專利名稱：靶向pax2用于治療乳腺癌的制作方法
靶向PAX2用于治療乳腺癌本申請要求于2010年2月18日提交的美國專利申請號12/708，294的優先權，以及于2009年8月M日提交的美國專利申請號12Λ46，292的優先權。
背景技術：
乳腺癌是女性最常見的癌癥原因，并且在美國是女性第二大常見的癌癥死亡原因。雖然多數初期乳腺癌是基于發現乳腺影像異常來診斷的，但是腫塊或乳腺組織堅實度的變化也可能是疾病的警報信號。過去幾十年內提高乳腺癌風險意識已致使進行乳腺攝影篩查的女性數量增加，導致更早期檢測癌癥并且由此提高存活率。盡管如此，乳腺癌是45 至陽歲女性最常見的死亡原因。已知許多類型的癌癥是由遺傳畸變即突變引起的。突變的積聚和細胞控制功能受損致使從正常組織到早期癌前的進行性表型變化，如上皮內瘤變(IEN)到日益嚴重的IEN 到淺表癌以及最終到浸潤性疾病。該過程通常在幾年甚至十幾年內相對緩慢地發生，雖然在一些情況下可能相對迅速。癌基因依賴是，癌細胞對維持惡性表型的單一癌基因的連續活化或過表達的生理依賴。這種依賴發生于標志腫瘤進程的其它變化的環境中。浸潤性癌癥的長期進程為臨床干預提供了時機。因此，重要的是鑒定指征癌前疾病的生物標志物，以便可以采取治療措施預防或延緩浸潤性癌癥的發展。發明概述本發明一方面涉及預防或治療個體中乳腺疾病的方法。所述方法包括向個體乳腺組織給予抑制PAX2表達或PAX2活性的組合物。在一實施方案中，所述乳腺疾病是乳腺癌或乳腺上皮內瘤變(MIN)。在另一實施方案中，所述抑制PAX2表達包括向個體的乳腺癌組織或MIN組織給予編碼PAXkiRNA的核酸。在相關實施方案中，所述SiRNA包含選自以下的序列SEQ ID NO :3_6和11-15。在另一實施方案中，所述組合物包含抑制PAX2與DEFBl啟動子結合的寡核苷酸。在相關實施方案中，所述寡核苷酸包含正向或反向的SEQ ID NO :1。在相關實施方案中，所述寡核苷酸包含X1GGAACX2序列，其中Xl和X2是與DEFBl 編碼序列中SEQ ID NO 1的鄰近核苷酸互補的0至30個核苷酸。在相關實施方案中，所述寡核苷酸包含選自以下的序列SEQ IDNO =18-21,25,26, 28 禾口 29。在另一實施方案中，所述組合物包含RAS信號通路的阻斷劑。在另一實施方案中，所述組合物包含選自以下的拮抗劑血管緊張素II的拮抗齊U，血管緊張素II受體的拮抗劑，血管緊張素轉化酶(ACE)的拮抗劑，絲裂原活化蛋白激酶 (MEK)的拮抗劑，ERK1，2(細胞外信號調節激酶)的拮抗劑，以及信號轉導及轉錄活化因子 3 (STAT3)的拮抗劑。還公開了治療個體中乳腺癌或MIN的方法，所述方法包括增強個體乳腺癌組織或 MIN組織中的DEFBl表達。在一實施方案中，增強DEFBl表達包括向個體的乳腺癌組織或MIN組織給予有效量的DEFBl。在另一實施方案中，增強DEFBl表達包括向個體的乳腺癌組織或MIN組織給予有效量的編碼DEFBl的表達載體。還公開的是用于治療個體乳腺疾病的方法，所述方法包括(a)測定來自所述個體的患病乳腺組織中PAX2-比-DEFBl的表達率；(b)測定來自所述個體的所述患病乳腺組織的ERA5R狀態；以及(c)基于(a)和(b)的結果，向所述個體的乳腺組織給予組合物，所述組合物(1)抑制PAX2表達或PAX2活性，(2)表達DEFBl，或(3)抑制PAX2表達或PAX2活性并且表達DEFBl。附圖簡要說明附圖與說明書一起闡述本發明的一個或多個實施方案，用于說明本發明的原理。 只要有可能，整個附圖所使用的相同附圖標記是指實施方案的相同或類似元件。圖IA至ID給出β -防御素-1 (DEFBl)表達的定量RT-PCROlRT-PCR)分析。圖2給出DEFBl誘導膜完整性和細胞形態改變的顯微鏡分析。