專利名稱：在糖尿病前期和2型糖尿病中血清淀粉樣蛋白的表型比例的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過檢測血清淀粉樣蛋白A(SAA)表型比例的水平和調節來測定、診斷和/或評價糖尿病前期、2型糖尿病、胰島素抗性和其相關病癥的方法。本發明也涉及篩選調節此種比例的分子的方法，及其在治療和/或改善糖尿病前期、2型糖尿病、胰島素抗性和其相關病癥的相關癥狀中的用途。
背景技術：
2型糖尿病(也稱為2型糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病或成年發病型糖尿病)是表征為高血糖的代謝疾病。該病癥由缺乏機體產生的胰島素或機體細胞產生胰島素耐受性 (胰島素抗性)造成。由于胰島素是從血液中吸收葡萄糖的必需物質，所以胰島素內穩態的紊亂最終導致失去血糖控制和發生糖尿病病癥。如果不加以控制，過量血糖最終導致產生大量并發癥，包括但不限于失明、皮膚潰瘍、截肢、心臟病和腎臟疾病。雖然關于多種并發癥與失去血糖控制的關聯性提出了許多理論，然而尚不清楚多種途徑相互作用的機理。到2007年為止，疾病控制中心確定美國人群中7. 8% (兩千三百六十萬人)患有2 型糖尿病，估計> 20%的美國人處于糖尿病前期。由于這些病癥的衰弱特性和其相關治療成本，發現更有效和高效的早期檢測方法對美國人群和西方人群的健康狀況至關重要。評價血糖控制水平的“金標準”是口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)。這一測試包括測定個體或患者的空腹血糖，然后在口服給予葡萄糖溶液后2小時測定血糖。目前的指南限定，正常葡萄糖耐量(NGT)為2小時葡萄糖水平彡140mg/dl。2型糖尿病(DM)的標準是2小時葡萄糖彡200mg/dl，葡萄糖耐量受損(IGT或糖尿病前期)的定義是140至200mg/dl。盡管這些標準被美國糖尿病協會和世界衛生組織所批準，但這些值并非沒有臨床誤差或不需要解釋。糖尿病護理方面的最新進展包括在糖尿病和糖尿病前期診斷中采用蛋白質生物標記物血紅蛋白AlC(HbAlC)的用途指南。鑒于血紅蛋白在血液中持久，它可用作血糖控制的長期衡量物。盡管已長期用作患者的糖尿病治療是否充分的生物標記物，但以前相矛盾的數據妨礙了 HbAlC在糖尿病測定中的應用。即使接受這些新指南和其與標準的OGTT標準和空腹血糖水平聯合使用，糖尿病前期或2型糖尿病的診斷最終仍然依賴于診斷醫師的解釋和判斷。由于2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和發生相關并發癥的大流行特征，世界范圍內都需要其他檢測/診斷/評估方法，以便在盡可能早的時間介入并提供評估通過生活方式改變和/或用藥進行治療的有效性的方式。也需要其他代謝或內分泌靶點來開發能緩解或改善與這些相關病癥相關聯的問題和癥狀的治療。
發明內容
本文第一次指出，SAA表型比例的調節與應用OGTT后2小時獲得的葡萄糖值和某些代謝疾病狀態的臨床診斷相關聯。這些發現將SAA表型比例鑒定為臨床評估/診斷2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥的生物標記物。毫無疑問，在機理上SAA也可參與這些疾病狀態的發生/發展和病理，因此SAA表型比例也可用作改善和/或治療疾病癥狀或病癥的治療靶點。本發明的另一目的是使用SAA和計算SAA表型比例，作為體外和體內檢測和/或診斷2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥的新靶點和篩選方法。本發明的另一目的是在2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥的治療中使用SAA表型比例作為調節SAA的分子的新靶點和/或用于篩選旨在體外和/或體內調節其表達、活性和/或清除的分子。權利要求書中具體列出被認為是本發明特征的一些新特征。然而，無論是從其結構和其操作以及額外目的和優勢來說，通過下文與附圖聯合解讀的本發明的示范性實施方式都能更好地理解本發明本身。除非另有說明，本說明書和權利要求書中使用的術語和短語應具有本領域普通技術人員所理解的普通和慣常涵義。如果想要表示任何其他涵義，說明書中會具體說明將該具體涵義賦予所述術語或短語。同樣，在優選實施方式的描述中使用術語“功能”或“手段”并不說明想要援引美國專利法條款112(35U. S. C. §112)第6款的特別規定來定義本發明。相反，如果想要援引美國專利法條款112第6款的規定來定義本發明，權利要求書會具體指明術語“用于...的手段”或“用于...的步驟”和功能，而在這種術語中不再說明任何支持該功能的結構、材料或動作。即使當權利要求引述進行某功能的“手段”或“步驟”，如果還引述支持該手段或步驟的任何結構、材料或動作，那么本發明也不援引美國專利法條款112第6款的規定。而且，即使本發明援引美國專利法條款112 第6款的規定進行限定，本發明也不應僅限于優選實施方式所述的特定結構、材料或動作， 此外，還包括能進行權利要求所述功能的所有結構、材料或動作，以及任何已知或將來開發的進行權利要求所述功能的等同結構、材料或動作。附圖簡要說明參照以下詳述和附圖能夠更好地理解本發明的目的和特征。
