用于因子xa抑制劑的解毒劑的單位劑量制劑及其使用方法

專利名稱：用于因子xa抑制劑的解毒劑的單位劑量制劑及其使用方法
技術領域：
本發明涉及逆轉和/或中和因子Xa抑制劑的解毒劑的單位劑量制劑。特別地，解毒劑可以是因子Xa(fXa)衍生物，所述因子Xa(fXa)衍生物具有降低的固有促凝血活性或沒有固有促凝血活性，但也能夠結合和/或中和fXa抑制劑，由此作為靶向fXa的抗凝血劑的解毒劑。本發明還涉及使用特定劑量解毒劑的方法。
背景技術：
市場上在治療或預防在不活動時或正接受醫療手術時易于形成血凝塊的患者(例如，那些患有凝血病癥的患者)的不期望血栓形成時需要抗凝血劑。然而，抗凝血療法的一個重要限制是與治療有關的出血風險，且在服用過量或如果需要緊急手術的情況下限制了迅速逆轉抗凝血活性的能力。因此，極為期望針對所有形式的抗凝血療法的特定且有效解毒劑。出于安全考慮，同樣有利的是在研發新的抗凝血劑藥物中獲得抗凝血劑-解毒劑對。目前對于過度抗凝血可用的抗凝血劑-解毒劑對是肝素-魚精蛋白和華法林(warfarin)-維生素K。新鮮的冷凍血衆和重組因子Vila(rfVIIa)也已用作遭受嚴重創傷或嚴重出血的患者在低分子量肝素治療中的非特異性解毒劑。(Lauritzen,B.等人，Blood，2005，607A-608A)還報導了魚精蛋白片段(美國專利第6，624，141號)和小的合成肽(美國專利第6，200, 955號)作為肝素或低分子量肝素解毒劑；和凝血酶突變蛋白質(美國專利第6，060，300號)作為凝血酶抑制劑的解毒劑。已報導將凝血酶原中間產物和衍生物作為水蛭素和合成凝血酶抑制劑的解毒劑(美國專利第5，817，309號和第6，086，871號)。抗凝血療法的一種有希望的形式靶向因子Xa(fXa)，且實際上，目前在臨床研發的不同階段中有多種直接fXa抑制劑用于抗凝血療法中。一種直接fXa抑制劑Xarelto (利伐沙班(rivaroxaban))已經被批準在歐盟和加拿大用于臨床使用以預防矯形外科手術患者中的靜脈血栓。這些中的多數是小分子。盡管這些新的fXa抑制劑展示有希望用于治療，但仍需要特定且有效的解毒劑。在過度抗凝血或利用這些fXa抑制劑治療的患者需要手術的情況下，可能需要一種試劑來實質上中和所施用的一種或多種fXa抑制劑并恢復正常止血。目前可用試劑(例如重組因子Vila(rfVIIa))是以機械方式進行限制且并非特定用于fXa抑制劑的逆轉，且因此臨床醫生極為期望有改良的選擇。在人類研究中，已經使用rfVIIa來逆轉間接抗凝血酶III依賴性fXa抑制劑(例如磺達肝素(fondaparinux)和依達肝素(idraparinux))的作用(Bi jsterveld, NR 等人，Circulation, 2002,106 :2550-2554 ;Bi jsterveld, NR 等人，British J. ofHaematology) 2004 (124) :-658)。因子 Vlla(fVIIa)的作用機制是與組織因子一起作用以將血液循環中存在的因子X(fX)轉化成fXa來恢復患者的正常止血。這種作用模式必然意味著為了中和活性位點定向的fXa抑制劑所可能達到的fXa的最高可能濃度受fX的循環血漿濃度限制。因此，使用rfVIIa來逆轉直接fXa抑制劑的作用的潛力在機械上受限。由于fX的循環血漿濃度為150納摩爾(“nM”)，所以通過這種模式所產生的fXa的最大量將為150nM。小分子fXa抑制劑(例如利伐沙班(rivaroxaban))的報告治療濃度(大約 600nM, Kubitza D 等人，Eur. J. Clin. Pharmacol,2005,61 =873-880)高于由rfVIIa所生成 的fXa的可能量。因此，使用rfVIIa來逆轉由fXa抑制劑所產生的治療或超治療水平的抗凝作用提供的效能水平不充分。如圖4中所示，在中和因子Xa抑制劑貝曲西班(betrixaban)的抗凝血活性中使用rfVIIa具有有限的作用(如下文所闡述)。重組fVIIa展示50nM至IOOnM的劑量響應解毒活性，但所述作用在IOOnM至200nM之間趨于穩定，此表明其解毒作用除其濃度以外還受其他因素限制。在所有所測試的rfVIIa濃度中，貝曲西班仍展示fXa的劑量響應抑制，在250nM的濃度下高達約75%抑制。此觀察結果與fVIIa的建議作用機制一致。此結果還被展示rfVIIa不能完全逆轉磺達肝素對凝血酶生成和凝血酶原活化的參數的抑制作用的研究所支持。