用于治療神經疾病的模型系統和治療方案的制作方法

            文檔序號:1201438閱讀:412來源:國知局
            專利名稱:用于治療神經疾病的模型系統和治療方案的制作方法
            用于治療神經疾病的模型系統和治療方案相關申請的交叉引用本申請為正式申請,要求美國臨時申請號61/185,989 (2009年6月10日遞交)的權利。
            背景技術
            關于興奮性神經毒性的早期工作表明,可以使用阻斷谷氨酸受體的藥物來治療中風和神經創傷(Albers,Archives in Neurology 49:418-420(1992) ;Albers Ann Neurol 25:398-403(1989))。盡管早期在體外和在動物模型中的測試看上去很有希望, 但不幸的是,迄今,所有谷氨酸拮抗物的中風臨床試驗都沒顯示出益處,甚至表現出毒性副作用(Davis 等,Lancet349 32(1997) ;Morris 等,J Neurosurg 91 :737_743 (1999); Davis 等,Stroke31 347-354(2000) ;Ikonomidou 等,Proc Natl Acad Sci U S A 97 12885-12890(2000) ;Lees 等,Lancet 355 1949-1954 (2000))。可能的解釋是施用抑制 CNS 中興奮性神經傳遞的化學劑后的負面影響超過了它們作為神經保護劑的效用(Ikonomidou 和Turski,Lancet Neurology383_386 (2002)。谷氨酸能信號傳遞為CNS行使功能所需, 因此,阻斷必需的興奮性神經傳遞具有負面后果(Ikonomidou,Biochem. Pharmacol. 62 401-405(2001))。因此,需要更為完善的治療神經元死亡的方法,以規避阻斷谷氨酸受體的負面后果。本發明的發明人之一報道了突觸后密度蛋白95 (PSD-95)將NMDARs偶聯到介導興奮性神經毒性和缺血性腦損傷的途徑上(Aarts等,Science298,846-850 (2002))。這種偶聯通過向神經元轉導多肽而被破壞,所述多肽結合到PSD-95/NMDAR相互作用復合體一側的模塊結構域上。這種處理減弱了下游NMDAR信號傳導而不阻斷NMDAR活性,保護了培養的皮層神經元不受到興奮性毒性的損傷,減少了遭受短暫性局灶性腦缺血大鼠的腦梗死體積。發明概述本發明提供了治療或預防由興奮性神經毒性介導的疾病的方法,包括對患有該病或具有罹患該病風險的受試者施用抑制PSD-95與NMDAR2B結合和/或PSD-95 與nNOS結合的藥劑(pharmacological agent),其中當該化學劑為具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ IDNO 6)的肽時,劑量為2_3mg/kg,如果該化學劑不是具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽時,劑量遞送與2_3mg/kg具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽等價有效濃度的該化學劑。在一些方法中,該化學劑為具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽,劑量為2. 6mg/kg。在一些方法中,每疾病發作期,施用一次劑量。在一些方法中,施用劑量,不共施用抗炎藥。本發明也提供了治療或預防由興奮性神經毒性介導的疾病的方法,包括對患有該病或具有罹患該病風險的受試者施用抑制PSD-95與NMDAR2B結合和/或PSD-95與 nNOS結合的藥劑,其中藥劑被連接到內化肽(internalization ρ印tide),藥劑通過靜脈輸注5-15分鐘的時間來施用。在一些方法中,連接到內化肽的藥劑為具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 6)的肽,施用時間為5分鐘。在一些方法中,藥劑的劑量大于lmg/kg。