通過抑制針對對氧磷酶1(pon1)的天然反義轉錄物來治療pon1相關的疾病的制作方法

專利名稱：通過抑制針對對氧磷酶1(pon1)的天然反義轉錄物來治療pon1相關的疾病的制作方法
技術領域：
本申請要求保護提交于2009年6月16日的美國臨時專利申請第61/187，311號的優先權，所述申請通過引用以其整體結合于本文中。本發明的實施方案包括調節PONl和相關分子的表達和/或功能的寡核苷酸。
背景技術：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面(包括DNA復制、轉錄和翻譯) 而言為重要的。雜交對于探測特定核酸或者改變其表達的各種技術而言亦為主要的。反義核苷酸例如通過與靶RNA雜交來擾亂基因表達，從而干擾RNA剪接、轉錄、翻譯和復制。 反義DNA具有附加的特征，該特征為DNA-RNA雜合體充當核糖核酸酶H消化的底物，該活性存在于大多數細胞類型中。可將反義分子遞送到細胞中，這與寡脫氧核苷酸(ODN)的情況一樣，或者它們如RNA分子一樣可由內源基因表達。FDA最近批準了一種反義藥物, VITRAVENETM(用于治療巨細胞病毒視網膜炎)，這反映了反義物具有治療應用。發明概述提供本概述以呈現本發明的概述，從而簡要地指出本發明的性質和實質。在理解以下的情況下提出本概述其不會用于解釋或限制權利要求的范圍或含義。在一個實施方案中，本發明提供通過使用靶定天然反義轉錄物的任何區域的反義寡核苷酸來抑制天然反義轉錄物的作用，引起相應有義基因的增量調節的方法。本文也考慮天然反義轉錄物的抑制可通過siRNA、核酶和小分子來達到，認為所述siRNA、核酶和小分子在本發明的范圍之內。—個實施方案提供在體內或體外調節患者細胞或組織中的PONl多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%的序列同一性， 所述多核苷酸包含在SEQ ID NO 2的核苷酸1-534之內的5_30個連續核苷酸；從而在體內或體外調節患者細胞或組織中PONl多核苷酸的功能和/或表達。在另一個優選的實施方案中，寡核苷酸靶定PONl多核苷酸的天然反義序列，例如 SEQ ID NO :2所述的核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :3-7所述。另一個實施方案提供在體內或體外調節患者細胞或組織中PONl多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與PONl多核苷酸的反義物的反向互補序列具有至少50%的序列同一'丨生；從而在體內或體外調節患者細胞或組織中PONl多核苷酸的功能和/或表達。另一個實施方案提供在體內或體外調節患者細胞或組織中PONl多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與PONl反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一'丨生；從而在體內或體外調節患者細胞或組織中PONl多核苷酸的功能和/或表達。
在優選的實施方案中，組合物包含一種或多種與有義和/或反義PONl多核苷酸結合的反義寡核苷酸。在另一個優選的實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經修飾或取代的核苷酸。在另一個優選的實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經修飾的鍵。在又一個實施方案中，所述修飾核苷酸包含經修飾的堿基，其包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -O-甲基、氟-或碳、亞甲基或其他鎖定核酸(LNA)分子。優選地，所述修飾核苷酸為鎖定核酸分子，包括a -L-LNA。在另一個優選的實施方案中，將所述寡核苷酸經皮下、肌內、靜脈內或腹膜內施用給患者。在另一個優選的實施方案中，將所述寡核苷酸在藥物組合物中施用。治療方案包括至少一次給患者施用反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時間內包含多個劑量。 所述治療可與一種或多種其它類型的療法組合。在另一個優選的實施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質體中或附著于載體分子 (例如膽固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附圖
簡述圖I為實時PCR結果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理!fepG2細胞后PONl mRNA的倍數變化+標準偏差,所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000 引入。實時PCR結果顯示，!fepG2細胞中PONl mRNA的水平在用針對PONl反義物Hs. 611732 設計的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加。表示為⑶R-0709、⑶R-0711、⑶R-0710、 CUR-0707和CUR-0708的條分別對應于用SEQ ID NO :3_7處理的樣品。序列表描述SEQ ID NO :1:人類(Homo sapiens)對氧磷酶 I (PONl)，mRNA。(NCBI 檢索號 NM_000446)SEQ ID NO 2 :天然 PONl 反義序列(Hs. 611732)。SEQ ID NO :3_7 :反義寡核苷酸。*指硫代磷酸酯鍵。發明詳述參考用于說明的示例應用在下文中描述本發明的數個方面。應當理解的是，陳述許多具體細節、關系和方法來提供對本發明的充分理解。然而，在相關領域的普通技術人員將容易地認識到，可在不含一個或多個具體細節的情況下實施本發明或者可用其他方法來實施本發明。本發明不受行為或事件的排序限制，因為一些行為可以不同的順序進行和/ 或與其他行為或事件同時進行。此外，并非所有說明性的行為或事件對實施本發明的方法都為必需的。意圖本文公開的所有基因、基因名稱和基因產物對應于來自任何物種的同源物， 對該物種而言本文公開的組合物和方法為適用的。因此，該術語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產物。理解的是，當公開來自具體物種的基因或基因產物時，意圖此公開僅為示例性的，并且除非其出現的文段中明確指示，否則不應理解為限制。因此，例如，對于本文公開的在一些實施方案中有關哺乳動物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來自其他動物(包括但不限于其他哺乳動物、魚類、兩棲動物、爬行動物和鳥類)的同源和/或直向同源基因和基因產物。在優選的實施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用的術語僅以描述具體的實施方案為目的而不意圖限制本發明。除非文段另有明確指示，否則也意圖本文所用的單數形式“一”、“一個”和“所述”包括復數形式。此外，就術語“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其變型在詳述和/或權利要求中所用的程度而言，意圖這類術語以類似于術語“包含”的方式為包括在內的。術語“約”或“大約”意為在由本領域普通技術人員所確定的具體值的可接受誤差范圍之內，這部分取決于該值是如何測定或確定的，即，測量系統的限制。例如，按照本領域的實踐，“約”可意為在I個或大于I個標準偏差之內。或者，“約”可意為高達給定值的 20 %，優選10 %，更優選5 %，和還更優選I %的范圍。或者，具體地關于生物系統或過程，該術語可意為在值的數量級之內，優選在值的5倍之內，更優選在2倍之內。當本申請和權利要求描述具體值時，除非另作說明，否則應假設術語“約”意為在具體值的可接受誤差范圍之內。本文所用的術語“mRNA”意為目前已知的靶定基因的mRNA轉錄物，以及任何可闡明的其它轉錄物。“反義寡核苷酸”或“反義化合物”意為與另一個RNA或DNA (靶RNA、DNA)結合的 RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過RNA-RNA相互作用結合另一個RNA 靶標并改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可增量調節或減量調節特定多核苷酸的表達和/ 或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點來看有用的任何外源RNA或DNA分子。 這類分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、 酶促RNA、治療用編輯RNA (therapeutic editing RNA)以及激動劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物(alternate splicer)、 引物、探針以及其他與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，可將這些化合物以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環狀寡聚化合物的形式引入。在本發明的文段中，術語“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚物或聚合物。術語“寡核苷酸”，也包括天然和/或經修飾單體或鍵 (linkage)的線性或環狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和異頭物形式、 肽核酸(PM)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體與單體相互作用的規律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對、Ho0gsteen或反 Hodgsteen型堿基配對等)特異地結合靶多核苷酸。寡核苷酸可為“嵌合的”，即，由不同的區組成。在本發明的文段中，“嵌合的”化合物為寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學區，例如，DNA區、RNA區、PNA區等。每個化學區由至少一個單體單元(即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸典型地包含至少一個區，其中所述寡核苷酸為經修飾的以表現出一種或多種所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增強的對核酸酶降解的抗性、增強的細胞攝取和/或增強的對靶核酸的結合親和力。因此寡核苷酸的不同區可具有不同的特性。本發明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結構。
寡核苷酸可由可“全符合狀態(in “register”)”地連接或通過間隔物連接的區組成，所述“全符合狀態”地連接即此時單體像在天然DNA —樣連續地連接。所述間隔物意在構成區之間的共價“橋”，并在優選的情況下具有不超過約100個碳原子的長度。所述間隔物可攜帶不同的功能性，例如具有正或負電荷、具有特殊的核酸結合特性(嵌入劑、溝結合劑、毒素、熒光團等)、為親脂的、誘導特殊的二級結構如例如誘導α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“Ρ0Ν1”和“對氧磷酶I”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、 種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用的措詞‘對氧磷酶I’、PONl、A-酯酶I、芳族酯酶I、ESA、K-45、MVCD5、 PON、P0N-1、血清芳基二烷基磷酸酶I、血清對氧磷酶/芳基酯酶I，在本申請中可交換地使用。本文所用的術語“對......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩定的復合體，或(ii) 能夠與祀定基因的mRNA轉錄物的一部分形成穩定的雙鏈體。復合體和雙鏈體的穩定性可通過理論計算和/或體外測定來確定。用于確定雜交復合體和雙鏈體的穩定性的示例性測定法描述于下文實施例中。本文所用的術語“靶核酸”包括DNA、從這類DNA轉錄的RNA (包括前mRNA和mRNA) 以及從這類RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。這種通過特異地與靶核酸雜交的化合物對該靶核酸功能的調節，一般稱為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復制和轉錄。待干擾的 RNA功能,包括所有的生活機能,例如,RNA向蛋白質翻譯位點的易位、蛋白質自RNA的翻譯、 產生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。對靶核酸功能的這類干擾的整體效果為對編碼產物或寡核苷酸表達的調節。RNA干擾“RNAi”由雙鏈RNA(dsRNA)分子介導，該分子具有與其“靶”核酸序列的序列特異性同源性。在本發明的某些實施方案中，介體為5-25個核苷酸的“小干擾”RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA通過稱為切酶的RNA酶對dsRNA的加工得到。siRNA雙鏈體產物募集到叫做RISC(RNA誘導的沉默復合體)的多蛋白siRNA復合體中。不希望受任何具體理論所約束，認為隨后RISC被引向靶核酸(適當地為mRNA)，在此處siRNA雙鏈體以序列特異性的方式相互作用來介導催化方式的切割。可依照本發明使用的小干擾RNA，可根據本領域眾所周知和普通技術人員熟悉的程序來合成和使用。用于本發明的方法中的小干擾RNA適當地包含約I-約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實例中，siRNA可包含約5-約 40nt、約5-約30nt、約10-約30nt、約15-約25nt、或約20-25個核苷酸。適當寡核苷酸的挑選通過使用電腦程序來促進，該程序自動比對核酸序列并指出具有同一性或同源性的區。將這類程序用于比較例如通過搜索諸如GenBank等數據庫或通過測序PCR產物而獲得的核酸序列。對來自一系列物種的核酸序列的比較，允許選擇在物種之間顯示適度同一性的核酸序列。在未測序基因的情況下，進行DNA印跡來確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。如本領域眾所周知的，通過在不同的嚴格程度下進行DNA印跡，可能獲得同一性的近似衡量。這些程序允許選擇以下寡核苷酸，其對待控制的受試者中的靶核酸序列表現出高度的互補性，并且對其他物種中的相應核酸序列表現出較低程度的互補性。本領域的技術人員將認識到，在挑選用于本發明的適當的基因區方面具有相當大的自由。“酶促 RNA，，意為具有酶活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260,3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先結合靶RNA來起作用。這類結合通過酶促核酸的靶結合部分進行，所述靶結合部分保持緊密靠近進行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先識別而后通過堿基配對結合靶RNA，且一旦結合到正確的位點，即進行酶促切割靶RNA。“誘餌RNA”意為模擬配體的天然結合域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結合靶標競爭結合特異性配體。例如，已顯示HIV反式激活應答(TAR)RNA的過表達可充當“誘餌” 并有效地結合HIV tat蛋白，從而阻止其結合到在HIV RNA中編碼的TAR序列。這意指特定的實例。本領域人員將認識到，這只是一個實例，而其他的實施方案可使用本領域一般已知的技術容易地產生。本文所用的術語“單體”通常指以下單體，其通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小范圍從少量單體單元(例如從約3-4)到約數百個單體單元的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。術語“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本領域的技術人員應清楚的是，先前認為“非天然存在”的多種核苷酸后來已在自然中發現。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環的分子，而且還包括其雜環類似物和互變異構體。其他類型的核苷酸的說明性實例為以下分子，其含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-橋亞乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基_4_三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷，和在Benner等美國專利第5，432，272號中描述的“非天然存在的”核苷酸。術語“核苷酸”意在涵蓋這些實例以及其類似物和互變異構體中的每一個和全部。尤其令人關注的核苷酸為含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被認為是有關人中的治療和診斷應用的天然存在核苷酸。核苷酸包含天然2，-脫氧和2，-輕基糖，例如，如Kornberg和Baker, DNA復制(DNA Replication)， 第2版(Freeman, San Francisco, 1992)中所述的以及其類似物。提及核苷酸的“類似物”包括具有經修飾的堿基部分和/或經修飾的糖部分的合成核苷酸(參見例如，由Scheit,核苷酸類似物(Nucleotide Analogs), John Wiley, New York, 1980 ；Freier 和 Altmann, (1997)Nucl. Acid. Res.，25(22)，4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnologyl9 :17-18 ；Manoharan M. , (1999)Biochemica et Biophysica Actal489 :117-139 ;Freier S. M. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443, UhIman, E. , (2000)Drug Discovery&Development, 3 :203-213, Herdewin P., (2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310 —般描述的)；2，-0，3，-C-連接的[3.2.0] 二環阿糖核苷。這類類似物包括設計以增強結合特性的合成核苷酸，所述結合特性為例如雙鏈體或三鏈體穩定性、特異性等。本文所用的“雜交”意為寡聚化合物的基本上互補鏈的配對。一種配對的機理涉及寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可為沃森-克里克、Ho0gsteen或反Ho0gsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為互補的核苷酸，其通過形成氫鍵配對。雜交可在各種環境下進行。反義化合物為“可特異地雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結合干擾靶核酸的正常功能而導致功能和/或活性的調節，并且在需要特異性結合的條件下存在足夠程度的互補性來避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結合，所述條件即在體內測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況中進行測定的條件下。本文所用的短語“嚴格雜交條件”或“嚴格條件”是指以下條件，在該條件下本發明的化合物與其靶序列雜交，但與最少數量的其他序列雜交。嚴格條件為序列依賴的且在不同環境下將不同，在本發明的文段中，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴格條件”由寡聚化合物的性質和組成以及正在其中研究它們的試驗來確定。