酪蛋白來源的蛋白酶抑制肽的制作方法

專利名稱：：酪蛋白來源的蛋白酶抑制肽的制作方法
技術領域：
：本發明涉及抑制蛋白酶活性的化合物、肽、肽模擬物和藥物組合物，以及這些化合物、肽、肽模擬物和藥物組合物治療或預防疾病狀態的用途。特別是，所述疾病狀態是牙周病。本申請要求澳大利亞臨時申請第20099(^841號的優先權，該申請在此通過援引整體并入。
背景技術：
：牙周病是牙齒支持組織的細菌相關的炎性疾病，并且是主要的公眾健康問題。幾乎所有的人群在某種程度上都患有牙周病。據1989年美國牙齒健康調查(DentalHealthsurvey)的報道，85%的研究人群患有牙周病。牙周病的主要形式是牙齦炎，其與牙菌斑在齦緣的非特異性聚集有關。牙周病更具破壞性的形式(牙周炎)與特定革蘭氏陰性細菌的齦下感染有關。與這種疾病有關的主要細菌病原體稱為“紅色復合體”，其由福賽斯坦納菌(Tannerellaforsythia)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)以及齒柜密螺旋體(Tr印onemadenticola)構成。牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎的主要發病原因。牙齦卟啉單胞菌的主要毒力因子被認為是其細胞外半胱氨酸蛋白酶，統稱為牙齦菌蛋白酶。最常見的是RgpA和RgpB(Arg-牙齦菌蛋白酶)以及Kgp(Lys-牙齦菌蛋白酶)。Arg-牙齦菌蛋白酶在Arg殘基的羧基側切割，而Lys-牙齦菌蛋白酶在Lys殘基的羧基側切割。據了解這些細胞結合的半胱氨酸蛋白酶對蛋白降解從而提供用于生長以及存活或毒力的其它固有和外在功能的肽至關重要。這些存活和毒力功能中有一些功能可以是對宿主組織的細菌粘附、血細胞凝集以及細菌細胞表面蛋白和分泌蛋白的加工。RgpA和Kgp的催化結構域可以作為復合體與一系列非共價結合的序列相關血凝素/粘附素結構域結合于細胞表面，而RgpB已被證實不是作為蛋白酶粘附素復合體的一部分存在，并且僅由催化結構域構成。存在幾種抑制牙齦菌蛋白酶的天然來源的和合成的分子。通過篩選生物活性產物，已經發現了牙齦菌蛋白酶的天然抑制劑，而基于蛋白酶活性位點和蛋白酶抑制劑的結構，已經合成了幾種合成抑制劑。例如，已經從蔓越莓汁[特別是多酚和高分子量不可透析組分(NDM)]、綠茶兒茶酚和大蒜中分離了Arg-和Lys-牙齦菌蛋白酶抑制劑。這些抑制劑都具有一種或多種問題，如它們是合成的、生成成本昂貴、具有無法接受的味道或未獲得許可用于人類。存在對更好的或可選的與各種疾病特別是牙周病發病機理有關的細菌酶的抑制劑的需要。在說明書中對任何現有技術的參考，不是且不應認為，是以任何形式承認或表示該現有技術在澳大利亞形成公知常識的一部分或任何其他權限，或合理地期望本領域技術人員將該現有技術確定、理解以及認為相關。發明概述根據本發明，提供了用于抑制、降低或防止細菌酶活性的化合物、肽或肽模擬物，所述化合物、肽或肽模擬物包含酪蛋白的氨基酸序列或其片段。在一實施方案中，酶可以是胞外蛋白酶。在具體實施方案中，胞外蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶，如牙齦菌蛋白酶。在某些實施方案中，蛋白酶是RgpA、RgpB或Kgp。在某些實施方案中，所述化合物、肽或肽模擬物包含選自以下的氨基酸序列LeuProGlnGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO1)；TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlielieVal(SEQIDNO2)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:3)；TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPhe(SEQIDNO:4)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:5)。在其他實施方案中，所述化合物、肽或肽模擬物包含還選自以下的氨基酸序列LeuProGlnGlyValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:6)；LeuSerProGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:7)；LeuSerSerGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:8)；TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlieLeuVal(SEQIDNO9)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrlieGlu(SEQIDNO:10)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:11)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThr(0-連接的GalNAc)ProThrThrGlu(SEQIDNO:12)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-連接的GalNAc)krThrProThrThrGlu(SEQIDNO:13)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-連接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:14)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThr(0_連接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:15)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:16)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrIleAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:17)；ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:18)；ProProLysLysAspGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