使用副粘病毒載體的經鼻噴霧型結核疫苗的制作方法

專利名稱：使用副粘病毒載體的經鼻噴霧型結核疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及使用副粘病毒載體的經鼻噴霧型結核疫苗，特別涉及使用人的副流感病毒2型病毒載體(hPIV2)的經鼻噴霧型結核疫苗。
背景技術：
結核是由屬于分枝桿菌屬的人型結核菌(結核分枝桿菌，Mycobacterium tuberculosis)引起的感染癥。即使在現在，結核也是導致大量感染者的疾病之一。在全世界，每年有800萬人患結核病，約200萬人死亡。這是由于現有的結核疫苗BCG (Bacil 1 e de Calmette et Guerin 卡介菌)疫苗對成人不具有效果，因此，在嬰幼兒期的疫苗接種只在年輕時得到預防結核效果，即使追加接種，也不能誘導對成人的預防結核效果。另外，在日本，每年產生2萬人以上的結核病患者(約20名患者/10萬人)，成為中等流行國家。在結核預防中使用的BCG疫苗以牛型結核菌(牛分枝桿菌，Mycobacterium bovis)為原型。通過將牛型結核菌經過長時間傳代培養，失去對人的毒性，將僅殘留抗原性的細菌作為BCG疫苗使用。由對人體接種該活菌而獲得免疫，進行對人型結核菌的感染防御。BCG疫苗是現在被實用化的唯一的結核預防疫苗，嬰幼兒結核的預防效果得到廣泛認可。BCG疫苗的效果在十余年左右喪失，在成人后，通過自然免疫力的增加防止結核的發生。但是，依靠自然免疫力不能充分抑制成人結核的發病。對于該事態，可以考慮在成人后再接種BCG疫苗的方法，但是，已知BCG疫苗對成人結核的效果低(或幾乎無效)。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 國際公開公報2002/066055專利文獻2 日本特開2008-074749號公報非專利文獻非專利文獻1 第52屆日本病毒學會學術集會，M蛋白欠損^ 7 7 ；^ > ι' 2 型々4卟7 (PIV2)及t/ 7々7 IL-4 f揷入L· tz PIV2乃性狀解析，2004年11月21日

發明內容
發明所要解決的課題對于上述事態，進行了若干種成人結核疫苗的開發。例如，進行了 MVA85A疫苗(在安卡拉痘苗病毒中表達抗酸桿菌85A抗原的疫苗),Aeras402疫苗(在35型腺病毒中表達 85A 抗原和 TB10. 4 的疫苗)和 M72F (別名 GSK TBlOl 是由 GSK (Glaxo Smith Kline)公司開發的疫苗，是將結核分枝桿菌的蛋白質和GSK公司的AS02佐劑共同使用的疫苗)等的開發。但是，至今仍沒有得到具有充分效果的成人結核疫苗。本發明是鑒于上述事實而作出的，其目的在于提供在結核預防中具有效果的經鼻噴霧型疫苗。
用于解決課題的方法hPIV2是屬于副粘病毒科的病毒，其基因組是約15000堿基的單鏈負鏈RNA。在該核酸結合核衣殼蛋白(NP)，形成螺旋對稱的核苷蛋白質復合體(核衣殼，RNP)。編碼病毒基因組的蛋白質中，M蛋白與病毒糖蛋白的細胞質內區域、被膜脂質雙層膜和RNP相互作用， 在病毒顆粒的出芽中是重要的。通過基因重組使M蛋白缺失的病毒基因組雖然感染細胞， 表達特定的病毒蛋白質，但不能出芽。本發明的發明人發現，使M蛋白缺失的PIV2能夠作為用于在標的細胞表達外來蛋白質的載體使用(非專利文獻1)。另一方面，本發明的發明人發現抗酸桿菌來源的α抗原在過敏性疾病的預防、治療中是有效的(專利文獻1)。構建在CMV啟動子和TPA信號肽的下游中重組入有α抗原的表達載體PcDNA-α-K，在哮喘小鼠模型中進行驗證。另外，發現為了有效地使用α抗原，作為表達量多的載體，使用PIV2，對過敏性疾病是有效的(專利文獻2)。本發明的發明人在研究上述技術在結核疫苗中是否能夠應用時，吃驚地發現， 在現有的方法中，幾乎得不到效果的結核菌感染預防，在使M蛋白質或F蛋白質缺損的 hPIV2(rhPIV2)中重組入有α抗原的表達載體顯示結核預防效果，從而基本完成了本發明。這樣，第1發明涉及的經鼻噴霧型結核疫苗，特征在于在使M基因、F基因或HN 基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原(Ag85B)、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體(以下稱為“α抗原等”)的基因。另外，第2發明涉及的結核預防或治療方法，特征在于在使M基因、F基因或HN 基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因，對包括人的哺乳動物進行噴霧且經鼻給藥。副粘病毒是指屬于副粘病毒科的病毒。副粘病毒在基因組中具有負鏈單鏈RNA，病毒粒是指顯示150nm 350nm多形性的病毒分類。副粘病毒顆粒被包于被膜中，在被膜表面排列有2種糖蛋白(F和HN)。