黑色箭頭指示膜波動，白色箭頭指示凋亡小體。圖3給出前列腺癌細胞中DEFBl的細胞毒性分析。用PonA處理前列腺細胞系 DU145、PC3和LNCaP來誘導DEFBl表達1_3天，之后進行MTT測定以確定細胞活力。結果表示為平均值士標準偏差，η = 9。圖4Α和4Β給出由DEFBl誘導DU145和PC3細胞的細胞死亡。圖5給出DEFBl誘導之后的泛半胱天冬酶(pan-caspase)分析。圖6給出PAX2 siRNA處理之后配對盒同源基因2 (PAX2)蛋白表達的沉默。圖7給出對用PAX2 siRNA處理之后的前列腺癌細胞生長的分析。圖8給出對siRNA沉默PAX2之后的細胞死亡的分析。結果表示為平均值士標準偏差，η = 9。圖9給出對半胱天冬酶活性的分析。
圖10給出對ΡΑΧ2 siRNA處理之后的凋亡因子的分析。圖11給出PAX2與DNA識別序列結合的模型。圖12示出DEFBl報告子構建體。圖13給出抑制PAX2導致DEFBl表達。圖14給出抑制PAX2導致DEFBl啟動子活性增強。圖15給出DEFBl表達致使膜完整性受損。圖16給出PAX2抑制導致膜完整性受損。圖17A和17B給出PAX2與DEFBl啟動子結合的ChIP分析。圖17A中，泳道1包含IOObp的分子量標志物。泳道2是陽性對照，代表交聯和免疫沉淀反應之前從DU145擴增的DEFBl啟動子的160bp區。泳道3是陰性對照，代表無DNA進行的PCR。泳道4和5 是陰性對照，分別代表用IgG從交聯的DU145和PC3進行免疫沉淀反應的PCR。交聯之后用抗-PAX2抗體免疫沉淀的25pg DNA (泳道6和8)和50pg DNA (泳道7和9)的PCR擴增分別顯示DU145和PC3中160bp的啟動子片段。圖17B中，泳道1包含IOObp分子量標志物。泳道2是陽性對照，代表交聯和免疫沉淀反應之前從DU145擴增的DEFBl啟動子的 160bp區。泳道3是陰性對照，代表無DNA進行的PCR。泳道4和5是陰性對照，分別代表用IgG從交聯的DU145和PC3進行免疫沉淀反應的PCR。交聯之后用抗-PAX2抗體免疫沉淀的25pgDNA (泳道6和8)和50pg DNA (泳道7和9)的PCR擴增分別顯示DU145和PC3 中160bp的啟動子片段。圖18給出PrdPD和PrdHD與DNA的預測結構。圖19給出不同配對結構域共有序列的比較。在圖頂部示出ftxl-配對-結構域士 DNA復合物晶體學分析中所描述的蛋白士 DNA接觸的示意圖。空框指示α-螺旋，陰影框指示折疊，以及粗線指示轉角。接觸的氨基酸由單字母代碼給出。僅給出直接接觸的氨基酸士堿基。空圈指示大溝接觸，而紅箭頭指示小溝接觸。該示意圖是配對結構域蛋白所有已知共有序列的比對(僅給出正義鏈)。共有序列之間的垂直線指示保守的堿基對。位置編號在圖底部給出。圖20給出靶向ΡΑΧ2作為化學預防性策略。圖21給出血管緊張素II (Ang II)對DU145細胞中ΡΑΧ2表達的影響。圖22Α給出洛沙坦(Losartan，Los)對DU145細胞中PAX2表達的影響。圖23給出Los阻斷AngII對DU145中PAX2表達的影響。圖M給出AngII增加DU145細胞增殖。圖25A，圖25B和圖25C給出Los和MAP激酶抑制劑對DU145細胞中PAX2表達的影響。圖25A給出用洛沙坦處理DU145細胞阻抑磷酸化-ERK1/2和PAX2表達；圖25B給出 MEK激酶抑制劑和AICAR阻抑PAX2蛋白表達；圖25C給出MEK激酶抑制劑和洛沙坦阻抑磷酸化-STAT3蛋白表達。圖26A和26B給出Los和MEK激酶抑制劑對DU145細胞中PAX2活化的影響。圖27給出AngII在UrEC細胞中增加PAX2表達而降低DEFBl表達。圖28給出AngII信號轉導和PAX2前列腺癌的示意圖。