不含白蛋白的肉毒桿菌毒素制劑的制作方法

專利名稱：不含白蛋白的肉毒桿菌毒素制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及包含肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)的藥物制劑。具體地，本發明涉及通過非蛋白質性質的賦形劑穩定的肉毒桿菌毒素制劑。
背景技術：
肉毒桿菌毒素(也稱為肉毒毒素或肉毒桿菌神經毒素)是由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)產生的神經毒素。肉毒桿菌毒素通過阻止乙酰膽堿穿過神經肌肉接頭(neuromuscular junction)的突觸傳遞或釋放來產生肌肉麻痹。肉毒桿菌毒素的作用基本上阻斷了通常可引起肌肉痙攣或收縮的信號，從而導致麻痹。
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存在8種天然存在的血清學相關的肉毒桿菌毒素，已知其中的7種引起麻痹(即，肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C、D、E、F和G)。這些血清型的每一種通過利用類型特異性抗體的中和作用來區別。然而，對于所有7種活性肉毒桿菌毒素，肉毒桿菌毒素蛋白分子的分子量為約150kD。當由肉毒梭菌釋放時，肉毒桿菌毒素存在于包含150kD肉毒桿菌毒素蛋白分子和結合的非毒素蛋白的復合物中。復合物的總大小可發生變化。例如，肉毒桿菌毒素A型復合物可由肉毒梭菌產生為900kD、500kD和300kD復合物。肉毒桿菌毒素B型和C型復合物只產生為700kD或500kD復合物。肉毒桿菌毒素D型復合物產生為300kD和500kD復合物。肉毒桿菌毒素E型和F型復合物只產生為300kD復合物。所述復合物據認為包含非毒素血凝素蛋白以及非毒素和非毒性非血凝素蛋白。這兩種非毒素蛋白(其和肉毒桿菌毒素分子一起構成相關神經毒素復合物)據認為為肉毒桿菌毒素分子提供抗變性的穩定性和當毒素被攝入時提供抗消化性酸的保護作用。雖然肉毒桿菌毒素是已知對于人最致命的天然存在的毒素，但其已廣泛地用作治療劑和美容劑。例如，在1986年，使用A型肉毒桿菌毒素來治療眉間區域的運動相關的皺紋的可行性首次得到 Schantz 和 Scott, in Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects ofBotulinum, N. Y. Academic Press, 143-150 (1981)的證實。A型肉毒桿菌毒素用于治療皺紋的用途公布于 1992 年(Schantz 和 Scott, in Lewis G.E. (Ed)Biomedical Aspects ofBotulinum, N. Y. Academic Press, 143-150 (1981)),并且到了 1994 年,臉上其他運動相關的皺紋可用A型肉毒桿菌毒素來治療(Scott，Ophthalmol，87 :1044-1049 (1980))。多年來，對美容肉毒桿菌毒素治療的需要穩定地增加，在美國目前肉毒桿菌毒素的年銷售額每年超過10億美元。制造商業肉毒桿菌毒素制劑的一個挑戰是穩定肉毒桿菌毒素。像許多蛋白質一樣，肉毒桿菌毒素可被許多環境因素例如熱、堿性條件、機械剪切力或與反應表面或物質的接觸降解或變性。此外，穩定商業制劑中的肉毒桿菌毒素的困難因毒素的極端毒性而加大，所述極端毒性只允許極少量毒素用于治療目的。如果肉毒桿菌毒素制劑未被適當地穩定，那么極少量的肉毒桿菌毒素可能經歷不想要的反應和/或粘附至其貯存容器的內表面，從而導致不可接受的肉毒桿菌毒素或活性的損失。通常以凍干的(即冷凍干燥的)或真空干燥的粉劑分配商業肉毒桿菌毒素制劑，以防止降解和使肉毒桿菌毒素制劑更易于操作和降低運輸費用。在使用之前，用液體載體例如水或鹽水溶液重建肉毒桿菌毒素粉末制劑。例如，一種商購可得的肉毒桿菌毒素制劑在商標BOTOX_ (Allergan, Inc.，Irvine, Calif.)下出售。以忙存在單獨的小瓶中的真空干燥的粉劑分配BOTOX 制劑，每一個小瓶裝有約100個單位(U)的肉毒梭菌毒素A型復合物、O. 5毫克人血清白蛋白和O. 9毫克氯化鈉。已報導，必須在-10°C或更低的溫度下貯存商業肉毒桿菌毒素制劑以在一年貯存期限內維持標記的效力。在肉毒桿菌毒素的商業制劑中，通常加入人血清白蛋白作為填充載體(bulkcarrier)和穩定劑。通常，白蛋白可通過一個或多個下列機制穩定治療性蛋白質(例如，肉毒桿菌毒素)(1)減少治療性蛋白質至貯存或分配容器的內表面的粘附，所述容器包括玻璃器具、貯存瓶以及用于注射藥物組合物的注射器；和(2)減少治療性蛋白質的變性，特別是在重建以制備治療性蛋白質的溶液后。人血清白蛋白具有呈現最小的免疫原性的額外有 利方面，這減少了人患者產生抗肉毒桿菌毒素制劑的抗體的可能性。雖然人血清白蛋白已被采用為商業肉毒桿菌毒素制劑的穩定劑，但仍然存在與該方法相關的重大問題。一個嚴重的問題是，白蛋白來源于血液，從而易于攜帶血液傳播的病原體或感染劑。例如，人血清白蛋白可攜帶人免疫缺陷病毒(HIV)。白蛋白也可攜帶朊病毒，其為負責引起稱為克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)的神經退行性障礙的蛋白質性質的感染劑。朊病毒在腦中引起蛋白質的錯誤折疊，從而通常在癥狀開始發作后數月的時間跨度內導致癡呆、記憶喪失、說話障礙、運動協調的喪失以及死亡。用非蛋白質性質的穩定劑替代人血清白蛋白的嘗試通常遭遇困難。非蛋白質性質的聚合物可對肉毒桿菌毒素起反應或可包含降解和/或使肉毒桿菌毒素變性的反應性雜質。例如，一些研究已使用泊洛沙姆作為肉毒桿菌毒素的非蛋白質性質的穩定化合物。然而，這些研究報導，重建的泊洛沙姆穩定的肉毒桿菌毒素制劑顯示低肉毒桿菌毒素活性，這表明泊洛沙姆賦形劑不能適當地穩定肉毒桿菌毒素，和/或誘導了不想要的降解反應發生。因此，高度期望具有穩定的、但無蛋白質性質的賦形劑，特別是無任何基于動物蛋白質的賦形劑的肉毒桿菌毒素制劑。此外，高度期望具有本身不與肉毒桿菌毒素反應的非蛋白質性質的穩定賦形劑。發明概述在一個方面，本發明涉及通過非蛋白質性質的賦形劑穩定的肉毒桿菌毒素制劑。具體地，在優選實施方案中，本發明涉及經穩定的但無白蛋白或其他動物蛋白質來源的賦形劑的肉毒桿菌毒素制劑。本發明的一個方面提供包含肉毒桿菌毒素、非還原性二糖或非還原性三糖、非離子型表面活性劑和能夠使PH維持在4. 5至6. 5之間的生理上相容的緩沖劑的液體組合物。液體組合物中的非還原性糖的濃度在10%至40% (w/v)的范圍內并且非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5% (w/v)的范圍內。本發明的另一個方面通過干燥上述液體組合物而提供粉末組合物。本發明還提供了用于穩定肉毒桿菌毒素制劑的方法。所述方法包括組合肉毒桿菌毒素、非還原性二糖或非還原性三糖、非離子型表面活性劑和能夠使PH維持在4. 5至6. 5的生理上相容的緩沖劑成分以形成液體組合物。液體組合物中的非還原性糖的濃度在10%至40% (w/v)的范圍內并且非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5% (w/v)的范圍內。任選地，所述方法還包括干燥液體組合物以產生穩定的粉末組合物。本發明的另一個方面提供包含肉毒桿菌毒素、非還原性二糖或非還原性三糖、非離子型表面活性劑、填充劑(bulking agent)和生理上相容的緩沖劑的液體組合物。