:19)；4ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:20)；ProProLysLysAspGlnAspLysThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:21)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrlieGlu(SEQIDNO:22)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:23)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThHO-連接的GalNAc)ProThrThrGluSEQIDNO:24)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-連接的GalNAc)SerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:25)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-連接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:26)；ThrGlulieProThr(0_連接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:27)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:28)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:29)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:30)；ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:31)以及ThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:32)。在其他實施方案中，所述化合物、肽或肽模擬物包含SEQIDNOs1-32中的保守取代。這些取代在下文進一步描述。在某些實施方案中，本發明的肽或肽模擬物的長度為至少13個氨基酸。在其他實施方案中，肽或肽模擬物的長度為70個氨基酸或更少。在某些實施方案中，肽或肽模擬物的長度為15-61個氨基酸。在其他實施方案中，肽或肽模擬物的長度為20-30個氨基酸。在其他實施方案中，化合物、肽或肽模擬物是非磷酸化或非糖基化的。在另一形式中，化合物、肽或肽模擬物是翻譯后修飾的。例如，化合物、肽或肽模擬物可以僅磷酸化或僅糖基化，或既磷酸化又糖基化。可以以此方式修飾一個或多個殘基。在具體實施方案中，化合物、肽或肽模擬物由選自SEQIDNOs:1_32(包括端點)中任一個的氨基酸序列組成或基本上由選自SEQIDNOs:1-32(包括端點)中任一個的氨基酸序列組成。在這些實施方案中，包括SEQIDNOs1-32以及其他氨基酸殘基的化合物、肽或肽模擬物“基本上由SEQIDNOs:1-32組成”，只要其表現出抑制、降低或防止細菌酶的活性，這可以根據下文所述的測定確定。同樣，化合物、肽或肽模擬物“基本上由SEQIDNO:1-32之一”組成，其中其比相應的SEQID(序列標識)短，只要其表現出抑制、降低或防止細菌酶的活性，這可以根據下文所述的測定確定。因此這些實施方案不包括全長酪蛋白序列。在其他實施方案中，本發明的化合物、肽或肽模擬物包含與選自SEQIDNOs:1_32的氨基酸序列60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%相同的氨基酸序列。在其他實施方案中，化合物、肽或肽模擬物基本上由這類氨基酸序列組成。在一些實施方案中，本發明的化合物、肽或肽模擬物包含與選自SEQIDNOs1-5的氨基酸序列60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%相同的氨基酸序列。在某些實施方案中，提供了用于抑制、降低或防止細菌酶活性的化合物、肽或肽模擬物，所述化合物、肽或肽模擬物包含能形成螺旋結構并且非競爭性抑制、降低或防止細菌酶活性的氨基酸序列。在其他實施方案中，當酶與底物相互作用時，所述化合物、肽、肽模擬物例如通過與所述酶、底物或酶和底物兩者結合抑制、降低或防止所述酶由所述底物產生產物。在另一實施方案中，本發明提供了用于抑制、降低或防止有需要的患者口腔中牙齦卟啉單胞菌酶活性的治療肽，所述治療肽選自SEQIDNO=USEQIDNO:2和SEQIDNO:3，或以上的糖基化和磷酸化變體和缺失和取代突變體。在一些實施方案中，SEQIDNO1的變體和突變體選自SEQIDNO6,SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。在一些實施方案中，SEQIDNO2的變體和突變體選自SEQIDNO:4和SEQIDNO:9。在一些實施方案中，SEQIDNO3的變體和突變體選自SEQIDNO5和SEQIDNOs:10_32。在某些實施方案中，提供了抑制細菌酶的組合物，其包含本發明的化合物、肽或肽模擬物以及藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，組合物還包含二價陽離子。在一實施方案中，提供了治療或預防一種或多種疾病狀態的方法，其包括給予有需要的個體有效量的本發明的化合物、肽或肽模擬物。在一實施方案中，將所述化合物、肽或肽模擬物或組合物直接給予個體的牙齦。在一實施方案中，所述化合物、肽或肽模擬物可以是可應用于口的組合物的一部分，所述組合物如包括牙膏(toothpaste)、牙粉、液態潔牙劑在內的潔牙劑、漱口水、錠劑、口香糖、牙膏(dentalpaste)、牙齦按摩膏、漱口片、乳制品和其他食品。適合治療或預防的疾病狀態或疾病的實例包括牙周病和齲齒。根據本發明，由牙齦菌蛋白酶的酶活性引起的或與其有關的任何疾病或疾病狀態，都可以適合治療或預防。需要治療或有發展成牙周病或齲齒風險的個體是動物。在一些實施方案中，個體是人、犬、貓、馬、綿羊或牛。在另一實施方案中，提供了治療或緩解個體的牙周病癥狀的方法，其包括給予所述個體本發明的化合物、肽、肽模擬物或組合物。根據一些實施方案，提供了抑制細菌酶的方法，其包括使酶與包含化合物、肽或肽模擬物的組合物接觸，所述化合物、肽或肽模擬物包含選自SEQIDNos:1-5中任一個的氨基酸序列和其中的保守取代或基本上由其組成或由其組成，如選自SEQIDNos1-32的氨基酸序列和與SEQIDNos1-32至少60%相同的氨基酸序列。