在一些方法中,藥劑的劑量為2-3mg/kg。在一些方法中,藥劑的劑量為 2. 6mg/kg。在一些方法中,劑量不超過50mg/kg,前提是如果劑量大于3mg/kg,則該劑量與抗炎藥共施用。在一些方法中,施用劑量,不共施用抗炎藥。在一些方法中,受試者患有中風。在一些方法中,受試者正在經歷手術,可選地,治療動脈瘤的血管內手術。本發明還提供了抑制神經手術或血管內手術(無論其是否發生在CNS中)中的缺血性損傷的方法,包括對經歷神經手術的患者施用有效給藥方案的抑制PSD-95與NMDAR 2B結合的化學劑。在一些方法中,神經手術為診斷性腦血管造影術。在一些方法中,神經手術為治療動脈瘤的血管內手術。在一些方法中,在血管內手術之前施用化學劑。在一些方法中,在完成血管內手術后1小時內施用化學劑。在一些方法中,血管內手術包括向動脈瘤中置入線圈(coil)。在一些方法中,血管內手術包括將支架(stent)置入有動脈瘤的血管中。在一些方法中,血管內手術包括置入微導管(microcatheter)。本發明提供了對藥劑進行臨床試驗的方法,包括對經歷腦動脈瘤血管內手術的患者群體施用藥劑,并將這些患者中手術損傷效應的頻率與經歷血管內手術而沒有施用藥劑的對照患者進行比較,以確定藥劑是否降低了損傷效應。在一些方法中,通過腦梗死的數量和/或大小來評估損傷效應。一些方法還包括在中風的動物模型中測試藥劑。一些方法還包括在患有中風的人類患者中測試藥劑。一些方法還包括標記藥劑用于治療中風。在一些方法中,藥劑抑制PSD95與NMDAR 2B和/或PSD-95與nNOS的結合。本發明還提供了測試藥劑的方法。這些方法包括(a)將微粒(particles)置入到靈長類動物的腦血管中;(b)給靈長類動物施用藥劑;以及(c)將此靈長類動物的損傷效應與沒有用化合物處理的對照靈長類動物進行比較。在一些方法中,通過梗死的數量和/ 或大小來評估損傷效應。在一些方法中,通過MRI或CAT掃描來確定梗死。在一些方法中, 通過與對照靈長類動物比較靈長類動物的行為癥狀來評估損傷效應。一些方法還包括在恢復期后對同樣的靈長類動物重復步驟(a)-(c),條件是在重復步驟(a)-(c)中測試的藥劑可以與在之前進行步驟(a)-(c)時的相同或可以不同。一些方法還包括重復步驟(a)-(c), 但是其中對照靈長類動物接受藥劑且將之前接受了藥劑的動物作為對照動物。在一些方法中,藥劑抑制PSD-95與NMDAR 2B和/或PSD-95與nNOS的結合。一些方法還包括對人中風受試者施用藥劑。一些方法還包括對經歷動脈瘤血管內手術的人受試者施用藥劑。在一些方法中,在將微粒置入到腦血管中之后施用藥劑。在一些方法中,在將微粒置入到腦血管中之前施用藥劑。在一些方法中,微粒為100微米的聚苯乙烯球體。在一些方法,對靈長類動物施用20個球體。在一些方法中,靈長類動物為獼猴。本發明還提供了凍干的組合物,所述組合物包含具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 6)的肽,其從在GMP條件下制備的于生理鹽水中的肽溶液凍干而來。本發明還提供了儲存藥物組合物的方法,所述方法包括將包含具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO 6)的肽的藥物組合物,于生理鹽水中,以10_30mg/ml 的濃度,在GMP條件下于低于0°C儲存至少2年的時間。可選地,濃度為18-20mg/ml。一些方法還包括對患者施用藥物組合物。附圖簡述

            圖1顯示,在對照動物中注射球體后24小時,梗死的彌散加權MRI掃描,與接受了血管內手術以置入線圈來修復動脈瘤的人進行比較。上部顯示在44歲的女性中于動脈瘤線圈置入后48小時的擴散缺陷。下部顯示在雄性食蟹猴(Cynomolgus macaque)中注射 20x IOOum聚苯乙烯微球后24小時的擴散缺陷。圖2比較經治療的動物和對照動物中MRI可見梗死的數量和體積。圖3顯示有關皮層中梗死的與圖2類似的數據。圖4顯示按50mg/kg以及輸注時間3分鐘或60分鐘施用Tat_NR2B9c后的血壓變化。圖5顯示,對于7. 6mg/kg Tat_NR2B9c的5分鐘輸注而非1小時輸注(最右欄), 與鹽水安慰劑相比,治療后24小時所測定的梗死的大小顯著降低。定義“嵌合肽”是指天然不彼此連接的兩個肽組分作為融合蛋白或通過化學鍵互相連接而成的肽。“融合”蛋白或多肽是指復合的多肽,即單一的連續氨基酸序列,其由通常不以單一多肽序列的形式融合在一起的兩個(或更多個)不同的、異源的多肽組成。術語“PDZ結構域”是指約90個氨基酸的模塊蛋白質結構域,其特征在于與腦突觸蛋白PSD-95、果蠅的分隔連接蛋白Discs-Large(DLG)、和上皮緊密連接蛋白ZOl (ZOl)具有顯著的序列同一性(例如,至少60% )。PDZ結構域也被稱作Discs-Large同源重復序列 (“DHRs”)和GLGF重復序列。通常,PDZ結構域表現出維持核心共有序列(Doyle, D. Α., 1996,Cell 85 1067-76)。示例性的包含PDZ結構域的蛋白質和PDZ結構域序列公開于美國申請號10/714,537,在此就其全部內容通過參考引用并入本文。術語“PL蛋白”或“PDZ配體蛋白”是指與PDZ-結構域形成分子復合物的天然蛋白質,或是指其羧基端,當與全長蛋白質分開來表達時(例如,作為3-25個殘基的肽片段, 例如3,4,5,8,9,10,12,14或16個殘基),形成這樣的分子復合物的蛋白質。可以對分子復合物進行體內觀察,或者使用描述于例如美國申請號10/714,537中的“A分析法”或“G分析法”進行體外觀察。術語“NMDA受體”或“NMDAR”是指已知與NMDA相互作用的膜相關蛋白(包括以下所描述的各種亞基形式)。該受體可以是人的或非人的(例如,小鼠、大鼠、兔、猴)。“PL基序”是指PL蛋白的C末端氨基酸序列(例如C末端3,4,5,6,7,8,9,10, 12,14,16,20或25個連續的殘基)(“C末端PL序列)或已知結合PDZ結構域的內部序列 (“內部PL序列”)。"PL肽”是包含特異地與PDZ結構域結合的PL基序、或由PL基序組成、或基于PL 基序的肽。術語“分離的”或“純化的”意思是指,目標物(例如,肽)已經從存在于樣品中的污染物中純化出來,所述樣品例如從天然來源獲得的包含目標物的樣品。如果目標物被分離或純化,則其是于樣品中存在的主要大分子(例如,多肽)(即,基于摩爾計,其在組合物中比任何一種其它物更加豐富),以及優選地,目標物占存在的所有大分子物的至少約50% (基于摩爾計算)。通常,分離的、純化的或基本上純的組合物占存在于組合物中的所有大分子物的80%以上至90%。最優選地,目標物被純化至基本同質(即,以常規檢測方法在組合物中不能檢測到污染物),其中組合物基本上由單一一種大分子組成。術語分離的或純化的不必排除旨在與分離物聯合起作用的其它組分的存在。例如,內化肽可以被描述為分離的,盡管其與活性肽連接。“肽模擬物”是指合成的化學化合物,所述化合物具有與天然氨基酸組成的肽基本相同的結構和/或功能特征。肽模擬物可以完全包含氨基酸的合成的非天然類似物,或可以為部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸類似物的嵌合分子。肽模擬物也可以包含任何數量的天然氨基酸保守性替換,只要這樣的替換不實質性改變模擬物的結構和/或抑制或結合活性。多肽模擬組合物可以包含任何組合的非天然結構組分,所述非天然結構組分典型來自3類結構基團a)非天然酰胺鍵(“肽鍵“)連接的殘基連接基團;b)代替天然存在的氨基酸殘基的非天然殘基;或c)誘導二級結構模擬(即誘導或穩定二級結構)的殘基, 所述二級結構例如,β轉角、Y轉角、β折疊、α螺旋構象等。在包含活性肽和內化肽的嵌合肽的肽模擬物中,活性部分或內化部分或兩者均可以為肽模擬物。術語“特異性結合”是指兩個分子例如配體和受體間的結合,其特征在于即使在許多其它不同分子存在的條件下,一個分子(配體)也具有與另一個特定的分子(受體)結合的能力,即在非均質的分子混合物中,一種分子表現出和另一種分子的優先結合。配體和受體的特異性結合也可以通過在存在過量未標記配體時可檢測標記的配體與受體的結合減少(即結合競爭試驗),而證明。興奮性神經毒性是神經元由于興奮性神經遞質谷氨酸的受體(例如NMDA受體 (例如,NMDAR 2Β))的過度激活而被損傷或殺死的病理學過程。