在這些實施方案中，非還原性二糖成分的濃度在O. 50至3.0% (w/v)的范圍內，填充劑的濃度在I. 5%至7. 5%的范圍內，非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5% (w/v)的范圍內；并且組合物的PH在4. 5至6. 5的范圍內。此外，選擇非還原性二糖或非還原性三糖的量(相對于填充劑的量)以便當干燥液體組合物時填充劑不結晶。本發明還明確地涉及通過干燥所述液體組合物而制備的粉末制劑。本發明還提供了用于穩定肉毒桿菌毒素制劑的方法，包括組合肉毒桿菌毒素、非 還原性二糖或非還原性三糖、非離子型表面活性劑、填充劑和生理上相容的緩沖劑以形成液體組合物。非還原性二糖成分的濃度在O. 50至3.0% (w/v)的范圍內，填充劑的濃度在I. 5%至7. 5%的范圍內，非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5% (w/v)的范圍內；并且組合物的pH在4. 5至6. 5的范圍內。任選地,所述方法還包括干燥液體組合物以產生穩定的粉末組合物。此外，選擇非還原性二糖或非還原性三糖的量(相對于填充劑的量)以便當干燥液體組合物時，填充劑不結晶。本發明還提供了包含肉毒桿菌毒素、非還原性糖、非離子型表面活性劑、生理上相容的緩沖劑、帶正電荷的肽和任選的填充劑的液體組合物。帶正電荷的肽具有選自下列的氨基酸序列RKKRRQRRR-G- (K) 15-G-RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR_G- (K) 15_G_RGRDDRRQRRR 和 YGRKKRRQRRR-G-(K) 15_G_YGRKKRRQRRR。液體組合物的pH在4. 5至6. 5的范圍內。本發明還明確地涉及通過干燥此類液體組合物而制備的粉末制劑。本發明的另一個方面提供了用于穩定肉毒桿菌毒素制劑的方法，包括組合肉毒桿菌毒素、非還原性糖、非離子型表面活性劑、生理上相容的緩沖劑、帶正電荷的肽和任選的填充劑。帶正電荷的肽和任選的填充劑的液體組合物。帶正電荷的肽具有選自下列的氨基酸序列RKKRRQRRR-G- (K) 15-G-RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR_G- (K) 15_G_RGRDDRRQRRR 和 YGRKKRRQRRR-G- (K) 15-G-YGRKKRRQRRR。液體組合物的pH在4. 5至6. 5的范圍內。任選地，所述方法還包括干燥所述液體組合物以產生穩定的粉末組合物。附圖
概述圖I :在40°C下貯存凍干的肉毒桿菌毒素后，作為時間的函數的恢復的肉毒桿菌
毒素活性。圖2 :在不同的溫度下貯存凍干的肉毒桿菌毒素后，作為時間的函數的恢復的肉毒桿菌毒素活性。圖3 :在不同的溫度下貯存凍干的肉毒桿菌毒素后，作為時間的函數的恢復的肉毒桿菌毒素活性。發明詳述本發明涉及經穩定的、未添加源自(即，純化自)動物來源的蛋白質性質的賦形劑例如白蛋白的肉毒桿菌毒素制劑。因此，本發明的肉毒桿菌毒素制劑不遭受與血液傳播的病原體或其他類型的感染劑相關的潛在問題。本發明還提供了用于制備未添加動物來源的蛋白質性質的賦形劑的肉毒桿菌毒素制劑的方法。在優選實施方案中，制劑根本不包含任何蛋白質性質的賦形劑。然而，在某些實施方案中，非來源于動物來源的蛋白質性質的賦形劑(例如，重組白蛋白或重組明膠)可存在于本發明的制劑中。如本文中與本發明的肉毒桿菌毒素制劑結合使用的，術語“穩定”和其變型(例如，“穩定作用”、“穩定的”、“經穩定的”等)是指在指定的時間段內制劑中肉毒桿菌毒素的生物學活 性的保持，如通過20只小鼠的LD50測定而測量的(參見LB Pearce，RE Borodic,Tox. AppI. Pharmacol, vl28, p69,1994 和 ICCVAM/NICEATM/ECVAM，Scientific Workshopon Alternate Methods to Refine, Reduce and Replace the Mouse LD50 Assay forBotulinum Toxin Testing, 2006年11月14日)。在優選實施方案中，在指定的時間段內肉毒桿菌毒素的生物學活性得到100%保持。然而，在其他實施方案中，在指定的時間段內肉毒桿菌毒素的生物學活性的至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %得到保持。在某些實施方案中，指定的時間段的持續時間可經選擇以與肉毒桿菌毒素產物的制造過程的持續時間一致。例如，指定的時間段的持續時間可經選擇以足以在將肉毒桿菌毒素經歷一個或多個處理步驟時穩定肉毒桿菌毒素。在其他實施方案中，所述指定的時間段可以是大約數周、數月或甚至數年，例如當選擇非毒素制劑成分以允許長期穩定肉毒桿菌毒素制劑以便貯存時的情況。在某些實施方案中，所述指定的時間段是至少2周，至少I個月，至少3個月，至少6個月，至少9個月，至少I年，至少18個月或至少2年。在其他實施方案中，通過使用本發明的制劑，所述指定的時間段與肉毒桿菌毒素保持期望量的生物學活性的時間相一致，所述時間包括例如，如上所述的活性的持續時間。可選擇用于穩定制劑的成分，以允許在低溫(例如，-5至-10°C )下或在環境溫度下穩定，如本文中所描述的。在某些實施方案中，以固體形式提供本發明的肉毒桿菌毒素制劑。例如，可凍干或真空干燥制劑以產生固體制劑。當以固體形式提供本發明的肉毒桿菌毒素制劑，并且在其間測量肉毒桿菌毒素制劑的穩定性的指定的時間段為I周或更短時間時，重建時觀察到的活性據認為為初始恢復時的活性。在本發明的某些優選實施方案中，在初始恢復時活性得到至少70%、80%或90%的保持。在其他實施方案中，在初始恢復時活性得到至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的保持。在特別優選的實施方案中，初始恢復時的活性高于99%并且可以甚至為100%。在其他實施方案中，在給定的貯存溫度下，在其間測量穩定性的指定的時間段超過12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月。當以固體形式提供本發明的肉毒桿菌毒素制劑，并且在其間測量肉毒桿菌毒素制劑的穩定性的指定的時間段為12個月或更長時，重建時觀察到的活性據認為為長期貯存時的活性。在某些優選實施方案中，當長期貯存時肉毒桿菌毒素的活性得到至少70^^80%或90%的保持。在某些實施方案中，當長期貯存時肉毒桿菌毒素的活性得到90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的保持。在某些實施方案中，在25°C下貯存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得到至少90%的保持；在25°C下貯存12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少91 %的保持;在25 °C下貯存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少 92% 的保持；在 25°C下貯存 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少93%的保持；在25°C下貯存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少94%的保持；在25°C下貯存12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少95%的保持;在25°C下貯存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少96% 的保持；在 25°C下貯存 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少97%的保持；在25°〇下貯存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少98 %的保持；或在25 °C下貯存12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23或24個月后，肉毒桿菌毒素的活性得至少99%的保持。