在具體實施方案中，化合物、肽或肽模擬物的氨基酸序列不包含全長酪蛋白序列。根據這些實施方案中的任何一個，細菌酶可以是牙齦菌蛋白酶，如來自牙齦卟啉單胞菌的牙齦菌蛋白酶。根據這些實施方案中的任何一個，接觸步驟可以包括給予有需要的個體(如人)所述組合物，如需要治療或有發展成齲齒風險的個體。根據這些實施方案中的任何一個，所述方法可以有效治療或緩解牙周病或齲齒的癥狀。在另一實施方案中，本發明的方法還包括給予選自抗炎劑、與牙齦卟啉單胞菌或牙齦卟啉單胞菌所表達的蛋白結合的抗體、抗生素和抗生物膜劑的試劑。抗生素可以選自阿莫西林、強力霉素和甲硝噠唑。抗炎劑包括非類固醇抗炎藥(NSAID)。NSAID的實例包括除了抑制環氧合酶的化合物。NSAID的具體實例包括阿司匹林、布洛芬和萘普生。抗生物膜劑的實例是延胡索酸還原酶的抑制劑如奧克太生(oxantel)。在另一實施方案中，本發明提供了有效量的本發明的化合物、肽、肽模擬物或組合物在制備用于治療或預防牙周病和/或本文確定為適合治療的其他疾病狀態的藥物中的用途。本方面還提供了用于治療或預防牙周病(和/或上文確定為適合治療的其他疾病狀態)的藥物組合物，其包含有效量的本發明的化合物、肽或肽模擬物以及藥學上可接受的載體。組合物還可以包含選自抗炎劑、與牙齦卟啉單胞菌或來自牙齦卟啉單胞菌的蛋白結合的抗體、抗生素和抗生物膜劑的試劑。抗生素可以選自阿莫西林、強力霉素和甲硝噠唑。根據一些實施方案，提供了包含化合物、肽或肽模擬物的藥物組合物，所述化合物、肽或肽模擬物包含有效抑制個體中細菌酶的量的酪蛋白的氨基酸序列或酪蛋白氨基酸序列的抑制細菌酶的片段，基本上由其組成或由其組成，如選自SEQIDNos:1-5中任一個和其中的保守取代或SEQIDNos1-32和與SEQIDNos1-32至少60%相同的序列的氨基酸序列。在具體實施方案中，所述化合物、肽或肽模擬物的氨基酸序列不包含全長酪蛋白序列。根據這些實施方案中的任何一個，組合物還包含諸如鋅的二價陽離子和/或選自抗炎劑、抗生素、抗生物膜劑和與牙齦卟啉單胞菌或牙齦卟啉單胞菌所表達的蛋白結合的抗體的試劑。根據這些實施方案中的任何一個，可以將所述組合物配制成向牙齦局部給藥和/或可以將其以單位劑量的形式提供。在另一實施方案中，本發明提供了用于治療或預防牙周病(和/或上文確定為適合治療的其他疾病狀態)的組合物，其包含作為活性成分的本發明的化合物、肽或肽模擬物。所述組合物還可以包含二價陽離子。在另一實施方案中，本發明提供了包含作為主要成分的有效量的本發明的化合物、肽或肽模擬物的藥物組合物。所述組合物可以用于例如治療或預防牙周病和/或上文確定為適合治療的其他疾病狀態。在一些實施方案中，所述組合物還包含二價陽離子。在另一實施方案中，本發明提供了用于治療或預防牙周病和/或上文確定為適合治療的其他疾病狀態的本發明的化合物、肽或肽模擬物。在另一實施方案中，本發明提供了用于治療或預防牙周病的組合物，其包含本發明的化合物、肽或肽模擬物。在一些實施方案中，所述組合物還包含二價陽離子。在另一方面，本發明提供了組件試劑盒(kitofparts)，其包含(a)本發明的化合物、肽、肽模擬物或組合物和(b)藥學上可接受的載體。在某些實施方案中，二價陽離子選自ai2+、Ca2+、CU2+、Ni2+、C02+、i^2+、Sn2+和Mn2+。另夕卜，二價陽離子可以與氟化物結合，如SnF+和CuF+。在一些實施方案中，二價陽離子是Ca2+或Si2+。在某些實施方案中，二價陽離子與所述化合物、肽或肽模擬物的比例范圍為1.02.0-1.010.0，如1.04.0。如本文所用，除非上下文另有要求，否則術語”包含(comprise)”和所述術語的變形如”包含(comprising)”、”包含(comprises)”和”包含(comprised)”并非意圖排除其他添加物、成分、整體或步驟。附圖簡要說明圖1在具有合成的αS1-酪蛋白(11-23)(Π)、β-酪蛋白(193-205)(□)、β-酪蛋白(193-209)(曰)和κ-酪蛋白(109-137)(S)肽的情況下，牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞的Arg特異性蛋白水解活性。用2個獨立的細菌培養物和3次技術重復進行測定。測定中細胞的平均數量為4.0E+08cfu/mL。圖2在具有合成的asl-酪蛋白(11-23)(Π)、β-酪蛋白(193-209)(Ξ)和κ-酪蛋白(109-137)(目)肽的情況下，牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞的Lys特異性蛋白水解活性。用2個獨立的細菌培養物和3次技術重復進行測定。測定中細胞的平均數量為4.0E+08cfu/mLo圖3在具有100μM合成的酪蛋白來源的肽的情況下，純化的復合體的Arg-(B)和Lys特異性(Β)蛋白水解活性。用6次技術重復進行測定。圖4在具有幾種濃度的κ-酪蛋白(109-137)的情況下，純化的RgpB的蛋白水解活性。RgpB的濃度為0.23μg/μL。圖5利用熒光BSA底物(DQTMBSA)和500μM酪蛋白肽測量的牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞的Arg和Lys特異性蛋白酶活性。κ-酪蛋白(106-169)是天然來源的，而其他κ-酪蛋白肽是合成的。誤差條計算為3次技術重復和2個生物復制品的標準偏差。所有肽均顯著不同于(P<0.05)對照值。κ-酪蛋白(117-123)和κ-酪蛋白(127-137)彼此沒有顯著不同(P<0.05)，但是與其余的肽顯著不同。κ-酪蛋白(106-169)顯著不同于κ-酪蛋白(106-137)，而非顯著不同于κ-酪蛋白(109-137)或κ-酪蛋白(117-137)。κ-酪蛋白(106-137)顯著不同于除了κ-酪蛋白(117-137)以外的所有肽。κ-酪蛋白(109-137)顯著不同于除了κ-酪蛋白(106-169)以外的所有肽。圖6測定中，在ImM半胱氨酸濃度，具有合成的κ-酪蛋白(109-137)肽和SiCl2的情況下，牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞的Arg特異性蛋白水解活性。用3個獨立的細菌培養物和4次技術重復進行測定。圖7測定中，在ImM半胱氨酸濃度，具有合成的κ-酪蛋白(109-137)肽和SiCl2的情況下，牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞的Lys特異性蛋白水解活性。用2個獨立的細菌培養物和3次技術重復進行測定。圖8測定中，在ImM半胱氨酸濃度，具有合成的κ-酪蛋白(109-137)肽和SiCl2的情況下，純化的蛋白復合體的Arg-和Lys-特異性(口)蛋白水解活性。