(Gerotiafas，GT 等人，Thrombosis & Haemostasis 2204(91) :531-537)。外源活性fXa不能以類似于rfVIIa的方式直接施用受試者。不像rfVIIa在缺少其輔因子組織因子的情況下具有極低促凝血活性那樣，天然fXa是強效酶且具有造成血栓形成的潛在風險。因此，使用rfVIIa或活性fXa作為fXa抗凝血療法的解毒劑有缺點。本發明的制劑和方法中使用的解毒劑闡述于美國專利申請公開案第2009-0098119號中。這一出版物及本文所提及的任何出版物、專利和專利申請案均以整體引用的方式并入本文中。盡管在前面提到的申請中披露了解毒劑，解毒劑的劑量給藥是確保患者安全的一個關鍵因素。

發明內容
現在已發現，以一定劑量提供fXa蛋白質的經修飾衍生物的施用可用作靶向fXa的抗凝血劑的解毒劑。所述fXa蛋白質的經修飾衍生物并不與fXa競爭組裝成凝血酶原酶復合物，而是結合和/或實質上中和抗凝血劑，例如fXa抑制劑。可用作解毒劑的衍生物經修飾以降低或去除固有的促凝血和抗凝血活性，同時保留結合至抑制劑的能力。預計本發明的衍生物可包括修飾活性位點、或改變Gla結構域或自fXa去除整個Gla結構域、或其各種組合。由于已知活性位點經修飾的全長fXa是抗凝血劑，因此進一步預計修飾Gla結構域將降低或消除fXa衍生物對正常止血的抗凝血作用。在一個實施例中，本發明涉及一種單位劑量制劑，其包含藥學上可接受的載體和包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或與SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的雙鏈多肽(two chain polypeptide),其量是約IOmg-約2g。在一些實施例中，所述量是約IOOmg-約
I.5g 或約 200mg-約 Ig 或約 400mg-約 900mg。在某些實施例中，多肽的量對于中和因子Xa抑制劑是約20%、50%、75%、90%、95%、99%或約100%有效的。
在另一實施例中，本發明涉及用于向正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的受試者施用的單位劑量制劑，所述制劑包含藥學上可接受的載體和中和量的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或與SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的雙鏈多肽，所述中和量是在至少約30分鐘內，使多肽的循環濃度與因子Xa抑制劑的循環濃度的摩爾比為至少約1:1。在一個實施例中，所述摩爾比涉及貝曲西班誘導的抗凝血。在其他實施例中摩爾比是約I:I或約2I和在再其他實施例中摩爾比是約4I或更高。 在一些實施例中，載體是鹽水。在一些實施例中載體是無菌鹽水。在其他實施例中，制劑具有每毫升鹽水約0. 2-約IOmg多肽的濃度。在其他實施例中，濃度是每毫升鹽水約2-約6mg多肽或每毫升鹽水約2mg多肽。在某些實施例中，多肽是凍干的。在另一實施例中，本發明涉及一種在正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的受試者中，選擇性結合和抑制外源施用的因子Xa抑制劑的方法，包括向所述受試者施用本發明的單位劑量制劑。在再另一實施例中，本發明涉及一種在正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的受試者中，防止、減少或停止出血的方法，包括向所述受試者施用本發明的單位劑量制劑。在再另一實施例中，本發明涉及一種在正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的患者中，校正fXa抑制劑依賴性藥效或替代標志物的方法,包括向所述受試者施用本發明的單位劑量制劑。在本發明的方法中，所述制劑可以通過推注靜脈注射或推注和輸注的組合或通過皮下施用的方式施用。人類凝血因子的皮下劑量給藥已經報告于文獻中。參見McCarthy K等人，Thrombo. Haemost. ,2002,87 (5) ,824-30 ；Gerrard AJ 等人，Br. J. Haematol.，1992,81(4) :610-3 ；Miekka SI 等人，Haemophilia，1998，4 (4)，436-42。在某些實施例中，約10-約20%的制劑是作為推注施用的，而其余制劑輸注一段時間直至出血已基本上停止。