在本發明的某些實施方案中，以液體形式而非固體形式貯存肉毒桿菌毒素制劑。在某些優選實施方案中，根據本發明的液體肉毒桿菌毒素制劑在室溫下保持至少60%、70^^80%或90%的肉毒桿菌毒素活性達到8小時。在特別優選實施方案中，根據本發明的液體肉毒桿菌毒素制劑在室溫下保持100%的肉毒桿菌毒素活性達到8小時。本發明的肉毒桿菌毒素制劑中的賦形劑有利地減少或消除在制造和貯存過程中籍以使肉毒桿菌毒素損失的機制。不希望受理論束縛，據認為，本發明的非蛋白質性質的賦形劑減少或消除不想要的肉毒桿菌毒素至用于制造、貯存或遞送制劑的容器的粘附。此類容器的非限定性實例包括利用玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯和其他聚合物制造的容器。此外，并且再次地不希望受理論限制，據認為，本發明的非蛋白質性質的賦形劑可減少或防止肉毒桿菌毒素與肉毒桿菌毒素在制造、貯存或遞送過程中所遇到的物體或物質之間的不想要的反應。在優選實施方案中，非蛋白質性質的賦形劑對于制劑的其他成分是惰性的。在某些實施方案中，以粉末形式制備肉毒桿菌毒素制劑以易于操作、運輸或貯存。可通過本領域已知的任何方法制備粉劑形式。此類方法的非限定性實例包括冷凍干燥、真空干燥、轉鼓式干燥(drum-drying)和噴霧干燥,其中冷凍干燥和真空干燥是特別優選的。本文中所使用的術語“肉毒桿菌毒素”意欲指任何已知類型的肉毒桿菌毒素，無論是由細菌產生的還是通過重組技術產生的，以及可隨后發現的任何這樣的類型，包括工程變體或融合蛋白。如上文中所提及的，目前，已表征了 7種免疫學獨特的肉毒桿菌神經毒素，即肉毒桿菌神經毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，其每一種通過利用類型特異性抗體的中和作用來區別。肉毒桿菌毒素血清型可從Sigma-Aldrich和從Metabiologics, Inc.(Madison，Wis.)以及從其他來源獲得。肉毒桿菌毒素的不同血清型在它們影響的動物物種方面和在它們引發的麻痹的嚴重性和持續時間方面可發生變化。用于本發明的組合物的肉毒桿菌毒素可選地可以是肉毒桿菌毒素衍生物，即，具有肉毒桿菌毒素活性但相對于天然存在或重組的天然肉毒桿菌毒素而言在任何部分上或任何鏈上包含一種或多種化學或功能改變的化合物。例如，肉毒桿菌毒素可以是經修飾的神經毒素(例如，與天然或重組產生的神經毒素或其衍生物或片段相比較，至少一個其氨基酸被缺失、修飾或替代的神經毒素)。例如，肉毒桿菌毒素可以是已以例如增強其性質或減小其不期望的副作用但仍然保留期望的肉毒桿菌毒素活性的方式修飾的肉毒桿菌毒素。肉毒桿菌毒素可以是由細菌產生的任何肉毒桿菌毒素復合物，如上所述的。可選擇地，肉毒桿菌毒素可以是使用重組或合成化學技術制備的毒素(例如，重組肽、融合蛋白或雜種神經毒素，如從不同肉毒桿菌毒素血清型的亞基或結構域制備的那些(例如，參見美國專利No. 6，444，209))。肉毒桿菌毒素也可以是已顯示具有所需的肉毒桿菌毒素活性的總體分子的一部分，并且在這樣的情況下本身可被使用或作為組合或綴合分子例如融合蛋白的一部分使用。此外，肉毒桿菌毒素可以以肉毒桿菌毒素前體的形式存在，所述前體本身可以是非毒性的，例如在蛋白水解切割后變得有毒性的無毒性鋅蛋白酶。本文中所使用的術語"肉毒桿菌毒素復合物"或"毒素復合物"是指與相關內源非毒素蛋白質(即，由肉毒梭菌產生的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)在一起的約150kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子(屬于肉毒桿菌毒素血清型A-G的任一種)。然而，應指出，肉毒桿菌毒素復合物作為一個單一毒素復合物不必一定來源于肉毒梭菌。例如，可以首先重組制備肉毒桿菌毒素或經修飾的肉毒桿菌毒素，隨后將其與非毒素蛋白組合。還可購買重組肉毒桿菌毒素(例如，從List Biological Laboratories, Campbell, CA購買)，隨后將其與非毒素蛋白組合。本發明還涉及"減少的肉毒桿菌毒素復合物"，其中所述肉毒桿菌毒素復合物具有與在由肉毒梭菌產生的肉毒桿菌毒素復合物中天然發現的量相比較減少量的非毒素蛋 白。在一個實施方案中，使用任何常規的蛋白質分離法，從來源于肉毒梭菌的肉毒桿菌毒素復合物提取一部分血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白，以制備減少的肉毒桿菌毒素復合物。例如，可通過經由在pH 7. 3下暴露于紅細胞而解離肉毒桿菌毒素復合物來產生減少的肉毒桿菌毒素復合物(參見，例如，EP 1514556A1，通過引用引入本文)。可使用HPLC、透析、柱子、離心和其他用于從蛋白質提取蛋白質的方法。可選擇地，當通過將合成產生的肉毒桿菌毒素與非毒素蛋白組合來產生減少的肉毒桿菌毒素復合物時，可簡單地向混合物中加入，與天然存在的肉毒桿菌毒素復合物中存在的量相比，更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白。在根據本發明的減少的肉毒桿菌毒素復合物中，任何非毒素蛋白(例如，血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或兩者)可獨立地減少任何量。在某些示例性實施方案中，一種或多種非毒素蛋白，與肉毒桿菌毒素復合物中通常發現的量相比較，減少至少約O. 5 %、1%、3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一個實施方案中，從肉毒桿菌毒素復合物中除去基本上全部的在來源于肉毒梭菌的肉毒桿菌毒素復合物中通常發現的非毒素蛋白(例如，超過95%的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。在另一個實施方案中，只使用無任何血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白的純肉毒桿菌毒素分子。此夕卜，雖然在某些情況下，內源非毒素蛋白的量可減少相同的量，但本發明還涉及使每一種內源非毒素蛋白減少不同的量，以及減少至少一種內源非毒素蛋白，但不減少其他蛋白質。本發明還涉及肉毒桿菌毒素的組合和混合物的一般用途，盡管由于它們的不同性質和特性，在衛生保健或美容工業中目前通常不施用肉毒桿菌毒素血清型的混合物。本發明的肉毒桿菌毒素制劑包含非離子型表面活性劑。通常，本發明涉及具有穩定肉毒桿菌毒素的能力且適合于藥物用途的任何非離子型表面活性劑的使用。在某些實施方案中，非離子型表面活性劑是聚山梨醇酯，其非限定性實例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80。