一般而言，嚴格雜交條件包括低濃度(< O. 15M)的含有諸如Na++或K++等無機陽離子的鹽(即，低離子強度)、溫度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列復合體的Tm，以及存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，雜交率對于每I %甲酰胺減少I. I %。高嚴格雜交條件的實例為O. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v) SDS、60°C下達30分鐘。本文所用的“互補的”是指在一條或兩條寡聚鏈上兩個核苷酸之間精確配對的能力。例如，如果在反義化合物的某個位置上的核堿基能夠與在靶核酸的某個位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認為所述寡核苷酸和所述靶核酸之間氫鍵合的位置為互補位置。當可彼此氫鍵合的核苷酸占據了每個分子中足夠數量的互補位置時，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子為彼此互補的。因此，“可特異性雜交的”和“互補的”為以下術語，其用于表示在足夠數量的核苷酸上有足夠程度的精確配對或互補性，使得穩定和特異的結合發生在寡聚化合物和靶核酸之間。據本領域了解，寡聚化合物的序列不需要與其可特異雜交的靶核酸的序列100% 互補。此外，寡核苷酸可在一個或多個區段上雜交，使得間插或鄰近的區段不涉及雜交事件(例如，環結構、錯配或發夾結構)。本發明的寡聚化合物包含與其靶定的靶核酸序列內的靶區至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%的序列互補性。例如，其中反義化合物的20個核苷酸中有18個與靶區互補且因而會特異地雜交的反義化合物，表示90%互補性。在此實例中，余下的非互補核苷酸可與互補核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此鄰接或鄰接互補核苷酸。因此，長度為18個核苷酸的反義化合物具有4 (四)個非互補核苷酸，該非互補核苷酸位于與靶核酸完全互補的兩個區的側翼，所述反義化合物會具有與靶核酸77. 8%的總互補性，因此落入本發明的范圍內。反義化合物與靶核酸區的互補性百分比可使用本領域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序常規地確定。同源性、序列同一性或互補性百分比可通過例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系統版本8, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison ffis.)使用默認設置來確定，該程序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. AppI. Math.，(1981) 2,482-489)。本文所用的術語“解鏈溫度(Tm) ”是指以下溫度，在限定的離子強度、pH和核酸濃度下，在該溫度下平衡時50%與靶序列互補的寡核苷酸與靶序列雜交。典型地，嚴格條件為以下條件，其中鹽濃度至少為約O. 01-1. OM Na離子濃度(或其他鹽)，pH 7. 0-8. 3且溫度對于短寡核苷酸(例如，10-50個核苷酸)而言至少為約30°C。嚴格條件也可通過外加諸如甲酰胺等去穩定劑來達到。本文所用的“調節”意為在基因表達方面的增加(刺激)或減少(抑制)。術語“變體”，當用于多核苷酸序列的文段中時，可包括有關野生型基因的多核苷酸序列。此定義也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態的”變體。剪接變體可具有與參比分子顯著的同一性，但因為在mRNA加工期間外顯子的可變剪接而一般具有更多或更少數量的多核苷酸。對應的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物種變體為在不同物種之間不同的多核苷酸序列。本發明中尤其實用的是野生型基因產物的變體。變體可由核酸序列中的至少一個突變產生并可導致產生改變的mRNA或者其結構或功能可能改變或不變的多肽。任何給定的天然或重組基因可不具有、具有一個或許多等位基因形式。 產生變體的常見突變變化一般歸因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些變化類型中的每一個可單獨或與其他類型聯合發生，在給定序列中發生一次或多次。產生的多肽一般將具有相對于彼此的顯著的氨基酸同一性。多態變體為在給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態變體也可包括“單核苷酸多態性”(SNP)或單堿基突變，其中多核苷酸序列因一個堿基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病狀態傾向(即與抗性相對的易感性)的某個群體。衍生多核苷酸包括經過化學修飾的核酸，例如用烷基、酰基或氨基置換氫。衍生物 (例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這些中示例性的是硫代磷酸酯及本領域已知的其他含硫的種類。衍生核酸也可含有標記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學發光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。“衍生的”多肽或肽為經修飾的多肽或肽，例如，通過糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸鹽化作用、還原/烷基化、酰化、化學偶聯或溫性福爾馬林處理。也可將衍生物修飾以含有可檢測標記(直接地或間接地)，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標記。本文所用的術語“動物”或“患者”意在包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、紹、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蜘蛛類。“哺乳動物”涵蓋通常在醫療護理下的溫血哺乳動物(例如，人和馴養動物)。實例包括貓科動物、犬、馬、牛科動物和人，以及僅僅人。“處理”或“治療”涵蓋對哺乳動物中疾病狀態的治療，并包括(a)防止疾病狀態出現于哺乳動物中，特別是當這類哺乳動物傾向于疾病狀態但尚未診斷為患有該疾病狀態時；(b)抑制疾病狀態，例如，阻止其發展；和/或(C)減輕疾病狀態，例如，引起疾病狀態的退行直到達到所需的終末點。治療也包括改善疾病的癥狀(例如，減少疼痛或不適)，其中這類改善可直接或可非直接地影響疾病(例如，原因、傳遞、表達等)。本文所用的“癌癥”是指在哺乳動物中發現的所有類型的癌癥或新生物或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥自身表現為包含癌癥惡性細胞的“腫瘤”或組織。腫瘤的實例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing, s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、 上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤和視網膜母細胞瘤。可通過依照本發明的公開組合物治療的其它癌癥，包括但不限于，例如，何杰金病(Hodgkin' s Disease)、非何杰金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、成神經細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多癥、原發性巨球蛋白血癥、小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰腺胰島素瘤(insulanoma)、惡性類癌、膀胱癌、惡化前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、 甲狀腺癌、成神經細胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌、惡性高鈣血癥、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌和前列腺癌。“神經疾病或病癥”是指神經系統和/或視覺系統的任何疾病或病癥。“神經疾病或病癥”包括涉及中樞神經系統(腦、腦干和小腦)、周圍神經系統(包括腦神經)和自主神經系統(其部分位于中樞和周圍神經系統_■者中)的疾病或病癥。神經病癥的實例包括但不限于，頭痛、木僵和昏迷、癡呆、發作、睡眠障礙、創傷、感染、新生物、神經眼科學、運動障礙、脫髓鞘病、脊髓病癥、以及周圍神經、肌肉和神經肌肉接點的病癥。成癮和精神病也包含在神經病癥的定義中，包括但不限于，雙相性精神障礙和精神分裂癥。以下為可使用依照本發明的組合物和方法治療的數種神經病癥、癥狀、體征和綜合征的清單獲得性癲癇樣失語癥；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質營養不良；年齡相關性黃斑變性；胼胝體發育不全；失認癥；艾卡迪綜合征；亞歷山大病；阿爾拍斯病(Alpers’ disease);交叉性偏癱；血管性癡呆；肌萎縮側索硬化；無腦畸形；Angelma綜合征；血管瘤病；缺氧；失語癥；失用癥；蛛網膜囊腫；蛛網膜炎；阿-基氏腦畸形(Anronl-Chiari malformation);動靜脈畸形；阿斯佩各綜合征；共濟失調毛細血管擴張癥(ataxia telegiectasia);注意不集中的過度反應癥；孤獨癥；自主神經功能障礙；背痛；巴滕病；貝切特病；貝爾氏麻痹；良性自發性瞼痙攣；良性灶；肌萎縮；良性顱內高血壓；賓斯旺格病；瞼痙攣；Bloch Sulzberger 綜合征；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性成膠質細胞瘤)；脊髓腫瘤；布朗-塞卡爾綜合征；卡納萬病；腕管綜合征；灼痛；中樞性疼痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解； 頭部病癥(cephalic disorder);腦動脈瘤；腦動脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓；夏-馬-圖病；化學療法誘導的神經病和神經性疼痛；Chiari畸形；舞蹈癥；慢性炎性脫髓鞘性多神經病；慢性痛；慢性區域性疼痛綜合征；科-勒綜合征；昏迷，包括持續性植物狀態；先天性面癱；皮質基底節變性；顱動脈炎；顱縫早閉；克雅病；累積性創傷障礙 (cumulative trauma disorder);庫興綜合征(Cushing, s syndrome);巨細胞包涵體病； 巨細胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征；丹-沃(DandyWalker)綜合征；Dawson病；德摩西埃綜合征；Dejerine-Klumke麻痹；癡呆；皮肌炎；糖尿病神經病變；彌漫性硬化；自主神經功能異常；書寫困難；誦讀困難；張力失常；早期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍綜合征；腦炎； 腦膨出；腦三叉神經血管瘤病；癲癇；歐勃麻痹；特發性震顫；法布里病；法爾綜合征；昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性癲癇發作；費希爾綜合征；弗里德賴希共濟失調；額顳癡呆和其它“tau蛋白病變(tauopathies)”；高歇病；格斯特曼綜合征；巨細胞動脈炎；巨細胞性包涵體病；細胞性腦白質營養不良；格-巴綜合征；HTLV-1相關性脊髓病；哈-斯病；顱腦損傷；頭痛；偏側面肌痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經炎型遺傳性共濟失調；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；HIV相關性癡呆和神經病(還是AIDS的神經表現)；前腦無裂畸形；亨廷頓舞蹈病和其它聚谷氨酰胺重復疾病(polyglutamine repeat disease)； 積水性無腦畸形；腦積水；皮質醇增多癥；缺氧；免疫介導的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調癥；嬰兒植烷酸貯積病；嬰兒雷夫敘姆病；嬰兒性痙攣；炎性肌病；顱內囊腫；顱內高血壓；Joubert綜合征；基-塞(Keams-Sayre)綜合征；肯尼迪病Kinsboum綜合征；克-費 (Klippel Feil)綜合征；克拉伯病；庫-韋病；庫魯病；拉福拉病；朗-愛(Lambert-Eaton) 肌無力綜合征；Landau_Kleffner綜合征；側髓(瓦倫伯格)綜合征；學習無能；利氏病； Lennox-Gustaut綜合征；累-奈綜合征；腦白質營養不良；路易(Lewy)體癡呆；無腦回； 閉鎖綜合征；Lou Gehrig病(即，運動神經元病或肌萎縮側索硬化)；椎間盤疾病；萊姆病-神經后遺癥；馬-約病；巨腦(macrencephaly);巨腦(megalencephaly);梅-羅綜合征；美尼爾癥；腦膜炎；門克斯病；異染性腦白質營養不良；小頭畸形；偏頭痛；米勒費希爾綜合征；小中風(mini-stroke);線粒體肌病；默比厄斯綜合征；單肢肌萎縮；運動神經元病；腦底異常血管網病；粘多糖癥；多發性梗塞性癡呆(milti-infarct dementia)； 多病灶運動神經病；多發性硬化和其它脫髓鞘病癥；多系統萎縮伴隨直立性低血壓；P肌肉萎縮癥；重癥肌無力；髓鞘脫失(myelinoclastic)彌漫性硬化；嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣攣；肌病；先天性肌強直；發作性睡病；神經纖維瘤病；神經阻滯劑惡性綜合征；AIDS的神經表現；狼瘡的神經后遺癥；神經性肌強直；神經元臘樣脂褐質癥；神經元遷移障礙；尼曼-皮克病；0’ Sullivan-McLeod綜合征；枕神經痛；隱性脊柱神經管閉合不全序列征；大田原(Ohtahara)綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼肌陣痙攣；視神經炎；直立性低血壓；過度使用綜合征；感覺異常；神經變性疾病或病癥(帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側索硬化(ALS)、癡呆、多發性硬化以及其它和神經元細胞死亡有關的疾病和病癥)；先天性副肌強直；類腫瘤性疾病；發作性發作(paroxysmal attacks);帕-羅 (Parry Romberg)綜合征；佩-梅病；周期性癱瘓；周圍神經病；疼痛性神經病和神經性疼痛；持續性植物狀態；全身性發育遲緩；感光性噴嚏反射；植烷酸貯積病；皮克病；神經挾捏；垂體瘤；多肌炎；腦穿通畸形；小兒麻痹癥后期綜合征；皰疹后神經痛；感染后腦脊髓炎；直立性低血壓；普-韋(Prader-Willi)綜合征；原發性側索硬化；朊病毒病；進行性一側面萎縮；進行性多灶性白質腦病；進行性硬化性灰質萎縮；進行性核上性麻痹；腦假瘤； 拉姆齊 亨特綜合征(I型和11型)；拉斯馬森(Rasmussen)腦炎；反射性交感神經營養不良綜合征；雷夫敘姆病；反復性運動障礙；反復性應激損傷；腿多動綜合征；逆轉錄病毒相關性脊髓病；雷特綜合征；雷耶綜合征；舞蹈病；桑德霍夫病；謝耳德病；腦裂；視隔發育不全(septo-optic dysplasia);驚嚇嬰兒綜合征；帶狀皰疫；希-德綜合征；斯耶格倫綜合征；睡眠性呼吸暫停；索托斯綜合征(Soto' s syndrome);痙攣狀態；脊柱裂；脊髓損傷； 脊髓瘤；脊髓性肌萎縮；僵人綜合征(Stiff-Person syndrome);中風；斯-韋綜合征；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動脈硬化性腦病；西德納姆舞蹈病；暈厥；脊髓空洞癥；遲發性運動障礙；泰-薩病；顳動脈炎；脊髓栓系綜合征(tethered spinal cord syndrome);肌強直性白內障；胸廓出口綜合征；三叉神經痛；Todd麻痹；圖雷特綜合癥；短暫性腦缺血發作；傳染性海綿狀腦病；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經痛；熱帶痙攣性輕截癱；結節性硬化癥；血管性癡呆(多發梗塞性癡呆)；血管炎，包括顳動脈炎；希-林(Von Hippel-Lindau)病；瓦倫伯格綜合征；韋-霍(Werdnig-Hoffman)病；韋斯特綜合征；急性頸部扭傷(whiplash);威廉斯綜合征；Wildon病；以及澤爾韋格綜合征。“炎癥”是指全身性炎性病況以及局部地與單核細胞、白細胞和/或中性粒細胞的遷移和吸引有關的病況。炎癥的實例包括但不限于，因以下引發的炎癥感染致病生物(包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、病毒、真菌、以及寄生物，例如原生動物和蠕蟲)、移植排斥 (包括實質器官的排斥，例如腎、肝、心、肺或角膜，以及骨髓移植的排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))或者局限性慢性或急性自身免疫反應或變態反應。自身免疫性疾病包括急性腎小球腎炎；類風濕性或反應性關節炎；慢性腎小球腎炎；炎性腸病，例如克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎和壞死性小腸結腸炎；與粒細胞輸注有關的綜合征；炎性皮膚病，例如接觸性皮炎、特應性皮炎、銀屑病；系統性紅斑狼瘡(SLE);自身免疫性甲狀腺炎、多發性硬化、以及糖尿病的某些形式、或任何其它自體免疫狀態(其中受試者自身免疫系統的攻擊導致病理性組織破壞)。變態反應包括變應性哮喘、慢性支氣管炎、急性和遲發型超敏反應。全身性炎性疾病狀態包括與創傷、燒傷、缺血事件(例如在心、腦、腸或外周脈管系統中的血栓形成事件，包括心肌梗死和中風)后的再灌注、膿毒癥、ARDS或多器官功能障礙綜合征相關的炎癥。炎性細胞募集也在粥樣硬化斑塊中發生。炎癥包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、韋格納肉芽腫病、橋本甲狀腺炎、肝細胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類風濕性關節炎、反應性淋巴樣增生、骨關節炎、潰瘍性結腸炎、乳頭狀癌、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宮內膜異位 (adenomyosis)、子宮內膜異位癥(endometriosis)、急性子宮頸炎、慢性子宮頸炎、淋巴樣增生、多發性硬化、繼發于特發性血小板減少性紫癜的肥大、原發性IgA腎病、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、肺氣腫、慢性腎盂腎炎、以及慢性膀胱炎。心血管疾病或病癥包括可引起缺血或者由心臟的再灌注引發的那些病癥。實例包括但不限于，動脈粥樣硬化、冠狀動脈疾病、肉芽腫性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽腫性)、 原發性肥大性心肌病、外周動脈病(PAD)、外周血管疾病、靜脈血栓栓塞、肺栓塞、中風、心絞痛、心肌梗死、由心搏停止引發的心血管組織損傷、由心臟分流引發的心血管組織損傷、心源性休克，以及相關的病況，所述病況會是本領域普通技術人員已知的，或涉及心臟或脈管系統的機能障礙或組織損傷，特別是但不限于，與PONl激活有關的組織損傷。CVS疾病包括但不限于，動脈粥樣硬化、肉芽腫性心肌炎、心肌梗死、繼發于瓣膜性心臟病的心肌纖維化、 無梗死形成的心肌纖維化、原發性肥大性心肌病、以及慢性心肌炎(非肉芽腫性)。“代謝疾病或病癥”是指大范圍的內分泌系統的疾病和病癥，包括例如胰島素抵抗、糖尿病、肥胖癥、葡萄糖耐量降低、高膽固醇血癥、高血糖癥、高胰島素血癥、血脂障礙 (dyslipidemia)和高脂血癥。與氧化應激有關的疾病或病癥的實例包括但不限于動脈粥樣硬化、帕金森病、心力衰竭、心肌梗死、阿爾茨海默氏病、慢性疲勞綜合征、肌萎縮側索硬化(ALS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發性硬化、肝臟疾病或病癥、胃腸疾病或病癥、糖尿病、癌癥、自身免疫、免疫相關的疾病或病癥、神經疾病或病癥、神經變性疾病或病癥、神經修復和麻痹、神經內分泌分化、炎性疾病、肌肉疾病或病癥、與傳染性生物有關的疾病或病癥等。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標在一個實施方案中，靶標包括對氧磷酶I (PONl)的核酸序列，包括但不限于與PONl有關的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。