預計輸注可以施用約6小時、或約6-約12小時、或約12-約24小時或48小時。在另一方面中，經修飾的因子Xa蛋白是與能夠延長所述因子Xa衍生物的血漿半壽期(或循環半壽期)的試劑共同施用的。在又一方面中，解毒劑與一個部分偶聯(conjugate)以延長其血衆半壽期。在另一方面中，本發明提供試劑盒，其包含用于抗凝血用途的fXa抑制劑和當需要實質上中和所述fXa抑制劑的抗凝血活性時使用的fXa抑制劑解毒劑(或因子Xa衍生物)。當所述解毒劑是以凍干形式提供使，所述試劑盒優選進一步包含一瓶無菌鹽水。本發明進一步提供的是一種肽偶聯物，其包含以共價或非共價方式連接至剛剛所闡述多肽的載體。所述載體可為脂質體、膠束(micelle)、藥學上可接受的聚合物、或藥學上可接受的載體。可以在整個說明書的其余部分發現本發明額外的實施例。附圖簡述圖I示意性地展示表13中所示的人類因子X(SEQ ID NO. I)的結構域結構，如在Leytus 等人，Biochem.，1986，25，5098-5102 中所報告。SEQ ID NO. I 是由表 14 中所示的人類fX的核苷酸序列(SEQ ID NO. 2)編碼的人類fX的氨基酸序列，如現有技術中所知。例如，經翻譯的氨基酸序列報告于Leytus等人，Biochem. , 1986, 25, 5098-5102中且可在〈http://www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer, fcgi db = nuccore&id = 89142731>的基因庫(GenBank)作為“NM_000504”中找到。此序列中的氨基酸編號是基于fX序列。人類fX前體(SEQ ID NO. I)含有pr印ro-前導序列(SEQ ID NO. I的氨基酸I至40)，隨后是對應于fX輕鏈(LC)的序列(SEQ ID NO. I的氨基酸41至179)、對應于在fX分泌期間去除的RKR(SEQ ID NO. 16)三聯體的序列(SEQ ID NO. I的氨基酸180至182)、和對應于fX重鏈的序列(SEQ ID NO. I的氨基酸183至488)，所述重鏈含有激活肽(AP) (SEQ ID NO. I的氨基酸183至234)和催化結構域(SEQ ID NO. I的氨基酸235至488)。圖2(SEQ I D NO. 3)展示成熟人類因子X的氨基酸序列。此圖中氨基酸編號是基于成熟fX序列，自fX輕鏈的N-末端開始。因子X在血漿中作為通過二硫鍵連接的雙鏈分子循環。輕鏈(LC)具有139個氨基酸(SEQ ID NO. I的氨基酸41至179)殘基且含有富Y-羧基谷氨酸(Gla)的結構域(SEQ ID NO. 3的氨基酸1_45)(包括短芳香族堆棧(AS)(SEQ ID NO. 3的氨基酸40-45))，之后是兩個表皮生長因子(EGF)樣結構域(EGF1 SEQ IDNO. 3的氨基酸46-84，EGF2 SEQ ID NO. 3氨基酸85-128)。重鏈(HC)具有306個氨基酸且含有52個氨基酸的激活肽(AP SEQ ID NO. 3的氨基酸143-194)，然后是催化結構域(SEQID NO. 3的氨基酸195-448)。胰凝乳蛋白酶編號中的H57-D102-S195的催化三元體等效物位于fX序列中的His236、Asp282、和Ser379處并加下劃線(SEQID NO. 3的氨基酸236、282和 379)。圖3示意性地展示圖2中所示的成熟人類因子X的結構域結構。此圖中的氨基酸編號是基于成熟fX序列。突出顯示用于胰凝乳蛋白酶消化以去除含Gla-結構域的片段(SEQID NO. 3的氨基酸1-44)和用于fX激活以去除激活肽的切割位點。胰凝乳蛋白酶消化fXa產生缺少1-44氨基酸殘基的無Gla結構域fXa(SEQ ID NO. 4)。圖4展示在使用PPP制備的樣品的凝血酶生成中在組織因子的存在下各種濃度的rfVIIa對fXa抑制劑貝曲西班(如下文所述)的抗凝血活性的影響(表示為相對熒光單位(RFU)分析)(如實施例2中所述)。數據顯示，rfVIIa和組織因子的組合在高達250nM的濃度下不能完全中和fXa抑制劑貝曲西班的抗凝血活性。圖5展示在含活性fXa和貝曲西班的純化體系中Gla-結構域完整的無水-fXa逆轉貝曲西班的fXa抑制作用(空心圓)，而與活性fXa相比，僅無水-fXa的促凝血活性可忽略(空心三角)。將fXa發色活性標準化成在無任何抑制劑的情況下的活性fXa (空心正方形)。