圖1是利用質譜免疫試驗分析人血漿樣品的SAA和SAA表型比例的質譜結果。圖2是從圖1所示和分析的葡萄糖耐量正常(NGT)患者和葡萄糖耐量受損(IGT， 糖尿病前期)患者的人血漿樣品觀察到的SAA表型比例的點狀圖。圖3是從圖1所示和分析的葡萄糖耐量正常(NGT)患者和2型糖尿病(DM)患者的人血漿樣品觀察到的SAA表型比例的點狀圖。圖4顯示從圖1所示和分析的每個樣品群，即葡萄糖耐量正常(NGT)患者的人血漿樣品、葡萄糖耐量受損(IGT，糖尿病前期)患者的人血漿樣品和2型糖尿病(DM)患者的人血漿樣品獲得的SAA質譜表型比例數據建立的ROC曲線。發明詳述本發明第一次證明，SAA表型比例與糖尿病前期和2型糖尿病疾病狀態的臨床診斷相關聯。也第一次證明SAA表型比例的調節與OGTT結果相當。觀察到的這一現象直接顯示這種新標記物的實用性，因為它涉及2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和/或其相關病癥或并發癥。本發明包括SAA表型比例作為體外和/或體內測定/診斷/評估2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和/或其相關病癥或并發癥的生物標記物的應用。此外，本發明包括SAA表型比例作為體外和/或體內篩選化合物的標記物的應用，旨在通過改變SAA的表達、修飾、活性和/或清除來調節此種比例，用于治療或減輕與糖尿病前期、2型糖尿病、胰島素抗性和/或其相關病癥或并發癥相關的癥狀。本發明也包括測定SAA形式的方法以計算來自生物樣品的SAA表型比例，從而測定/診斷/評估2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和/或其相關病癥或并發癥。本發明也延伸了這些測定SAA表型比例的方法以篩選化合物，旨在通過改變SAA 的表達、活性和/或清除來調節此種比例，用于治療或減輕與糖尿病前期、2型糖尿病、胰島素抗性和/或其相關病癥或并發癥相關的癥狀。定義除非另有說明，本文所用的所有科技術語均具有本發明所屬領域的技術人員所通常理解的含義。除非另有說明，本文所用的以下術語具有屬于它們自身的涵義。本文所用的“SAA”是描述血清淀粉樣蛋白A急性期蛋白家族的總術語。SAA有兩種同種型，它們由基因SAAl和SAA2表達，各自具有多個等位基因變體。它們總稱為SAA。 SAA用作載脂蛋白，在肝細胞和脂肪細胞中表達。本文所用的“母體SAA”指樣品中觀察到的SAA的最常見的完整內源性形式。它通常是SAAl (MW= 11, 68 ，但也可包括等位基因變體或點突變形式。本文所用的“SAA-Arg”指缺失N末端精氨酸殘基的SAA的特定截短變體。本文所用的“分析”指確定生物樣品的SAA表型比例。本文所用的“SAA表型比例”指通過給定生物樣品的母體SAA測定量除以SAA-Arg 測定量計算的商。本文所用的“生物樣品”指具有多個組分的液體或提取物。復雜培養基可包括但不限于組織、細胞提取物、核提取物、細胞裂解液和排泄物、血液、血清、血漿、唾液、尿液、 痰液、滑膜液、腦脊液、淚液、糞便、唾液、膜提取物、工業液體等。本文所用的“2型糖尿病(DM)”是根據血液中葡萄糖過量確定的臨床病癥。輔助臨床評定的參比限是空腹葡萄糖值> 126mg/dl和/或2小時口服葡萄糖耐量測試值彡 200mg/dl。本文所用的“糖尿病前期、葡萄糖耐量受損(IGT) ”是根據血液存在的葡萄糖超出正常量所確定的臨床病癥。輔助臨床評定的參比限是空腹葡萄糖值為110-125mg/dl和/ 或2小時口服葡萄糖耐量測試值為140-199mg/dl。本文所用的“葡萄糖耐量正常(NGT) ”是血糖水平在正常濃度范圍內的臨床測定。 輔助臨床評定的參比限是空腹葡萄糖值< 110mg/dl和/或2小時口服葡萄糖耐量測試值 < 140mg/dl。本文所用的“胰島素抗性”是激素胰島素降低血糖水平的有效性降低的身體狀況。 評價胰島素抗性的金標準是使用高胰島素-正葡萄糖鉗夾。本文所用的“相關病癥或并發癥”定義為通常與2型糖尿病的發生和進展有關的各種疾病。這些疾病包括但不限于心臟病發作、皮膚潰瘍、失明、截肢和腎衰竭。本文所用的“質譜”指使分析物揮發/電離形成氣相離子并確定其絕對或相對分子量的能力。合適的揮發/電離形式是激光/光、熱、電、霧化/噴霧等或其組合。合適的質譜形式包括但不限于基質輔助激光解吸/飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)、電噴霧(或納米噴霧)電離(ESI)質譜等或其組合。
本文所用的“對象”指由其獲得的生物樣品中含有可測量水平的SAA和/或SAA變體的任何人、動物或其他活的有機體。在本發明中，確立SAA表型比例的方法用生物樣品(生物基質)進行。可能的生物基質包括但不限于組織、全血、血清、血漿、唾液、腦脊液或尿液。樣品可以是游離或者固定于固體支持物。固體支持物的例子包括但不限于濾紙、珠、陣列等。可使用本領域已知的用于固定樣品的任何固體支持材料。樣品可以是天然形式，或者經過處理，這些處理包括但不限于變性、還原、蛋白水解消化等。為了測定SAA表型比例，本發明可利用分離或純化步驟以首先分離或去除生物樣品中的SAA。所述分離可通過多種方式進行，包括但不限于層析、離心、親和相互作用、化學方法、染色方法和凝膠電泳。層析技術可包括但不限于高效液相層析(HPLC)、薄層層析 (TLC)、紙層析(PC)、親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、反相層析等。親和相互作用利用了某分子結合具有適當相稱構象的另一分子的能力。所用的親和方法可包括但不限于 利用抗體(Ab)、抗體片段(FAb)、適體、蛋白質、肽、凝集素等的親和相互作用。在夾心實驗中，可采用第一和第二親和配體的組合。凝膠電泳方法可包括但不限于丙烯酰胺、瓊脂糖等。化學方法可包括但不限于氨基酸分析、測序等。染色方法可包括但不限于利用直接結合于SAA蛋白和其變體或者與SAA和其變體相結合分子的任何染料等。用于計算SAA表型比例的檢測SAA形式的方法利用某些檢測技術形式檢測分離蛋白(即分離的SAA和/或SAA變體)。檢測方法的性質可以是直接或間接。檢測技術包括但不限于染色、波譜學、波譜測定法、光譜測定法、比色法、熒光法、發光法、磁力、放射性同位素、核磁共振波譜法、χ-射線晶體學，表面等離振子共振、質譜法等。根據生物樣品的狀態，測定和用于計算SAA表型比例的SAA的檢測形式可以是完整形式或其片段。分析證明生物標記物的實用性