對氧磷酶家族由共享結構特性和酶促活性(其中有水解LDL中的氧化脂質的能力)的三個成員(P0N1、P0N2和P0N3)組成。盡管跨越物種的單個家族成員之間的保守性可表示保持這些功能性差異的強大進化壓力，但是不同家族成員的確切功能還不清楚。對氧磷酶(PON)為肝分泌的蛋白質，主要在血清中發現。名稱來源于其體內水解有機磷酸酯對氧磷的能力。有3種已知的paN等位基因形式。血清對氧磷酶/芳基酯酶 (PaN-I)為與HDL有關的354個殘基4345kD的A-酯酶。眾所周知其涉及水解數種有機磷酸酯殺蟲劑。P0N2和P0N3為已知的具有類似序列的等位基因變體。數個人類群體研究已顯示PONI基因的常見多態性和冠狀動脈疾病(CAD)之間的顯著聯系。而且，PONI具有破壞在氧化LDL中發現的某些促炎氧化磷脂的能力。此外，除了提出對氧磷酶可能參與外，并沒有孤立的機制。在對小鼠的遺傳研究中，PONI mRNA和蛋白質水平與主動脈損傷大小逆相關。PONI 活性可與在群體研究中觀察到的HDL水平和CAD具有一定關聯。家族性高膽固醇血癥為導致慢性高水平血清膽固醇(包括HDL和LDL 二者)的遺傳性病癥。所述病癥還以LDL受體缺陷為特征。其為常染色體顯性，患病率估值為每百萬群體I個純合子。LDL受體通常參與攝取和隨后由肝細胞消除LDL。這些患者中LDL的蓄積為LDL受體缺陷的結果。由于建立者效應而有確定的高發群體，以法國人、加拿大人最為有名。40-50歲男性和50-60歲女性雜合子在患有動脈粥樣硬化性心臟病的第20-30年形成黃瘤。因為過度的斑塊聚集引發的心肌梗死，純合子通常存活不到三十歲。他們具有范圍為500-1，000mg/dl的總膽固醇，在6歲形成黃瘤，并在10歲形成癥狀性冠狀動脈疾病。LDL受體缺陷患者的治療為未決的。純合子對HMG-CoA還原酶抑制劑無應答(它們不具有功能性LDL受體來增量調節)，而雜合子應答正常的一半。雖然煙酸對降低LDL有效，但其耐受差。非藥理治療包括每周血漿去除、部分回腸旁路、門腔靜脈分流(protocaval shunt)和肝移植。在優選的實施方案中，將反義寡核苷酸用于預防或治療與PONl家族成員有關的疾病或病癥。可用由利用反義化合物獲得的干細胞再生的細胞/組織治療的示例性對氧磷酶I (P0N1)介導的疾病和病癥包括心血管疾病或病癥、代謝疾病或病癥(例如糖尿病、肥胖癥、高膽固醇血癥等)、高血壓、動脈粥樣硬化、致動脈粥樣化的疾病或病癥、冠心病、氧化應激、神經疾病或病癥、孤獨癥/孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder)、癲癇、癌癥、炎癥、中風、創傷、腎病、類風濕性關節炎、魚眼病、紫癜、多囊性卵巢綜合征、甲狀腺機能亢進、肝病、血管性癡呆、傳染病(例如在急相反應期間)、由暴露于多種外源化合物例如環境化學品(例如金屬，如鈷、鎘、鎳、鋅、銅、鋇、鑭、汞；二氯乙酸、四氯化碳)等、藥物(例如膽堿能毒蕈堿拮抗劑、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、酒精)誘導的應激；老化和衰老。在一個優選的實施方案中,將PONl反義寡核苷酸在治療上用于器官移植(例如肝移植、腎移植、骨髓移植、心臟移植等)。在預防或治療腎病的實例中，患者中PONl表達或功能的增加將在治療或預防腎病中有巨大治療價值。在一個優選的實施方案中，給患者施用至少一種反義寡核苷酸。近端小管上皮細胞(PTEC)憑借它們產生表示炎癥應答的趨化因子和細胞因子，在腎對損傷的應答中起主要作用。骨形態發生蛋白-7(ΒΜΡ-7/0Ρ-1)減少急性和慢性腎衰竭的動物模型中的巨噬細胞浸潤和組織損傷。PONl阻抑PTEC中的下列因子的基礎表達和TNF- α刺激表達促炎細胞因子IL-6和IL-I β、趨化因子MCP-I和IL-8以及血管收縮內皮素_2 (ΕΤ-2)。在預防或治療肥胖癥的實例中，給需要這類預防或治療的受試者施用反義寡核苷酸。脂肪組織對于調節能量平衡而言為主要的。哺乳動物中存在兩種功能上不同類型的脂肪白色脂肪組織，甘油三酯儲存的主要部位；棕色脂肪組織，其專化于能量消耗并可抵制肥胖癥。決定白色和棕色脂肪組織的發育命運和功能的因素仍然知之甚少。然而，骨形態發生蛋白(BMP)家族的一些成員支持白色脂肪組織分化，即使在沒有正常所需的激素誘導混合物時，PONl也罕見地促進棕色前脂肪細胞(preadiposites)的分化。PONl激活棕色脂肪形成的全部程序，包括誘導棕色脂肪命運的早期調節劑PRDM16(含PR結構域16)和 PGC-I (過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)輔激活劑-I)，增加定義棕色脂肪的標記解偶聯蛋白I(UCPl)和脂肪形成轉錄因子PPAR以及CCAAT/增強子結合蛋白(C/EBP)的表達， 和誘導經由p38促分裂原活化蛋白(MAP)激酶(也稱為Mapkl4)和PGC-I依賴途徑的線粒體生物發生。此外，PONl觸發將間充質祖細胞向棕色脂肪細胞譜系定型。在優選的實施方案中，施用一種或多種反義寡核苷酸在體內和體外促進棕色脂肪細胞分化和產熱，并預防或治療肥胖癥。在另一個優選的實施方案中，施用一種或多種PONl反義寡核苷酸,預防、治療和/ 或維持受試者的體重在正常參數之內。在另一個優選的實施方案中，給干細胞施用PONl。這些干細胞可為任何來源且可用于干細胞治療。例如，可將患者的干細胞收集、離體培養、與一種或多種PONl反義核苷酸接觸、擴繁并重新輸回患者中。所述干細胞可為胚胎的、骨髓來源的、多能的等。在另一個優選的實施方案中，施用一種或多種PONl反義寡核苷酸，預防或治療肝病，增強肝再生和功能。如上所述，PONl為多功能細胞因子，其介導許多不同細胞類型的生長和分化。在其在發育期間的多個功能之中，PONl介導從中部前腸內胚層長出肝芽，該肝芽最后產生肝細胞。在成體中，PONl主要由腎和骨產生。PONl以100-300pg/m的濃度范圍在血液中循環。在正常成體中，肝細胞具有靜止的高度分化表型且在人或動物肝中很少分裂。然而，它們復制的固有能力沒有喪失且在肝切除之后或者由于化學品或病毒的急性肝損傷時容易被激活。如果功能性肝實質的損失未達到臨界水平，則肝可完整地再生其功能團塊。然而，如果活性肝細胞的數量落在臨界水平之下，則肝(急性肝衰竭)的再生能力不能彌補肝團塊的急性損失。在這點上，由出現肝性腦病(歸因于肝的合成和代謝功能損失)確定的急性肝衰竭導致顯著的死亡率(40-80% )，而用于治療的原位肝移植的供體器官仍然非常有限。在一個優選的實施方案中，施用一種或多種PONl反義寡核苷酸，預防或治療肝細胞、組織和肝自身的損傷。在另一個實施方案中，施用一種或多種PONl反義物保護、預防或治療肝病或其相關病癥。肝臟疾病或病癥可通過任何試驗來鑒定或診斷，例如肝功能試驗，其測定白蛋白、 α -I抗胰蛋白酶、ALP、ALT、AST、Y -谷氨酰轉肽酶(GGT)、凝血酶原時間、血清膽紅素、尿膽
紅素酶等。在一個優選的實施方案中，寡核苷酸對于PONl (其包括但不限于非編碼區)的多核苷酸而言為特異的。PONl靶標包括PONl的變體；P0N1的突變體，包括SNP ；P0N1的非編碼序列；等位基因、片段等。優選所述寡核苷酸為反義RNA分子。依照本發明的實施方案，靶核酸分子不單獨限于PONl多核苷酸，而是擴展到PONl 的任何同種型、受體、同源物、非編碼區等。在另一個優選的實施方案中，寡核苷酸靶定PONl靶標的天然反義序列(針對編碼和非編碼區的天然反義物)，所述PONl靶標包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優選所述寡核苷酸為反義RNA或DNA分子。在另一個優選的實施方案中，本發明的寡聚化合物也包括變體，其中在所述化合物的一個或多個核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個核苷酸為腺嘌呤，則可產生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的變體。這可在所述反義化合物的任何位置上完成。然后使用本文所述的方法來檢測這些化合物以確定其抑制靶核酸的表達的能力。在一些實施方案中，反義化合物與靶標之間的同源性、序列同一性或互補性為約 50%-約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約60% -約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約70% -約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約80% -約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。反義化合物在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶核酸的結合干擾靶核酸的正常功能而引起活性損失，并且在需要特異性結合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結合。這類條件包括，即，在體內測定或治療性處理情況中的生理條件，以及在體外測定情況中進行測定的條件。反義化合物，不論DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶DNA或RNA分子的結合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用損失， 并且在需要特異性結合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶序列的非特異性結合，所述條件即在體內測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況中進行測定的條件下。在另一個優選的實施方案中，靶定PONl調節PONl的表達或功能，PONl包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列、一個或多個如SEQ ID NO :2所述的序列等。在一個實施方案中，表達或功能與對照相比為增量調節的。在另一個優選的實施方案中，表達或功能與對照相比為減量調節的。在另一個優選的實施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :3-7所述的核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個經修飾的核苷酸、較短或較長的片段、經修飾的鍵等。經修飾的鍵或核苷酸間鍵的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優選的實施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可連接到本發明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無需在此描述。反義物的特異性和靈敏性也被本領域的技術人員掌握用于治療用途。已將反義寡核苷酸用作在動物和人的疾病狀態治療中的治療部分。已將反義寡核苷酸安全和有效地施用給人，并且目前正在進行許多臨床試驗。因此已確定寡核苷酸可為有用的治療形式，其可經配置以在用于治療細胞、組織和動物尤其人的治療方案中有用。在本發明的實施方案中，寡聚反義化合物(具體地寡核苷酸)結合到靶核酸分子并調節由靶基因編碼的分子的表達和/或功能。待干擾的DNA功能包括例如復制和轉錄。 待干擾的RNA功能包括所有的生活機能,例如RNA向蛋白質翻譯位點的易位、蛋白質自RNA 的翻譯、產生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。所述功能可被增量調節或受抑制，這取決于所需的功能。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、 可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少一部分雜交的其他寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環狀寡聚化合物的形式引入。在本發明的文段中，將反義化合物靶定到特定的核酸分子可為多步過程。所述過程通常以鑒定待調節其功能的靶核酸開始。此靶核酸可為，例如其表達與特定病癥或疾病狀態有關的細胞基因(或從基因轉錄的mRNA)，或來自傳染劑的核酸分子。在本發明中，所述靶核酸編碼對氧磷酶I (PONl)。靶定過程通常也包括確定靶核酸內的至少一個靶區、區段或位點以用于發生反義相互作用，使得產生所需的效應，例如，表達的調節。在本發明的文段中，術語“區”定義為具有至少一個可識別結構、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區內為區段。“區段”定義為在靶核酸內區的較小或亞部分。本發明所用的“位點”定義為靶核酸內的位置。在優選的實施方案中，反義寡核苷酸結合到對氧磷酶I(PONl)的天然反義序列并調節對氧磷酶I (PONl) (SEQ ID NO 1)的表達和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID NO :2-7。在另一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸結合到對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的一個或多個區段并調節對氧磷酶I (PONl)的表達和/或功能。所述區段包含對氧磷酶 I (PONl)有義或反義多核苷酸的至少五個連續的核苷酸。在另一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸對對氧磷酶I (PONl)的天然反義序列而言為特異的，其中所述寡核苷酸與對氧磷酶I(PONl)的天然反義序列的結合調節對氧磷酶I (PONl)的表達和/或功能。在另一個優選的實施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO :3-7所述的序列、 使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷酸、較短或較長的片段、經修飾的鍵等。經修飾的鍵或核苷酸間鍵的實例包括硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等。在另一個優選的實施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物。可連接到本發明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無需在此描述。由于如本領域已知，翻譯起始密碼子通常為Y -AUG(在轉錄的mRNA分子中；在相應的DNA分子中為5' -ATG)，因而翻譯起始密碼子也稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子” 或“AUG起始密碼子”。少數基因具有翻譯起始密碼子，其具有RNA序列5' -GUG、5' -UUG 或Y -CUG ;以及Y -AUA、5' -ACG和Y -CUG已顯示在體內起作用。因此，術語“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括許多密碼子序列，但在每個情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個或更多個備選起始密碼子，其中的任何一個可優先地用于在特定細胞類型或組織中或在特定條件組下的翻譯起始。在本發明的文段中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指這樣的一個或多個密碼子，其在體內用于起始由編碼對氧磷酶I (PONl)的基因轉錄的mRNA的翻譯，與這類密碼子的一個或多個序列無關。基因的翻譯終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三個序列中的一個，即，5' -UAA、5' -UAG和Y -UGA(對應的DNA序列分別為Y -TAA, 5' -TAG 和 5' -TGA)。術語“起始密碼子區”和“翻譯起始密碼子區”是指從翻譯起始密碼子開始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個連續的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。類似地，術語“終止密碼子區”和“翻譯終止密碼子區”是指從翻譯終止密碼子開始在任一方向上 (即，5’或3’)包含約25-約50個連續的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。因此，“起始密碼子區”(或“翻譯起始密碼子區”)和“終止密碼子區”(或“翻譯終止密碼子區”)均為可用本發明的反義化合物有效地靶定的區。本領域已知的可讀框(ORF)或“編碼區”是指在翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區，也為可有效地靶定的區。在本發明的文段內，靶定的區為包含基因可讀框 (ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內區。另一種靶區包括本領域已知的5’非翻譯區(5’UTR)，是指在翻譯起始密碼子的5’ 方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’加帽位點和翻譯起始密碼子之間的核苷酸 (或基因上對應的核苷酸)。再一種靶區包括本領域已知的3’非翻譯區(3' UTR)，是指在翻譯終止密碼子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3’末端之間的核苷酸(或基因上對應的核苷酸)。mRNA的5’加帽位點包含經由5’ -5’三磷酸酯鍵連接到mRNA的5’最末端殘基的N7-甲基化鳥苷殘基。認為mRNA的5’帽區包括5’帽子結構本身以及鄰近該帽位點的前50個核苷酸。用于本發明的另一種靶區為5’帽區。盡管一些真核mRNA轉錄物為直接翻譯的，但是許多包含一個或多個稱為“內含子”的區，其在翻譯前被從轉錄物中切除。余下的(且因此翻譯的)區稱為“外顯子”，并將其剪接在一起形成連續的mRNA序列。在一個實施方案中，靶定剪接位點(即，內含子-外顯子連接處或外顯子-內含子連接處)在疾病牽涉異常剪接或疾病牽涉特定剪接產物過度產生的狀況中特別有用。因重排或缺失所致的異常融合連接處為靶位點的另一個實施方案。 經由來自不同基因來源的兩個(或更多個)mRNA的剪接過程產生的mRNA轉錄物稱為“融合轉錄物”。內含子可使用靶定到例如DNA或前mRNA的反義化合物來有效地靶定。在另一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸結合到靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區并調節靶分子的表達和/或功能。在另一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸結合到天然反義多核苷酸并調節靶分子的表達和/或功能。在另一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸結合到有義多核苷酸并調節靶分子的表達和/或功能。可變RNA轉錄物可產生自DNA的相同基因組區。這些可變轉錄物一般稱為“變體”。 更具體地，“前mRNA變體”為產生自相同的基因組DNA的轉錄物，其與產生自相同的基因組 DNA的其他轉錄物在其起始或終止位置上不同且包含內含子和外顯子序列二者。當剪接期間切除了一個或多個外顯子或內含子區、或其部分時，前mRNA變體產生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體為經加工的前mRNA變體，并且由于剪接所致，每種獨特的前mRNA變體必須總是產生獨特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。 如果未發生前mRNA變體的剪接，則前mRNA變體與mRNA變體完全相同。變體可通過使用可變信號啟動或終止轉錄來產生。前mRNA和mRNA可具有多于一個起始密碼子或終止密碼子。起源于使用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。