此更充分地闡述于實施例4中。數據表明，無水-fXa對于fXa底物無活性，但仍保留fXa抑制劑結合能力。圖6展示在使用PPP制備的樣品的血漿凝血酶生成(表示為相對熒光單位(RFU))分析(如實施例2中所述)中，圖5中具有完整Gla結構域的無水-fXa是有效抑制劑。其在約115nM時幾乎完全抑制凝血酶生成。數據表明，Gla-結構域未修飾的無水-fXa并不適于用作fXa抑制劑解毒劑。圖7展示在96孔板格式中活性fXa的凝血活性在胰凝乳蛋白酶消化之前和在胰凝乳蛋白酶消化15分鐘和30分鐘之后的比較。如此圖中所示，凝血時間(0D405的變化)在fXa被胰凝乳蛋白酶消化15分鐘之后明顯延遲，且當fXa被消化30分鐘時有長達20分鐘的時間未觀察到凝血。此結果還用于建立胰凝乳蛋白酶消化無水_fXa的條件，這是因為在消化期間可監測到無水-fXa沒有活性。此更充分地闡述于實施例I中。圖8展示去Gla的無水-fXa對因子Xa抑制劑貝曲西班的結合親和力，如實施例4中所闡述。數據表明，通過胰凝乳蛋白酶消化無水_fXa而制備以去除含Gla-結構域的片段(殘基1-44)的去Gla的無水-fXa能夠以與天然fXa類似的親和力結合貝曲西班(fXa Ki = 0. 12nM,去 Gla 的無水-fXa Kd = 0. 32nM)。
圖9展示，在實施例2的使用PPP制備的樣品的凝血酶生成分析中，通過添加濃度為680nM的解毒劑(去Gla的無水-fXa)逆轉不同濃度貝曲西班的抗凝血活性。在濃度為680nM時，去Gla的無水-fXa能夠得到實質上完全的fXa活性恢復。

圖10展示，在使用PPP制備的樣品的凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式(如實施例3中所述)，通過不同濃度的解毒劑(去Gla的無水-fXa)逆轉250nM貝曲西班的抗凝血活性。數據表明，當使用約608nM的解毒劑來中和250nM的fXa抑制劑貝曲西班時，凝血時間與對照貧血小板血漿的凝血時間相當。圖11展示，在使用PPP制備的樣品的凝血延長分析中使用aPTT試劑在96孔板格式中，563nM的解毒劑(去Gla的無水-fXa)對依諾肝素(enoxaparin) (0. 3125-1. 25U/mL)的抗凝血活性的影響，其表示為標準化之后的倍數變化。分析方案闡述于實施例3中。數據表明，添加563nM的解毒劑明顯中和低分子量肝素依諾肝素的活性。圖12展示在發色分析中解毒劑(去Gla的無水-fXa)對凝血酶(5nM)活性的作用和50nM阿加曲班(argatroban)( 一種特異性凝血酶抑制劑)對其的抑制作用。正如所預期，fXa抑制劑的解毒劑在高達538nM濃度下不會以可檢測方式影響凝血酶活性或所述特異性抑制劑阿加曲班對其的抑制作用。此更充分地闡述于實施例14中。圖13展不,在aPTT分析中使用標準凝血計時器(standard coagulation timer)通過改變解毒劑去Gla的無水-fXa的濃度對400nM貝曲西班抗凝血活性的影響。分析方案闡述于實施例3中。數據展示，fXa抑制劑的解毒劑實質上逆轉了 400nM貝曲西班對fXa的抑制作用。據估計，在400nM貝曲西班的情況下,解毒劑的EC5tl為約656nM。圖14展示CHO細胞中用于表達fXa三重突變體(SEQ ID NO. 12)的DNA構建體的圖。將質粒DNA線性化并轉染至CHO dhfr(-)細胞中。使用四氫葉酸酯(HT)缺乏的培養基加甲氨蝶呤(MTX)來選擇細胞。通過ELISA來針對高蛋白質表達篩選穩定克隆。在無血清培養基中產生fXa三重突變體并通過離子交換與親和柱的組合來純化。圖中的編號是基于編碼人類fX SEQ ID NO. I的多核苷酸序列進行。例如，活性位點S419(SEQ ID NO. I)處的丙氨酸突變等效于成熟人類fX的S379(SEQ ID NO. 3)處的突變，如整個申請案且更具體地實施例7所討論。圖15展示分別使用識別人fX重鏈和輕鏈的單克隆抗體的純化的r-解毒劑的SDS-PAGE 和 Western 印跡。圖15A展示離子交換和親和純化純化的r-解毒劑的Western印跡。當將連接輕鏈和重鏈的二硫鍵還原后，r-解毒劑重鏈遷移到類似于血漿源性fXa的預計分子量。與正常FXa相比，fXa突變體的Gla-結構域中缺失6_39aa使得r_解毒劑輕鏈的分子量條帶較低。圖15B和15C展示離子交換和親和純化后接大小排阻層析得到的純化的r-解毒劑的 SDS-PAGE 和 Western 印跡。