用6次技術重復進行測定。圖9測定中，在ImM半胱氨酸濃度，具有合成的asl-酪蛋白(11-23)肽(Π)、β-酪蛋白(193-209)(S)和SiCl2的情況下，牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞的Arg特異性蛋白水解活性。圖10測定中，在ImM半胱氨酸濃度，具有合成的asl_酪蛋白(11-23)肽(Π)、β-酪蛋白(193-209)(S)和S1Cl2的情況下，牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞的Lys特異性蛋白水解活性。用2個獨立的細菌培養物和3次技術重復進行測定。圖11濃度為0μM(―X——)、25μM(—~)、50μM(―)、75μM(和100μΜ(~X~)的K-酪蛋白(109-137)肽和濃度為0.15、0·25和1.OmM的底物BapNA抑制純化的RgpB的萊恩威佛-伯克圖(Lineweaver-Burkplot)。圖12評價κ-酪蛋白(109-137)肽抑制RgpB的抑制常數(Ki)的第二個圖表。與每組點有關的線表示各個數據組的線性回歸分析。將&評估為回歸線的負截距。圖13κ-酪蛋白(109-137)和人絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制劑G進化枝成員1剪接變體3(Q5UGI5)、血漿絲氨酸蛋白酶Cl抑制劑(P0515Q和推斷的絲氨酸蛋白酶抑制劑(KU家族)(A3LQ30)的BLAST序列比對。圖14:β-酪蛋白(193-209)與人絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal型5短同種型(Q3LX95)、人絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal-型5(Q9NQ38)、人抑彈性蛋白酶蛋白(彈性蛋白酶特異性抑制劑)(Ρ19957)和人ΡΙ3蛋白(肽酶抑制劑3、皮膚來源的(SKALP)、同種型CRAa)(Q6FG74)的BLAST序列比對。圖15αS1_酪蛋白(11-23)與ATP依賴性Clp蛋白酶ATP-結合亞基clpX(P50866)、絲氨酸蛋白酶(Q1NE66)和ATP依賴性鋅金屬蛋白酶017VHT4)的BLAST序列比對。圖16所提出的反競爭性抑制劑模型，E=Arg-或Lys-牙齦菌蛋白酶、S=BapNA或GPKNA底物、I=κ-酪蛋白(109-137)肽和P=ρ-硝基酰基苯胺產物。圖17:a)參與與κ-酪蛋白(109-137)、Si(II)以及底物(BapNA)相互作用的RgpB活性位點的殘基。RgpB的His211和G1u152、k-酪蛋白(109-137)的Aspll5(Asp7)和Glull8(GlulO)與Si(II)的靜電相互作用突出顯示。肽的Ilel22(Ilel4)與BapNA底物的疏水相互作用也突出顯示。RgpB的Trp284和Cys244分別與底物的Arg殘基以及酰胺鍵形成相互作用。b)在存在Si(II)的情況下，所提出的結合于RgpB=BapNA復合體的κ-酪蛋白(109-137)的分子模型。發明的詳細描述應當理解的是，本說明書中公開和限定的本發明延伸至所提到的或根據正文或附圖顯而易見的兩個或多個個體特征的所有可選組合。所有這些不同組合構成了本發明的各種可選方面。表現出蛋白酶抑制性的化合物、肽或肽模擬物可以用于口腔護理產品、功能食品和藥物中。本發明鑒定了新的乳酪蛋白肽，其特征是具有牙齦卟啉單胞菌胞外蛋白酶抑制活性。這些肽可以合成產生或由乳酪蛋白的酶促消化獲得。可以從來自多種物種的乳酪蛋白獲得肽，包括人、牛、山羊和綿羊。牛乳酪蛋白是已知對進一步的蛋白水解分解具有相對抗性的蛋白的天然來源。牛乳在消化后，可在人的小腸的遠端部分和血液中檢測到它們。這些肽具有幾個優勢，包括但不限于它們可以來源于天然來源，不具有可感知的味道、并且當組合使用時可以掩蓋二價陽離子如鋅的味道。肽包含選自以下的氨基酸序列asl-酪蛋白(11-23)-(SEQIDNO1)β-酪蛋白(193-20-(SEQIDNO2)κ-酪蛋白(109-137)-(SEQIDNO3)β-酪蛋白(193-20-(SEQIDNO4)κ-酪蛋白(117-137)-(SEQIDNO:5)。本發明還包括SEQIDNO:1-5的氨基酸序列的功能片段。功能片段是比對應于SEQIDNO:1-5的氨基酸序列短但仍然保留了SEQIDNO:1_5的相應氨基酸序列的功能的氨基酸序列。通過例如利用外肽酶縮短氨基酸序列，或通過合成更短的氨基酸序列并隨后檢測任何蛋白酶抑制活性，如通過下文實施例所示的方法，能夠很容易地確定功能片段。SEQIDNO:1-5的氨基酸序列的變體也在本發明的范圍內，所述變體對應于衍生SEQIDNOS1-5的牛酪蛋白的直系同源和旁系同源蛋白的片段。如果序列被基因復制事件隔離，則序列是“旁系同源的”如果生物體中的基因經復制占據同一基因組的2個不同位置，則2個拷貝是旁系同源的。如果序列被物種形成事件隔離，則序列是“直系同源的”當一個物種分化為2個單獨的物種時，則認為所產生的物種中的單基因的分化拷貝是直系同源的。本發明范圍內的另一組變體是含有翻譯后修飾的SEQIDNO:1_5的氨基酸序列。具體的翻譯后修飾是磷酸化和糖基化。為了說明這些修飾，牛酪蛋白的許多已知的遺傳變體作為以下而著稱A.asl-酪蛋白1.%1-酪蛋白父3-9卩(遺傳變體-八、8、(、03、卩、6和《)2.aS1-酪蛋白片段B.aS2-酪蛋白1.%2-酪蛋白^-15卩(遺傳變體4、8、(、0)2.aS2-酪蛋白Xa-9P(f51_207)(遺傳變體_A、C)3.αS2-酪蛋白Xa-5P(f65"203)(遺傳變體-A、C)C.β-酪蛋白1.日-酪蛋白父3-5卩(遺傳變體-八1、八2、八3、8、(、0』、卩、6、!11、硭和12.β-酪蛋白Xa-IP(f29-209)(遺傳變體-A1、A2、A3、B、C、Ε、F、G、H1、H2禾口I)3.3-酪蛋白13-(打06-209)(遺傳變體-八2、六3、8、卩、6、硭)4.β-酪蛋白Xa-(f108-209)(遺傳變體-A2、B、F、G和H2)5.3-酪蛋白父3-4卩(打-28)(遺傳變體-六2、0和莊)6.3-酪蛋白父3-5卩(打-105)(遺傳變體-八1、六2、8、(、0』、卩、6、!11、硭和1)7.β-酪蛋白Xa-5P(f1-107)(遺傳變體-A1、A2、A3、B、C、D、Ε、F、G、H1、H2禾口I)8.旦-酪蛋白父^卟江四-^^^遺傳變體-八1]2』^』』；、!!1、!!2*!)9.β-酪蛋白Xa-IP(f29-107)(遺傳變體-A1、A2、A3、B、C、Ε、F、G、H1、H2禾口I)D.k-酪蛋白1.1^-酪蛋白父3-2卩(遺傳變體-八、8、(』、卩1、產、61、62、!1、1和了)2.