術語“受試者”或“患者”包括人和獸醫動物,例如哺乳動物。術語“劑/化學劑”(agent)包括任何化合物,包括具有或不具有藥物活性的化合物、天然化合物、合成的化合物、小分子、肽和肽模擬物。術語“藥劑”是指具有藥理學活性的化學劑。藥劑包括為已知藥物的化合物、藥理學活性已經被鑒定但正在動物模型或臨床試驗中進行進一步治療性評估的化合物。嵌合劑包括與內化肽連接的藥劑。如果一種化學劑在篩選系統中表現出活性,表明該活性劑在疾病的預防或治療中有用或可能有用,則該化學劑可以被描述為具有藥理學活性。篩選系統可以是體外的、細胞的、動物或人。化學劑可以被描述為具有藥理學活性,盡管可能需要進一步的測試來確立其在疾病治療中實際的預防或治療效用。Tat肽是指包含GRKKRRQRRR(SEQ ID NO :1)或由其組成的肽,其中在該序列中不超過5個殘基被缺失、替換或插入,保留了其促進所連接的肽或其它化學劑吸收到細胞中的能力。優選地,任何氨基酸改變為保守替換。優選地,任何替換、缺失或內部插入合計起來使肽保留凈的陽離子電荷,優選地與以上序列的電荷相似。Tat肽的氨基酸可以用生物素或類似的分子衍生化以減輕炎癥反應。將連接到內化肽的藥劑與抗炎藥進行共施用的意思是,這兩種化學劑的用藥時間足夠接近,從而抗炎藥可以抑制由內化肽誘導的炎癥反應。統計上顯著是指ρ值小于0. 05,優選地小于0. 01,以及最優選地小于0. 001。疾病的發作期是指存在疾病的病征和/或癥狀的時期,該時期穿插在沒有病征和 /或癥狀、或病征和/或癥狀表現較輕的更長時期之中。發明詳述I.概要
            本發明提供了動物模型和臨床試驗,用于評估化學劑在治療或預防中風和其它神經疾病中的潛在用途。本發明也提供了該化學劑臨床應用的優選劑量、輸注方案和藥物組合物。11·用于治療疾病的化學劑盡管在以下所描述的動物模型或臨床試驗中可以對任何化學劑(包括在以前的中風臨床試驗中失敗了的化學劑)進行功效篩選,但優選類型的化學劑抑制PSD-95和一種或多種NMDARs之間的相互作用。這樣的化學劑可以用于減輕至少部分由NMDAR興奮性神經毒性介導的中風和其它神經病學狀況的損傷效應。這樣的化學劑包括肽,所述肽具有包含或基于NMDA受體的PL基序或PSD95的PDZ結構域的氨基酸序列。這樣的肽也可以抑制 PSD-95和nNOS以及其它谷氨酸受體(例如,鉀鹽鎂礬(kainite)受體或AMPA受體),例如 KV1-4和GluR6,之間的相互作用。優選的肽抑制突觸后密度蛋白95(PSD-95)的PDZ結構域1和2(人氨基酸序列由Stathakism提供,Genomics 44(1) :71_82 (1997))與一或多種 NMDA受體2亞基的C末端PL序列之間的相互作用,所述NMDA受體2亞基包括神經元N-甲基-D-天冬氨酸受體的 NR2B 亞基(Mandich 等,Genomics 22,216-8 (1994))。NMDAR2B 的 GenBank 識別號為 4099612、其具有 C 末端 20 個氨基酸 FNGSSNGHVYEKLSSIESDV (SEQ IDNO 11)和PL基序ESDV(SEQ ID N0:12)。優選的肽抑制人PSD-95和人NMDAR受體。然而,對于這些蛋白質的物種變體,也能夠顯示出抑制作用。可以使用的NMDA和谷氨酸受體的列表顯示如下表1 具有PL序列的NMDA受體
            名稱 “IGI或Acc# |C末端20mer序列|C末端4mer |PL |內部PL ,
            I序列備ID
            NMDARl 307302 HPTDITGPLNLSDPSVST STVV』X AA216^
            VV (SEP ID NO: 13) (SEQ ID
            ____NO:27)
            NMDARW 292282 HPTDITGPLNLSDPSVST STVV_X AA216^
            VV rSE(3IDNOil3) (SEP ID ι_lNO:27)
            權利要求