圖16展示經口單獨施用貝曲西班(15mg/kg)、或經口施用貝曲西班(15mg/kg)然后靜脈注射(300ug，IV)根據實施例I制得的血漿源性解毒劑(Pd-解毒劑)之后小鼠(n=7-10/組)中的貝曲西班血漿水平。pd-解毒劑是在I. 5小時的時間點之前5分鐘時施用，并在經口施用貝曲西班之后I.5、2.0和4.0小時時取小鼠血液樣品(0.5mL)。分析全血INR、貝曲西班和解毒劑血漿水平。將小鼠血漿中的貝曲西班水平(平均值土SEM)繪示為小鼠在15mg/kg(空心正方形)和15mg/kg接著解毒劑注射(空心圓)之后的時間的函數。在I. 5小時時間點(解毒劑注射后5分鐘)解毒劑治療組的PK-PD相關性匯總于表I中。根據INR測量值，單次注射解毒劑使功能性貝曲西班減少>50%。此更充分地闡述于實施例8中。圖17展示利用經純化r-解毒劑進行小鼠實驗(n = 4-10/組)的結果。比較經口單獨施用貝曲西班(15mg/kg)或經口施用貝曲西班(15mg/kg)然后靜脈注射(300ug)r-解毒劑之后小鼠血衆中的貝曲西班水平(圖17A)和全血INR(圖17B)。標明各治療組的平均值。如表2中所匯總，單次靜脈注射r-解毒劑使得離體全血1殿有> 50%校正，此證明經由單次或多次注射或其它方案解毒劑有效中和fXa抑制劑。這些結果表明，本發明的fXa變體具有充當普適解毒劑在具有出血或其它醫療緊急狀況的患者中逆轉fXa抑制劑的抗凝血作用的潛力。此更充分地闡述于實施例8中。圖18展示在96孔濁度變化凝血分析中r-解毒劑逆轉依諾肝素的抑制作用。這些結果基本上類似于Pd-解毒劑(圖11)，此表明兩種fXa衍生物均具有相當的功能性解毒劑活性。508nM r-解毒劑實質上校正了( > 75% ) I. 25U/mL依諾肝素的抑制作用。分析方案呈現于實施例11中。圖19展示r-解毒劑逆轉低分子量肝素(LMWH)的抑制作用，如在人類血漿凝血分析中所測試。圖18和19 二者均于實施例11中討論。圖20展示r-解毒劑逆轉利伐沙班的抗凝血作用。此更充分地討論于實施例12中。圖21展示r-解毒劑的多核苷酸序列和經翻譯多肽序列的排列。圖22展示在單次靜脈注射(I次注射)或兩次注射(2次注射)r-解毒劑的情況下小鼠實驗(n = 5/組，312ug/200ul r_解毒劑)的結果。對經口施用貝曲西班(15mg/kg)之后靜脈注射運載體或r-解毒劑之后的血漿中的貝曲西班水平進行比較(圖22A)(參見實施例8的詳細闡述)。如圖22A中所示，與運載體對照(對照I)相比，單次靜脈注射r-解毒劑使血漿中的貝曲西班水平增加8倍以上，此表明解毒劑在體內有效結合貝曲西班的能力。與單次注射相比，第二次注射解毒劑又使貝曲西班水平增加不到2倍，此表明在小鼠血液中貝曲西班的數量有限且其抗凝血作用被解毒劑逆轉。圖22B表明，單次和雙次注射解毒劑之后，所測量的INR隨小鼠血漿中解毒劑/貝曲西班的比例的增加而降低。圖23展示使用r-解毒劑逆轉利伐沙班(A)、貝曲西班⑶和阿哌沙班(C)對fXa的抑制。使用Dynafit和Graphpad Prism軟件進行曲線擬合和數據分析(實施例15)。圖24展示人類血漿中r-解毒劑對利伐沙班的PT延長的逆轉(實施例16)。圖25展示阿哌沙班的PT延長而添加r-解毒劑逆轉其抗凝血作用(實施例16)。圖26展示r-解毒劑對依諾肝素抗凝血作用的逆轉(實施例17)。圖27展示大鼠中靜脈施用r-解毒劑對利伐沙班誘導的抗凝血的劑量響應逆轉(實施例18)。圖28展示r-解毒劑給藥到抗凝血化(anticoagulated)大鼠中時對利伐沙班游離(未結合)部分的劑量響應減少(實施例19)。圖29A和B展示通過全血INR和PT比率測量的大鼠中IV施用r_解毒劑對利伐沙班誘導的抗凝血的持續逆轉(實施例20)。 圖30展示麻醉大鼠中依諾肝素的劑量范圍 研究(實施例21)。圖31展示通過活化的部分促凝血酶原激酶時間測量的大鼠中IV施用r-解毒劑和硫酸魚精蛋白對依諾肝素誘導的抗凝血的持續逆轉(實施例21)。圖32展示施用r-解毒劑對貝曲西班誘導的抗凝血的持續逆轉(實施例22)。圖33展示Sprague-Dawley大鼠中Img靜脈給藥之后r_解毒劑的血衆濃度_時間概貌(實施例23)。圖34展示恒河猴中IOmg靜脈給藥之后r_解毒劑的血漿濃度-時間概貌(實施例 24)。圖35A和35B展示施用r_解毒劑中和利伐沙班活性的模擬時間進程曲線。在圖35A中，400mg劑量的r-解毒劑(推注給藥)逆轉20mg劑量的利伐沙班，同時假設R-解毒劑的T1/2為3小時。