κ-酪蛋白Xa-2P(fl06-169)(遺傳變體-AJaEJ^F^G^G2和J)3.κ-酪蛋白Xa-2P(fll7-169)(遺傳變體-AJaEaF^F^G^G2和J)aX表示遺傳變體，其中遺傳變體可以是下列括號中所說的任一變體。上文的名稱描述了酪蛋白的已知變體，例如β-酪蛋白B-lP(f29_209)表示，蛋白是酪蛋白β家族的一部分，是B遺傳變體，含有可以被磷酸化的氨基酸殘基，并且是β-酪蛋白蛋白的從殘基四到殘基209的片段。已知的是，在這些蛋白中的氨基酸易于磷酸化。酪蛋白變體的名稱和其他描述記載于Farrelletal.NomenclatureofProteinsofCow，sMilk(牛乳蛋白名稱)-SixthRevision(第6次修訂).JournalofDairyScience(2004)87:1641-1674中。因此，對應于SEQIDNO:1_5的氨基酸序列的這些序列的片段是變體，并且形成所公開的本發明的一部分。因為認為導致肽的蛋白酶抑制活性的是所述肽的物理性質而不是所述肽的具體序列，因此可以在肽序列中進行所謂的保守取代，而不會大量損失活性。在未限制本發明的情況下，在一些實施方案中，肽或肽模擬物的高達25%的氨基酸是保守取代的。意圖是，將不會導致大量損失活性的此類保守取代包括于本發明內。盡管本領域技術人員完全理解上文提到的保守取代的概念，但是為了清楚，保守取代是下文所列的保守取代。Gly,Ala,Val,lie,Leu,Met；Asp,Glu,Ser；Asn,Gln；Ser,Thr；Lys,Arg,His；Phe，Tyr，Trp；以及Pro,Na-堿性氨基酸。本領域技術人員已知的是，氨基酸的極性、帶電荷的(+)、帶電荷的㈠或脂肪族組的一成員被同一組的另一成員的任何取代，都可以是保守取代。為了舉例說明這些其他實施方案(并未限制本發明)，提供了下述序列asl-酪蛋白(11-23)，LeuProGlnGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO1)(家牛(Bosaurus)(牛(cow)))LeuProGlnGlyValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:6)(水牛(Bubalusbubalis)(家養水牛(Domesticwaterbuffalo)))LeuSerProGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:7)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat)))LeuSerSerGluValLeuAsnGluAsnLeuLeuArgPhe(SEQIDNO:8)(綿羊(Ovisaries)(綿羊(Sheep)))β-酪蛋白(193-209)，TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlielieVal(SEQIDNO:2)(家牛(牛))TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPheProlieLeuVal(SEQIDNO9)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat))、綿羊(0visaries)(綿羊(Sheep)))β-酪蛋白(193-205)，TyrGlnGluProValLeuGlyProValArgGlyProPhe(SEQIDNO:4)(家牛(牛))κ-酪蛋白(109-137)，ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:3)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrlieGlu(SEQIDNO:10)(非洲野牛(Synceruscaffernanus)(森林水牛(ForestBuffalo)))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:11)(瘤牛(Bosindicus)(瘤牛(Zebu)))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThr(0-連接的GalNAc)ThrThrGlu(SEQIDNO:12)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-連接的GalNAc)krThrProThrThrGlu(SEQIDNO:13)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-連接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:14)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThHO-連接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:15)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:16)(家牛(牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrIleAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:17)(水牛(家養水牛))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:18)(水牛(家養水牛))ProProLysLysAspGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:19)(美洲雪羊(Oreamnosamericanus)(里予生山羊))ProProLysLysAsnGlnAspLysThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:20)(美洲雪羊(野生山羊))ProProLysLysAspGlnAspLysThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:21)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat))、綿羊(Ovisaries)(綿羊(Sheep)))κ-酪蛋白(117-137)，ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:5)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrIleGlu(SEQIDNO:22)(非洲野牛(森林水牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProlieThrGlu(SEQIDNO:23)(瘤牛(瘤牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThHO-連接的GalNAc)ProThrThrGlu(SEQIDNO:24)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThr(0-連接的GalNAc)SerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:25)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThr(0-連接的GalNAc)Glu(SEQIDNO:26)(家牛(牛))ThrGlulieProThr(0_連接的GalNAc)lieAsnThrlieAlaSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:27)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSer(P)GlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:28)(家牛(牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieValSerGlyGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:29)(水牛(家養水牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerValGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:30)(水牛(家養水牛))ThrGlulieProThrlieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:31)(美洲雪羊(野生山羊))ThrGluValProAlalieAsnThrlieAlaSerAlaGluProThrSerThrProThrThrGlu(SEQIDNO:32)(山羊(Caprahircus)(山羊(Goat))、綿羊(Ovisaries)(綿羊(Sheep)))(P)表示，前面的氨基酸是磷酸化的即kr(P)是磷酸化的絲氨酸氨基酸。(0-連接的(ialNAc)表示前面的氨基酸具有與氨基酸側鏈羥基氧連接的N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)，即Thr(0-連接的(ialNAc)是具有與其側鏈羥基氧連接的N-乙酰基半乳糖胺的蘇氨酸氨基酸。其他聚糖可以連接于felNAc，從而使聚糖鏈的長度增加至包括二糖，例如Gal(βl_3)GalNAc，三糖例如NeuAc(α2-3)Gal(β1-3)GalNAc或Gal(β1-3)[NeuAc(a2_6)]GalNAc，和四糖例如NeuAc(α2-3)Gal(β1-3)[NeuAc(α2-6)]GalNac。本發明還提供了包含選自以下的氨基酸序列的化合物、肽或肽模擬物deptxptte(其中χ=tq或st),Qepvx1GpvrGPx2PIIx3I(其中&=l、n或Kx2=f、y或C禾口&=l、h或v)以及evlnenllrf。在這些實施方案中，本發明提供了化合物、肽或肽模擬物，其由選自SEQIDNos1-32(包括端點)中任一個的氨基酸序列組成，或基本上由選自SEQIDNos:1-32(包括端點)中任一個的氨基酸序列組成，但不包括全長酪蛋白序列。本領域技術人員應當理解的是，可以對SEQIDNos:1_32中任一個序列所限定的氨基酸序列進行一個或多個氨基酸缺失，而不喪失所述化合物、肽或肽模擬物抑制、降低或防止蛋白酶活性的能力。在某些實施方案中，可以缺失高達25%的肽或肽模擬物，包括SEQIDNos:1_32，然而，所得的肽或肽模擬物必須保留抑制、降低或防止蛋白酶活性的能力。可以進行實驗，包括本文所述的那些實驗，來確定具有這樣的氨基酸序列的化合物、肽或肽模擬物是否仍然能抑制、降低或防止蛋白酶活性，該氨基酸序列與SEQIDNos:1-32中任一個的區別在于一個或多個氨基酸的缺失。可以將本發明的化合物、肽、肽模擬物或組合物直接給予需要治療或預防牙周病的個體的牙齦。在一些實施方案中，通常局部給予本發明的組合物，然而，本領域技術人員應當理解，也可以經腸胃外給予所述化合物、肽、肽模擬物或組合物，例如通過靜脈內、腹膜內、肌肉內、鞘內或皮下注射。可選地，可以將本發明的化合物、肽、肽模擬物配制成用于口腔給藥(包括舌下和頰)、肺部給藥(鼻內和吸入)、透皮給藥或直腸給藥的組合物。需要治療的個體可以是表現出牙周病的亞臨床或臨床癥狀的個體。牙周病的亞臨床或臨床表現包括牙齦的急性或慢性炎癥。可以存在急性炎癥的特點，包括血漿和白細胞從血液到受損組織的運動增加。也可以存在牙齦急性感染的臨床病征，包括發紅(紅色)、灼熱(熱增加)、瘤(腫脹)、痛苦(疼)以及機能喪失(喪失功能)。慢性炎癥的特征可以是白細胞(單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、血漿細胞)浸潤。可以觀察到組織和骨損失。需要治療的個體的特征還可以是，存在于牙周部位的牙齦卟啉單胞菌細菌的水平增加，高于在無牙周病的個體中所觀察到的正常范圍。給藥途徑取決于許多因素，包括待給予的拮抗劑或組合物的屬性，以及給個體疾病狀態的嚴重程度。應當理解，本發明化合物、肽、肽模擬物的給藥頻率和所給予的本發明的化合物、肽、肽模擬物的量，在個體間可以變動，除了其他情況外，這還取決于個體中牙周病的階段和進展。給藥頻率可以由醫師決定。還考慮到，是牙齦菌蛋白酶或相關蛋白酶(例如其他半胱氨酸蛋白酶)的蛋白酶活性的結果或與其相關的任何疾病、疾病狀態或綜合征，可以通過本發明的化合物、肽、肽模擬物或組合物預防或治療。此外，是牙周病的結果或與其相關的其他疾病、疾病狀態或綜合征也可以得到治療，或者發展這些疾病、疾病狀態或綜合征的風險可以降低。例如，牙周病可以增加個體發展心血管疾病的風險。發展心血管疾病的這種增加風險可以通過給予患有牙周病的個體本發明的化合物、肽、肽模擬物或組合物來治療牙周病而得到降低。