基、四膜蟲細胞條件培養基和其組合。
87.如權利要求82-86中任一項所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽至少含所述C末端弗林蛋白酶多肽。
88.如權利要求82-87中任一項所述的方法，其特征在于，所述b)中生成的切割的RSVF蛋白胞外域多肽基本不含脂質和脂蛋白。
89.—種含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，所述組合物用如權利要求82-88中任一項所述的方法生產。
90.如權利要求89所述的組合物，其特征在于，所述組合物是免疫原性組合物。
91.一種生產含RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法，所述方法包括 a)提供含RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽在133-136位含改變的弗林蛋白酶切割位置，且所述可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以結合含F1亞基但136/137位沒有被切割的F2片段的形式生成所述多肽的細胞，條件是所述改變的弗林蛋白酶切割位置不缺失氨基酸131-134 ;和 b)從所述生物材料中純化所述RSVF蛋白胞外域多肽，從而生成所述組合物。
92.如權利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物材料選自下組昆蟲細胞條件培養基或細胞裂解物、哺乳動物細胞條件培養基或細胞裂解物、禽類細胞條件培養基或細胞裂解物、酵母細胞條件培養基或細胞裂解物、四膜蟲細胞條件培養基或細胞裂解物和其組口 o
93.如權利要求91或92所述的方法，其特征在于，在b)中純化RSVF蛋白胞外域多肽單體、三聚體或單體和三聚體的組合。
94.如權利要求93所述的方法，其特征在于，b)中的純化包括尺寸排阻色譜。
95.如權利要求91-94中任一項所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽至少含所述C末端弗林蛋白酶多肽。
96.如權利要求91-95中任一項所述的方法，其特征在于，所述包括RSVF蛋白胞外域多肽的組合物基本不含脂質和脂蛋白。
97.一種含RSV F蛋白胞外域多肽的組合物，所述組合物用如權利要求92-96中任一項所述的方法生產。
98.如權利要求97所述的組合物，其特征在于，所述組合物是免疫原性組合物。
全文摘要
本發明涉及含RSV F蛋白的免疫原性組合物、制備含RSV F蛋白胞外域多肽的組合物的方法，和某些遺傳改造的RSV F蛋白和編碼該遺傳改造的RSV F蛋白的核酸。用所述方法制備的組合物可在主要或單一所需形式和構型中包含RSV F蛋白胞外域多肽。本發明還涉及誘導對RSV F的免疫應答的方法。
文檔編號A61K39/155GK102639147SQ201080040594
公開日2012年8月15日 申請日期2010年7月15日 優先權日2009年7月15日
發明者K·斯旺森, P·R·道米策 申請人:諾華有限公司