副粘病毒中，例如，包括副流感病毒(PIV)、牛副流感病毒 3型、仙臺病毒、流行性腮腺炎病毒、犬瘟熱病毒、牛瘟病毒、麻疹病毒、小反芻動物瘟病毒、 新城雞瘟病毒、禽副粘病毒2 9型、亨德拉病毒、尼帕病毒、牛呼吸合胞體病毒(牛RS病毒)、人呼吸合胞體病毒(人RS病毒)、人偏肺病毒等。α抗原優選是來自堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)或牛分枝桿菌 BCG(Mycobacterium bovis BCG)的α抗原。另外，α抗原的類似物優選為抗原85復合體結構蛋白85Α或抗原85復合體結構蛋白85C。發明的效果根據本發明，對成人結核也能夠提供預防、治療效果高的疫苗。本發明涉及的疫苗是充分利用作為骨架的副粘病毒(特別是hPIV2)具有的呼吸器感染中的高蛋白表達特性、并且給藥便利性高的經鼻噴霧型的活疫苗。目前開發中的 MVA85A和Aeras 402的重組活疫苗均為注射劑，相對于此，本發明涉及的經鼻疫苗為噴霧劑，目的蛋白的表達量也高于注射劑給藥。在結核預防中，在疾病表現部位的肺的局部免疫誘導被視為比全身免疫更重要。通過使用插入了具有細胞免疫(Thl)移動性功能的蛋白基因的副粘病毒載體，可以得到在肺中的高細胞性免疫誘導，因此，與其它載體相比，可以認為對結核菌的疫苗效果更高。另外，即使在作為骨架的病毒的病原性中，對成人的安全性也特別高。另外，在制造方面，通過培養細胞的使用和噴霧化，能夠實現高成品率和成本降低。


圖1是通過導入終止密碼子從而不表達M蛋白質的反義rhPIV2基因組的簡要說明圖。圖2是從含有通過在T7啟動子的下游導入重組入的終止密碼子而得到的M基因缺損型反義rhPIV2基因組cDNA的質粒載體回收病毒顆粒的方法的說明圖。圖3是表示使M蛋白基因或F蛋白基因缺失、將Ag85B等基因作為表達型重組入的 AM/rhPIV2 和 AF/rhPIV2 的結構圖。圖4是確認在rhPIV2_GFP經鼻給藥的倉鼠的氣管中GFP的表達的顯微鏡照片圖。圖5是通過rhPIV2_Ag85B確認有無基因產物的表達時蛋白免疫印跡的照片圖。圖6是表示在F表達細胞中含有GFP基因的Δ F/rhPIV2增殖從而出現GFP熒光的細胞增加的情況的圖。圖7是表示通過在Δ F/rhPIV2中導入BCG_Ag85B的載體表達BCG_Ag85B的情況的蛋白免疫印跡圖。圖8是以rhPIV2_Ag85B(M終止，M-stop)疫苗經鼻給藥后的小鼠中確認感染結核菌后的肺中結核菌的結節的照片圖。分別是(A)投與對照物(rhPIV2-GFP)4次后，(B)投與表達型 Ag85B-DNA 2 次、rhPIV2_Ag85B (Μ 終止)2 次后、(C)投與 rhPIV2_Ag85B (Μ 終止)4 次后，感染結核菌的小鼠的肺。圖9是表示圖8中所示的肺病變情況的顯微鏡照片圖。分別是㈧投與 rhPIV2-Ag85B (Μ終止)4次后、(B)投與對照物(rhPIV2_GFP) 4次后，感染結核菌的小鼠的月市。圖10是表示比較在rhPIV2_Ag85B(M終止)疫苗的結核感染預防試驗中的結核菌數的圖表。
具體實施例方式接著，邊參照圖表邊說明本發明的實施方式。本發明的技術范圍不受這些實施方式限定，能夠不改變發明要點地以各種方式實施。本發明的技術范圍覆蓋均等的范圍。在本發明中使用的人副粘病毒(特別是hPIV2)，病原性極低且蛋白質表達量多。 因此，能夠制備直接重組入編碼外來蛋白質的α抗原的基因的副粘病毒基因并使用。但是，除去病毒的結構蛋白質基因，將該基因由細胞、質粒等供給，供給更安全的非增殖型病毒載體的腺病毒載體等，在作為副粘病毒基因的一種的hPIV2載體中，使用使 hPIV2的M基因、F基因或HN基因缺損的rhPIV2，由此，雖然感染和蛋白質的表達同等進行， 但不產生感染性hPIV2，形成更安全的hPIV2載體。因此，在本發明中，在使M基因、F基因或HN基因缺損的hPIV2(rhPIV2)中重組入編碼α抗原等的基因。作為重組入α抗原等的部位，可以是rhPIV2基因組的任意位置，但是，通過在反義病毒基因組的5 ‘末端側重組入，外來蛋白質的表達量變多，故而優選。反義PIV2基因組是單鏈RNA，從5'末端向3'末端具有稱為前導序列(Leader 啟動子序列)、NP、V/P、M、F、HN、L、拖尾序列(Trailer)的結構。因此，編碼α抗原等的基因優選位于緊隨前導序列(啟動子序列)之后或者NP和 V/P之間等的靠近5'末端側的位置。為了使作為基質蛋白的M基因和作為構成膜蛋白質基因的F基因或HN基因缺損， 可以例示將編碼M蛋白質、F蛋白質或HN蛋白質的基因部分的全部或一部分敲除的方法， 或在編碼M蛋白質、F蛋白質或HN蛋白質的基因某處重組入終止密碼子的方法等。