實施例分析人血漿的血清淀粉樣蛋白A的表型比例本發明的一個示范性實施方式是測定SAA表型比例，用作生物標記物來區分臨床上確定的樣品群。利用質譜免疫試驗(MSIA)技術分析這一示范性實施方式。在該實施例中，對從新診斷為并且臨床上確定為NGT、IGT或DM的患者獲得的人檸檬酸血漿樣品進行分析。從NGT個體獲得237個血漿樣品，從IGT患者獲得98個血漿樣品，從DM患者獲得25個血漿樣品，均以相同方式分析。用親和移液器吸頭進行MSIA。親和移液器吸頭由裝在移液器吸頭入口處的小、 多孔性微柱構成。所述微柱用親和配體衍生化。用于衍生親和移液器吸頭的親和配體是抗-SAA抗體。樣品制備包括加入內標( ，用于半定量地測定母體SAA和SAA-Arg。各樣品混合物由10 μ L人血漿、20 μ L十倍稀釋的馬血清(馬SAA是^S)和170 μ L HEPES緩沖鹽水構成。通過親和移液器重復吹打樣品，用抗-SAA親和移液器吸頭進行試驗，以便從樣品中提取SAA。在SAA親和回收后，純化過程使用HEPES緩沖鹽水和水沖洗。然后，用芥子酸MALDI基質從親和移液器中洗脫富集和純化的蛋白質，并直接沉積到MALDI質譜靶標上進行后續質譜檢測。檢測所得質譜顯示人血漿中存在的多種SAA形式以及IRS的信號。用IRS獲得的SAA信號的積分歸一化各個譜圖。在各質譜內，多種SAA形式可清晰分辨，但主要是母體SAA和SAA-Arg，如圖1所示。圖1也說明葡萄糖耐量正常(NGT)患者、葡萄糖耐量受損患者(IGT)和2型糖尿病患者(DM)的人血漿樣品中，SAA表型比例不同。獲得母體SAA和 SAA-Arg信號的積分，并計算SAA表型比例。得到母體SAA的積分并除以SAA-Arg的積分， 獲得SAA表型比例。IGT和DM譜圖中，SAA-Arg與母體SAA的比例明顯傾斜。所得的質譜數據顯示出區分來自NGT患者和IGT/DM患者的樣品的能力。圖2是由NGT患者和IGT患者的樣品觀察到的SAA表型比例的點狀圖。采用SAA表型比例作為 IGT的生物標記物，IGT測定中的截止值為1.3760。圖2還指出每個群體的平均值和標準差。圖3是由NGT患者和DM患者的樣品觀察到的SAA表型比例的點狀圖。采用SAA表型比例作為DM的生物標記物，DM測定中的截止值為1. 4780。圖3還指出每個群體的平均值和標準差。還測定了 SAA表型比例在臨床上的靈敏度和特異性。這些值列于下表1。
權利要求
1.在一個或多個對象中測定、診斷或監測2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥中至少一種的方法，所述方法包括分析SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的步驟。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的步驟包括分析母體SAA和SAA-Arg中至少一種的步驟。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的步驟包括進行質譜、層析、親和反應、凝膠電泳、離心、化學方法和染色方法中至少一種的步驟。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的步驟包括進行單一試驗的步驟。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法還包括進行一次質譜分析的步驟。
6.一種在對象中診斷糖尿病前期的方法，所述方法包括以下步驟檢測來自該對象的生物樣品中SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的水平，當所述SAA、SAA變體和SAA 表型比例中至少一種的水平受到調節，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的水平相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為糖尿病前期。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述診斷所述對象為糖尿病前期的步驟包括步驟當所述SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的水平提高，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的水平相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為糖尿病前期。