“肽模擬物”是與本發明的肽具有基本相同的結構和/或功能特征的合成化合物，后者在下文有進一步的描述。通常，肽模擬物與本發明的肽具有相同或相似的結構，例如相同或相似的酪蛋白序列或其片段。肽模擬物通常含有至少一個非天然合成的殘基。肽模擬物化合物的非天然成分可以基于下述的一種或多種a)除了天然酰胺鍵(肽鍵)連接以外的殘基連接基團；b)替代天然存在的氨基酸殘基的非天然殘基；或c)誘導二級結構模擬物，即誘導或穩定二級結構的殘基，所述二級結構如β轉角、Y轉角、β折疊、α螺旋構象寸。肽模擬物可以利用科技文獻和專利文獻所述的各種程序和方法合成，例如OrganicSynthesesCollectiveVolumes,Gilmanetal.(Eds)JohnWiley&Sons,Inc.，NY,al-0beidi(1998)Mol.Biotechnol.9:205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3:17-27；Ostresh(1996)MethodsEnzymol.267220-234。本發明的化合物、肽或肽模擬物可以以藥物組合物的形式給予。這些組合物可以在GMP條件下或在一些實施方案中通過常規混合、溶解、造粒、包糖衣(dragee-making)、研碎、乳化、裝入膠囊、包封(entrapping)或凍干的方式制備。藥物組合物可以利用一種或多種生理可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑配制。所述組分可以促進將肽或肽模擬物加工成可以藥用的制品。用于治療的給藥可以是腸胃外、靜脈內、口服、皮下、動脈內、顱內、鞘內、腹膜內、局部、鼻內或肌肉內給藥。用于腸胃外給藥的藥物組合物通常是無菌的并且基本上是等滲的。也可以使用生理相容緩沖液，如漢克氏溶液(Hank'ssolution)、林格氏溶液(Ringer'ssolution)或生理鹽水或乙酸鹽緩沖液。溶液也可以含有懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。肽或肽模擬物可以以在使用前待溶解于溶劑中的粉末形式提供，所述溶劑如無菌無熱源的水。有關肽或多肽序列即本文所定義的本發明的肽的“百分比氨基酸序列同一性)”或“百分比(％)相同”，被定義為，在比對序列并且如果需要引入缺口以實現最大百分比序列同一性，且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分后，候選序列中與具體肽或多肽序列即本發明的肽中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。本領域技術人員可以決定測量比對的適當參數，包括在被比較的序列的全長內實現最大比對所需的任何算法(下文描述了非限制性實例)。當比對氨基酸序列時，給定氨基酸序列A與、和或針對給定氨基酸序列B的百分比氨基酸序列同一性(可選地，其可以表述為，與、和或針對給定氨基酸序列B具有或包含一定百分比的氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)可以計算為百分比氨基酸序列同一性=X/Y100，其中X是利用A和B的序列比對程序或算法比對評分為相同匹配的氨基酸殘基的數量，Y是B中氨基酸殘基的總數。如果氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，則A與B的百分比氨基酸序列同一性將會不等于B與A的百分比氨基酸序列同一性。在計算百分比同一性時，通常計算準確匹配。兩條序列間百分比同一性的確定，可以利用數學算法完成。比較兩條序列所用的數學算法的非限制性實例是，KarlinandAltschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法，在KarlinandAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中做了改進。將這種算法并入Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403的LASTN和BLASTX程序。為了獲得用于比較目的的帶缺口的比對，可以利用Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389所述的GappedBLAST(BLAST2.0)。可選地，可以用PSI-Blastan執行檢測分子間疏遠關系的迭代搜索。參閱Altschuletal.(1997)同上。當利用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序時，可以使用各自程序(如BLASTX和BLASTN)的缺省參數。比對也可以通過檢查手動進行。比較序列所用的數學算法的另一非限制性實例是ClustalW算法(Higginsetal.(1994)NucleicAcidsRes.22:4673-4680)。ClustalW比較序列并比對氨基酸或DNA序列的全部，因此能夠提供有關全部氨基酸序列的序列保守性的數據。ClustalW算法可以用于幾個商業可利用的DNA/氨基酸分析軟件包中，如VectorNTI程序組的ALIGNX模塊(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。在用ClustalW比對氨基酸序列后，可以評定百分比氨基酸同一性。可用于ClustalW比對分析的軟件程序的非限制性實例是GENED0C或JalView(http:Ilwww,ialview.org/)。GENEDOC允許評定多個蛋白間的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于比較序列的數學算法的另一非限制性實例是MyersandMiller(1988)CABIOS4:11-17的算法。將這一算法并入ALIGN程序(版本2.0)，其是第10版GCGWisconsinGenetics軟件包(可從Accelrys，Inc.，9685ScrantonRd.，SanDiego,CA,USA獲得)的一部分。當利用ALIGN程序比較氨基酸序列時，可以利用PAM120權重殘基表、缺口長度罰分12和缺口罰分4。盡管本發明可以應用于人類，但是本發明也可以用于獸醫目的。本發明用于治療或預防如牛、綿羊、馬的家畜和家禽、諸如貓和狗的伴生動物和動物園動物中的本文所述的疾病或疾病狀態。可以制備含有上文所述的藥物組合物的本發明的口腔組合物，并且可以以適用于口腔的各種形式使用，如包括牙膏、牙粉、液態潔牙劑在內的潔牙劑、漱口水、錠齊U、口香糖、牙膏、牙齦按摩膏、漱口片、乳制品和其他食品。