在其他實施方案中，非離子型表面活性劑是山梨聚糖酯，其非限定性實例包括Span 20>Span 60>Span 65和Span 80。本發明還涉及泊洛沙姆的使用，其非限定性實例包括泊洛沙姆181、泊洛沙姆188和泊洛沙姆407。本發明還涉及將Triton X-100或NP-40用作非離子型表面活性劑。此外，本發明涉及其中聯合使用不同非離子型表面活性劑的組合的實施方案。在某些優選實施方案中，非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯、泊洛沙姆和山梨聚糖，其中聚山梨醇酯和山梨聚糖是特別優選的。在優選實施方案中，非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5%的范圍內，或在O. 01%至O. 2%的范圍內，或在O. 02%至O. I %的范圍內或在O. 05至O. 08%的范圍內。本發明還涉及其中非離子型表面活性劑的濃度為O. 01%,O. 02%,O. 03%,O. 04%,O. 05%,O. 06%,O. 07%,O. 08%,O. 09%,O. 10%,O. 11%,O. 12%,O. 13%,O. 14%或 O. 15%的制劑。本發明的肉毒桿菌毒素包含非還原性糖。在優選實施方案中，非還原性糖具有高于55°C、57°C或60°C的玻璃轉化溫度。不希望受理論束縛，據認為，此類玻璃轉化溫度高至足以抑制引起肉毒桿菌毒素變性的不期望的分子運動。在某些特 別優選的實施方案中，非還原性糖是二糖，其非限定性實例包括海藻糖和蔗糖。在其他實施方案中，非還原性糖是三糖，其非限定性實例是棉子糖。通常，本發明的肉毒桿菌毒素制劑中非還原性糖的濃度在10%至40% (w/v),優選10%至25% (w/v),更優選15%至20% (w/v)的范圍內。在某些優選實施方案中，非還原性糖的濃度為10%、11 %、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20% (w/v) 0當非還原性糖是海藻糖時，優選地海藻糖的水合形式(即，海藻糖-二水合物)用于制備制劑，雖然同樣還涉及海藻糖的無水形式的使用。此外，本發明的一個方面是認識到非還原性糖的選擇可用于將肉毒桿菌毒素制劑的穩定性確定為溫度的函數。例如，當肉毒桿菌毒素制劑經歷無冷凍的條件時，有利地使用海藻糖作為非還原性糖，因為海藻糖在環境溫度下賦予肉毒桿菌毒素穩定性。因此，可在不同制造過程中在環境溫度下有利地加工本發明的含海藻糖制劑而無肉毒桿菌毒素活性的可察覺的損失。在其中將冷卻肉毒桿菌毒素制劑的情況下(例如，在持續數月或甚至數年的長期貯存過程中)，可選擇蔗糖作為非還原性糖。本發明還涉及糖的混合物。例如，在某些實施方案中，將蔗糖和海藻糖二者加入肉毒桿菌毒素制劑。糖混合物的成分的比率將取決于要實現的效果并且可通過常規實驗來確定。也在本發明的范圍內的是，在純化、制造或貯存的不同階段過程中單獨或組合地使用不同的非還原性糖，例如二糖。因此，例如，可在較高的溫度(例如，環境溫度)下在初始加工和/或純化的過程中使用海藻糖，隨后除去海藻糖并且用蔗糖替代海藻糖。可以通過例如透析、層析或本領域內已知的其他方法實現一種非還原性糖例如二糖的去除和對另一種糖的替代。本發明的另一個方面是認識到本文中指定的非還原性糖(或糖類)對于某些實施方案可用作固體肉毒桿菌毒素制劑的主要填充劑。具體地，已發現，非還原性糖，當以本文中指定的量加入時，可在凍干或真空干燥肉毒桿菌毒素制劑后形成穩定且力學上堅固的餅狀物。不希望受理論限制，據認為此類制劑中的非還原性糖形成無定型固體，其中非還原性糖上的羥基隨機確定非還原性糖的方向以使氫鍵鍵合最大化，這穩定了肉毒桿菌毒素并且賦予固體餅狀物力學堅固性。在某些優選實施方案中，本文中描述的非還原性糖用作肉毒桿菌毒素制劑的唯一填充劑。在其他優選實施方案中，非還原性糖用作主要填充劑，但向肉毒桿菌毒素制劑加入少量第二填充劑。第二填充劑不受特別限制，并且可以是對肉毒桿菌毒素制劑的穩定性不具有不可接受的不利作用的任何填充劑。當使用具有結晶傾向的第二填充劑時，優選以足夠低的濃度加入它們，以便它們不能結晶。不希望受理論限制，據認為此類第二填充劑的結晶對在凍干或真空干燥后獲得的固體餅狀物的穩定性具有不利影響。本發明的其他方面是出人意料的結果非還原性糖，在本文中描述的濃度上，不僅可用于穩定凍干的肉毒桿菌毒素制劑，而且還可用于穩定溶液相中的肉毒桿菌毒素制劑。在優選實施方案中，肉毒桿菌毒素制劑包含緩沖劑。通常，能夠使pH維持在4. 5至6. 5的范圍內，更優選在5至6的范圍內以及最優選在約5. 5的任何生理上相容的緩沖劑適合用于本發明的肉毒桿菌毒素制劑。此類緩沖劑的非限定性實例包括包含檸檬酸、醋酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸和組氨酸的鹽的緩沖劑。適當的緩沖劑濃度的非限定性實例包括在O. 400%至O. 600%；0. 450%至O. 575%或O. 500%至O. 565%的范圍內的緩沖劑濃度。本發明還涉及包含緩沖鹽的混合物的肉毒桿菌毒素制劑，所述混合物的非限定性實例包括檸檬酸鹽/醋酸鹽、檸檬酸鹽/組氨酸、檸檬酸鹽/酒石酸鹽、馬來酸鹽/組氨酸或琥珀酸鹽/組氨酸。在某些優選實施方案中，緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑。在某些實施方案中，肉毒桿菌毒素制劑包含使得更易于操作肉毒桿菌毒素制劑的凍干形式的填充劑(除了非還原性糖外)。在某些優選實施方案中，填充劑在冷凍干燥條件
下結晶并且當以固體狀態存在時不與其他賦形劑充分混合。然而，在其他優選實施方案中，填充劑在冷凍干燥條件下保持無定形，即使已知其在冷凍過程中具有結晶的傾向(例如，甘露醇或甘氨酸)。如本領域技術人員所理解的，填充劑在冷凍干燥過程中是結晶還是保持無定形受若干因素控制，包括填充劑的類型、填充劑相對于制劑的其他成分的量以及冷凍干燥制劑的速率。在某些優選實施方案中，調整非還原性糖相對于填充劑的量以抑制填充劑的結晶。在該情況下，基于重量百分比，非還原性糖對填充劑的比率可以大于O. 33 I ；0.5 1,0. 75 : I ;1 : I ;2 : 1，3 : I或4 : I。本發明涉及的填充劑的非限制性實例包括山梨醇、甘露醇、甘氨酸、精氨酸和組氨酸。在某些實施方案中，填充劑的濃度可在1%至10%，2%至6%，3%至5%或4%至4. 5% (w/v)的范圍內。在某些優選實施方案中，當使用填充劑時，非還原性糖的濃度可從10%至40% (w/v)的范圍減少至O. 5%至3. O % (w/V)的范圍。此外，在某些優選實施方案中，非還原性糖對填充劑的比率在O. 07至2. O的范圍內，優選在O. 4至O. 6的范圍內。因此，例如，制劑可包含甘露醇作為填充劑以及海藻糖二水合物作為非還原性糖，其中甘露醇以I. 5%至7. 5% (w/v)的濃度范圍存在并且海藻糖以O. 5%至3.0% (w/v)的濃度范圍存在。優選，填充劑不是氯化鈉。可通過任何常規施用途徑施用本發明的肉毒桿菌毒素制劑。在本發明的某些實施方案中，通過肌內或皮下注射將肉毒桿菌毒素制劑施用至受試者中。在其他實施方案中，局部施用肉毒桿菌毒素制劑。無論局部施用還是通過注射施用肉毒桿菌毒素制劑，所述制劑可包含具有帶正電荷的效應基團(efficiency group)的帶正電荷的載體(如上文中所描述的)以促進肉毒桿菌毒素至目標組織內的滲透。然而，應當指出，帶正電荷的載體不是穩定所必需的，并且本發明涉及其中制劑不包含這樣的帶正電荷的載體的實施方案。本發明的肉毒桿菌毒素制劑也可通過藥物遞送裝置來施用，其非限定性實例是皮膚貼劑。