通過在細胞中向使M基因、F基因或HN基因缺損的PIV2基因組基因中短暫性地導入分別表達M蛋白質、F蛋白質或HN蛋白質的質粒而使該基因表達的方法，或形成分別表達M基因、F基因或HN基因的細胞，在該細胞上使M基因、F基因或HN基因缺損的PIV2 增殖，由此，能夠在不表達這些基因的細胞、組織中制作不進行多階段增殖的非增殖型的 PIV2。將完全缺損M基因、F基因或HN基因、不能自律增殖的病毒分別稱為AM/rhPIV2或 rhPIV2 ( Δ Μ)、Δ F/rhPIV2 或 rhPIV2 ( Δ F)、或 Δ HN/rhPIV2 或 rhPIV2 ( Δ ΗΝ)。在本發明中，α抗原(Ag85B)是在抗酸桿菌中普遍存在的蛋白之一，鑒定為作為抗原85復合體之一的抗原85復合體結構蛋白85B。該抗原85復合體由分子量為30 32kD 左右的抗原 85 復合體結構蛋白 85A(Ag85A Jnfect. Immun. 57 :3123-3130,1989)、抗原 85 復合體結構蛋白 85B (Infect. Immun. 58 (2), 550-556, (1990). Accession No. X53897) 和抗原85復合體結構蛋白85C(Ag85C Jnfect. Immun. 59 :5205-3212,1991)構成。這些蛋白質是抗酸桿菌的主要分泌蛋白。已知在結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等的同屬細菌之間，這些分泌蛋白的基因、氨基酸序列超越種屬，顯示高同源性，顯示對單克隆抗體的交叉反應性(Microbiol. Rev. 56 :648-661，1992)。作為α抗原(抗原85復合體結構蛋白85Β :Ag85B)的類似物，可以列舉抗原85復合體結構蛋白85A(Ag85A)、抗原85復合體結構蛋白85C(Ag85C)等。在本發明中，編碼抗酸桿菌來源的α抗原或其類似物的基因是指能夠表達α 抗原蛋白或抗原85復合體結構蛋白85Α、抗原85復合體結構蛋白85C等α抗原蛋白的類似物的基因。具體而言，可以列舉含有處于編碼α抗原或其類似物的基因表達載體的形態的基因。作為編碼α抗原的基因，可以列舉編碼堪薩斯分枝桿菌(Infect. Immun. 58 :550-556. 1990)、牛分枝桿菌 BCG(J. Bacteriol. 170 :3847-3854. 1988)、鳥分枝桿菌(Infect. Immun. 61 :1173—1179，1993)、胞內分枝桿菌(Biochem, Biophys. Res. Commun. 196 1466-1473，1993)、麻風分枝桿菌(Mol. Microbiol. 6 153-163，1992)等抗酸桿菌來源的α抗原的基因。這些基因均能夠在本發明中使用。其中，作為編碼堪薩斯分枝桿菌的α抗原的基因，可以列舉具有序列序號1所示的第390 第1244的堿基序列的 DNA，作為編碼牛分枝桿菌BCG的α抗原的基因，可以列舉具有序列序號3所示的第121 第975的堿基序列的DNA。除了這些DNA以外，也能夠使用具有與該DNA互補的序列的DNA 和在嚴格條件下雜交的突變體DNA，編碼含有相對于由該DNA編碼的蛋白質的氨基酸序列使1個或多個(優選數個)氨基酸殘基被取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的蛋白質的 DNA;上述DNA是編碼具有與堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG來源的α抗原同樣的功能的蛋白質的突變體DNA。與堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG來源的α抗原同樣的功能是指顯示對結核菌(結核分枝桿菌)的感染發揮同樣的預防效果。牛分枝桿菌BCG的α抗原包括285個氨基酸殘基的成熟蛋白質，該氨基酸序列具有比堪薩斯分枝桿菌的α抗原更高的與結核分枝桿菌的氨基酸同源性(100%)，可以認為通過導入該α抗原，發揮更高的結核發病預防效果。作為用于得到突變體DNA的具體方法，例如，可以列舉以下的方法。S卩，在50%甲酰胺、4XDenhardt、5XSSPE(SSPE 溶液EDTA 磷酸鈉鹽(SSPE)UXDenhardt 0. 02%水溶性聚蔗糖、0. 02%聚乙烯吡咯烷酮、0. 02%牛血清蛋白),0. 2% SDS、100y g/mL、ssDNA和 12. 5ng 的探針(使用 BcaBest DNA Labeling Kit (TakaRa)，通過[α-32P] dCTP (Amersham) 標記12. 5ng具有序列序號1所示的第390號 第1244號的堿基序列或序列序號3所示的第121號 第975號的堿基序列得到的cDNA斷片)存在下，以45°C進行14 16小時菌落雜交后，在1XSSPE、0. 5% SDS溶液中以45°C洗凈過濾器30分鐘，此后，在0. IXSSPE, 0. 