            1.治療或預防由興奮性神經毒性介導的疾病的方法,所述方法包括給患病或具有患病風險的受試者施用抑制PSD-95與NMDAR 2B的結合和/或PSD-95與nNOS的結合的藥劑,其中當藥劑為具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 6)的肽時,劑量為2_;3mg/ kg,如果藥劑不是具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽,則劑量遞送與2_;3mg/kg 具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV的肽等效的有效濃度的該藥劑。
            2.權利要求1的方法,其中藥劑為具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQID NO:6)的肽,劑量為2.6mg/kg。
            3.權利要求1的方法,其中每疾病發作期,該劑量施用一次。
            4.權利要求1的方法,其中施用該劑量,不共施用抗炎藥。
            5.治療或預防由興奮性神經毒性介導的疾病的方法,所述方法包括給患病或具有患病風險的受試者施用抑制PSD-95與NMDAR 2B的結合和/或PSD-95與nNOS的結合的藥劑, 其中藥劑與內化肽連接,且通過靜脈內輸注5-15分鐘來施用該藥劑。
            6.權利要求5的方法,其中與內化肽連接的藥劑為具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO :6)的肽,且輸注時間為 5 分鐘。
            7.權利要求6的方法,其中藥劑的劑量為lmg/kg以上。
            8.權利要求6的方法,其中藥劑的劑量為2-;3mg/kg。
            9.權利要求6的方法,其中藥劑的劑量為2.6mg/kg。
            10.權利要求6的方法,其中劑量不超過50mg/kg,條件是如果劑量大于:3mg/kg,則與抗炎藥共施用該劑量。
            11.權利要求5的方法,其中施用該劑量,不共施用抗炎藥。
            12.權利要求5的方法,其中受試者患有中風。
            13.權利要求5的方法,其中受試者正經歷手術。
            14.權利要求13的方法,其中受試者正經歷血管內手術以治療動脈瘤。
            15.抑制缺血性損傷的方法,所述缺陷性損傷來自對連接腦和心臟或向肢體、腎臟、視網膜或脊髓供血的血管進行的血管內手術或神經手術,所述方法包括對經歷血管的血管內手術或神經手術的受試者按有效方案施用抑制PSD-95與NMDAR 2B的結合的化學劑。
            16.權利要求15的方法,其中缺血性損傷來自神經手術,所述神經手術為診斷性腦血管造影術。
            17.權利要求15的方法,其中缺血性損傷來自神經手術,所述神經手術為治療動脈瘤的血管內手術。
            18.權利要求15的方法,其中化學劑在血管內手術之前施用。
            19.權利要求15的方法,其中化學劑在血管內手術完成的1小時內施用。
            20.權利要求15的方法,其中血管內手術包括將線圈置入動脈瘤中。
            21.權利要求15的方法,其中血管內手術包括將支架置入有動脈瘤的血管中。
            22.權利要求15的方法,其中血管內手術包括插入微導管。
            23.對藥劑進行臨床試驗的方法,所述方法包括給在腦血管上或在連接腦和心臟或向肢體、視網膜、腎臟或脊髓供血的血管上接受血管內手術的受試者的群體施用藥劑;并將這些受試者中手術的損傷效應的頻率與接受血管內手術而沒有施用藥劑的對照受試者進行比較,以確定藥劑是否降低了損傷效應。
            24.權利要求23的方法,其中受試者正經歷腦動脈瘤的血管內手術。
            25.權利要求23的方法,其中通過腦梗死的數量和/或大小來評估損傷效應。