當局部施用肉毒桿菌毒素制劑時，有利地在制劑中包含具有帶正電荷的分支基團的帶正電荷的載體(如上文中所描述的)，以促進肉毒桿菌毒素的經皮滲透(也參見美國專利申請09/910，432 ;11/073，307 ；11/072, 026和10/793，138，將每一個所述專利申請通過引用整體并入本文)。在不使用帶正電荷的載體或某些增強經皮運輸的其他手段的情況下，預期局部施用的肉毒桿菌毒素的經皮通量相當低。應當指出，除了本文中描述的帶正電荷的載體的使用外，對于本發明的肉毒桿菌毒素制劑，本發明還涉及增強經皮運輸的其他方法的使用。此類方法的非限定性實例包括使用脂質體、電離子透入療法(iontophoresis)、膠束等進行的肉毒桿菌毒素制劑的經皮遞送。此外，當局部施用肉毒桿菌毒素制劑時，通常有利地將它們與膠凝劑和/或粘度調節劑(viscosity-modifying agent)混合以增加制劑的粘度,從而使肉毒桿菌毒素的施用更容易和更精確。此外，如果使用帶正電荷的載體，那么這些試劑可幫助防止含水肉毒桿菌毒素/載體制劑干掉(這傾向于引起肉毒桿菌毒素的活性降低)。特別優選的試劑是不帶電荷的并且不干擾肉毒桿菌毒素活性或毒素-載體復合物穿過皮膚的效率的那些試劑。例如，膠凝劑可以是某些基于纖維素的膠凝劑，例如羥丙纖維素(HPC)。在某些實施方案中，將肉毒桿菌毒素/載體復合物配制于具有2-4% HPC的組合物中。可選擇地，可通過加入聚乙二醇(PEG)改變含有肉毒桿菌毒素/載體復合物的溶液的粘度。在其他實施方案中，將肉毒桿菌毒素/載體溶液與預混合的粘性試劑例如Cetaphil 濕潤劑組合。在其他實施方案中，粘度調節劑是泊洛沙姆，其非限定性實例包括泊洛沙姆188和泊洛沙姆407。粘度調節劑還可以是聚丙烯酸、聚酰胺或植物膠(例如，瓜爾膠)。此外，可將本文中描述的肉毒桿菌毒素制劑與賦形劑混合，以形成乳劑(包括微乳劑)、懸浮劑、乳膏劑、洗劑、凝膠、粉劑或用于給皮膚或其中可使用所述組合物的其他組織施用的其他常見的固體或液體組合 物。此類組合物還可包含通常用于此類產品的其他成分，例如抗微生物劑、濕潤劑和水化劑(hydration agent)、滲透劑、防腐齊U、乳化齊U、天然或合成油、溶齊U、表面活性劑、去垢劑、潤滑劑、抗氧化劑、芳香劑、充填劑(fi 11 er)、增稠劑、蠟、氣味吸收劑、染料、著色劑、粉劑，和任選地麻醉劑、抗癢添加劑(anti-itch additive)、植物提取物、調理劑(conditioningagent)、增深劑(darkening agent)或增白劑(lightening agent)、閃爍劑(glitter)、保濕劑(humectant)、云母(mica)、礦物質、多酹、娃酮或其衍生物、防曬劑、維生素和植物藥物(phytomedicinal)。本發明還提供了用于制備和/或施用本發明的肉毒桿菌毒素制劑的試劑盒。在某些實施方案中，試劑盒包括肉毒桿菌毒素以及產生根據本發明的穩定的制劑所需的此類另外的賦形劑。試劑盒還可包括可用于產生這樣的制劑的預混合物。在其他實施方案中，試劑盒包括已被凍干的根據本發明的肉毒桿菌毒素制劑和用于遞送所述制劑的裝置，其非限定性實例是注射器。本發明提供了在治療過程中將“治療量”的肉毒桿菌毒素遞送至受試者的制劑。如本文中所使用的，術語“治療量”是指足以產生期望的效果(例如，肌肉的松弛，皺紋的治療，疼痛的治療或活動過度的腺例如汗腺的活動的減少)的肉毒桿菌毒素的量。肉毒桿菌毒素的“治療量”隱含地理解為不引起不想要的麻痹或其他不期望的或有害的副作用的安全量。施用的肉毒桿菌毒素的具體量將取決于幾個因素，包括施用途徑、施用位置、待治療的適應癥和特定制劑中的肉毒桿菌毒素的血清型。例如，當選擇A型血清型肉毒桿菌毒素時，治療量可在10U至150U或1，000U至2，500U的范圍內。在其他優選實施方案中，治療量的范圍為400U至800U和I, 000U至50，000U,優選2，000至35，000U,更優選3，000U至30，000U,以及更優選4，000U至25，000U。在某些實施方案中，治療量的范圍為4，000U至8，000U, 9，000U 至 19，000U 或 20，000U 至 40，000U。施用本發明的組合物以引起期望的效果，所述效果可以是美容或治療效果。期望的效果包括某些肌肉的松弛(目的在于例如，減少細紋和/或皺紋的出現(特別是在臉上)或以其他方式調整面容例如拓寬眼睛、提升嘴角或抹平從上唇散開的紋)，或肌張力的總體緩解。可在臉或其他地方實現最后提及的效果，肌張力的總體緩解。本發明的組合物可包含適當有效量的肉毒桿菌毒素以用作單劑量治療，或可被更加濃縮以用于在施用的位置稀釋或用于多次施用。可給受試者施用穩定的肉毒桿菌毒素復合物或穩定的減少的肉毒桿菌毒素復合物，以治療狀況例如不期望的面肌或其他肌痙攣、多汗癥、痤瘡或其中期望緩解肌肉疼痛或痙攣的身體其他地方的狀況。將肉毒桿菌毒素施用遞送至肌肉或至其他皮膚相關結構。 可對例如臉、腿、肩、背(包括腰)、腋、掌、足、頸、腹股溝、手或足的背部、肘、上臂、膝、大腿、臀部、軀干、骨盆或期望施用肉毒桿菌毒素的身體的任何其他部分進行施用。在某些優選實施方案中，本發明的肉毒桿菌毒素制劑包含具有帶正電荷的效應基團的帶正電荷的載體。在該情況下，帶正電荷的載體以足以促進肉毒桿菌毒素至目標組織的滲透的量存在。如本文中所使用的，術語“帶正電荷的”意指載體在至少某些溶液相條件下，更優選在至少某些生理上相容的條件下具有正電荷。更具體地，“帶正電荷的”意指所述基團包含在所有pH條件下帶電荷的官能性(例如季胺)，或包含可在某些溶液相條件下獲得正電荷(例如在伯胺的情況下，PH的改變)的官能性。更優選，本文中所使用的“帶正電荷的”是指，在生理上相容的條件下具有與陰離子締合的行為的那些基團。具有多個帶正電荷的部分的聚合物不必一定是同聚物，這對于本領域技術人員來說是顯然的。帶正電荷的部分的其他實例在現有技術中是公知的并且可容易地使用，這對于本領域技術人員來說是顯然的。通常，帶正電荷的載體包含帶正電荷的主鏈，其通常是原子鏈，并且在生理pH下在鏈中具有攜帶正電荷的基團，或攜帶正電荷的基團連接至從主鏈延伸的側鏈。優選，帶正電荷的主鏈本身不具有確定的酶促或治療生物學活性。線性主鏈是烴主鏈，其在某些實施方案中被選自氮、氧、硫、硅和磷的雜原子間隔。大部分主鏈鏈原子通常是碳。此外，主鏈通常是重復單位的聚合物(例如，氨基酸、聚(氧乙烯)、聚(丙烯胺)、聚亞烷基亞胺(polyalkyleneimine)等)，但也可以是異聚物。在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈是聚丙烯胺(polypropyleneamine),其中許多胺的氮原子作為攜帶正電荷的銨基(四取代的)存在。在另一個實施方案中，帶正電荷的主鏈是非肽基聚合物，其可以是異聚物或同聚物例如聚亞烷基亞胺，例如聚乙烯亞胺或聚丙烯亞胺，其具有約100至約2，500, 000D，優選約250至約1，800, 000D，最優選約1000至約1，400, 000D的分子量。在另一組實施方案中，主鏈已連接多個側鏈部分，所述側鏈部分包含帶正電荷的基團(例如，銨基、吡啶鎗基、鱗基(phosphonium group)、锍基、胍鐵基或脒鐵基)。該組實施方案中的側鏈部分可沿主鏈間隔放置，其間隔是一致的或可變的。此外，側鏈的長度可以相似或不相似。例如，在一組實施方案中，側鏈可以是具有I至20個碳原子并且在遠端(遠離主鏈)以上述帶正電荷的基團之一終止的線性或分支烴鏈。在本發明的所有方面，載體與肉毒桿菌毒素之間的結合是通過非共價相互作用進行的，其非限定性實例包括離子相互作用、氫鍵鍵合、范德瓦爾斯力或其組合。