使用可變終止密碼子的轉錄物稱為該前mRNA或mRNA 的“可變終止變體”。可變終止變體的一個具體類型為“聚腺苷酸變體”，其中所產生的多重轉錄物起因于轉錄機構對其中一種“聚腺苷酸終止信號”的可變選擇，從而產生終止在獨特的聚腺苷酸位點上的轉錄物。在本發明的文段內，本文所述的變體類型也為靶核酸的實施方案。將反義化合物與之雜交的靶核酸上的位置定義為活性反義化合物靶定的靶區的至少5個核甘酸長的部分。雖然將某些示例性靶區段的具體序列列舉于此，但是本領域的技術人員會認識到，這些用于說明和描述在本發明范圍內的具體實施方案。根據本公開內容，其他靶區段可由本領域普通技術人員容易地鑒定。認為以下靶區段同樣適合靶定，該靶區段長度為5-100個核苷酸并包含選自說明性的優選靶區段之內的一段至少五(5)個連續的核苷酸。靶區段可包括DNA或RNA序列，其包含來自說明性優選靶區段之一的5’末端的至少5個連續核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續段，其開始于靶區段5’末端的緊接上游且持續到該DNA或RNA包含約5-約100個核苷酸為止)。類似優選的靶區段由以下DNA或RNA序列表示，該序列包含來自說明性優選靶區段之一的3’末端的至少5個連續核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續段，其開始于靶區段3’末端的緊接下游且持續到該DNA或RNA包含約5-約100個核苷酸為止)。本領域技術人員根據本文所說明的靶區段，無需過度試驗就能夠鑒定進一步優選的靶區段。一旦鑒定一個或多個靶區、區段或位點，就選出與該靶標足夠互補的反義化合物， 所述足夠互補即充分良好且具有足夠的特異性雜交以得到所需的效果。在本發明的實施方案中，寡核苷酸與特定靶標的反義鏈結合。所述寡核苷酸長度為至少5個核苷酸且可為合成的，使得每個寡核苷酸靶定重疊的序列，由此將寡核苷酸合成為覆蓋靶多核苷酸的全長。靶標也包括編碼區以及非編碼區。在一個實施方案中，優選通過反義寡核苷酸來靶定特定核酸。將反義化合物靶定到特定核酸為多步過程。該過程通常開始于鑒定其功能待調節的核酸序列。這可為，例如其表達與特定的病癥或疾病狀態有關的細胞基因(或從該基因轉錄的mRNA)，或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA(ncRNA)。可將RNA歸類為⑴信使RNA(mRNA)，其被翻譯成蛋白，和⑵非編碼蛋白的 RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉錄物和包含高密度的終止密碼子并缺少任何廣泛的“可讀框”的其他轉錄單元(TU)。許多ncRNA似乎開始于蛋白編碼基因座的3’非翻譯區 (3丨UTR)中的起始位點。ncRNA常常為罕見的且至少一半已由FANTOM協會測序的ncRNA 似乎未聚腺苷酸化。大多數研究者因為明顯的原因而關注經加工并輸出到細胞質的聚腺苷酸化mRNA。近來，已顯示非聚腺苷酸化核RNA的群體可非常巨大，且許多這類轉錄物產生于所謂的基因內區。ncRNA可調節基因表達的機制為通過與靶轉錄物的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNA可分組成(I)順式編碼RNA，其在相同的基因位置、但在其所作用的RNA 相反的鏈上編碼，因此顯示對其靶標完美的互補性，和(2)反式編碼RNA，其在與其所作用的RNA不同的染色體位置上編碼，一般不表現出與其靶標完美的堿基配對潛能。不希望受到理論的約束，通過本文所述的反義寡核苷酸來擾亂反義多核苷酸，可改變相應有義信使RNA的表達。然而，此調節可為不一致的(反義敲減導致信使RNA上升) 或一致的(反義敲減導致伴隨的信使RNA下降)。在這些情況下，可將反義寡核苷酸靶定到反義轉錄物的重疊或非重疊部分，引起其敲減或隔離。編碼以及非編碼反義物可以相同的方式來靶定，并且任一種類別均能夠調節相應有義轉錄物——以一致或不一致的方式。用于鑒定針對靶標使用的新寡核苷酸的策略可基于通過反義寡核苷酸或任何其他調節所需靶標的方法對反義RNA轉錄物的敲減。策略I :在不一致調節的情況下，敲減所述反義轉錄物提升常規(有義)基因的表達。若后者基因編碼已知或假定的藥物靶標，則其反義配對物的敲減可預料到地模擬受體激動劑或酶刺激劑的作用。策略2 :在一致調節的情況下，可伴隨地敲減反義和有義轉錄物兩者，從而達到常規(有義)基因表達的協同下降。如果例如將反義寡核苷酸用于進行敲減，則此策略可用于應用針對有義轉錄物靶定的一種反義寡核苷酸和針對相應反義轉錄物的另一種反義寡核苷酸，或同時靶定重疊的有義和反義轉錄物的單個有力對稱的反義寡核苷酸。根據本發明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)，以及與靶核酸的至少一部分雜交且調節其功能的其他寡聚化合物。因此，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA 樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環狀或發夾寡聚化合物且可包含結構元件，例如內部或末端突起、錯配或環。將反義化合物常規地制備為線性的，但可被連接或者另外制備成環狀和/或分枝的。反義化合物可包括構建體， 例如雜交以形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈，或具有足夠自我互補性以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。可將所述兩條鏈內部連接而留下游離的3’或5’末端， 或可將其連接形成連續的發夾結構或環。發夾結構可在5’或3’末端上包含突出端，產生單鏈特征的延伸。所述雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進一步的修飾可包括與末端之一、經挑選的核苷酸位置、糖位置或與核苷間鍵之一連接的綴合基團。或者，所述兩條鏈可經由非核酸部分或連接基團來連接。當僅由一條鏈形成時，dsRNA可呈自我互補的發夾型分子形式，其在其自身上對折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的。 基因表達的特異性調節可通過在轉基因細胞系中穩定表達dsRNA發夾來完成，然而，在一些實施方案中，基因表達或功能為增量調節的。當形成自兩條鏈，或呈在其自身上對折形成雙鏈體的自身互補發夾型分子形式的單鏈時，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區)為以沃森-克里克模式堿基配對的互補RNA鏈。一旦弓丨入系統，本發明的化合物可引起一種或多種酶或結構蛋白的作用以實現靶核酸的切割或其他修飾，或可經由基于占據的機制來運作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個或多個2’脫氧糖和一般地T而不是U堿基)或 “RNA樣”(即，一般具有一個或多個2’羥基或2’修飾的糖和一般U而不是T堿基)。核酸CN 102612560 A
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螺旋可采取多于一種類型的結構，最普通地A和B型。據認為，一般而言，具有B型樣結構的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結構的寡核苷酸為“RNA樣”。在一些(嵌合的)實施方案中，反義化合物可包含A和B型區兩者。在另一個優選的實施方案中，所需的寡核苷酸或反義化合物，包括以下中的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經修飾的鍵的反義寡核苷酸、干擾 RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA);微小干擾 RNA (miRNA);小時序 RNA (stRNA);或短發夾 RNA(shRNA);小RNA誘導的基因激活(RNAa);小激活RNA(saRNA)、或其組合。dsRNA也可激活基因表達，這是已被稱為“小RNA誘導的基因激活”或RNAa的機制。 靶定基因啟動子的dsRNA誘導相關基因的有效轉錄激活。在人細胞中使用合成dsRNA(稱為“小激活RNA” (saRNA))證實RNAa。目前未知RNAa在其他生物體中是否為保守的。 已發現小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA))是稱為 RNA干擾(RNAi)的進化保守機制的觸發物。RNAi總是經由重構染色質來導致基因沉默，從而抑制轉錄、降解互補mRNA或阻斷蛋白翻譯。然而，在下文實施例章節詳述的例子中，顯示寡核苷酸增加對氧磷酶I (PONl)多核苷酸和其編碼產物的表達和/或功能。dsRNA也可充當小激活RNA(saRNA)。不希望受理論約束，通過靶定基因啟動子中的序列，saRNA在稱為 dsRNA誘導的轉錄激活(RNAa)的現象中誘導靶基因表達。在另一個實施方案中，本文鑒定的“優選靶區段”可用于篩選調節對氧磷酶 I (PONl)多核苷酸表達的另外化合物。“調節劑”為以下化合物，其減少或增加編碼對氧磷酶 I (PONl)的核酸分子的表達并包含與優選靶區段互補的至少5個核苷酸的部分。篩選方法包括以下步驟使編碼對氧磷酶I(PONl)有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優選靶區段與一種或多種候選調節劑接觸，以及選擇一種或多種減少或增加編碼對氧磷酶I(PONl) 多核苷酸的核酸分子表達的候選調節劑(例如SEQ ID NO :3-7)。一旦顯不一種或多種候選調節劑能夠調節(例如減少或增加)編碼對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的核酸分子表達， 則可將所述調節劑用于對氧磷酶I(PONl)多核苷酸功能的進一步調查研究，或用作依照本發明的研究、診斷或治療劑。靶定天然反義序列優選地調節靶基因的功能。例如，PONl基因(例如檢索號 NM_000446)。在一個優選的實施方案中,祀標為PONl基因的反義多核苷酸。在一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸靶定對氧磷酶I (PONl)多核苷酸(例如檢索號NM_000446)的有義和/或天然反義序列、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優選所述寡核苷酸為反義分子且所述靶標包括反義和/或有義PONl多核苷酸的編碼和非編碼區。本發明的優選靶區段也可與本發明的其各自互補的反義化合物結合，以形成穩定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領域中已顯示這類雙鏈寡核苷酸部分經由反義機制來調節靶表達和調節翻譯以及RNA加工。此外，所述雙鏈部分可經受化學修飾。例如，已顯示這類雙鏈部分通過所述雙鏈體的反義鏈與靶標的典型雜交來抑制該靶標，從而觸發靶標的酶促降解。在一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸靶定對氧磷酶I (PONl)多核苷酸(例如檢索號NM_000446)、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。 優選所述寡核苷酸為反義分子。CN
依照本發明的實施方案，靶核酸分子不單獨限于對氧磷酶I (PONl)而是擴展到對氧磷酶I(PONl)分子的任何同種型、受體、同源物等等。在另一個優選的實施方案中，寡核苷酸靶定PONl多核苷酸的天然反義序列(例如，如SEQ ID NO :2所述的多核苷酸)，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :3-7所述。在一個實施方案中，所述寡核苷酸與對氧磷酶I(PONl)反義物的核酸序列互補或結合，并調節對氧磷酶I (PONl)分子的表達和/或功能，所述核酸序列包括但不限于與對氧磷酶I (PONl)多核苷酸有關的非編碼有義和/或反義序列。在另一個優選的實施方案中，所述寡核苷酸與如SEQ ID NO :2所述的PONl天然反義物的核酸序列互補或結合，并調節PONl分子的表達和/或功能。在一個優選的實施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :3_7的至少5個連續核苷酸的序列且調節對氧磷酶I (PONl)分子的表達和/或功能。多核苷酸靶標包括PONl，包括其家族成員、PONl的變體；P0N1的突變體，包括SNP ； PONl的非編碼序列；P0N1的等位基因；物種變體、片段等等。優選所述寡核苷酸為反義分子。在另一個優選的實施方案中，祀定對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的寡核苷酸包括 反義 RNA、干擾 RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA);微小干擾 RNA (miRNA);小時序 RNA (stRNA)； 或短發夾RNA(shRNA);小RNA誘導的基因激活(RNAa);或小激活RNA(saRNA)。在另一個優選的實施方案中，對氧磷酶I (PONl)多核苷酸(例如SEQ ID NO 2)的靶定調節這些靶標的表達或功能。在一個實施方案中，表達或功能相比于對照為增量調節的。在另一個優選的實施方案中，表達或功能相比于對照為減量調節的。在另一個優選的實施方案中，反義化合物包括如SEQ ID N0:3_7所述的序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個經修飾的核苷酸、更短或更長的片段、經修飾的鍵等等。在另一個優選的實施方案中，SEQ ID NO :3_7包含一個或多個LNA核苷酸。所需靶核酸的調節可以本領域已知的數個方式來進行。例如，反義寡核苷酸、 siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)為能夠催化一種或多種不同反應(包括以核苷酸堿基序列特異的方式反復切割其他單獨的核酸分子的能力)的核酸分子。這類酶促核酸分子可用于，例如，靶定幾乎任何RNA轉錄物。由于反式切割酶促核酸分子的序列特異性，其有望作為用于人類疾病的治療劑 (Usman&McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294 ；Christoffersen 和 Marr, (1995) J. Med. Chem. 38，2023-2037)。可將酶促核酸分子設計成在細胞RNA背景下切割特定的RNA靶標。這類切割事件致使mRNA無功能且終止從該RNA的蛋白表達。以這種方式，可選擇性地抑制與疾病狀態有關的蛋白合成。一般而言，帶有RNA切割活性的酶促核酸通過首先與靶RNA結合來起作用。這類結合通過酶促核酸的靶結合部分來進行，該酶促核酸的靶結合部分保持緊密靠近進行切割靶RNA的分子的酶促部分。因此，所述酶促核酸首先識別而后通過互補的堿基配對與靶RNA 結合，且一旦與正確的位點結合，即進行酶促地切割靶RNA。這類靶RNA的策略性切割將破壞其指導合成編碼蛋白的能力。在酶促核酸結合和切割其RNA靶標之后，其從該RNA中釋放以尋找另一個靶標且可反復結合和切割新靶標。
已使用諸如體外選擇(進化)策略(Orgel,(1979)Proc. R. Soc. London, B 205, 435)等數種途徑來進化能夠催化各種反應的新核酸催化劑，所述反應為例如磷酸二酯鍵和酰胺鍵的切割和連接。催化活性最佳的核酶的開發會顯著地有助于以調節基因表達為目的而采用RNA 切割核酶的任何策略。例如錘頭狀核酶在存在Mg2+輔因子的飽和(IOmM)濃度下，以約 Imin-I的催化速率(kcat)起作用。已顯示人造“RNA連接酶”核酶以約IOOmin-I的速率催化相應的自我修飾反應。此外，據了解具有由DNA組成的底物結合臂的某些經修飾的錘頭狀核酶，以接近IOOmin-I的倍數轉換速率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最終，用某些核苷酸類似物置換在錘頭的催化核心內的特定殘基產生顯示出在催化速率上多達10倍改進的修飾核酶。這些研究結果證實核酶可以以顯著高于大多數天然自我切割核酶展示于體外的催化速率，促進化學轉化。那么可能的是，可優化某些自我切割核酶的結構以產生最高的催化活性，或者可制備展示出顯著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA 基序。通過符合“錘頭”模型的RNA催化劑來分子間切割RNA底物首先顯示于1987年 (Uhlenbeck，0. C. (1987) Nature, 328 :596-600)。將所述 RNA 催化劑回收并與多種 RNA 分子反應，證實其為真正催化性的。基于“錘頭”基序設計的催化性RNA已通過在催化性RNA中作出適當的堿基改變以維持與靶序列的必要堿基配對，來用于切割特定靶序列。這允許使用催化性RNA來切割特定靶序列，并指出根據“錘頭”模型設計的催化性RNA可能在體內切割特定底物RNA。RNA干擾(RNAi)已成為調節哺乳動物和哺乳動物細胞中基因表達的強大工具。 此方法要求使用表達質粒或病毒以及加工成siRNA的小發夾RNA的編碼序列，將小干擾 RNA(siRNA)作為RNA本身或作為DNA遞送。此系統能夠有效將前siRNA轉運到它們在其中活躍的細胞質中，并允許使用經調節的和組織特異的啟動子用于基因表達。在一個優選的實施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體、或其模擬物、嵌合體、類似物或同源物。此術語包括由天然存在核苷酸、糖和共價核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸以及類似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。由于所需性質，例如增強的細胞攝取、對靶核酸增強的親和力以及在核酸酶存在時增大的穩定性，常常需要這類經修飾或取代的寡核苷酸超過天然形式。根據本發明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同源物)、核酶、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA以及與靶核酸的至少一部分雜交且調節其功能的其他寡聚化合物。因此，它們可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環狀或發夾寡聚化合物且可包含結構元件，例如內部或末端突起、錯配或環。將反義化合物常規地制備成線性但可經連接或者另外地制備成環狀和/或分枝的。反義化合物可包括構建體，例如雜交以形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈，或帶有足夠自我互補性以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。可將所述兩條鏈內部連接而留下游離的3’或5’末端或可將其連接形成連續的發夾結構或環。發夾結構可在5’或3’末端上包含突出端，產生單鏈特征的延伸。雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進一步的修飾可包括與末端之一、經挑選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一連接的綴合基團。備選地，所述兩條鏈可經由非核酸部分或連接基團來連接。當形成自僅一條鏈時，dsRNA可采取自我互補的發夾型分子形式，其在其自身上對折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的。基因表達的特異性調節可通過dsRNA發夾在轉基因細胞系中的穩定表達來完成。當形成自兩條鏈或采取在其自身上對折形成雙鏈體的自身互補的發夾型分子形式的單鏈時，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區)為以沃森-克里克模式堿基配對的互補RNA鏈。一旦弓丨入系統，本發明的化合物可引起一種或多種酶或結構蛋白的作用以實現靶核酸的切割或其他修飾，或可經由基于占據的機制來運作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個或多個2’脫氧糖和，一般地，T而不是U堿基) 或“RNA樣”(S卩，一般具有一個或多個2’羥基或2’修飾的糖和，一般U而不是T堿基)。 核酸螺旋可采取多于一種類型的結構，最普通地A和B型。據認為，一般而言，具有B型樣結構的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結構的寡核苷酸為“RNA樣”。