圖四給出阻斷PAX2表達作為前列腺癌療法的示意圖。圖30給出用Gleason評分對DEFBl和PAX2表達的比較。圖31A和31B給出PAX2-DEFB1比值作為前列腺癌發展的預測因子。圖32給出Donald預測因子(DPF)是基于相對的PAX2-DEFB1表達率。圖33A和3 給出對人前列腺組織中hBD_l表達的分析。圖34A和34B給出對前列腺細胞系中hBD_l表達的分析。圖34A給出與hPrEC細胞相比，hBD-Ι誘導之前和之后前列腺癌細胞系中hBD-Ι的表達水平。一個星號代表相比 hPrEC統計學更高的表達水平。兩個星號代表相比hBD-Ι誘導之前的細胞系統計學顯著的表達水平(學生t-檢驗，ρ < 0. 05)。圖34B給出通過免疫細胞化學驗證前列腺癌細胞系 DU145中的異常hBD-Ι表達。將UrEC細胞對hBD_l進行染色作為陽性對照(A =DIC和B 熒光)。用hBD-Ι轉染DU145細胞并誘導18小時(C =DIC和D 熒光)。比例尺=20 μ Μ。圖35給出前列腺癌細胞中hBD-Ι的細胞毒性分析。各柱子代表一式三份進行三個獨立試驗的平均值士標準誤。圖36A和圖36B給出正常、PIN和腫瘤的LCM人前列腺組織切片中hBD_l和cMYC 表達的QRT-PCR分析。每種基因的表達表示為與β-肌動蛋白相比的表達率。圖36Α給出正常、PIN和腫瘤切片中hBD-Ι表達水平的比較。圖36B給出正常、PIN和腫瘤切片中cMYC 表達水平的比較。
圖37給出用siRNA敲低PAX2之后的hBDl表達的QRT-PCR分析。hBD_l表達水平表示為與β-肌動蛋白相比的表達率。星號代表與PAXkiRNA處理之前的細胞系相比統計學更高的表達水平(學生t-檢驗，ρ < 0. 05)。圖38A和38B給出PAX2 siRNA處理之后PAX2蛋白表達的沉默。圖38A給出通過 Western印跡分析檢測HPrEC前列腺原代細胞(泳道1)以及DU145 (泳道2)，PC3 (泳道3) 和LNCaP(泳道4)前列腺癌細胞中的PAX2表達。將印跡清除并重新探測作為內參的β-肌動蛋白，以確保等量上樣。圖38Β給出對用ΡΑΧ2 siRNA雙螺旋轉染之后證實ΡΑΧ2表達敲低的全部DU145，PC3和LNCaP的Wfestern印跡分析。同樣地，將印跡清除并重新探測作為內參的β-肌動蛋白。圖39給出對用ΡΑΧ2 siRNA處理之后的前列腺癌細胞生長的分析。比例尺= 20 μ m0圖40給出對siRNA沉默PAX2之后的細胞死亡的分析。結果表示為平均值士標準偏差，η = 9。圖41給出對半胱天冬酶活性的分析。比例尺=20 μ m.圖42A至42C給出對PAX2 siRNA處理之后的凋亡因子的分析。結果表示為平均值士標準偏差，η = 9。星號代表統計學差異(ρ < 0. 05)。發明詳述本發明一方面提供預防或治療個體中乳腺癌的方法。所述方法包括給予個體組合物，所述組合物包含ΡΑΧ2表達或ΡΑΧ2活性的抑制劑，或者DEFB-I表達或DEFB-I活性的增強劑。在一實施方案中，所述個體被診斷患有乳腺上皮內瘤變(MIN)。在某些方面，乳腺組織的ΡΑΧ2在MIN之前被上調。因而，本申請還提供了治療或預防個體中MIN的方法。所述方法包括給予個體組合物，所述組合物包含ΡΑΧ2表達或ΡΑΧ2 活性的抑制劑，或者DEFB-I表達或DEFB-I活性的增強劑。蛋白“活性”包括，例如轉錄、翻譯、細胞內轉位、分泌、通過激酶的磷酸化、通過蛋白酶的剪切、與其它蛋白的嗜同和嗜異結合、泛素化作用。在某些方面，“ΡΑΧ2活性”具體是指ΡΑΧ2與DEFB-I啟動子的結合。乳腺癌普遍用于乳腺癌篩選的方法包括自我和臨床乳腺檢查，X-射線乳腺攝影以及乳腺磁共振成像(MRI)。乳腺癌篩查的最新技術是超聲計算機斷層成像術，其利用聲波形成三維圖像并且乳腺癌在不用χ-射線乳腺攝影中所用的危險放射線的情況下檢測乳腺癌。