在一組實施方案中，帶正電荷的主鏈是具有多個帶正電荷的側鏈基團(例如，賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸、高精氨酸等)的多肽。優選，所述多肽具有約100至約1，500，000D，更優選約250至約1，200, 000D，最優選約1000至約1，000, 000D的分子量。本領域技術人員將理解，當將氨基酸用于本發明的該部分時，側鏈可在連接的中心具有D-或L-型(R或S構型)。在某些優選實施方案中，多肽具有約500至約5000D，更優選1000至約4000D，更優選約2000至約3000D的分子量。在其他實施方案中，多肽具有至少約10，000的分子量。在另一個實施方案中，主鏈部分是聚賴氨酸并且效應基團，如本文中所描述的，連接至所述聚賴氨酸。聚賴氨酸可具有約100至約1，500, 000D,優選約250至約1，200, 000D,最優選約1000至約3000D的分子量。在一個示例性實施方案中，具有帶正電荷的效應基團的帶正電荷的載體是具有氨基酸序列RKKRRQRRR-G-(K) 15_G_RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G-(K) 15-G-RGRDDRRQRRR 或 YGRKKRRQRRR-G- (K) 15_G_YGRKKRRQRRR 的肽。其也可以是任何商購可得(Sigma Chemical Company, St. Louis,Mo. ,USA)的聚賴氨酸，例如具有 MW > 70，000D的聚賴氨酸，具有70，000至150，000D的MW的聚賴氨酸，具有MW 150, 000至300，000D的聚賴氨酸和具有MW > 300，000D的聚賴氨酸。適當的聚賴氨酸的選擇將取決于組合物的其余成分并且足以給組合物提供總體凈正電荷，并且提供優選為帶負電荷的成分的組合長度的I至4倍的長度。可選擇地，主鏈可以是多肽的類似物例如類肽。參見，例如，Kessler,Angew. Chem.Int. Ed. Engl. 32 :543 (1993) :Zuckermann 等人 Chemtracts—MacromoI. Chem. 4 :80(1992)；和 Simon 等人 Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 89:9367(1992))。簡而言之，類肽是其中側鏈 連接至主鏈氮原子而非α-碳原子的多聚甘氨酸。如上所述，一部分側鏈通常以帶正電荷的基團終止，以提供帶正電荷的主鏈成分。類肽的合成描述于例如美國專利5，877，278中，其通過引用整體并入本文。當在本文中使用該術語時，具有類肽主鏈結構的帶正電荷的主鏈被認為是“非肽”，因為它們不由在α -碳位置上具有天然存在的側鏈的氨基酸組成。可使用許多種其他主鏈，其采用例如多肽的空間或電子模擬物，其中肽的酰胺鍵被替代物替代，例如酯鍵、硫代酰胺(--CSNH--)、反向硫代酰胺(--NHCS--)、氨基亞甲基(-NHCH2-)或反向亞甲基氨基(一CH2NH--)基團、酮亞甲基(--COCH2--)基團、亞膦酸酯(一PO2RCH2—)、氨基磷酸鹽和氨基磷酸酯(一PO2RNH—)、反向肽(一NHCO—)、反式烯烴(—CR = CH—)、氣代稀經(—CF = CH—)、二亞甲基(一CH2CH2—)、硫釀(—CH2S—)、輕基亞乙基(--CH(OH)CH2-)、亞甲基氧(一CH2O--)、四唑(CN4)、磺酰氨基(--SO2NH-)、亞甲基磺酰氨基(--CHRSO2NH--)、反向亞酰氨基(--NHSO2--)，以及具有丙二酸鹽(酯)和/或偕-二氨基-烷基亞單位的主鏈，例如，如由Fletcher等人((1998) Chem. Rev. 98 :763)綜述的和由其中引用的參考文獻詳細描述的。許多上述置換導致，相對于由α-氨基酸形成的主鏈，大致電子等排的聚合物主鏈。在上文提供的每一個主鏈中，可附加攜帶帶正電荷的基團的側鏈基團。例如，磺酰胺基連接的主鏈(--SO2NH-和--NHSO2--)可具有連接至氮原子的側鏈基團。類似地，羥基亞乙基(--CH(OH)CH2--)連接可攜帶連接至羥基取代基的側鏈基團。通過使用標準合成方法，本領域技術人員可容易地采用其他連接化學來提供帶正電荷的側鏈基團。在本發明的某些實施方案中，帶正電荷的載體包含帶正電荷的效應基團。效應基團的非限定性實例包括-(gly)nl_(arg)n2 (其中下標nl是O至20，更優選O至8，更優選2至5的整數，并且下標n2獨立地是約5至約25，更優選約7至約17，最優選約7至約13的奇整數)、HIV-TAT或其片段、或Antennapedia PTD或其片段。優選，側鏈或分支基團具有上述通式-(glyU-brg),其他優選實施方案是，其中分支或效應基團是具有式(gly) P-RGRDDRRQRRR- (gly) q、(gly) p-YGRKKRRQRRR- (gly) q 或(gly) p-RKKRRQRRR- (gly) q 的HIV-TAT片段的那些基團，其中下標P和q各自獨立地是O至20的整數并且所述片段通過片段的C末端或N末端連接至載體分子。側鏈分支基團在連接的中心可具有D-或L-型(R或S構型)。優選的HIV-TAT片段是這樣的片段，其中下標P和q各自獨立地是O至8，更優選2至5的整數。其他優選實施方案是，其中分支基團為Antennapedia PTD基團或其片段(所述片段保留所述基團的活性)的那些實施方案。這些在本領域內是已知的，例如參見，Console等人，T. Biol. Chem. 278 :35109 (2003)。優選，帶正電荷的載體按總載體重量的百分比計，以至少約O. 05%，優選約O. 05至約45重量％，最優選約O. I至約30重量％的量包含側鏈，帶正電荷的分支基團。對于具有式_(gly)nl_(arg)n2的帶正電荷的分支基團，最優選的量為約O. I至約25%。下列實施例意欲提供本發明的不同實施方案的非限定性舉例說明。如本領域技術人員將理解的，可進行改變而不背離本發明的精神和范圍。
實施例實施例I :肉毒桿菌毒素制劑的制備 通過將適當量的海藻糖二水合物、聚山梨醇酯-20、組氨酸和鹽酸組氨酸組合以產生2x制劑儲備液來制備本發明的示例性肉毒桿菌毒素制劑，所述制劑儲備液包含36%海藻糖二水合物、O. 05%聚山梨醇酯-20和I. 126%組氨酸(pH 5. 5)。將溶液冷卻至4°C。通過離心從硫酸銨儲備懸浮液沉淀肉毒桿菌毒素API。將毒素沉淀溶解在具有O. 05%聚山梨醇酯-20的O. 56%組氨酸緩沖劑(pH 5. 5)中。用組氨酸/聚山梨醇酯_20溶液進一步稀釋該溶液以產生I. 074 μ g/mL溶液的毒素儲備液。通過將充足的肽溶解至水中以產生6.0mg/mL肽的溶液來制備載體肽RKKRRQRRR-G-(K) 15_G_RKKRRQRRR的儲備液。將毒素儲備液、肽儲備液、O. 56%組氨酸緩沖劑和2x制劑儲備液組合以產生由18%海藻糖二水合物、O. 025%聚山梨醇酯-20、0. 56%組氨酸緩沖劑、55ng/mL毒素和150 μ g/mL載體肽組成的制劑原料藥產品。實施例2 :肉毒桿菌毒素制劑的冷凍干燥本實施例提供了用于根據本發明的肉毒桿菌毒素制劑的冷凍干燥方法。將實施例I中描述的制劑原料藥產品的200 μ L等分轉移至55個2-mL玻璃瓶的每一個中。將灰色丁基橡膠冷凍干燥塞寬松地置于玻璃瓶的上方。將小瓶置于冷凍干燥器中并且起始冷凍干燥。冷凍干燥法包括3個主要階段(I)冷凍階段；(2)第一干燥階段；和(3)第二干燥階段。這3個主要階段的每一個階段包括一個或多個單獨的處理步驟，其在下面指定的溫度和壓力下進行。完成第一干燥所需的第一干燥時間視瓶子的數目和瓶子中的填充體積而變化。冷凍