在一些(嵌合的) 實施方案中，反義化合物可包含A和B型區兩者。依照本發明的反義化合物可包含約5-約80個核苷酸(即約5-約80個連接核苷)長度的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長度。換言之，本發明的單鏈反義化合物包含5-約80個核苷酸，而本發明的雙鏈反義化合物(例如，dsRNA)包含5-約 80個核苷酸長度的有義和反義鏈或部分。本領域普通技術人員將認識到，這包括5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 或 80 個核苷酸長度、 或其之內任何范圍的反義部分。在一個實施方案中，本發明的反義化合物具有10-50個核苷酸長度的反義部分。 本領域普通技術人員將認識到，這包括具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49或50個核苷酸長度、或其之內任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實施方案中， 寡核苷酸長度為15個核苷酸。在一個實施方案中，本發明的反義或寡核苷酸化合物具有12或13-30個核苷酸長度的反義部分。本領域普通技術人員將認識到，這包括具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長度、或其之內任何范圍的反義部分的反義化合物。在另一個優選的實施方案中，本發明的寡聚化合物也包括其中不同的堿基存在于化合物中的一個或多個核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個核苷酸為腺苷，那么可產生在此位置包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置上進行。然后使用本文所述的方法來檢測這些化合物以確定其抑制靶核酸表達的能力。在一些實施方案中，反義化合物與靶標之間的同源性、序列同一性或互補性為約 40%-約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約60% -約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約70% -約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約80% -約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個優選的實施方案中，反義寡核苷酸(例如，SEQ ID NO :2_7中所述的核酸分子)包含一個或多個取代或修飾。在一個實施方案中，將核苷酸用鎖定核酸(LNA)取代。在另一個優選的實施方案中，寡核苷酸靶定與PONl有關的編碼和/或非編碼序列以及如SEQ ID NO :1和2所述的序列有義和/或反義的核酸分子的一個或多個區。也將寡核苷酸靶定到SEQ ID NO :1和2的重疊區。本發明的某些優選的寡核苷酸為嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”或“嵌合體”，在本發明的文段中，為包含兩個或更多個化學上不同區的寡核苷酸，每個區由至少一個核苷酸組成。這些寡核苷酸典型地包含賦予一種或多種有益特性(例如，對核酸酶的抗性增強、 攝入細胞增強、對靶標增強的結合親和力)的修飾核苷酸的至少一個區，以及作為能夠切割RNA = DNA或RNA = RNA雜合體的酶底物的區。作為實例，核糖核酸酶H為細胞核酸內切酶， 其切割RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈。核糖核酸酶H的活化因此導致RNA靶標的切割，從而大大地增強基因表達的反義調節效率。因此，當使用嵌合寡核苷酸時，與雜交到相同靶區的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，常常可用較短的寡核苷酸獲得相當的結果。RNA靶標的切割可通過凝膠電泳和必要時本領域已知的相關核酸雜交技術，常規地檢測。在一個優選的實施方案中，嵌合寡核苷酸包含修飾成增加靶結合親和力的至少一個區，并且通常包含充當核糖核酸酶H的底物的區。寡核苷酸對其靶標(在此情況下，編碼ras的核酸)的親和力通過測定寡核苷酸/靶標對的Tm來常規地確定，Tm為寡核苷酸與靶標解離的溫度；解離以分光光度法檢測。Tm越高，寡核苷酸對靶標的親和力越大。本發明的嵌合反義化合物可作為如上所述的兩種或更多種寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸模擬物的復合結構而形成。本領域亦已將這類化合物稱為雜合體或gapmer。教導制備這類雜合結構的代表性美國專利包括但不限于，美國專利第 5，013，830,5, 149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133、 5，565，350,5, 623，065,5, 652，355,5, 652，356 及 5，700，922 號，每個通過引用結合于本文中。在另一個優選的實施方案中，經修飾的寡核苷酸區包含在糖的2’位置上修飾的至少一個核苷酸，最優選2’ -O烷基、2’ -O-烷基-O-烷基或2’ -氟修飾的核苷酸。在其它優選的實施方案中，RNA修飾包括在RNA 3’末端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的2’ -氟、2’ -氨基和2’ O-甲基修飾。將這類修飾常規地摻入到寡核苷酸中，已顯示這些寡核苷酸具有比2’ -脫氧寡核苷酸對給定靶標更高的Tm(即，更高的靶結合親和力)。這種增加的親和力的作用大大地增強基因表達的RNAi寡核苷酸抑制。核糖核酸酶H為切割 RNAiDNA雙鏈體的RNA鏈的細胞核酸內切酶；此酶的活化因此導致RNA靶標的切割，且因此可大大地增強RNAi抑制效率。RNA靶標的切割可通過凝膠電泳來常規地證實。在另一個優選的實施方案中，也修飾嵌合寡核苷酸以增強核酸酶抗性。細胞包含可降解核酸的各種核酸外切酶和核酸內切酶。已顯示許多核苷酸和核苷修飾使摻入有它們的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對核酸酶消化更有抗性。核酸酶抗性通過將寡核苷酸與細胞提取物或分離的核酸酶溶液一起孵育并測定隨時間推移剩余的完好寡核苷酸的程度(通常地通過凝膠電泳) 來常規地測定。已修飾成增強其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾寡核苷酸保持完好持續更長時間。已證實多種寡核苷酸修飾增強或賦予核酸酶抗性。包含至少一個硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸為目前更優選的。在一些情況下，增強靶結合親和力的寡核苷酸修飾也能夠獨立地增強核酸酶抗性。一些所需的修飾可在De Mesmaeker等，(1995) Acc. Chem. Res. ,28 366-374中找到。預想用于本發明的一些優選寡核苷酸的具體實例包括包含經修飾的骨架的那些，所述經修飾的骨架為例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環烷基糖間鍵或者短鏈雜原子或雜環的糖間鍵。最優選的為帶有硫代磷酸酯骨架和帶有雜原子骨架的寡核苷酸，雜原子骨架特別地為CH2—NH—0—CH2、CH, —N (CH3) —0—CH2 [稱為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架]、CH2—O—N(CH3) —CH2、CH2_N(CH3) —N(CH3) —CH2 和 0—N(CH3)—CH2—CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示為0—P—0-CH。由De Mesmaeker 等，(1995)Acc. Chem. Res. 28 :366-374公開的酰胺骨架也為優選的。同樣優選的為具有嗎啉代骨架結構的寡核苷酸(Summerton和Weller,美國專利第5，034, 506號)。在其他優選的實施方案中，將寡核苷酸的例如肽核酸(PM)骨架、磷酸二酯骨架替換為聚酰胺骨架，核苷酸直接或間接地與聚酰胺骨架的氮雜氮原子結合。寡核苷酸也可包含一個或多個取代的糖部分。優選的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種0H、SH、SCH3、F、OCN, 0CH30CH3、 0CH30(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2 或 O(CH2)nCH3，其中 η 為 I-約 10 ;C1_C10 低級烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；C1 ；Br ；CN ；CF3 ；0CF3 ;0—、S—、或N-烷基； 0—、S—、或N-烯基；S0CH3 ；S02CH3 ；0N02 ；N02 ；N3 ；NH2 ;雜環烷基；雜環烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基團；報道基團；嵌入劑；改進寡核苷酸藥代動力學特性的基團；或改進寡核苷酸藥效學特性的基團以及具有類似特性的其他取代基。 優選的修飾包括2’-甲氧乙氧基[2' -0-CH2CH20CH3，也稱為2' -0-(2-甲氧乙基)]。其他優選的修飾包括2’ -甲氧基(2' -O—CH3)、2’ -丙氧基(2' -0CH2CH2CH3)和2’ -氟 (2' -F)。類似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進行，具體地在3’末端核苷酸上糖的 3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基基團的環丁基。寡核苷酸也可另外或備選地包含核堿基(本領域常常簡稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括在天然核酸中僅稀少或短暫地存在的核苷酸， 例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特別地5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2’脫氧胞嘧啶且常常在本領域中稱為5-Me-C)、5_羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基 HMC,以及合成核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、
2-(氨烷基氨基)腺嘌呤或其他雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2， 6-二氨基嘌呤。可包括本領域已知的“通用的”堿基，例如，肌苷。已顯示5-Me-C取代增強核酸雙鏈體的穩定性達O. 6-1. 2V (Sanghvi，Y. S.，載于Crooke，S. T.和Lebleu，B.，編輯，反義研究和應用(Antisense Research and Applications), CRC Press, Boca Raton, 1993,276-278頁)且為目前優選的堿基取代。本發明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學方法使一種或多種增強寡核苷酸的活性或細胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這類部分包括但不限于脂質部分，例如膽固醇部分、膽留醇基部分、脂族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸。包含親脂性部分的寡核苷酸以及用于制備這類寡核苷酸的方法為本領域已知的，例如美國專利第5，138，045,5, 218，105和5，459，255號。無需將給定寡核苷酸中的所有位置一致地修飾，且實際上多于一種上述修飾可摻入到單個寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸內的單個核苷內部。本發明也包括作為如上文中定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個實施方案中，本發明的核酸分子與另一個部分綴合，所述部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質或聚碳氫化合物。本領域技術人員將認識到，可將這些分子在糖、堿基或磷酸基的數個位置上連接到一個或多個構成核酸分子的任何核苷酸。依照本發明使用的寡核苷酸可通過眾所周知的固相合成技術來便利和常規地制備。用于這類合成的設備由包括Applied Biosystems在內的數個供應商銷售。也可使用用于這類合成的任何其他方法；寡核苷酸的實際合成完全在本領域普通技術人員的才能之內。亦眾所周知的是使用類似技術來制備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。還眾所周知的是使用類似技術和市購經修飾的amidites和可控孔度玻璃(CPG)產品， 例如生物素、突光黃、Π丫唳、或補骨脂素修飾的amidites和/或CPG(可從Glen Research, Sterling VA購買)，以合成熒光標記的、生物素化的或其他修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。依照本發明，使用修飾(例如使用LNA單體)以增加寡核苷酸的效價、特異性和作用持續時間并拓寬其施用途徑，所述寡核苷酸由諸如M0E、ANA、FANA、PS等當前的化學物質組成。這可通過用LNA單體取代當前寡核苷酸中的一些單體來完成。LNA修飾的寡核苷酸可具有類似于母體化合物的大小或可更大或優選更小。優選這類LNA修飾寡核苷酸包含少于約70 %、更優選少于約60 %、最優選少于約50 %的LNA單體且其大小在約5_25個核苷酸之間，更優選在約12-20個核苷酸之間。優選的修飾寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3’烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3’ -5’鍵合的硼烷磷酸酯 (boranophosphates)、這些的2’ -5’連接類似物，以及具有反極性的那些，其中核苷單元的相鄰對為3’ -5’與5’ -3’或2’ -5’與5’ -2’連接的。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導制備上述含磷鍵的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第3，687，808、 4，469，863,4, 476，301,5, 023，243,5, 177，196,5, 188，897,5, 264，423,5, 276，019、 5，278，302,5, 286，717,5, 321，131,5, 399，676,5, 405, 939,5, 453，496,5, 455，233、 5，466，677,5, 476，925,5, 519，126,5, 536，821,5, 541，306,5, 550, 111,5, 563，253、 5，571，799,5, 587，361和5，625，050號，每個通過引用結合于本文中。優選的修飾寡核苷酸骨架(其中不包含磷原子)，具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵、或一種或多種短鏈雜原子或雜環核苷間鍵形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亞甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2組分部分的其他骨架。教導制備上述寡聚核苷的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第 5，034，506,5, 166，315,5, 185，444,5, 214，134,5, 216，141,5, 235，033,5, 264，562、 5，264，564,5, 405，938,5, 434，257,5, 466，677,5, 470，967,5, 489，677,5, 541，307、 5，561，225,5,596，086,5,602,240,5,610, 289,5, 602, 240,5, 608, 046,5, 610, 289、 5，618，704,5, 623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439 號，每個通過引用結合于本文中。在其他優選的寡核苷酸模擬物中，將核苷酸單元的糖和核苷間鍵(即骨架)，均用新基團置換。維持堿基單元用于與適當的核酸靶化合物雜交。一種這類寡聚化合物，即已顯示具有優秀的雜交特性的寡核苷酸模擬物，稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架替換為含酰胺的骨架，具體地氨乙基氨基乙酸骨架。將核堿基保留并直接或間接地與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子結合。教導制備PNA化合物的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第5，539，082,5, 714，331和5，719，262號，每個通過引用結合于本文中。 PNA化合物的進一步教導可在Nielsen等，(1991) Science 254，1497-1500中找到。在本發明的另一個優選的實施方案中，帶有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和帶有雜原子骨架的寡聚核苷，雜原子骨架具體地為-CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N (CH3) -0-CH2 -(稱為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架)、-CH2-0-N (CH3) -CH2-、-CH2N (CH3) -N (CH3) CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示為上文引用的美國專利第 5，489，677號的-0-P-0-CH2-，以及上文引用的美國專利第5，602，240號的酰胺骨架。同樣優選的為具有上文引用的美國專利第5，034，506號的嗎啉代骨架結構的寡核苷酸。修飾寡核苷酸也可包含一個或多個經取代的糖部分。優選的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種0H ；F ;0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或O 烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可為取代或未取代的C到CO烷基或C2到CO烯基和炔基。特別優選的為 O (CH2) n0mCH3、O (CH2) n，0CH3、O (CH2) nNH2、O (CH2) nCH3、0 (CH2) 110見12及0(01211(^(012)11013)2，其中11和111可為I-約10。其他優選的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種C到CO、低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或 O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團、報道基團、嵌入劑、用于改進寡核苷酸藥代動力學特性的基團、或用于改進寡核苷酸藥效學特性的基團，以及具有類似特性的其他取代基。優選的修飾包括2’ -甲氧乙氧基(2' -0-CH2CH20CH3，也稱為2’ -0-(2-甲氧乙基)或2' -M0E)，S卩，烷氧基烷氧基基團。進一步優選的修飾包括 2’ -二甲基氨基氧基乙氧基，即0(CH2)20N(CH3)2基團，也稱為2' -DMAOE (如下文實施例中所述)，以及2’ - 二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領域也稱為2’ -O-二甲基氨基乙氧基乙基或 2' -DMAE0E)，即 2' -0-CH2-0-CH2-N (CH2) 2。其他優選的修飾包括2’ -甲氧基(2 ' -0CH3)、2’ -氨基丙氧基 (.2' -0CH2CH2CH2NH2)和2’ -氟(2' -F)。類似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進行，具體地在3’末端核苷酸上或2’ -5’連接的寡核苷酸中糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基糖的環丁基部分。教導制備這類經修飾的糖結構的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第4，981，957,5, 118，800、 5，319，080,5, 359，044,5, 393，878,5, 446，137,5, 466，786,5, 514，785,5, 519，134、 5，567，811,5, 576，427、5，591，722、5，597，909、5，610，300、5，627，053、5，639，873、 5，646，265,5, 658，873,5, 670，633和5，700，920號，每個通過引用結合于本文中。寡核苷酸也可包含核堿基(本領域常常簡稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、