還可以使用基因測試。用于乳腺癌的基因測試一般包括測試BRCA基因中的突變。這除了對那些有提高乳腺癌風險的患者，通常是不推薦的技術。女性死亡的主要原因，乳腺癌的發生率，在美國過去這三十年逐漸增加。雖然乳腺癌的發病機理尚不清楚，但是正常乳腺上皮細胞轉化成惡性表型可能是遺傳因素的結果， 尤其是30歲以下的女性。最近，BRCAl和BRCA2的發現和表征已擴大了我們對能促進家族乳腺癌的遺傳因素的理解。這兩個基因座內的生殖細胞系突變與50-85%的乳腺癌和/或卵巢癌的終身風險相關。然而，其它非遺傳因素很可能對該疾病的病因也具有重大影響。無論其起因是什么，如果在其進程早期未被檢測到，那么乳腺癌發病率和死亡率會顯著增加。 因而，大量工作已集中于乳腺組織的細胞轉化和腫瘤形成的早期檢測上。
目前，鑒定乳腺癌的主要方式是通過檢測致密腫瘤組織的存在。這可以通過直接檢查乳腺外部或通過乳腺攝影或其它X-射線成像方法來實現不同程度的效力。然而，后面的方法有相當大的代價。每當進行乳腺攝影時，患者承受測試過程中所使用的放射線的電離特性所誘導的較小的患有乳腺腫瘤的風險。此外，該方法昂貴并且技術員的主觀解釋可能導致不精確，例如，一項研究表明，對于由所調查的一組放射科醫生單獨解釋的一組乳腺影像，大約三分之一存在主要臨床分歧。此外，許多女性感到進行乳腺攝影是痛苦的經歷。 因此，國家癌癥研究所并不推薦50歲以下的女性進行乳腺攝影，因為與年紀較大的女性相比，該群體發展成乳腺癌的可能性較低。然而，引人注意的是，雖然50歲以下的女性僅有約 22%發生乳腺癌，但數據顯示絕經前女性的乳腺癌更具侵襲性。PAX2PAX基因是編碼核轉錄因子的九個發育調控基因家族。它們在胚胎發生中起重要作用，并且以非常有序的時空模式表達。它們全部包含編碼DNA結合結構域的384個堿基對的“配對盒”區，所述“配對盒”區在整個進化過程中是高度保守的(Stuart，ET, et al. 1994)。通過許多可直接歸因于PAX基因的雜合不足的天然鼠和人類綜合癥已證實PAX 基因對發育過程的影響。Dressier等(1990)已給出PAX2序列。人PAX2蛋白及其變體的氨基酸序列，以及編碼這些蛋白的DNA序列列于SEQ ID NO :39-59 (SEQ ID N0:39，由人PAX2 基因的外顯子1編碼的氨基酸序列；SEQ ID N0:40，人PAX2基因啟動子和外顯子1 ;SEQ ID NO :41，人PAX2的氨基酸序列；SEQ ID NO :42，人PAX2基因；SEQ ID NO :43，人PAX2基因變體b的氨基酸序列；SEQ ID NO :44，人PAX2基因變體b ;SEQ IDNO :45，人PAX2基因變體c的氨基酸序列；SEQ ID NO :46，人PAX2基因變體c ；SEQ ID NO :47，人PAX2基因變體d的氨基酸序列；SEQ IDNO 48,人PAX2基因變體d ；SEQ ID NO :49，人PAX2基因變體e的氨基酸序列；SEQ ID NO :50，人PAX2基因變體e)。據報道，PAX2通過與DEFB-1啟動子(Bose SK et al. ,MoI Immunol. 2009，46 :1140-8.)在緊鄰 DEFBl TATA盒的 5，-CCTTG_3，(SEQ ID NO 1) 識別位點處相結合而阻抑DEFB-I表達。在一些文獻中，結合位點還稱為3’-GTTCC-5’ (SEQ IDNO 1)或 5，-CAAGG-3，(SEQ ID NO :2)識別位點，5，-CAAGG-3，(SEQ IDNO :2)是相對鏈上的序列。兩個序列都涉及DEFBl啟動子上的PAX2結合位點。已檢測PAX2表達的癌癥的例子列于表1。表1 表達PAX2的癌癥
表達PAX2美國估計的美國估計的全球估計的全球估計的