步驟速度/保持 °c分鐘
1H550
2R-4560
3H-45120
冷凍，冷凝器和抽真空冷凍溫度-4CTCShelf 或 Product Ave額外冷凍時間0分鐘真空起始允許-45Avg Cond0C熱起始允許200mTorr第一干燥
步驟速度/保持 0C分鐘mTorr
1H-45150150
2H-332520150
3R-25990150
4H-25275150
5H-15240150
6HO300150
7R25180150 8H25120150第二干燥步驟IH27160100實施例3 :具有海藻糖二水合物的肉毒桿菌毒素制劑的穩定性圖I和2顯示穩定性研究的結果，在所述研究中，如上所述制備利用海藻糖二水合物制備的兩種不同毒素濃度(llng/瓶和I. Ing/瓶)的成瓶的肉毒桿菌毒素制劑，將其于4°C、25°C和40°C下貯存，并且在指定的時間點上進行測試以測定肉毒桿菌毒素的生物學活性，進行長達18個月的持續時間。使用LD5tl小鼠測定法測量活性，并且將活性在圖I和2中報告為肉毒桿菌毒素的當量單位/瓶。在實驗開始時(t = O)，觀察到的活性為1802個單位的肉毒桿菌毒素/瓶(對于圖I中的制劑)和192個單位的肉毒桿菌毒素/瓶(對于圖2中的制劑)。圖I和2中觀察到的肉毒桿菌毒素活性的變異性據認為由使用LD5tl小鼠測定法和小樣本數量(η = I瓶/溫度-時間點)獲得的數據的固有噪聲導致。盡管存在該變異性，但數據仍然顯示，在該18個月的研究中，甚至在40°C的貯存溫度下，不存在損失恢復的活性的傾向。這些數據提供了本發明的示例性肉毒桿菌毒素制劑的穩定性的實例。實施例4 :具有蔗糖的肉毒桿菌毒素制劑的穩定性圖3顯示穩定性研究的結果，在所述研究中，使用上文中對于含海藻糖的制劑所描述的方案，制備成瓶的具有蔗糖的IIng/瓶的肉毒桿菌毒素制劑，將其在4°C和25°C下貯存，并且在指定的時間點進行測試以測定肉毒桿菌毒素的生物學活性，進行達18個月的持續時間。使用如上所述的LD5tl小鼠測定法測量活性，并且將活性在圖3中報告為肉毒桿菌毒素的當量單位/瓶。在實驗開始時(t = O)，觀察到的活性為2299個單位的肉毒桿菌毒素/瓶。圖3中觀察到的肉毒桿菌毒素活性的變異性據認為由使用LD5tl小鼠測定法和小樣本數量(η = I瓶/溫度-時間點)獲得的數據的固有噪聲導致。盡管存在該變異性，但數據仍然顯示，在該18個月的研究中，甚至在25°C的貯存溫度下，不存在損失恢復的活性的傾向。這些數據提供了本發明的示例性肉毒桿菌毒素制劑的穩定性的實例。實施例5 :具有填充劑的肉毒桿菌毒素制劑的冷凍干燥在本實施例中，通過將適當量的海藻糖二水合物、甘露醇、聚山梨醇酯-20、組氨酸和鹽酸組氨酸組合以產生制劑儲備液來制備肉毒桿菌毒素制劑，所述制劑儲備液包含3%海藻糖二水合物、7. 5%甘露醇、O. 05%聚山梨醇酯-20和O. 563%組氨酸(pH 5. 5)。將溶液冷卻至4°C。通過離心從硫酸銨儲備懸浮液沉淀肉毒桿菌毒素API。將毒素沉淀溶解在制劑儲備液中。該溶液的濃度為117 μ g/mL。用相同的溶液將該溶液進一步稀釋至11. 7μ g/mL的終毒素儲備液濃度。將充足量的具有氨基酸序列RKKRRQRRR-G-(K) 15-G-RKKRRQRRR的載體肽溶解在水中以制備20mg/mL的載體肽儲備液。組合這些溶液以產生具有3%海藻糖二水合物、7. 5%甘露醇、O. 05%聚山梨醇酯-20和O. 563%組氨酸(pH5. 5)、75 μ g/mL載體肽和5. 5ng/mL毒素的終組成的制劑原料藥產品。將制劑原料藥產品的200 μ L等分加入192個2_mL玻璃冷凍干燥瓶的每一個瓶中。將灰色丁基橡膠塞寬松地置于小瓶的上方。將小瓶置于冷凍干燥器中并且起始冷凍干燥。如先前的實施例一樣，冷凍干燥法包括3個主要階段(I)冷凍階段；(2)第一干燥階段；和(3)第二干燥階段。這3個主要階段的每一個階段包括一個或多個單獨的處理步驟，其在下面指定的溫度和壓力下進行冷凍
權利要求
1.一種液體組合物，其包含 肉毒桿菌毒素， 非還原性二糖或非還原性三糖， 非離子型表面活性劑，和 生理上相容的緩沖劑； 其中所述非還原性二糖或非還原性三糖的濃度在10%至40% (w/v)的范圍內， 其中所述非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5% (w/v)的范圍內，和 其中所述液體組合物的pH在4. 5至6. 5的范圍內。
2.權利要求I的液體組合物，其中所述非原性二糖選自海藻糖二水合物、蔗糖及其組合。
3.權利要求I的液體組合物，其中所述非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯、山梨聚糖酯、Triton X-100、NP-40、泊洛沙姆及其組合。
4.權利要求I的液體組合物，其中使用選自下列的鹽來制備所述緩沖劑檸檬酸的鹽、醋酸的鹽、琥珀酸的鹽、酒石酸的鹽、馬來酸的鹽和組氨酸的鹽。
5.權利要求I的液體組合物，其還包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與之連接的帶正電荷的效應基團。
6.權利要求5的液體組合物，其中具有帶正電荷的效應基團的帶正電荷的主鏈是具有選自下列的氨基酸序列的肽RKKRRQRRR-G- (K) 15_G_RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G- (K) 15_G_RGRDDRRQRRR和 YGRKKRRQRRR-G-(K) 15_G_YGRKKRRQRRR。
7.權利要求I的液體組合物，其中所述肉毒桿菌毒素以治療量存在。
8.權利要求I的液體組合物，其中所述肉毒桿菌毒素獲自選自A、B、C、D、E、F和G型的肉毒梭菌細菌的血清型。
9.一種通過干燥權利要求I的液體組合物而制備的粉末組合物。
10.權利要求9的粉末組合物，其中所述非原性二糖選自海藻糖二水合物、蔗糖及其組八口 ο
11.權利要求9的粉末組合物，其中所述非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯、山梨聚糖酯、Triton X-100、NP-40、泊洛沙姆及其組合。
12.權利要求9的粉末組合物，其中使用選自下列的鹽來制備所述緩沖劑檸檬酸的鹽、醋酸的鹽、琥珀酸的鹽、酒石酸的鹽、馬來酸的鹽和組氨酸的鹽。
13.權利要求9的粉末組合物，其還包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與之連接的帶正電荷的效應基團。
14.權利要求13的粉末組合物，其中具有帶正電荷的效應基團的帶正電荷的主鏈是具有選自下列的氨基酸序列的肽RKKRRQRRR-G- (K) 15_G_RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G- (K) 15_G-RGRDDRRQRRR和 YGRKKRRQRRR-G-(K) 15_G_YGRKKRRQRRR。
15.權利要求9的粉末組合物，其中所述冷凍干燥的組合物包含治療量的肉毒桿菌毒素。
16.權利要求9的粉末組合物，其中所述肉毒桿菌毒素獲自選自A、B、C、D、E、F和G型的肉毒梭菌細菌的血清型。
17.一種液體組合物,其包含肉毒桿菌毒素， 非還原性二糖或非還原性三糖， 非離子型表面活性劑， 填充劑，和 生理上相容的緩沖劑； 其中所述非還原性二糖的濃度在O. 50至3.0% (w/v)的范圍內， 其中所述填充劑的濃度在I. 5%至7. 5%的范圍內， 其中所述非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5% (w/v)的范圍內， 其中相對于填充劑的量，選擇所述非還原性二糖或非還原性三糖的量，以便當干燥液體組合物時，所述填充劑不結晶； 和其中所述組合物的pH在4. 5至6. 5的范圍內。