5% SDS溶液中，以55°C洗凈過濾器1小時，最后，在0. 1XSSPE、0. 5% SDS溶液中，以65°C 洗凈過濾器1小時，消除背景后，在X射線膠片(Fuji)中以-80°c暴露72小時，確定對應的菌落位置，將其單獨分離，由此能夠得到突變體DNA。它們的突變體所編碼的氨基酸序列相對于α抗原的氨基酸序列通常具有60%以上的同源性，優選具有75%以上的同源性。在編碼堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG以外的抗酸桿菌由來的α抗原的基因時，也可以同樣是它們的突變體。作為編碼α抗原類似物的抗原85復合體結構蛋白85Α的基因，可以列舉與關于上述α抗原基因的各種抗酸桿菌同樣的抗酸桿菌來源的基因。更具體而言，可以列舉編碼結核分枝桿菌來源的抗原85復合體結構蛋白85Α的DNA(Infect. Immun. 57 =3212-3130, 1989)。關于編碼抗原85復合體結構蛋白85C的基因也同樣可以列舉各種抗酸桿菌來源的基因。更具體而言，可以列舉編碼結核分枝桿菌來源的抗原85復合體結構蛋白85C的 DNAdnfect. Immun. 59 =3205-3212,1991)。關于這些DNA，也與上述同樣地，能夠使用具有與這些DNA互補的序列的DNA和在嚴格的條件下雜交的DNA，編碼含有相對于由該DNA編碼的蛋白質的氨基酸序列使1個或多個(優選數個)氨基酸殘基被取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的蛋白質的DNA ；上述DNA是編碼具有與抗原85復合體結構蛋白質85Α或抗原 85復合體結構蛋白85C同樣功能的蛋白質的突變體。上述DNA能夠基于上述文獻中所記載的序列信息、Genbank等的序列信息等，使用適當的DNA部分作為PCR引物，通過對抗酸桿菌來源的mRNA進行RT-PCR反應等進行克隆。 另外，也能夠基于氨基酸序列信息進行化學合成。上述DNA的突變體，例如，能夠通過定點突變法、PCR法或通常的雜交法等容易地得到。在本發明中，在結核預防中也能夠使用抗酸桿菌來源的α抗原蛋白、作為其類似物的抗原85復合體結構蛋白85Α或抗原85復合體結構蛋白85C其本身或它們的突變體蛋白。作為這樣的α抗原，可以列舉由編碼上述α抗原的基因編碼的蛋白質。具體而言，例如，可以列舉由具有序列序號1所示的堪薩斯分枝桿菌的堿基序列的DNA編碼的、具有序列序號2所示的氨基酸序列的α抗原，或由具有序列序號3所示的牛分枝桿菌BCG的堿基序列的DNA編碼的、具有序列序號4所示的氨基酸序列的α抗原等。后者的堿基序列和氨基 Ml^^i^SU^tiM URL(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/X62397 ？ ordinalpos = l&amp ；itool = EntrezSystem2. PEntrez. Sequence. Sequence_ResultsPanel.Sequence_ RVDocSum)得到。除了具有這些氨基酸序列的α抗原以外，也可以是含有相對于序列序號2或序列序號4的氨基酸序列使1或多個(優選數個)氨基酸殘基取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的、與該α抗原具有同樣功能的突變體蛋白質。除了堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG 來源以外的抗酸桿菌的α抗原時，也同樣地是含有相對這些氨基酸序列使1或多個(優選數個)氨基酸殘基取代、缺失和/或添加的氨基酸序列的、與該α抗原具有同樣功能的突變體蛋白質。另外，關于抗原85復合體結構蛋白85Α或抗原85復合體結構蛋白85C，也可以列舉結核分枝桿菌來源的抗原85復合體結構蛋白85Α (Infect. Immun. 57 =3213-3130, 1989)、結核分枝桿菌來源的抗原85復合體結構蛋白85C(Infect. Immun. 59 :3205-3212, 1991)等。關于這些α抗原蛋白的類似物，可以是與α抗原蛋白突變體同樣的突變體。這樣的蛋白質能夠通過使用編碼該蛋白質的基因得到重組DNA法制造，另外也能夠通過化學合成制造。或者也能夠以適當的培養基培養堪薩斯分枝桿菌、牛分枝桿菌BCG等的抗酸桿菌，從其培養液通過公知的精制法精制而得到(kand. J. Immunol. 43 202-209，1996 J.Bacteriol. 170 :3847-3854,1988 ；Hiroshima J.Med. Sci. 32 :1-8,1983 ； J. Bacteriol. 170 :3847-3854,1988)。