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述檢測SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的水平的步驟包括檢測母體SAA和SAA-Arg的步驟，并且所述診斷所述對象為糖尿病前期的步驟包括步驟當SAA表型比例受到調節，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的SAA表型比例相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為糖尿病前期。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述診斷所述對象為糖尿病前期的步驟包括步驟當所述SAA表型比例提高，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的SAA表型比例相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為糖尿病前期。
10.一種在對象中診斷2型糖尿病的方法，所述方法包括以下步驟檢測來自該對象的生物樣品中SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的水平，當所述SAA、SAA變體和SAA 表型比例中至少一種的水平受到調節，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的水平相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為2型糖尿病。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述診斷所述對象為2型糖尿病的步驟包括步驟當所述SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的水平提高，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的水平相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為2型糖尿病。
12.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述檢測SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的水平的步驟包括檢測母體SAA和SAA-Arg的步驟，并且所述診斷所述對象為 2型糖尿病的步驟包括步驟當SAA表型比例受到調節，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的SAA表型比例相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為2型糖尿病。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述診斷所述對象為2型糖尿病的步驟包括步驟當所述SAA表型比例提高，與一個或多個葡萄糖耐量正常對象的SAA表型比例相比有統計學顯著性差異，則診斷所述對象為2型糖尿病。
14.一種在一個或多個對象中評估2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥中至少一種的治療性處理的方法，所述方法包括監測來自所述一個或多個對象的生物樣品中SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的步驟。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述監測SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的步驟包括監測母體SAA和SAA-Arg中至少一種的步驟。
16.一種鑒定2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥中至少一種的治療性處理的方法，所述方法包括確定該治療性處理可否在對象中調節SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的活性或濃度的步驟。
17.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述確定該治療性處理可否調節SAA、 SAA變體和SAA表型比例中至少一種的活性或濃度的步驟包括測定該治療性處理可否調節 SAA、SAA變體和SAA表型比例中至少一種的活性和濃度的步驟。
全文摘要
本發明涉及通過檢測血清淀粉樣蛋白A(SAA)、SAA變體和/或SAA表型比例的水平和調節來診斷、測定和/或監測2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥。本發明也涉及通過監測SAA、SAA變體和/或SAA表型比例鑒定和評估2型糖尿病、糖尿病前期、胰島素抗性和其相關病癥的治療性處理的方法。
文檔編號A61K35/16GK102481320SQ201080037071
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月2日 優先權日2009年7月7日
發明者D·內代利科維, U·A·基爾南 申請人:英特琳斯克拜奧普洛博思有限公司