18.權利要求17的液體組合物，其中所述非還原性二糖選自海藻糖二水合物、蔗糖及其組合。
19.權利要求17的液體組合物，其中所述非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯、山梨聚糖酯、Triton X-100、NP-40、泊洛沙姆及其組合。
20.權利要求17的液體組合物，其中使用選自下列的鹽來制備所述緩沖劑檸檬酸的鹽、醋酸的鹽、琥珀酸的鹽、酒石酸的鹽、馬來酸的鹽和組氨酸的鹽。
21.權利要求17的液體組合物，其還包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與之連接的帶正電荷的效應基團。
22.權利要求21的液體組合物，其中具有帶正電荷的效應基團的帶正電荷的主鏈是具有選自下列的氨基酸序列的肽RKKRRQRRR-G- (K) 15_G_RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G- (K) 15_G-RGRDDRRQRRR和 YGRKKRRQRRR-G-(K) 15_G_YGRKKRRQRRR。
23.權利要求17的液體組合物，其中所述肉毒桿菌毒素以治療量存在。
24.權利要求17的液體組合物，其中所述肉毒桿菌毒素獲自選自A、B、C、D、E、F和G型的肉毒梭菌細菌的血清型。
25.通過干燥權利要求17的液體組合物而制備的粉末組合物。
26.權利要求25的粉末組合物，其中所述非還原性二糖選自海藻糖二水合物、蔗糖及其組合。
27.權利要求25的粉末組合物，其中所述非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯、山梨聚糖酯、Triton X-100、NP-40、泊洛沙姆及其組合。
28.權利要求25的粉末組合物，其中使用選自下列的鹽來制備所述緩沖劑檸檬酸的鹽、醋酸的鹽、琥珀酸的鹽、酒石酸的鹽、馬來酸的鹽和組氨酸的鹽。
29.權利要求25的粉末組合物，其還包含帶正電荷的主鏈，所述主鏈具有與之連接的帶正電荷的效應基團。
30.權利要求29的粉末組合物，其中具有帶正電荷的效應基團的帶正電荷的主鏈是具有選自下列的氨基酸序列的肽RKKRRQRRR-G- (K) 15_G_RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G- (K) 15_G-RGRDDRRQRRR和 YGRKKRRQRRR-G-(K) 15_G_YGRKKRRQRRR。
31.權利要求30的粉末組合物，其中所述冷凍干燥的組合物包含治療量的肉毒桿菌毒素。
32.權利要求25的粉末組合物，其中所述肉毒桿菌毒素獲自選自A、B、C、D、E、F和G型的肉毒梭菌細菌的血清型。
33.一種試劑盒，其包括 根據權利要求9或25的粉末組合物，和 注射器。
34.用于穩定肉毒桿菌毒素制劑的方法，所述方法包括 組合肉毒桿菌毒素、非還原性二糖或非還原性三糖、非離子型表面活性劑和生理上相容的緩沖劑以形成液體組合物， 其中所述非還原性二糖的濃度在10%至40% (w/v)的范圍內， 其中所述非離子型表面活性劑的濃度在O. 005%至O. 5% (w/v)的范圍內，以及 其中所述液體組合物的pH在4. 5至6. 5的范圍內。
35.權利要求34的方法，其還包括干燥所述液體組合物的步驟。
36.權利要求35的方法，其中干燥步驟包括冷凍干燥或真空干燥所述液體組合物。
37.一種液體組合物，其包含 肉毒桿菌毒素， 非還原性糖， 非離子型表面活性劑， 具有選自下列的氨基酸序列的帶正電荷的肽RKKRRQRRR-G-(K) 15_G_RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G-(K) 15_G_RGRDDRRQRRR 和 YGRKKRRQRRR-G-(K) 15_G_YGRKKRRQRRR ； 生理上相容的緩沖劑，和 任選地，填充劑； 其中所述組合物的pH在4. 5至6. 5的范圍內。
38.權利要求37的液體組合物，其中所述帶正電荷的肽的氨基酸序列為RKKRRQRRR-G-(K) 15_G_RKKRRQRRR。
39.權利要求38的液體組合物，其中所述非還原性糖選自海藻糖、蔗糖或棉子糖。
40.權利要求39的液體組合物，其中所述非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、Span 20、Span 60、Span 65和Span 80。
41.權利要求40的液體組合物，其中生理上相容的緩沖劑選自檸檬酸、醋酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸、組氨酸、檸檬酸鹽/醋酸鹽、檸檬酸鹽/組氨酸、檸檬酸鹽/酒石酸鹽、馬來酸鹽/組氨酸、琥珀酸鹽/組氨酸和磷酸鹽緩沖劑。
42.權利要求41的液體組合物，其中所述肉毒桿菌毒素是肉毒梭菌血清型A、B、C、D、E、F或G的150kD肉毒桿菌毒素蛋白。
43.權利要求37的液體組合物，其中所述帶正電荷的肽的氨基酸序列為RGRDDRRQRRR-G- (K) 15-g-rgrddrrqrrr。
44.權利要求43的液體組合物，其中所述非還原性糖選自海藻糖、蔗糖或棉子糖。
45.權利要求44的液體組合物，其中所述非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、Span 20、Span 60、Span 65和Span 80。
46.權利要求45的液體組合物，其中生理上相容的緩沖劑選自檸檬酸、醋酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸、組氨酸、檸檬酸鹽/醋酸鹽、檸檬酸鹽/組氨酸、檸檬酸鹽/酒石酸鹽、馬來酸鹽/組氨酸、琥珀酸鹽/組氨酸和磷酸鹽緩沖劑。
47.權利要求46的液體組合物，其中所述肉毒桿菌毒素是肉毒梭菌血清型A、B、C、D、E、F或G的150kD肉毒桿菌毒素蛋白。
48.權利要求37的液體組合物，其中所述帶正電荷的肽的氨基酸為YGRKKRRQRRR-G-(K)15-g-ygrkkrrqrrr。
49.權利要求48的液體組合物，其中所述非還原性糖選自海藻糖、蔗糖或棉子糖。
50.權利要求49的液體組合物，其中所述非離子型表面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、Span 20、Span 60、Span 65和Span 80。
51.權利要求50的液體組合物，其中生理上相容的緩沖劑選自檸檬酸、醋酸、琥珀酸、酒石酸、馬來酸、組氨酸、檸檬酸鹽/醋酸鹽、檸檬酸鹽/組氨酸、檸檬酸鹽/酒石酸鹽、馬來酸鹽/組氨酸、琥珀酸鹽/組氨酸和磷酸鹽緩沖劑。
52.權利要求51的液體組合物，其中所述肉毒桿菌毒素是肉毒梭菌血清型A、B、C、D、E、F或G的150kD肉毒桿菌毒素蛋白。
全文摘要
本發明涉及經穩定而不使用任何蛋白質性質的賦形劑的肉毒桿菌毒素制劑。本發明還涉及制備和使用此類肉毒桿菌毒素制劑的方法。
文檔編號A61P21/02GK102869373SQ201080035225
公開日2013年1月9日 申請日期2010年6月25日 優先權日2009年6月25日
發明者S·A·湯普森, C·L·魯伊格, J·M·沃 申請人:雷文斯治療公司