在圖35B中，使用900mg劑量的R-解毒劑(推注加6小時輸注)逆轉20mg劑量的利伐沙班，同時假設R-解毒劑的T1/2為I小時(實施例25)。圖36A和36B展示r_解毒劑中和貝曲西班活性的模擬時間進程曲線。在圖36A中，400mg劑量的r-解毒劑(推注給藥)逆轉SOmg劑量的貝曲西班，同時假設r_解毒劑的T172為3小時。在圖36B中，使用900mg劑量的r_解毒劑(推注加6小時輸注)逆轉80mg劑量的貝曲西班，同時假設r-解毒劑的T1/2為I小時(實施例26)。圖37展示r-解毒劑逆轉利伐沙班抗凝血的效果(實施例27)。圖38展示大鼠中施用r-解毒劑對依諾肝素抗凝血引起的血液損失的逆轉(實施例28)。每一處理組中單個動物的血液損失如圖41所示。圖39展示大鼠中施用r-解毒劑對磺達肝素抗凝血引起的血液損失的逆轉(實施例28)。每一處理組中單個動物的血液損失如圖43所示。圖40展示施用r-解毒劑對依諾肝素抗凝血引起的抗凝的逆轉。以血漿抗_fXa單位測量抗凝血(實施例29)。圖41展示大鼠中施用r-解毒劑對依諾肝素抗凝血引起的血液損失的劑量響應減輕(實施例28)。圖42展示大鼠尾部橫切模型(實施例28)中測量的血液損失與通過抗-fXa單位測量的依諾肝素濃度間的相關性(實施例29)。圖42a展示由于依諾肝素濃度提高到超過I. 5U/ml (通過抗-fXa單位分析測量)在血液損失上的一個急劇增加。圖42b展示血液損失與r-解毒劑濃度間的相關度分析，r2值為0. 799。圖42c展示抗-fXa單位與r_解毒劑濃度間的相關度分析，r2值為0. 689。圖43展示大鼠尾部橫切模型中(實施例28)r_解毒劑而非魚精蛋白對磺達肝素抗凝血造成的血液損失的逆轉。圖44展示通過抗-fXa活性分析測量的磺達肝素造成的抗凝血的逆轉。
詳細描述I.定義除非另有說明，否則本發明的實踐將使用組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學和重組DNA的常規技術，此在所屬領域的技術人員的范圍內。參見例如 Sambrook and Russell 編輯(2001)分子克隆實驗室手冊(Molecular Cloning A Laboratory Manual)，第3版；Ausubel等人編輯(2007)最新分子生物學實驗方法匯編(Current Protocols in Molecular Biology)系列；酶學方法(Methods inEnzymology)系列(學術出版社公司(Academic Press, Inc.)，紐約(N. Y.)) ；MacPherson等人(1991)PCR I :實用方法(PCR I A Practical Approach)(牛津大學出版社(OxfordUniversity Press)的 IRL Press) ;MacPherson 等人(1995)PCR 2 :實用方法(PCR 2 A Practical Approach) ；Harlow and Lane 編輯(1999)抗體，實驗室手冊(Antibodies，A Laboratory Manual) ；Freshney (2005)動物細胞的培養基本技術手冊(Culture ofAnimal Cells AManual ofBasic Technique)，第 5 版；Gait 編輯(1984)寡核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis);美國專利第 4，683，195 號；Hames 和 Higgins 編輯(1984)核酸雜交(Nucleic AcidHybridization) ；Anderson(1999)核酸雜交(NucleicAcid Hybridization) ；Hames and Higgins編輯(1984)轉錄和翻譯；固定化細胞和酶(Transcriptionand Translation immobilized Cells and Enzymes)(IRL Press (1986))；Perbal (1984)分子克隆實驗指南(A Practical Guide至Molecular Cloning) ；Miller andCalos編輯(1987)哺乳動物細胞的基因轉移載體(Gene Transfer Vectors for