2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、 8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代具體地5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤(methylquanine)和7_甲基腺嘌呤、8_氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和
3-脫氮雜腺嘌呤。此外，核苷酸包括公開于以下文獻中的核苷酸美國專利第3，687，808號、“高分子科學和工程的簡明百科全書(The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering) ”，858-859 頁，Kroschwitz, J. I.，編輯，John ffiley&Sons, 1990、Englisch 等，'Angewandle Chemie, International Edition' , 1991,30,613 jlt.S.SanghvijY. S. ,% 15 章，“反義研究和應用(Antisense Research and Applications) ”，289-302 頁，Crooke，
S.T.和Lebleu，B. ea.，CRC Press，1993。這些核苷酸中的某些對于增加本發明的寡聚化合物的結合親和力特別地有用。這些包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代增加核酸雙鏈體的穩定性達O. 6-1. 20C (Sanghvi，Y. S.，Crooke, S. T.和Lebleu, B.，編輯，“反義研究和應用”，CRC Press, Boca Raton，1993，276-278頁)且為目前優選的堿基取代，更特別地當與2’ -O甲氧基乙基糖修飾組合時。教導制備上述修飾核苷酸以及其他修飾核苷酸的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第 3，687，808、以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273、 5，367，066、5，432，272、5，457，187、5，459，255、5，484，908、5，502，177、5，525，711、 5，552，540,5, 587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941 號，每個通過引用
結合于本文中。本發明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使所述寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學連接，該部分或綴合物增強所述寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取。這類部分包括但不限于，脂質部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二-十六燒基_消旋_甘油或I，2- 二 -O-十六燒基_消旋_甘油-3-H-勝酸二乙銨)、 聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-t羥膽固醇部分。
教導制備這類寡核苷酸綴合物的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、 5，578，717,5, 580, 731,5, 580, 731,5, 591，584,5, 109, 124,5, 118，802,5, 138，045、 5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、 4，667，025,4,762，779,4,789，737,4,824，941,4,835，263,4,876，335,4,904，582、 4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、 5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、 5，371，241,5,391，723,5,416，203,5, 451，463,5, 510，475,5, 512，667,5, 514，785、 5，565，552,5, 567，810,5, 574，142,5, 585，481,5, 587，371,5, 595，726,5, 597，696、 5，599,923,5, 599, 928和5，688，941號，每個通過引用結合于本文中。藥物開發本發明的化合物也可應用于藥物開發和靶標驗證的領域。本發明包括本文所鑒定的化合物和優選的靶區段在闡明存在于對氧磷酶I(PONl)多核苷酸和疾病狀態、表型或病況之間的關系的藥物開發努力中的應用。這些方法包括檢測或調節對氧磷酶 I (PONl)多核苷酸，包括使本發明的化合物與樣品、組織、細胞或生物體接觸；在處理后的某個時間測定對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關的表型或化學終末點，以及任選將該測定值與未處理樣品或與用本發明的另一種化合物處理的樣品比較。這些方法也可與其他試驗平行或組合進行以確定未知基因的功能用于靶標驗證過程，或確定特定基因產物作為用于治療或預防特定疾病、病況或表型的靶標的有效性。評價基因表達的增量調節或抑制外源核酸到宿主細胞或生物體中的轉移可通過直接檢測細胞或生物體中核酸的存在情況來評價。這類檢測可通過本領域眾所周知的數種方法來完成。例如，外源核酸的存在情況可通過DNA印跡或通過聚合酶鏈式反應(PCR)技術使用以下引物來檢測，該引物特異地擴增與所述核酸相關的核苷酸序列。外源核酸的表達也可使用包括基因表達分析在內的常規方法來測定。例如，由外源核酸產生的mRNA可使用RNA印跡和反轉錄PCR(RT-PCR) 來檢測和定量。來自外源核酸的RNA表達也可通過測定酶活性或報道蛋白活性來檢測。例如，反義調節活性可根據靶核酸表達的減少或增加間接地測定，靶核酸表達的減少或增加作為外源核酸正在產生效應物RNA的指示。基于序列保守性，可設計和使用引物來擴增靶基因的編碼區。最初，可使用來自每個基因的最高表達的編碼區來建立模型對照基因，但任何編碼或非編碼區均可使用。每個對照基因通過將每個編碼區插入報道基因編碼區和其聚腺苷酸信號之間來裝配。這些質粒可產生在基因的上游部分具有報道基因以及在3’非編碼區中具有潛在RNAi靶標的mRNA。各個反義寡核苷酸的有效性可通過調節報道基因來測定。可用于本發明的方法中的報道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、螢光素酶 (Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚堿合酶(OCS)以及其衍生物。多重選擇標記為可利用的，其賦予對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、 草丁膦(phosphinothricin)、嘌呤霉素和四環素的抗性。確定報道基因調節的方法為本領域眾所周知的，包括但不限于，熒光法(例如熒光光譜法、熒光激活細胞分選術(FACS)、熒光顯微法)、抗生素抗性測定。PONl蛋白和mRNA表達可使用本領域技術人員已知和本文別處所描述的方法測定。例如，免疫測定法(例如ELISA)可用來測定蛋白水平。PONl ELISA測定試劑盒可市購，例如，從 R&D Systems (Minneapolis, MN)。在實施方案中，使用本發明反義寡核苷酸處理的樣品(例如，體內或體外細胞或組織)中的PONl表達(例如，mRNA或蛋白)通過與對照樣品中的PONl表達相比較來評價。例如，蛋白或核酸表達可使用本領域技術人員已知的方法，與模擬處理或未處理樣品中的蛋白或核酸表達相比較。或者，與用對照反義寡核苷酸(例如，具有已改變或不同序列的反義寡核苷酸)處理的樣品的比較可根據所需信息來進行。在另一個實施方案中，可將已處理樣品對比未處理樣品在PONl蛋白或核酸表達方面的差異，與已處理樣品對比未處理樣品在不同核酸(包括研究者認為適當的任何標準，例如，持家基因)表達方面的差異相比較。可將觀察到的差異根據需要例如以比例或分數的形式表達，用于與對照比較。 在實施方案中，PONl mRNA或蛋白水平,在用本發明反義寡核苷酸處理的樣品中，相對于未處理樣品或用對照核酸處理的樣品增加至約I. 25倍-約10倍或更多或者減少至約 1/1. 25-約1/10或更少。在實施方案中，PONl mRNA或蛋白水平增加或減少至至少約I. 25 倍、至少約I. 3倍、至少約I. 4倍、至少約I. 5倍、至少約I. 6倍、至少約I. 7倍、至少約I. 8 倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、至少約5. 5倍、至少約6倍、至少約6. 5倍、至少約7倍、至少約7. 5倍、至少約8 倍、至少約8. 5倍、至少約9倍、至少約9. 5倍、或至少約10倍或更多。試劑盒、研究試劑、診斷和治療本發明的化合物可用于診斷、治療和預防，并作為研究試劑和試劑盒的組分。此外，能夠靈敏特異地抑制基因表達的反義寡核苷酸，常常被普通技術人員用于闡明特定基因的功能或區分生物途徑的各個成員的功能。對于用于試劑盒和診斷和各種生物系統，本發明的化合物(單獨的或與其他化合物或治療劑組合)可用作在差異和/或組合分析中的工具，以闡明在細胞和組織內表達的基因的一部分或全部互補序列的表達模式。本文所用的術語“生物系統”或“系統”定義為表達或使得能夠表達對氧磷酶 I (PONl)基因產物的任何生物體、細胞、細胞培養物或組織。這些包括但不限于人、轉基因動物、細胞、細胞培養物、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個非限制性實例，將在用一種或多種反義化合物處理的細胞或組織內的表達模式與未用反義化合物處理的對照細胞或組織相比較，并針對基因表達的差異水平分析產生的模式，因為它們有關于，例如，所檢測基因的疾病相關、信號傳導途徑、細胞定位、表達水平、大小、結構或功能。這些分析可對受刺激或未受刺激的細胞以及在影響表達模式的其他化合物存在或不存在時進行。本領域已知的基因表達分析方法的實例包括DNA陣列或微陣列、SAGE(基因表達的系列分析)、READS (已消化cDNA的限制酶擴增)、TOGA (總基因表達分析)、蛋白質陣列和蛋白質組學、已表達序列標志(EST)測序、消減RNA指紋法(subtractive RNA fingerprinting, SuRF)、消減克隆(subtractive cloning)、差異顯示(DD)、比較基因組雜交、FISH (熒光原位雜交)技術和質譜分析法。本發明的化合物對于研究和診斷而言為有用的，因為這些化合物與編碼對氧磷酶 I (PONl)的核酸雜交。例如，作為有效的對氧磷酶I(PONl)調節劑以本文公開的這類效率和這類條件下雜交的寡核苷酸，在有利于基因擴增或檢測的條件下分別為有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要對編碼對氧磷酶I (PONl)的核酸分子特異檢測的方法中， 和可用于擴增所述核酸分子，以用于檢測或用于進一步研究對氧磷酶I (PONl)。本發明的反義寡核苷酸(具體地，引物和探針)與編碼對氧磷酶I (PONl)的核酸的雜交，可通過本領域已知的方法來檢測。這類方法可包括使酶與所述寡核苷酸綴合、放射性標記所述寡核苷酸或任何其他適當的檢測方法。也可制備使用這類檢測方法來檢測樣品中對氧磷酶I(PONl) 水平的試劑盒。反義物的特異性和靈敏性也由本領域技術人員掌握用于治療用途。已將反義化合物在動物(包括人)的疾病狀態的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已安全和有效地施用給人且許多臨床試驗目前正在進行。因此確立的是，反義化合物可為有用的治療形式，可將其經配置以在用于治療細胞、組織和動物、尤其是人的治療方案中有用。對于治療而言，將懷疑具有可通過調節對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的表達來治療的疾病或病癥的動物(優選人)，通過施用依照本發明的反義化合物來治療。例如，在一個非限制性實施方案中，所述方法包括給需要治療的動物施用治療上有效量的對氧磷酶 I (PONl)調節劑的步驟。本發明的對氧磷酶I(PONl)調節劑有效地調節對氧磷酶I (PONl) 的活性或調節對氧磷酶I (PONl)蛋白的表達。在一個實施方案中,動物中對氧磷酶I (PONl) 的活性或表達與對照相比抑制了約10%。優選地,將動物中對氧磷酶I (PONl)的活性或表達抑制約30%。更優選地，將動物中對氧磷酶I(PONl)的活性或表達抑制50%或更多。因此，與對照相比，寡聚化合物將對氧磷酶l(P0Nl)mRNA的表達調節至少10%、至少50%、至少25 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個實施方案中，與對照相比，在動物中對氧磷酶I (PONl)的活性或表達增加約10%。優選地,在動物中對氧磷酶I (PONl)的活性或表達增加約30%。更優選地,在動物中對氧磷酶I (PONl)的活性或表達增加50%或更多。因此,與對照比較,寡聚化合物使對氧磷酶I (PONl)mRNA的表達調節至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 98%、至少 99%或 100%。例如，對氧磷酶I(PONl)表達的下降可在動物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其他體液、組織或器官中測定。優選地，包含于待分析的所述液體、組織或器官之內的細胞包含編碼對氧磷酶I (PONl)肽的核酸分子和/或對氧磷酶I (PONl)蛋白本身。本發明的化合物可通過向合適的藥學上可接受的稀釋劑或載體中添加有效量的化合物來用于藥物組合物。本發明的化合物和方法的應用也可為預防上有用的。綴合物本發明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學方法將一種或多種增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這些部分或綴合物可包含與官能團(例如伯羥基或仲羥基)共價結合的綴合基團。本發明的綴合基團包括嵌入劑、報道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚體藥效學特性的基團，以及增強寡聚體藥代動力學特性的基團。典型的綴合基團包括膽固醇、脂質、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光黃、羅丹明、香豆素和染料。增強藥效學特性的基團，在本發明的文段中，包括改善攝取、增強對降解的抗性和/或加強與靶核酸的序列特異性雜交的基團。增強藥代動力學特性的基團，在本發明的文段中，包括改善本發明的化合物的攝取、分布、代謝或分泌的基團。代表性的綴合基團在提交于1992年10月23日的國際專利申請號PCT/US92/09196 和美國專利第6，287，860號中公開，所述文獻通過引用結合于本文中。綴合部分包括但不限于，脂質部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二 -十六烷基-消旋-甘油或I，2- 二 -O-十六燒基_消旋_甘油-3-H-勝酸二乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛燒乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。也可將本發明的寡核苷酸與活性藥物物質綴合，例如，阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、
(S)-(+)普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜草、11引哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺類藥物、抗糖尿病藥、抗菌劑或抗生素。教導制備這類寡核苷酸綴合物的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、 5，578，717,5, 580, 731,5, 580, 731,5, 591，584,5, 109, 124,5, 118，802,5, 138，045、 5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、 4，667，025,4,762，779,4,789，737,4,824，941,4,835，263,4,876，335,4,904，582、 4，958，013、5，082，830、5，112，963,5, 214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、 5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、 5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、 5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481,5, 587，371,5, 595，726、5，597，696、 5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941 號。制劑本發明的化合物也可與其他分子、分子結構或化合物的混合物混合、封裝、綴合或以其他方式締合，作為例如，脂質體、受體靶向分子、口服的、直腸的、局部的或其他制劑， 用于有助于攝取、分布和/或吸收。教導制備這類攝取、分布和/或吸收輔助制劑的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127、 5，521，291、5，543，165、5，547，932、5，583，020、5，591，721、4，426，330、4，534，899、 5，013，556、5，108，921、5，213，804、5，227，170、5，264，221,5,356，633、5，395，619、 5，416，016,5, 417，978,5, 462，854,5, 469，854,5, 512，295,5, 527，528,5, 534，259、 5，543，152,5, 556，948,5, 580，575和5，595，756號，每個通過引用結合于本文中。盡管，反義寡核苷酸不需要在載體的情況中施用以便調節靶表達和/或功能，但是本發明的實施方案涉及用于反義寡核苷酸表達的表達載體構建體，包括啟動子、雜合啟動子基因序列并且擁有強組成型啟動子活性，或可在所需情況下誘導的啟動子活性。在一個實施方案中，本發明實施涉及用適合的核酸遞送系統施用至少一種前述反義寡核苷酸。在一個實施方案中，該系統包含與多核苷酸可操作連接的非病毒載體。