在本發明中，作為結核疫苗，在使用編碼抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物或它們的突變體的基因時，具體而言，以含有編碼抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物或它們的突變體的基因的hPIV2的形態使用。作為rhPIV2，能夠使用使M基因、F基因或HN基因缺失的hPIV2基因組。通過在編碼M基因、F基因或HN基因缺失的hPIV2(rhPIV2)基因組中重組入編碼α抗原等的基因，構建表達α抗原等的rhPIV2載體。該表達載體通常能夠作為噴霧劑對包括人的哺乳動物給藥。噴霧劑能夠通過通常方法制備。例如，可以通過在適當的溶劑(PBS等的緩沖液、生理鹽水、穩定劑等)中溶解后， 根據需要以過濾器等過濾滅菌，接著在無菌容器中填充而制備。在噴霧劑中，可以根據需要加入常用的載體等。為了將這樣得到的表達載體作為結核疫苗使用，能夠通過噴霧劑的通常使用方法給藥。作為結核疫苗的給藥量，能夠根據對象患者的體重等變化，通常，作為表達載體，1 次使用約IXlO3 IXIOki個病毒，優選使用約IXlO4 IXlO9個病毒，優選經過數日 數周的間隔，合計給藥2 5次。以下，通過實施例具體說明本發明，但本發明不受這些實施例任何限定。實施例1 通過導入終止密碼子構建M蛋白缺失的反義rhPIV2 (Μ終止)基因組圖1中，表示在編碼M蛋白質的基因的確定位置中重組入終止密碼子的反義 rhPIV2 (Μ終止)基因組的概要。表示在Τ7啟動子的下游作為cDNA重組入Δ 119 (使M蛋白基因259位的AAG為TAG)和Δ觀9 (使M蛋白基因89位的ATG為TAG，并且使259位的 AAG 為 TAG)的 2 種 M 蛋白缺損 hPIV2(分別為 rhPIV2(A119) ^P rhPIV2 ( Δ 289))反義 rhPIV2基因組的質粒載體的情況(將它們總稱為rhPIV2(M終止))。在構建使M蛋白缺損的hPIV2(M終止)中，能夠使用本領域技術人員所公知的基因手法(例如PCR法)。實施例2 :rhPIV2 (Μ終止)的制備方法接著，說明從含有在Τ7啟動子的下游插入有反義rhPIV2基因組cDNA的質粒回收病毒顆粒的方法。在圖2中表示該方法的概要。將如圖1所示操作而構建得到的反義 rhPIV2 基因組(rhPIV2、rhPIV2(A^9)、rhPIV2(A119))轉染到表達 T7 RNA聚合酶的細胞 (例如，BSR-T7/5)中。此時，一同轉染作為表達hPIV2聚合酶單元(即，NP蛋白、P蛋白、L蛋白)載體的hPIV2-NP、hPIV2-P、hPIV2-L的3種表達載體。另外，在DNA的轉移中，能夠使用使用本領域技術人員所公知的方法(在本實施方式中使用Lipofectamine)。每48小時進行與Vero細胞的共培養5 7次，以90%以上的效率確認細胞病變效應(Cyto pathic effect :CPE)。此時，hPIV2中，在上清中可以確認大量的重組病毒顆粒，但在rhPIV2(A^9)和rhPIV2 ( Δ 119)中幾乎不能確認重組病毒顆粒。這表示如果缺損M蛋白質，則不能進行hPIV2的出芽。因此，取代Vero細胞，使用表達hPIV2_M的Cos細胞(轉染了作為表達M蛋白的載體的hPIV2-M的Cos細胞)共培養。其結果，對rhPIV2(A^9)和rhPIV2 ( Δ 119)也在上清中可以確認大量的重組病毒顆粒。上述說明了使用Τ7啟動子的rhPIV2的制備方法，但根據本發明，也能夠使用利用任意的載體制備的rhPIV2。實施例3 完全缺損M基因或F基因的反義基因組(AM/rhPIV2、AF/rhPIV2)的構建如圖3所示，在pUC118載體的ka I-Kpn I限制酶酶切位點導入含有hPIV2的基因組基因的質粒中編碼M基因、F基因和一部分HN基因的ka I-Kpn I限制酶酶切位點之間的大致5. 5kb的基因。關于M基因缺損基因組的構建，通過PCR制作包括M基因的Rl區域和R2區域的M 基因編碼區域完全缺失的AM/rhPIV〗。合成結合有缺失M基因的M基因上游區域序列和下游區域的引物，實施多重PCR，構建M基因編碼區域完全缺失的AM/rhPIV2。引物序列中，作為含有限制酶酶切位點的序列，為5' -tgaaggagat cattgagctc ttaaagggac ttg-3'(序歹丨J序號5)，作為M基因上游區域序歹丨J，為5 ‘ -tggaacgttt agttttttta ttaaatttat catgtccagc ct_3 ‘(序列序號6)，作為M基因下游區域序列，為5 ‘ -ttaataaaaa aactaaacgt tccacaataa atcaacgttc ag-3 ‘ (序列序號 7)和 5 ‘ -ggattcttaa agcttggatg gaga-3'(序列序號8)。另外，調整堿基數，使得全部堿基數為6的倍數。