的癌癥__新病例__死亡數__新病例__死亡數
前列腺__234,460 27,350__679,023 221,002
乳腺__214,600 41,430__1,151,298 410,712
卵巢__20,180__15,310__204,500124,860
_ 38,89012,840208,479101,895
8J __12,820__18,820__189,485141,650
權利要求
1.用于治療個體中乳腺疾病的方法，所述方法包括向所述個體的乳腺組織給予抑制 PAX2表達和/或PAX2活性的組合物，其中所述組合物包含一種或多種選自以下的成分編碼PAXkiRNA的多核苷酸，抑制 PAX2與DEFBl啟動子結合的多核苷酸，血管緊張素II的拮抗劑，血管緊張素II受體的拮抗齊U，血管緊張素轉化酶(ACE)的拮抗劑，絲裂原活化蛋白激酶(MEK)的拮抗劑，細胞外信號調節激酶1，2(ERK1，2)的拮抗劑，信號轉導及轉錄活化因子3 (STAT3)的拮抗劑，以及RAS 信號通路的阻斷劑。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述乳腺疾病是乳腺癌或乳腺上皮內瘤變(MIN)。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含編碼siRNA的多核苷酸，所述siRNA 包含選自以下的序列:SEQ ID NO :3-6和11-15。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含多核苷酸，所述多核苷酸包含正向或反向的SEQ ID NO :1。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述多核苷酸包含V-CCTTG-W序列及其互補序列，其中V和W是在DEFBl啟動子的PAX2結合位點側翼的1至35個核苷酸的連續核苷酸序列。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述多核苷酸包含選自以下的序列SEQID NO 18-21，25，26，28 和 29。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含依那普利。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含纈沙坦、奧美沙坦或替米沙坦。
9.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物包含U0U6或PD98059。
10.治療個體中乳腺癌或MIN的方法，所述方法包括增強所述個體乳腺癌組織或MIN組織中的DEFBl表達。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述增強DEFBl表達包括向所述個體的乳腺癌組織或MIN組織給予有效量的DEFBl。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述增強DEFBl表達包括向所述個體的乳腺癌組織或MIN組織給予有效量的編碼DEFBl的表達載體。
13.如權利要求1所述的方法，其還包括向所述個體給予有效量的抗激素劑的步驟。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述抗激素劑是他莫昔芬。
15.如權利要求1所述的方法，其還包括向所述個體給予有效量的抗-ERBB-2劑的步馬聚ο
16.如權利要求15所述的方法，其中所述抗-ERBB-2劑是赫賽汀。
17.如權利要求1所述的方法，其還包括向所述個體給予有效量的抗-Her-2劑的步驟。