這類非病毒載體的實例包括單獨的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO :3-7中的任一個或多個)或與適合的蛋白、多糖或脂質制劑組合的寡核苷酸。其他適合的核酸遞送系統包括病毒載體，典型地來自腺病毒、腺病毒伴隨病毒 (AAV)、依賴輔助病毒的腺病毒、逆轉錄病毒或仙臺病毒-脂質體(HVJ)復合體中的至少一種的序列。優選地，所述病毒載體包含與多核苷酸可操作連接的強真核啟動子，例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子。另外優選的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學綴合物。逆轉錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種優選的基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體, 其中gag基因和pol基因來自HIV基因組而env基因來自另一種病毒。DNA病毒載體為優選的。這些載體包括痘病毒載體(例如正痘病毒或禽痘病毒載體)、皰疹病毒載體(例如單純皰疹I病毒(HSV)載體、腺病毒載體和腺伴隨病毒載體。本發明的反義化合物包括任何藥學上可接受的鹽、酯、或這類酯的鹽、或任何其他化合物，其在施用給動物包括人后，能夠提供(直接地或間接地)生物學活性的代謝物或其殘留物。術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物的生理上和藥學上可接受的鹽SP， 保留母體化合物的所需生物活性且不對其賦予非所需的毒理學作用的鹽。對于寡核苷酸而言，藥學上可接受的鹽的優選實例和其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中，其通過引用結合于本文中。本發明也包括包含本發明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發明的藥物組合物可以以若干方式來施用，這取決于是否需要局部或全身治療以及待治療的區域。施用可為局部的(包括眼的和至黏膜包括陰道和直腸遞送)、肺的(例如，通過吸入或吹入散劑或氣霧劑，包括通過噴霧器)、氣管內的、鼻內的、表皮的和經皮的、□服的或胃腸外的。胃腸外施用包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉注射或輸注；或顱內例如鞘內或心室內施用。對于治療中樞神經系統中的組織而言，可通過例如注射或輸注進入腦脊液進行施用。施用反義RNA進入腦脊液已在例如美國專利申請公開第2007/0117772號，“Methods for slowing familial ALS disease progression(減緩家族性 ALS疾病進展的方法)”中描述，該申請通過引用以其整體結合于本文中。如果意圖將本發明的反義寡核苷酸施用給中樞神經系統中的細胞，可與一種或多種能夠促進主題反義寡核苷酸滲透穿過血腦屏障的物質一起施用。注射可在例如內嗅皮質或海馬中進行。通過施用腺病毒載體遞送神經營養因子至肌肉組織中的運動神經元描述于，例如，美國專利第 6，632，427 號，“Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons (腺病毒載體介導基因轉移進入髓質運動神經元)”,其通過引用結合于本文中。直接遞送載體至腦(例如，紋狀體、丘腦、海馬或黑質)為本領域已知且描述于例如美國專利第6，756，523號，“Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain(用于轉移外源基因進入中樞神經系統細胞(具體地腦中)的腺病毒載體)”，其通過引用結合于本文中。施用可快速，如通過注射，或在一段時間內進行，如通過緩慢輸注或施用緩釋制劑。主題反義寡核苷酸也可與提供所需藥學或藥效學特性的物質連接或綴合。例如， 反義寡核苷酸可與本領域已知的促進滲透或轉運穿過血腦屏障的任何物質(例如轉鐵蛋白受體的抗體)偶聯，并通過靜脈注射施用。反義化合物可與例如使反義化合物更有效和 /或增加反義化合物轉運穿過血腦屏障的病毒載體連接。滲透性血腦屏障破壞也可通過例如輸注糖或氨基酸來完成，所述糖包括但不限于，內消旋赤蘚醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+) 乳糖、D(+)木糖、衛矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-) 阿拉伯糖、纖維二糖、D (+)麥芽糖、D⑴蜜三糖、L(+)鼠李糖、D⑴蜜二糖、D(-)核糖、側金盞糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)巖藻糖、L(-)巖藻糖、D(-)來蘇糖、 L(+)來蘇糖和L(-)來蘇糖，所述氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和牛磺酸。用于增強血腦屏障滲透的方法和材料描述于，例如，美國專利第 4，866，042 號，“Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier (用于遞送遺傳物質穿過血腦屏障的方法)”,第6，294，520號， “Material for passage through the blood-brain barrier(用于通過血腦屏障的材料)，，，和第6，936，589號，“Parenteral delivery systems (胃腸外遞送系統)”，全部通過引用以其整體結合于本文中。主題反義化合物可與其他分子、分子結構或化合物的混合物混合、封裝、綴合或以其他方式締合，作為例如脂質體、受體靶向分子、口服的、直腸的、局部的或其他制劑，用于有助于攝取、分布和/或吸收。例如，陽離子脂質可包含在制劑中以促進寡核苷酸攝取。一種顯示出促進攝取的這類組合物為LIP0FECTIN(可從GIBC0-BRL，Bethesda, MD獲得)。認為帶有至少一個2’ -O-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸對于口服施用而言為特別有用的。用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體劑和散劑。常規藥物載體、水性、粉末或油性基質、增稠劑等可為必要的或所需的。包被的避孕套、手套等也可為有用的。可適宜地以單位劑型存在的本發明藥物制劑，可根據藥學工業中眾所周知的常規技術來制備。這類技術包括使活性成分與藥物載體或賦形劑組合的步驟。一般而言，制劑如下制備通過使活性成分與液體載體或細碎的固體載體或兩者均勻和緊密地組合，隨后在需要時使產物成形。可將本發明的組合物制成任何許多可能劑型，例如但不限于，片劑、膠囊劑、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。也可將本發明的組合物在水性、非水性或混合介質中制成混懸劑。水性混懸劑可進一步包含增加混懸劑粘度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述混懸劑也可包含穩定劑。本發明的藥物組合物包括但不限于，溶液劑、乳劑、泡沫劑和含脂質體的制劑。本發明的藥物組合物和制劑可包含一種或多種滲透促進劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成分。乳劑典型地為一種液體以通常直徑超過0. I μ m的液滴形式分散在另一種液體中的非均質體系。乳劑可包含除分散相之外的其他組分，以及可作為在水相、油相中的溶液或其本身作為單獨相存在的活性藥物。將微乳劑包括為本發明的一個實施方案。乳劑及其使用為本領域眾所周知的且進一步描述于美國專利第6，287，860號中。本發明的制劑包括脂質體制劑。本發明所用的術語“脂質體”意為由排列在一個或多個球形雙層中的兩親脂質組成的囊泡。脂質體為具有由親脂材料形成的膜和包含待遞送組合物的水性內部的單層或多層囊泡。陽離子脂質體為帶正電的脂質體，認為其與帶負電的DNA分子相互作用以形成穩定的復合體。認為pH敏感的或帶負電的脂質體誘捕DNA 而不是與其復合。陽離子和非陽離子脂質體均已用來遞送DNA到細胞。脂質體也包括“空間上穩定的”脂質體，該術語如本文所用是指包含一種或多種特化脂質的脂質體。當摻入到脂質體中時，這些特化脂質給脂質體帶來相對于缺乏這類特化脂質的脂質體增長的循環生命期。空間上穩定的脂質體的實例為以下脂質體，其中脂質體形成囊泡的脂質部分的部分包含一種或多種糖脂或衍生有一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂質體及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中。本發明的藥物制劑和組合物也可包含表面活性劑。表面活性劑在藥物產品、制劑和乳劑中的使用為本領域眾所周知的。表面活性劑及其使用進一步描述于美國專利第 6，287，860號中，其通過引用結合于本文中。在一個實施方案中，本發明使用各種滲透促進劑來實現核酸特別是寡核苷酸的有效遞送。除了有助于非親脂性藥物穿過細胞膜的擴散之外，滲透促進劑還增加親脂性藥物的滲透性。可將滲透促進劑歸類為屬于五大類的一種，五大類即表面活性劑、脂肪酸、 膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑。滲透促進劑及其使用進一步描述于美國專利第 6，287，860號，其通過引用結合于本文中。本領域的技術人員將認識到，根據其預期用途(即給藥途徑)來常規地設計制劑。用于局部給藥的優選制劑包括以下制劑，其中本發明寡核苷酸與局部遞送劑(例如，脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、留類化合物、螯合劑和表面活性劑)混合。優選的脂質和脂質體包括中性的(例如二油酰基-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蘧酰基磷脂酰膽堿 DMPC、二硬脂酰基磷脂酰膽堿)、陰性的(例如二肉豆蘧酰基磷脂酰甘油DMPG)和陽離子的 (例如二油酰基四甲基氨丙基DOTAP和二油酰基-磷脂酰基乙醇胺D0TMA)。對于局部或其他給藥而言，可將本發明的寡核苷酸封裝在脂質體內或可與其(特別是與陽離子脂質體)形成復合體。或者，可將寡核苷酸與脂質(特別是陽離子脂質)復合。優選的脂肪酸和酯類、其藥學上可接受的鹽以及它們的使用進一步描述于美國專利第 6，287，860 號中。用于口服給藥的組合物和制劑包括散劑或顆粒劑、微粒、納米粒子、在水或非水性介質中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊、小藥囊、片劑或小片。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可為所需的。優選的口服制劑為以下制劑，其中將本發明的寡核苷酸與一種或多種滲透促進劑、表面活性劑和螯合劑協同施用。優選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。優選的膽汁酸/鹽和脂肪酸及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中，其通過引用結合于本文中。還優選的為滲透促進劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽的組合。特別優選的組合為月桂酸的鈉鹽、癸酸和 UDCA。另外的滲透促進劑包括聚氧化乙烯-9-月桂醚、聚氧化乙烯-20-鯨蠟醚。本發明的寡核苷酸可以以包括噴霧干燥顆粒的顆粒形式口服地遞送，或絡合以形成微米或納米粒子。寡核苷酸絡合劑及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中，其通過引用結合于本文中。用于胃腸外、鞘內或心室內給藥的組合物和制劑可包括無菌水性溶液劑，其也可含有緩沖液、稀釋劑和其他適合的添加劑，例如但不限于，滲透促進劑、載體化合物和其他藥學上可接受的載體或賦形劑。本發明的某些實施方案提供藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種寡聚化合物和一種或多種其他通過非反義機制來起作用的化學治療劑。這類化學治療劑的實例包括但不限于癌癥化學治療藥物，例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、 伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、雙氯乙基-亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-巰鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧考福霉素、4-羥基過氧環磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5_氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤 (MTX)、秋水仙堿、泰素、長春新堿、長春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當與本發明的化合物一起使用時，這類化學治療劑可單獨地(例如，5-FU和寡核苷酸)、序貫地(例如，5-FU和寡核苷酸持續一段時間，接著MTX和寡核苷酸)、或與一種或多種其他的這類化學治療劑組合(例如，5-FU、MTX 和寡核苷酸，或5-FU、放射療法和寡核苷酸)使用。抗炎藥(包括但不限于非留體抗炎藥和皮質類固醇)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可組合到本發明的組合物中。反義化合物和其他非反義藥物的組合也在本發明的范圍之內。兩種或更多種組合的化合物可一起或序貫使用。在另一個相關的實施方案中，本發明的組合物可包含靶定到第一核酸的一種或多種反義化合物(特別是寡核苷酸)，以及靶定到第二核酸靶標的一種或多種其他反義化合物。例如，第一靶標可為對氧磷酶I (PONl)的特定反義序列，第二靶標可為來自另一個核苷酸序列的區域。或者，本發明的組合物可包含靶定到相同對氧磷酶I(PONl)核酸靶標的不同區域的兩種或更多種反義化合物。本文舉例說明了許多反義化合物的實例而其他的可選自本領域已知的適合化合物。兩種或更多種組合化合物可一起或序貫使用。給藥認為治療組合物的制劑和其隨后的施用(給藥)在本領域技術人員的技術之內。 給藥取決于要治療的疾病狀態的嚴重性和應答性，而療程從數天持續到數月，或直到完成治愈或達到疾病狀態的減輕。最佳給藥方案可根據患者體內藥物蓄積的測定來計算。普通技術人員可容易地確定最適劑量、給藥方法和重復率。最適劑量可根據單獨寡核苷酸的相對功效而不同，一般可基于發現在體外和體內動物模型中有效的EC50來評價。一般而言，劑量為O. 01 μ g-100g/kg體重,且可每天、每周、每月或每年給藥一次或多次,或甚至每 2-20年一次。本領域普通技術人員可基于測定體液或組織中藥物的停留時間和濃度來容易地評價給藥的重復率。成功治療之后，可能需要使患者進行維持療法以預防疾病狀態的復發，其中所述寡核苷酸以維持劑量來施用，范圍為O. 01 μ g-100g/kg體重,每天一次或多次到每20年一次。在實施方案中，使用下列劑量的藥物治療患者，所述劑量為至少約I、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、或至少約100mg/kg體重。反義寡核苷酸的某些注射劑量描述于，例如，美國專利第7，563，884號,“Antisense modulation of PTPlB expression(PTP1B表達的反義調節)”，通過引用以其整體結合于本文中。雖然上文已描述了本發明的各種實施方案，但是應理解的是，其僅以實例的方式提供，而并非限制。對公開的實施方案的許多改變可依照本文的公開內容來進行，而不會背離本發明的精神或范圍。因此，本發明的廣度和范圍不應受到任何上述的實施方案所限制。本文提及的所有文件都通過引用結合到本文中。本申請引用的所有出版物和專利文件都為所有目的而通過引用結合，引用程度如同單獨地指出各個出版物或專利文件一樣。至于申請人在本文件中對不同參考文獻的引用，申請人并不承認任何具體參考文獻對其發明而言為“現有技術”。本發明的組合物和方法的實施方案舉例說明于下列實施例中。
實施例下列非限制性的實施例用于舉例說明本發明的經挑選的實施方案。應理解的是， 所示組分的比例變化和要素備選對本領域的技術人員而言為顯而易見的且在本發明的實施方案的范圍之內。實施例I :對對氧磷酶I (PONl)的反義核酸分子和/或對氧磷酶I (PONl)多核苷酸有義鏈特異的反義寡核苷酸的設計如上指出的術語“對......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩定的復合體，或(ii) 能夠與祀定基因mRNA轉錄物的一部分形成穩定的雙鏈體。適當寡核苷酸的挑選通過使用計算機程序來促進，該計算機程序自動比對核酸序列并指出同一性或同源性區域。這類程序用于比較例如通過搜索諸如GenBank等數據庫或通過測序PCR產物而獲得的核酸序列。來自一系列物種的核酸序列的比較允許挑選顯示出物種之間適當同一性程度的核酸序列。在未測序基因的情況下，進行DNA印跡來確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。通過在各種嚴格程度下進行DNA印跡，如本領域眾所周知的，可獲得同一性的近似測量。這些程序允許挑選這樣的寡核苷酸，其對在待控制的受試者中的靶核酸序列表現高度的互補性而對在其他物種中的相應核酸序列表現較低程度的互補性。本領域技術人員將認識到，在挑選用于本發明的適當的基因區域上具有相當大的自由。反義化合物為“可特異雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結合干擾靶核酸的正常功能，導致功能和/或活性的調節，并且在需要特異性結合的條件下具有足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結合，所述條件即在體內測定或治療處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況中進行測定的條件下。本文所述的寡核苷酸的雜交特性可通過本領域已知的一種或多種體外測定法來確定。例如，本文所述的寡核苷酸的特性可通過使用解鏈曲線測定法確定靶天然反義物和潛在藥物分子之間的結合強度來獲得。靶天然反義物和潛在藥物分子(Molecule)之間的結合強度，可使用任何已建立的測定分子間相互作用強度的方法例如解鏈曲線測定法來評價。解鏈曲線測定法確定這樣的溫度，在該溫度下天然反義物/Molecule復合體發生從雙鏈構象到單鏈構象的迅速轉變。此溫度被廣泛認可為兩個分子之間相互作用強度的可
靠衡量。