關于F基因缺損基因組的構建，制作完全缺失了含有F基因的Rl區域和R2區域的 F基因編碼區域1884bp的AF/rhPIV2。關于F基因缺損基因組，在F結構基因的直上區域中存在Bcll限制酶酶切序列和在HN基因中存在Kpnl限制酶酶切序列，使用該限制酶酶切序列，進行基因的完全缺損。使用的引物，使用5' -actgatcaat ctaacaaaaa aactaaacgt tctaagcacg aacccttaag gtgtcgtaac gtctcgt-3 ‘ (序列序號 9)和 5 ‘ -acttgatagg acggtaccca ttgagcctca atg-3'(序列序號 10)進行構建。實施例4 短暫性病毒的回收對短暫性表達、回收導入結核疫苗的α抗原用基因并使M基因或F基因完全缺損的AM/rhPIV2或Δ F/rhPIV2病毒的系統，通過與rhPIV2 (M終止)病毒回收方法同樣的方法或其它的方法實現病毒回收。實施例5 :M蛋白質表達細胞或F蛋白質表達細胞的構建由于使hPIV2的M蛋白質和F蛋白質單獨且持續地在細胞中表達時，認為該蛋白質具有細胞毒性，因此，在(1)持續表達該蛋白質的系統以外，構建( 誘導性表達該蛋白質的系統。(1)蛋白質持續系統的構建
使用在保持新霉素抗性基因或嘌呤霉素抗性基因病保持雞β -actin啟動子序列和兔β-globin polyA序列(CAG romoter)的載體中導入了 M或F基因序列的載體進行實施。(2)蛋白質誘導表達系統的構建由誘導表達系統得到的M蛋白質表達細胞或F蛋白質表達細胞的構建通過利用誘導表達系統用Cre重組酶除去在2個IoxP序列中存在的填充序列，使用誘導的系統(pCALN載體)實施表達。該載體能夠在Swa I限制酶酶切位點插入外來基因。Swa I限制酶酶切位點是末端平滑，在該平滑末端部位為M基因時，在M基因的上下區域中通過PCR導入產生平滑末端酶切的Riie I限制酶酶切位點，構建該M基因的誘導表達載體。關于F基因誘導表達系統，在F基因的上下領域中通過PCR導入產生Swa I平滑末端酶切的限制酶酶切位點，構建該F基因的誘導表達載體。在該F基因回收用中使用的 PCR用弓丨物序列，使用 5' -aaatttaaat atattcagcc atgcatcacc tg_3'(序列序號 11)禾口 5' -aaatttaaat cttgtgatag atttcttaag atatcc-3 ‘ (序列序號 12)。實施例6 表達細胞的構建使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)等，向Vero細胞轉染上述載體，添加新霉素培養(lmg/ml)。利用新霉素的抗藥性進行篩選。回收能夠誘導表達M基因的Vero細胞。 使該細胞感染表達Cre蛋白質的腺病毒，使M蛋白質表達。使該細胞感染由上述實施例回收的M基因缺失病毒，實現非增殖型病毒的回收。其結果，能夠實現缺失M基因的非增殖型病毒的回收。以和M蛋白質表達細胞同樣的方法或其它的方法進行F蛋白質誘導表達細胞和F 蛋白質持續表達細胞的構建。其結果，能夠獲得F蛋白質誘導表達細胞和F蛋白質持續表達細胞。使用這些細胞，能夠實現缺損F基因的非增殖型病毒的回收(圖6)。實施例7 含有編碼α抗原的基因的rhPIV2的構建在含有序列序號1所示的第390 第1244的堿基序列的堪薩斯分枝桿菌的α 抗原基因(αΚ)的5'添加TPA的信號序列，再在3'中添加hPIV2的R1、插入序列和 R2，在rhPIV2的Not I部位插入，由此構建重組入有α抗原基因的rhPIV2 (以下稱為 “rhPIV2-Ag85B”或“rhPIV2/Ag85B”)(參照圖；3)。Not I部位是緊隨rhPIV2基因組的前導序列重組入的部位，被設置在反義rhPIV2基因組的5'末端附近。另外，作為對照，在Not I部位中，構建重組入有GFP (水母由來的熒光蛋白質)基因的rhPIV2(以下稱為“rhPIV2-GFP” 或“rhPIV2/GFP”)。通過實施例2的方法，大量制備rhPIV2-Ag85B和rhPIV2_GFP。接著，對于含有序列序號3所示的第121 第975的堿基序列的牛分枝桿菌BCG的 α抗原基因(aK)BCG_Ag85B的基因，在具有序列序號3所示的第121 第975的堿基序列的DNA中添加起始密碼子(ATG)，在rhPIV2的Not I部位插入，構建重組入有BCG_Ag85B 的 rhPIV2 (以下稱為 “ Δ M/rhPIV2_Ag85B (BCG) ” 或“或 Δ F/rhPIV2_Ag85B (BCG) ”)(參照圖3)。Not I部位是緊隨rhPIV2基因組的前導序列重組入的部位，被設置在反義rhPIV2 基因組的5'末端附近。即，對于BCG的Ag85B，在序列序號4的氨基酸序列中切除信號序列部分(1 40)，在第41 第325的氨基酸(FSR……)中重組入第121 第975的堿基(ttctccc……)。