MammalianCells)(冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)) ;Makrides編輯(2003)哺乳動物細胞的基因轉移和表達(Gene Transfer and Expression inMammalian Cells) ；Mayerand Walker編輯(1987)細胞核分子生物學中的免疫化學方法(Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology)(學術出版社(Academic Press)，倫敦(London))；Herzenberg等人編輯(1996)韋爾的實驗免疫學手冊(Weir’s Handbook of ExperimentalImmunology);小鼠胚胎操作實驗指南(Manipulating the Mouse Embryo A LaboratoryManual)，第3版(冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press) (2002))。所有包括范圍在內的數值指定(例如，pH、溫度、時間、濃度、和分子量)都是近似值，其以⑴或(-)o. I的增量變化。應了解，盡管不一定明確陳述，但是所有數值指定前面皆有術語“約”。還應該了解，盡管未必明確陳述，本文所述的試劑僅是例示性的且這些試劑的等效物已為此項技術習知。除非上下文另有明確說明，否則說明書和權利要求書中使用的單數形式“一個/一種(a，an)”和“所述的(the) ”包括復數意義。例如，術語“藥學上可接受的載體”包括多種藥學上可接受的載體，包括其混合物。本文所用術語“包含/包括”意欲指組合物和方法包括所列舉要素，但并不排除其它要素。當使用“基本上由...組成”定義組合物和方法時，將意味著出于所想要的用途不包括對所述組合有任何本質意義的其它要素。因此，基本上由本文所定義的要素組成的組合物不會將來自分離和純化方法的痕量污染物和藥學上可接受的載體(例如磷酸鹽緩沖的鹽水、防腐劑、和諸如此類)排除在外。“由...組成”將意味著排除其它成分的超過痕量的元素和用于施用本發明組合物的實質性方法步驟。通過這些過渡術語中的每一者定義的實施例均在本發明 的范圍內。診斷或治療的“受試者”是細胞或哺乳動物，包括人類。診斷或治療的非人類動物受試者包括，例如，鼠科動物(例如大鼠、小鼠)、犬科動物(canine)(例如狗)、兔科動物(例如家兔)、家畜、運動動物和寵物。術語“蛋白質”和“多肽”可互換使用且在其最廣泛意義上是指兩個或兩個以上的亞單位氨基酸、氨基酸類似物或肽模擬物的化合物。所述亞單位可通過肽鍵連接。在另一實施例中，所述亞單位可通過其它鍵(例如，酯、醚、氨基等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個氨基酸且對蛋白質或肽序列中可包含的氨基酸的最大數量并無限制。本文所用術語“氨基酸”涉及天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和D與L光學異構體二者、氨基酸類似物和肽模擬物。天然存在的氨基酸的單個字母和三個字母縮寫列示于下文中。如果肽鏈短，通常將三個或三個以上氨基酸的肽稱為寡肽。如果肽鏈較長，則通常將所述肽稱為多肽或蛋白質。
I-字母~ 3-字母氨基酸
~L-酪氨酸
GL-甘氨酸
FPheL-苯丙氨酸
MMetL-甲硫氨酸
~Al^L-丙氨酸
I-字母~ 3-字母氨基酸 SSerL-絲氨酸
L-異亮氨酸 ~L-亮氨酸
fTh^L-蘇氨酸
vHL-纈氨酸
~L-脯氨酸
KLysL-賴氨酸
~HiiL-組氨酸
權利要求
1.ー種單位劑量制劑，包含藥學上可接受的載體和約IOmg-約2g的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或與SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的雙鏈多肽。
2.權利要求I所述的單位劑量制劑，其具有約IOOmg-約I.5g的所述多肽。
3.權利要求2所述的單位劑量制劑，其具有約200mg-約Ig的所述多肽。
4.權利要求3所述的單位劑量制劑，其具有約400mg-約900mg的所述多肽。
5.任一前述權利要求所述的單位劑量制劑，其中所述多肽有效中和至少約20%的因子Xa抑制劑。
6.權利要求5所述的單位劑量制劑，其中所述抑制劑被中和至少約50%。
7.權利要求6所述的單位劑量制劑，其中所述抑制劑被中和至少約75%。