            26.權利要求23的方法,其中通過視網膜、腎臟、脊髓或肢體中梗死的數量和/或大小來評估損傷效應。
            27.權利要求23的方法,所述方法還包括在中風的動物模型中測試藥劑。
            28.權利要求23的方法,所述方法還包括在患有中風的人受試者中測試藥劑。
            29.權利要求23的方法,所述方法還包括對用于治療中風的藥劑進行標記。
            30.權利要求23的方法,其中藥劑抑制PSD95與NMDAR2B的結合和/或PSD-95與 nNOS的結合。
            31.測試藥劑的方法,包括a.將微粒置入靈長類動物的腦血管中;b.給靈長類動物施用藥劑;c.將步驟(a)中靈長類動物的損傷效應與沒有以化合物治療的對照靈長類動物進行比較。
            32.權利要求31的方法,其中通過梗死的數量和/或大小來評估損傷效應。
            33.權利要求31的方法,其中通過MRI或CAT掃描來確定梗死。
            34.權利要求31的方法,其中通過與對照靈長類動物比較該靈長類動物的行為癥狀來評估損傷效應。
            35.權利要求31的方法,所述方法還包括在恢復期后對相同靈長類動物重復步驟 (a)-(c),條件是在重復步驟(a)-(c)中測試的藥劑可以與在之前實施步驟(a)-(c)時的相同或不同。
            36.權利要求31的方法,所述方法還包括重復步驟(a)-(c),但對照靈長類動物接受藥齊U,以前接受藥劑的動物為對照動物。
            37.權利要求31的方法,其中藥劑抑制PSD-95與NMDAR2B的結合和/或PSD-95與 nNOS的結合。
            38.權利要求31的方法,所述方法還包括對人中風受試者施用藥劑。
            39.權利要求31的方法,所述方法還包括對經歷動脈瘤的血管內手術的人受試者施用藥劑。
            40.權利要求31的方法,其中在向腦血管中置入微粒之后施用藥劑。
            41.權利要求31的方法,其中在向腦血管中置入微粒之前施用藥劑。
            42.權利要求31的方法,其中微粒為100微米的聚苯乙烯球體。
            43.權利要求42的方法,其中對靈長類動物施用20個球體。
            44.權利要求31的方法,其中靈長類動物為獼猴。
            45.凍干的組合物,所述組合物包含具有氨基酸序列YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQID NO 6)的肽,其從在GMP條件下制備的肽于生理鹽水中的溶液凍干而來。
            46.儲存藥物組合物的方法,所述方法包括將包含具有氨基酸序列 YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO 6)的肽的藥物組合物,以于生理鹽水中10_30mg/ml的濃度,在GMP條件下于低于0°C儲存至少2年的時間。
            47.權利要求46的方法,其中濃度為18-20mg/ml。
            48.權利要求46或47的方法,所述方法還包括對受試者施用藥物組合物。
            全文摘要
            本發明提供用于評估化學劑在治療和預防中風以及其它神經疾病,特別是至少部分地由興奮性神經毒性介導的疾病,中的潛在用途的動物模型和臨床試驗。本發明也提供此化學劑臨床應用的優選劑量、輸注方案和藥物組合物。
            文檔編號A61K38/16GK102458441SQ201080035246
            公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月10日 優先權日2009年6月10日
            發明者J·D·加曼, M·蒂米安斯基 申請人:諾諾公司
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