實施例8 倉鼠中的GFP的表達確認對倉鼠經鼻投與(例5\105個病毒)1~迚1￥2-6 ，如圖5所示，在氣管(trachea) 和肺(lung)的上皮細胞中確認到GFP的熒光。由此可知，rhPIV2通過經鼻給藥，在氣管和肺中極高地促進外來基因的表達(圖4)。實施例9 關于使用小鼠的結核預防的效果確認將30只BALB/C小鼠分為A C 3組(10只/組)，隊各組分別施加下述處理。A組(對照組)將rhPIV2-GFP以2周間隔經鼻給藥4次。作為rhPIV2_GFP的經鼻給藥量，1次分量為ι χ IO7個病毒/20 μ L。B組(試驗組1)將表達型Ag85B_DNA經過2周腹腔內給藥2次，將 rhPIV2-Ag85B (Μ終止)以2周間隔經鼻給藥2次。作為表達型Ag85B_DNA的給藥量，為每 1只50yg。另外，作為rhPIV2-Ag85B(M終止)的經鼻給藥量，1次分量為1 X IO7個病毒 /20 μ L。C組(試驗組2)將rhPIV2_Ag85B (Μ終止)以2周間隔經鼻給藥4次。作為 rhPIV2-Ag85B (Μ終止)的經鼻給藥量，1次分量為1 X IO7個病毒/20 μ L。對各組在最終免疫1周后，使之經鼻感染強毒性的結核菌(Mycobacterium tuberculosis Kurono菌株)。在實驗開始后的第49日，摘出肺和脾臟，確認了結核結節、 病變切片的顯微鏡像和結核菌數。在圖8 圖10中表示結果。經鼻噴霧型疫苗的最大特征在于，與通過注射等進行疫苗接種相比，接種容易且安全性高。使用了 rhPIV2的結核疫苗能夠以現有的噴喉類容器進行接種，能夠進行迅速且安全的接種。特別是，考慮到醫生不足和由注射產生感染等，也可以認為對發展中國家等的疫苗接種帶來巨大的效果，世界性影響強。結核菌是在巨噬細胞等噬菌細胞中增殖的細胞內寄生性細菌。在結核菌的感染預防中，誘導活化的巨噬細胞和細胞毒性T細胞(CTL)的細胞性免疫(Thl)而不是抗體為主體的液體性免疫成為中心。Ag85B是不受基因背景影響地顯示誘導Thl類免疫反應的抗酸桿菌生物活性的單一蛋白，促進誘導在結核預防中重要的活化巨噬細胞的Y干擾素 (INF- y )的產生和T細胞向CTL的分化。因此，為了作為結核疫苗利用，制備將外來基因Ag85B作為分泌型導入的載體 (rhPIV2-Ag85B)，確認了 Ag85B的表達。其結果，如圖5所示，確認了 Ag85B作為蛋白質表達。使F表達細胞感染GFP-PIV2 ( Δ F)，如圖6所示，確認到GFP熒光，由此可知，可以進行病毒的表達和回收。另外，關于導入了 BCG-Ag85B的AF/rhPIV2-Ag85B(BCG)載體，可知BCG-Ag85B也作為蛋白質表達(圖7)。另外，可知在利用！·證1￥2(] 終止)、1~迚1￥2(八？)、1~迚1￥2(八]\0經鼻投與了 Ag85B 或 BCG_Ag85B 的小鼠中，月市中的強毒結核菌(Mycobacterium tuberculosis Kurono M 株)引起的肺結核特有的病變(結核結節)顯著地減少。其中，在圖8 圖10中表示 rhPIV2-Ag85B的結果。在圖8(A)中，確認了大量結核結節，另一方面，在圖8 (B)和圖8(C) 中，以該順序結核結節數比對照組顯著地減少。在圖9中表示結核結節的顯微鏡照片圖。在對照組(B)中，可知肺泡損壞情況，另一方面，在試驗組2(A)中，確認與通常狀態幾乎同等的情況。另外，關于rhPIV2 ( Δ F)、rhPIV2 ( Δ Μ)，也可以確認關于Ag85B和BCG_Ag85B與上述同等的效果。在圖10中表示在肺和脾臟中的結核菌數。在對照組中，分別計數得到在肺中105_°5 的菌數、在脾臟中104_°8的菌數。另一方面，在試驗組1中，分別地計數得到在肺中104 2°的菌數、在脾臟中IO3 45的菌數，在試驗組2中，分別地計數得到在肺中IO31tl的菌數、在脾臟中103_”的菌數。一般而言，在肺結核的計數試驗中，在以往的疫苗試驗中，除了 BCGjfW 確認顯著差別，在試驗組和對照組之間菌數相差10倍也是少有的。但是，在本試驗中，使用 rhPIV2-Ag85B的試驗組的結核菌數少至對照組結核菌數的1/10 1/100左右，因此，可知本實施方式的疫苗是預防效果非常高的疫苗。<關于本實施方式的結核疫苗的考察>hPIV2原型載體特異地感染氣管粘膜，具有(_)極性的非節段型單鏈RNA作為基因組，該RNA基因組中，6個堿基卷繞1個核衣殼蛋白，構成螺旋狀的核苷蛋白(RNP)。通過具有非節段型RNA作為基因組，不引起如具有節段型RNA基因組的流感病毒一樣的節段之間的突變(不連續突變)。另外，如果基因組不是6的倍數，轉錄、復制的效果顯著減少， 因此，也難以認為是由于同源性重組等產生的基因突變。