8.權利要求7所述的單位劑量制劑，其中所述抑制劑被中和至少約90%。
9.權利要求8所述的單位劑量制劑，其中所述抑制劑被中和至少約95%。
10.權利要求5所述的單位劑量制劑，其中所述因子Xa抑制劑選自下組磺達肝素、依達肝素、生物素化的依達肝素、依諾肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、組織因子途徑抑制劑、DX-9065a、YM-60828、YM—150、阿哌沙班、利伐沙班、TAK-442、PD-348292、奧米沙班、依度沙班、LY517717、GSK913893、利伐沙班、低分子量肝素、貝曲西班或其藥學上可接受的鹽、和它們的組合。
11.權利要求10所述的單位劑量制劑，其中所述因子Xa抑制劑選自下組貝曲西班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和它們的組合。
12.權利要求11所述的單位劑量制劑，其中所述因子Xa抑制劑選自下組貝曲西班、利伐沙班、阿哌沙班、和低分子量肝素。
13.一種用于向正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的受試者施用的單位劑量制齊U，所述制劑包含藥學上可接受的載體和中和量的包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或與SEQID NO. 13具有至少80%同源性的多肽的雙鏈多肽，所述中和量是在至少約30分鐘內，使多肽的循環濃度與因子Xa抑制劑的循環濃度的摩爾比為至少約I : I。
14.權利要求13所述的單位劑量制劑，其中所述摩爾比是約I: I或約2 I或約4 I。
15.任一前述權利要求所述的單位劑量制劑，其中所述載體是鹽水。
16.權利要求15所述的單位劑量制劑，其中所述制劑具有每毫升鹽水約O.2-約IOmg多肽的濃度。
17.權利要求16所述的單位劑量制劑，其中所述制劑具有每毫升鹽水約2-約6mg多肽的濃度。
18.權利要求17所述的單位劑量制劑，其中所述制劑具有每毫升鹽水約2mg多肽的濃度。
19.任一前述權利要求所述的單位劑量制劑，其中所述多肽是凍干的。
20.ー種在正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的受試者中選擇性結合和抑制外源施用的因子Xa抑制劑的方法，包括向所述受試者施用權利要求1-19中任ー項所述的單位劑量制劑。
21.ー種在正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的受試者中防止、減少或停止出血的方法，包括向所述受試者施用權利要求1-19中任一項所述的單位劑量制劑。
22.—種在正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的受試者中校正fXa抑制劑依賴性藥效或替代標志物的方法，包括向所述受試者施用權利要求1-19中任一項所述的單位劑量制劑。
23.權利要求22所述的方法，其中所述藥效或替代標志物選自下組INR、PT、aPTT、ACT、抗fXa單位、和凝血酶生成。
24.權利要求22或23所述的方法，其中所述校正是至少約20%或約50%或約75%或約90%或約95%。
25.權利要求20-24中任一項所述的方法，其中所述單位劑量制劑是通過推注靜脈內施用的。
26.權利要求20-24中任一項所述的方法，其中所述單位劑量制劑是作為輸注或推注加輸注的組合施用的。
27.權利要求26所述的方法，其中所述制劑的約10%-約20%作為推注施用，而將其余制劑輸注一段時間直至出血基本上停止。
28.權利要求26或27所述的方法，其中所述制劑施用約6小吋。
29.權利要求26或27所述的方法，其中所述制劑施用約6-約12小時。
30.權利要求26或27所述的方法，其中所述制劑施用約12-約24小時。
31.權利要求26或27所述的方法，其中所述制劑施用多至約48小吋。
全文摘要
本發明涉及針對靶向因子Xa的抗凝血劑的解毒劑的單位劑量制劑。本發明揭示的是在正經歷使用因子Xa抑制劑的抗凝血療法的患者中停止或阻止出血的方法。
文檔編號A61K38/48GK102625712SQ201080040105
公開日2012年8月1日 申請日期2010年7月14日 優先權日2009年7月15日
發明者A.哈特查理拉哈, S.J.霍倫巴克, U.辛哈, 盧根民 申請人:博爾托拉制藥公司