18.如權利要求17所述的方法，其中所述抗-Her-2劑是曲妥珠單抗。
19.如權利要求1所述的方法，其還包括向所述個體給予有效量的抗-AIB-1/SRC-3劑的步驟。
20.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物還包含一種或多種選自以下的試劑抗激素劑、抗-ERBB-2劑、抗-Her-2劑以及抗-AIB-1/SRC-3劑。
21.用于治療個體中乳腺疾病的方法，所述方法包括(a)測定來自所述個體的患病乳腺組織中PAX2-比-DEFBl的表達率；(b)測定來自所述個體的所述患病乳腺組織的ERA5R狀態；以及(c)基于(a)和(b)的結果，向所述個體的乳腺組織給予第一組合物，所述第一組合物 (1)抑制PAX2表達或PAX2活性，(2)表達DEFBl，或(3)抑制PAX2表達或PAX2活性并且表達DEFB1。
22.如權利要求21所述的方法，其中所述乳腺疾病是乳腺癌或MIN。
23.如權利要求21所述的方法，其中所述第一組合物包含編碼siRNA的多核苷酸，所述 siRNA包含選自以下的序列=SEQ ID NO 3-6禾口 11-15。
24.如權利要求21所述的方法，其中所述第一組合物包含多核苷酸，所述多核苷酸包含正向或反向的SEQ ID NO :1。
25.如權利要求對所述的方法，其中所述多核苷酸包含V-CCTTG-W序列及其互補序列， 其中V和W是在DEFBl啟動子的PAX2結合位點側翼的1至35個核苷酸的連續核苷酸序列。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述多核苷酸包含選自以下的序列SEQID NO 18-21，25，26，28 和 29。
27.如權利要求21所述的方法，其中所述第一組合物包含選自以下的拮抗劑血管緊張素II的拮抗劑，血管緊張素II受體的拮抗劑，血管緊張素轉化酶(ACE)的拮抗劑，絲裂原活化蛋白激酶(MEK)的拮抗劑，細胞外信號調節激酶1，2 (ERK1，2)的拮抗劑，信號轉導及轉錄活化因子3(STAT3)的拮抗劑。
28.如權利要求21所述的方法，其中所述第一組合物包含RAS信號通路的阻斷劑。
29.如權利要求21所述的方法，其中所述第一組合物是與抗體、受體或配體綴合以靶向所述個體腫瘤組織的抗-PAX2劑。
30.如權利要求21所述的方法，其中所述第一組合物是含有干擾或抑制PAX2與DEFBl 啟動子結合的小分子抗-PAX2劑。
31.如權利要求21所述的方法，其中所述步驟(c)還包括給予包含抗激素劑的第二組合物。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述抗激素劑是他莫昔芬。
33.如權利要求21所述的方法，其中所述步驟(c)還包括給予包含抗-ERBB-2劑的第二組合物。
34.如權利要求33所述的方法，其中所述抗-ERBB-2劑是赫賽汀。
35.如權利要求21所述的方法，其中所述步驟(c)還包括給予包含抗-Her-2劑的第二組合物。
36.如權利要求35所述的方法，其中所述抗-Her-2劑是曲妥珠單抗。
37.如權利要求21所述的方法，其中所述步驟(c)還包括給予包含抗-AIB-1/SRC-3劑的第二組合物。
全文摘要
本申請提供了通過抑制PAX2的表達來預防和/或治療個體中乳腺癌的方法。在某些實施方案中，抑制PAX2表達的方法是給予個體編碼PAX2siRNA的核酸。還提供了通過給予DEFB1或通過提高DEFB1的表達來治療個體中癌癥的方法。
文檔編號A61P35/00GK102481379SQ201080037397
公開日2012年5月30日 申請日期2010年2月19日 優先權日2009年8月24日
發明者卡爾頓·D·唐納德 申請人:菲吉尼克斯公司