在之前所示的臨床試驗階段的 MVA85A (安卡拉痘苗病毒)與AeraS402(35型腺病毒)中，母體是DNA病毒，不能避免偶然的同源重組等的危險性，但本實施方式的hPIV2載體的母體是RNA病毒，由于在細胞質內進行所有的生活循環，因此，與上述2種DNA載體不同，基因組不重組入核內染色體中。通過終止密碼子或基因的缺損而除去M基因、F基因或HN基因表達的載體，也沒有2次感染性顆粒產生的危險性，是能夠經鼻地向氣管粘膜特異地導入基因的RNP機器。 該載體原來的病原性低于上述DNA載體，也沒有人(成人)中的病原性報告，極其安全。另外，該載體涉及成為最大限度地利用來自hPIV2基因組的轉錄特征、使得基因組的外來基因表達量為最大，可以認為M基因、F基因或HN基因抑制了來自基因組的轉錄，因此，使M基因、F基因或HN基因的產物缺失的該載體的蛋白表達量極高。在倉鼠中經鼻投與了插入有 GFP (綠色熒光蛋白)的rhPIV2 (Μ終止)-GFP時，確認了 GFP的強表達(圖4)。在預防結核中，比全身免疫更重要的是在作為病態出現部位的肺的局部免疫(細胞免疫)的誘導。在本實施方式中，使用插入了細胞免疫誘導蛋白(Ag85B或BCG-Ag85B)的非增殖型rhPIV2-Ag85B載體或rhPIV2_BCG_Ag85B作為疫苗。該載體由于安全且能夠實現向肺的細胞免疫誘導蛋白的強表達，因此，可以認為作為成人結核疫苗載體是非常有效的。該疫苗載體通過接種只進行一次感染，作為不產生2次感染性顆粒的安全的弱毒性半活經鼻噴霧疫苗用被開發。作為外來抗原表達的非定型抗酸桿菌(堪薩斯分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG)來源的α抗原(Ag85B)具有細胞免疫誘導能力。通過在病態出現部位肺中使Ag85B高表達，可以認為誘導對結核菌的高細胞性免疫(Thl)。在實際中，如果使倉鼠鼻腔感染rhPIV2-GFP載體，則在氣管上皮細胞以及指導肺末端支氣管中可見作為標靶基因的GFP的強表達(圖4)。在使用小鼠的感染防御試驗(結核預防試驗)中，可以確認rhPIV2_Ag85B強大的結核預防效果(圖8 圖10)。在該試驗方案中，除了 rhPIV2-Ag85B的單獨給藥(試驗組2) 以外，研究了表達型Ag85B-DNA和rhPIV2-Ag85B的并用給藥(試驗組1)的效果。在試驗組2中，可以確認非常高預防效果，另一方面，在試驗組1中只能確認有限的效果。根據現有的報告顯示，對表達型Ag85B-DNA也可以確認預防效果，但在本次試驗結果中，可以認為表達型Ag85B-DNA的預防效果是有限的，可以認為試驗組1的預防效果多依賴于rhPIV2_Ag85B。另外，對導入BCG-Ag85B取代Ag85B的hgPIV2_BCG_Ag85B也可以得到與 rhPIV2-Ag85B同樣的預防效果。另外，如果對Ag85A、Ag85C也進行上述同樣的試驗，發揮與Ag85B同樣的結核預防效果的可能性非常高。這樣，根據本實施方式，可知通過投與在副粘病毒(特別是rhPIM)中重組入有編碼α抗原等的基因的表達載體，能夠發揮顯著的結核預防效果。
權利要求
1.一種經鼻噴霧型結核疫苗，其特征在于在使M基因、F基因或HN基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因。
2.如權利要求1所述的經鼻噴霧型結核疫苗，其特征在于所述《抗原是來自堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG的α抗原。
3.如權利要求1或2所述的經鼻噴霧型結核疫苗，其特征在于所述α抗原的類似物是抗原85復合體結構蛋白85Α或抗原85復合體結構蛋白85C。
4.一種結核的預防方法，其特征在于在使M基因、F基因或HN基因缺損的副粘病毒基因中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因，對人進行噴霧且經鼻給藥。
5.如權利要求4所述的結核的預防方法，其特征在于所述《抗原是來自堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG的α抗原。
6.如權利要求4或5所述的結核的預防方法，其特征在于所述α抗原的類似物是抗原85復合體結構蛋白85Α或抗原85復合體結構蛋白85C。
全文摘要
本發明提供對人結核、特別是對成人結核具有高預防效果的經鼻噴霧型疫苗。通過在副粘病毒基因(特別是rh-PIV2)中重組入有抗酸桿菌來源的α抗原(例如來自堪薩斯分枝桿菌或牛分枝桿菌BCG的α抗原)、其類似物、編碼具有與它們同樣的功能的它們的突變體的基因的經鼻噴霧型疫苗實現。
文檔編號A61P31/06GK102573897SQ201080037188
公開日2012年7月11日 申請日期2010年11月1日 優先權日2009年11月2日
發明者保富康宏, 河野光雄, 福村正之, 野阪哲哉 申請人:國立大學法人三重大學, 獨立行政法人醫藥基盤研究所, 生物科摩株式會社