解鏈曲線測定法可使用實際的天然反義RNA分子的cDNA拷貝或對應Molecule的結合位點的合成DNA或RNA核苷酸來進行。包含進行此測定的所有必需試劑的多種試劑盒為可得的(例如Applied Biosystems Inc. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包含含有雙鏈DNA(dsDNA)結合染料(例如ABI HRM染料、SYBR GreeruSYTO等)之一的適宜的緩沖溶液。dsDNA染料的特性為，其在游離形式幾乎不發出熒光，但當與dsDNA結合時為高度熒光的。為進行所述測定，將所述cDNA或相應寡核苷酸以由具體制造商的方案限定的濃度與Molecule混合。將所述混合物加熱到95°C以解離所有預先形成的dsDNA復合體，然后緩慢冷卻到室溫或由試劑盒制造商確定的其他較低的溫度以使DNA分子退火。隨后將新形成的復合體緩慢加熱到95°C，同時連續地收集由反應產生的熒光量的數據。熒光強度反比于反應中存在的dsDNA量。數據可使用與所述試劑盒相配的實時PCR儀器(例如ABI’s StepOne Plus Real Time PCR System或LightTyper儀器,Roche Diagnostics,Lewes,UK) 來收集。解鏈峰通過使用適當軟件(例如LightTyper (Roche)或SDS Dissociation Curve, ABI)對溫度(χ-軸)繪制熒光關于溫度的負導數(在y_軸上的_d (熒光)/dT)的圖形來構建。分析數據以確定從dsDNA復合體迅速轉變到單鏈分子的溫度。此溫度稱為Tm 且正比于兩個分子之間的相互作用強度。典型地，Tm將超過40°C。實施例2 =PONl多核苷酸的調節用反義寡核苷酸處理!fepG2細胞使來自ATCC的H印G2細胞(目錄號HB-8065)在37°C和5% C02下生長于生長培養基(MEM/EBSS(Hyclone 目錄號 SH30024 或 Mediatech 目錄號 MT-10-010-CV)+10 % FBS (Mediatech 目錄號 MT35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號 MT30-002-CI))。 試驗的前一天將所述細胞以密度I. 5XlOVml再接種到6孔板，并在37°C和5% CO2下培養。在試驗當天將6孔板中的培養基換成新鮮的生長培養基。將所有反義寡核苷酸稀釋到 20 μ M的濃度。將2 μ I此溶液與400 μ I Opti-MEM培養基(Gibco目錄號31985-070)和 4 μ I Lipofectamine2000 (Invitrogen 目錄號 11668019)在室溫下孵育 20min,然后施用到具有H印G2細胞的6孔板的每個孔。含有2 μ I水代替所述寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉染的對照。在37 °C和5 % CO2下培養3-18h后，將培養基換成新鮮的生長培養基。添加反義寡核苷酸48h后,將培養基移出，并遵循制造商的說明書使用Promega的SV Total RNA Isolation System(目錄號 Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(目錄號74181)從細胞中提取RNA。向如制造商的方案中所述使用Thermo Scientific^tJVerso cDNA試劑盒(目錄號AB1453B)或High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(目錄號4368813)進行的反轉錄反應中，添加600ng RNA。將來自此反轉錄反應的cDNA用于通過使用 ABI Taqman Gene Expression Mix(目錄號 4369510)和由 ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay Hs00166557_ml,Applied Biosystems Inc. ,Foster City CA)設計的引物/探針的實時PCR，來監控基因表達。使用下面的PCR循環50°C，2min ; 95°C, IOmin ；40 個循環的(95°C, 15 秒；60°C, lmin),使用 Mx4000 熱循環儀(Stratagene)。用反義寡核苷酸處理后基因表達的倍數變化基于處理和模擬轉染的樣品之間 18S-標準化的dCt值的不同來計算。
結果實時PCR結果顯示，HepG2細胞中PONl mRNA的水平在用針對PONl反義物 Hs. 158149和Hs. 674841設計的反義寡核苷酸處理后48h顯著增加(圖I)。盡管已就一個或多個實現舉例說明并描述本發明，但在閱讀和理解本說明書和附圖后，本領域技術人員將想到等價改變和修飾。此外，雖然本發明的具體特征可能已就幾個實現中的唯一一個公開，但這類特征可與其他實現的一個或多個其他特征組合，因為對于任何給定或具體應用而言可為所需和有利的。本公開內容的摘要將允許讀者快速確定本技術公開內容的性質。在理解以下的情況下將其提出其將不用于解釋或限制隨附權利要求的范圍或含義。SEQ ID NO 1> gi I 209413720 | ref | NM_000446. 5 | 人類對氧磷酶 I (PONl)，mRNAAATCGGCGCTGCCCCAGCAGGGCTGCGGCTGCAGGCAGGCAGAGCCTCCTAGCCCGTCGGTGTCTGCGC CCATCGATCCCTTTGTCTATCCCCGACCATGGCGAAGCTGATTGCGCTCACCCTCTTGGGGATGGGACTGGCACTCT TCAGGAACCACCAGTCTTCTTACCAAACACGACTTAATGCTCTCCGAGAGGTACAACCCGTAGAACTTCCTAACTGT AATTTAGTTAAAGGAATCGAAACTGGCTCTGAAGACTTGGAGATACTGCCTAATGGACTGGCTTTCATTAGCTCTGG ATTAAAGTATCCTGGAATAAAGAGCTTCAACCCCAACAGTCCTGGAAAAATACTTCTGATGGACCTGAATGAAGAAG ATCCAACAGTGTTGGAATTGGGGATCACTGGAAGTAAATTTGATGTATCTTCATTTAACCCTCATGGGATTAGCACA TTCACAGATGAAGATAATGCCATGTACCTCCTGGTGGTGAACCATCCAGATGCCAAGTCCACAGTGGAGTTGTTTAA ATTTCAAGAAGAAGAAAAATCGCTTTTGCATCTAAAAACCATCAGACATAAACTTCTCCCTAATTTGAATGATATTG TTGCTGTGGGACCTGAGCACTTTTATGGCACAAATGATCACTATTTTCTTGACCCCTACTTACAATCCTGGGAGATG TATTTGGGTTTAGCGTGGTCGTATGTTGTCTACTATAGTCCAAGTGAAGTTCGAGTGGTGGCAGAAGGATTTGATTT TGCTAATGGAATCAACATTTCACCCGATGGCAAGTATGTCTATATAGCTGAGTTGCTGGCTCATAAGATTCATGTGT ATGAAAAGCATGCTAATTGGACTTTAACTCCATTGAAGTCCCTTGACTTTAATACCCTCGTGGATAACATATCTGTG GATCCTGAGACAGGAGACCTTTGGGTTGGATGCCATCCCAATGGCATGAAAATCTTCTTCTATGACTCAGAGAATCC TCCTGCATCAGAGGTGCTTCGAATCCAGAACATTCTAACAGAAGAACCTAAAGTGACACAGGTTTATGCAGAAAATG GCACAGTGTTGCAAGGCAGTACAGTTGCCTCTGTGTACAAAGGGAAACTGCTGATTGGCACAGTGTTTCACAAAGCT CTTTACTGTGAGCTCTAACAGACCGATTTGCACCCATGCCATAGAAACTGAGGCCATTATTTCAACCGCTTGCCATA TTCCGAGGACCCAGTGTTCTTAGCTGAACAATGAATGCTGACCCTAAATGTGGACATCATGAAGCATCAAAGCACTG TTTAACTGGGAGTGATATGATGTGTAGGGCTTTTTTTTGAGAATACACTATCAAATCAGTCTTGGAATACTTGAAAA CCTCATTTACCATAAAAATCCTTCTCACTAAAATGGATAAATCAGTTATGTCAATTGTCAGATATTAAATAACAGTG TGTGACCCCAAAAGTACTTACCCTAAAACATGTGTTGCCTGGAAGCACATGTGTGTATCGCTGCCTTGCCATGTCTT GTTCAGAAGACACAGGGGAGCAGGGTTAGCTCACGTGTCTTTAGAACTCCAGTACTCACCCAGGGACTCCAGTTCAC AGGCCAGAAAACATATGCATTATGAAGTTCCCCTCTACTCCATGCACATAGTAAGTCTGACTATGGCAGTCAGACTT ACTTACTCCCATTTTCCCTTCGATATATGACTTTTTCTCAGTAAATATTAACCTGAATTATTCCAAAAAAAAAAAAA AAAAAASEQ ID NO :2 :天然反義序列(Hs. 611732)CTAGTGAGAAGGATTTTTATGGTAAATGAGGTTTTCAAGTATTCCAAGACTGATTTGATAGTGTATTCT CAAAAAAAAGCCCTACACATCATATCACTCCCAGTTAAACAGTGCTTTGATGCTTCATGATGTCCACATTTAGGGTC AGCATTCATTGTTCAGCTAAGAACACTGGGTCCTCGGAATATGGCAAGCGGTTGAAATAATGGCCTCAGTTTCTATG
權利要求
1.ー種在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少ー種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少ー種寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一‘丨生,所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :2的核苷酸1-534之內的5-30個連續核苷酸；從而在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的功能和/或表達。
2.ー種在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少ー種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少ー種寡核苷酸與對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的天然反義物的反向互補序列具有至少 50%序列同一性；從而在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的功能和/或表達。
3.ー種在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少ー種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；從而在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的功能和/或表達。
4.ー種在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與靶定對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區的至少ー種反義寡核苷酸接觸；從而在體內或體外調節患者細胞或組織中對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的功能和/或表達。
5.權利要求4的方法,其中對氧磷酶I(PONl)的功能和/或表達在體內或體外相對于對照增加。
6.權利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的天然反義序列。
7.權利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定包含對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權利要求4的方法,其中所述至少一種反義寡核苷酸包含一種或多種選自以下的修飾至少ー種經修飾的糖部分、至少ー種經修飾的核苷間鍵、至少ー種經修飾的核苷酸及其組合。
10.權利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經修飾糖部分2’ -0-甲氧基こ基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、ニ環糖部分及其組合。
11.權利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經修飾核苷間鍵硫代磷酸酷、2’ -0-甲氧基こ基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酷、碳酸酯、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯及其組合。
12.權利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其類似物、衍生物及組合。
13.權利要求I的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含至少一個如SEQID NO :3-7所述的寡核苷酸序列。
14.一種在體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中對氧磷酶I(PONl)基因的功能和/ 或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為5-30個核苷酸的短干擾RNA (SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的反義多核苷酸有特異性， 其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個連續核酸的互補序列具有至少50%序列同一性；和，在體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中對氧磷酶I (PONl)的功能和/或表達。
15.權利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約五個連續核酸的序列具有至少 80%序列同一性，所述序列與對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補。
16.一種在體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中對氧磷酶I(PONl)的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異，其中所述至少一種反義寡核苷酸與至少一個如SEQ ID NO :1和2所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內或體外調節哺乳動物細胞或組織中對氧磷酶 I (PONl)的功能和/或表達。
17.一種合成的、經修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種經修飾的糖部分；至少一種經修飾的核苷酸間鍵；至少一種經修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸為與正常對照相比在體內或體外與對氧磷酶 I (PONl)基因雜交并調節所述基因的功能和/或表達的反義化合物。
18.權利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
19.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的骨架。
21.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種經修飾的核苷酸，所述經修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物及組合。
22.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經修飾的核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
23.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經修飾的核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物及組合。
24.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種選自以下的經修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環糖部分及其組合。
25.權利要求17的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包含多種修飾,其中所述修飾包括選自以下的經修飾的糖部分2’ -O-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、 2’ -O-烷基修飾的糖部分、二環糖部分及其組合。
26.權利要求17的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸長度為至少約5-30個核苷酸且與對氧磷酶I (PONl)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與對氧磷酶I (PONl) 多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續核酸的互補序列具有至少約20%序列同一性。
27.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續核酸的互補序列具有至少約80 % 序列同一性。
28.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與正常對照相比在體內或體外與至少一種對氧磷酶I (PONl)多核苷酸雜交并調節所述多核苷酸的表達和/或功能。
29.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQIDNO :3_7所述的序列。
30.一種組合物，所述組合物包含對一種或多種對氧磷酶I(PONl)多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID NO :3_7所述核苷酸序列中的任一個相比，具有至少約40%序列同一性。
32.權利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO :3_7所述的核苷酸序列。
33.權利要求32的組合物，其中如SEQID NO :3_7所述的寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代。
34.權利要求33的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預防或治療與至少一種對氧磷酶I (PONl)多核苷酸和/或至少一種其編碼產物有關的疾病的方法，所述方法包括給患者施用治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種對氧磷酶I(PONl)多核苷酸的天然反義序列結合，并調節所述至少一種對氧磷酶 I (PONl)多核苷酸的表達；從而預防或治療與至少一種對氧磷酶I (PONl)多核苷酸和/或至少一種其編碼產物有關的疾病。
36.權利要求35的方法，其中與至少一種對氧磷酶I(PONl)多核苷酸有關的疾病選自 心血管疾病或病癥、代謝疾病或病癥(例如糖尿病、肥胖癥、高膽固醇血癥等)、高血壓、動脈粥樣硬化、致動脈粥樣化的疾病或病癥、冠心病、氧化應激、神經疾病或病癥、孤獨癥/孤獨癥譜系障礙、癲癇、癌癥、炎癥、中風、創傷、腎病、類風濕性關節炎、魚眼病、紫癜、多囊性卵巢綜合征、甲狀腺機能亢進、肝病、血管性癡呆、傳染病(例如在急相反應期間)、由暴露于多種外源化合物例如環境化學品(例如金屬，如鈷、鎘、鎳、鋅、銅、鋇、鑭、汞；二氯乙酸、 四氯化碳)、藥物(例如膽堿能毒蕈堿拮抗劑、普伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀、酒精)誘導的應激；老化和衰老。
37.一種鑒定和選擇用于體內施用的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態有關的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個連續核苷酸的至少一種寡核苷酸，所述連續核苷酸與所選的靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸互補；在嚴格雜交條件下，測定反義寡核苷酸與所述靶多核苷酸或所選靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；以及基于獲得的信息選擇用于體內施用的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發明涉及反義寡核苷酸，具體而言，其通過靶定對氧磷酶1(PON1)的天然反義多核苷酸，來調節對氧磷酶1(PON1)的表達和/或功能。本發明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與PON1表達有關的疾病和病癥中的用途。
文檔編號A61K48/00GK102612560SQ201080037017
公開日2012年7月25日 申請日期2010年6月16日 優先權日2009年6月16日
發明者J·科拉德, O·霍爾科瓦謝爾曼 申請人:歐科庫爾納有限責任公司