本發明的口腔組合物還可以包含其他完全已知的組分，這取決于具體口腔組合物的類型和形式。任選地，組合物還包含一種或多種對革蘭氏陰性厭氧菌有毒或抑制其生長的抗生素。潛在地，任何抑菌或殺菌抗生素都可以用于本發明的組合物中。合適的抗生素包括阿莫西林、強力霉素或甲硝噠唑。在本發明的某些形式中，口腔組合物的性質基本上可以是液態的，如漱口水或清洗劑。在這類制品中，媒介通常是水-醇混合物，期望包含下文所述的濕潤劑。通常，水與醇的重量比的范圍為約11到約201。這種類型的制品中水-醇混合物的總量的范圍通常為制品總重量的約70%到約99.9%。醇通常是是乙醇或異丙醇。在某些實施方案中，醇是乙醇。這類液態制品和本發明其他制品的pH的范圍一般為約5至約9，且通常為約5.0-7.0。可以用酸(如檸檬酸或苯甲酸)或堿(如氫氧化鈉)或緩沖液(如用檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等)控制PH。在本發明其他期望的形式中，組合物的性質基本上可以是固態的或糊狀的，如牙粉、牙科用錠(dentaltablet)或牙膏(牙科用乳膏)或凝膠潔牙劑。這類固態或糊狀口腔制品的媒介，通常含有牙齒可接受拋光材料。在牙膏中，液態媒介可以包含水和濕潤劑，其量通常在制品重量的約10%到約80%的范圍內。甘油、丙二醇、山梨醇和聚丙二醇是合適的濕潤劑/載體的例子。水、甘油和山梨醇的液態混合物也是有利的。在折射率是重要考慮因素的透明凝膠中，通常使用約2.5-30%w/w的水、0至約70%的w/w甘油和約20-80%w/w的山梨醇。牙膏、乳膏和凝膠通常含有天然的或合成的增稠劑或膠凝劑，其比例為約0.w/w至約10%w/w，如0.5%w/w至約5%w/w。合適的增稠劑是合成蒙脫石，例如LaporteIndustriesLimited銷售的名為Laponite(例如，CP、SP2002、D)的合成膠體鎂堿金屬硅酸鹽復合物粘土。按重量計，LaponiteD為約58.00%SiO2,25.40%MgO,3.05%Na2O,0.98%Li2O,以及一些水和微量金屬。其實際具體重量為2.53，并且在濕度為8%時，其表觀松裝密度為1.0g/ml。其他合適的增稠劑包括愛爾蘭蘚、i-卡拉膠(iotacarrageenan)、黃蓍膠、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥乙基丙基纖維素、羥丁基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素(例如商業名Natrosol)、羧甲基纖維素鈉以及膠體硅如細微研磨的Syloid(如M4)。也可以包含增溶劑，如多羥基化合物濕潤劑，如丙二醇、二丙二醇和己二醇；溶纖劑如甲基溶纖劑和乙基溶纖劑；在直鏈中含有至少12個碳的植物油和蠟，如橄欖油、蓖麻油和凡士林；以及酯，如乙酸正戊酯、乙酸乙酯以及苯甲酸芐酯。應當理解，常規情況下，口腔制劑通常是在合適的帶標簽的包裝中進行銷售或分銷。因此，一瓶口腔清洗劑會具有將其在本質上描述為口腔清洗劑或漱口水并指導其使用的標記；并且牙膏、乳膏或凝膠通常位于軟管包裝(collapsibletube)中，通常為掛鋁的、掛鉛的或塑料的，或其他壓擠器(squeeze)、泵或用于量化出內容物的加壓分散器，并具有將其在本質上描述為牙膏、凝膠、牙齒乳膏的標記。在本發明的組合物中可以使用有機表面活性劑，以達到增強的治療或預防作用，協助實現活性劑徹底、完全地分散在整個口腔中，并且使本發明的組合物更適合化妝品應用。所述有機表面活性物質的性質可以為陰離子的、非離子的或兩性的，且在一些實施方案中不與所述活性劑相互作用。通常將去垢劑物質作為表面活性劑，所述去垢劑物質賦予組合物去垢和發泡性質。陰離子表面活性劑的合適實例是高級脂肪酸單硫酸甘油單脂的水溶性鹽，例如氫化椰子油脂肪酸的單硫酸甘油單脂的鈉鹽；高級烷基硫酸鹽，例如月桂基磺酸鈉；烷基芳基磺酸鹽，例如十二烷基苯磺酸鈉、高級烷基磺基醋酸鹽、1，2-二羥基丙磺酸鹽的高級脂肪酸酯；以及低級脂肪族氨基羧酸化合物的基本飽和的高級脂肪族酰胺，諸如在脂肪酸、烷基或酰基中具有12-16個碳的那些化合物等。以上提到的酰胺的實例是N-月桂酰肌氨酸、以及N-月桂酰肌氨酸、N-肉豆蔻酰肌氨酸或N-棕櫚酰肌氨酸的鈉鹽、鉀鹽和乙醇胺鹽，以上應當基本脫離于肥皂或相似的高級脂肪酸材料。在本發明的口腔組合物中使用這些肌氨酸化合物是特別有利的，因為除了發揮部分降低牙釉質在酸溶液中的溶解性以夕卜，這些材料在抑制口腔中由于碳水化合物的分解導致的酸形成中還表現出延長的顯著抑制作用。適合使用的水溶性非離子表面活性劑的實例是，環氧乙烷和可與其發生反應的各種反應性含氫化合物的縮合產物，所述含氫化合物具有長疏水性鏈(例如，約12-20個碳原子的脂肪族鏈)，該縮合產物(“ethoxamers")含有親水性聚氧乙烯部分，所述縮合產生例如聚(環氧乙烯)與脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、多羥基醇(例如，山梨醇酐單硬脂酸酯)和聚環氧丙烷(例如，普流尼克(Pluronic)材料)的縮合產物。表面活性劑通常以約0.1-5%的重量比存在。值得注意的是，表面活性劑可以輔助溶解本發明的活性劑，并且由此降低所需的增容性濕潤劑的量。可以將各種其他材料并入本發明的口腔制劑中，如增白劑、防腐劑、硅氧烷、葉綠素化合物和/或與氨結合的材料，如脲、磷酸氫二銨，以及以上的混合物。這些佐劑如果存在，則摻入制劑的佐劑的量應當基本上不會對所需的性質和特征產生不利影響。還可以使用任何合適的調味材料或增甜材料。合適的調味組分的實例是調味油和水楊酸甲酯，所述調味油例如，綠薄荷油、薄荷油、鹿蹄草油、檫木油、丁香油、鼠尾草油、桉樹油、媒墨角蘭油、肉桂油、檸檬油和橙油。合適的增甜劑包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、木糖醇、環氨酸鈉、紫蘇亭、AMP(天冬酰胺苯丙氨酸酯甲酯)、糖精等。適當地，調味劑和增甜劑可以單獨或共同占制劑的約0.1%至5%或更多。還可以將本發明的化合物、肽或肽模擬物并入錠劑或口香糖或其他產品中，如通過攪拌進膠基(gumbase)或包被到膠基的外表面，其說明性的實例是明膠(jelutong)、膠乳、乙烯基樹脂等，理想地與常規可塑劑或柔軟劑、糖或其他增甜劑或諸如葡萄糖、山梨醇等一起。在另一方面，本發明提供了組件試劑盒，包含(a)化合物、肽、肽模擬物或組合物以及(b)藥學上可接受的載體。理想的是，所述試劑盒還包含使用它們治療或預防有這類治療需要的患者的牙周病的說明書。可以按照任何本領域內已知的制備藥物組合物的方法來制備意圖用于口腔的組合物，并且為了提供滿足藥學上外觀和味覺的制劑，該組合物可以含有一種或多種選自以下的試劑增甜劑、調味劑、著色劑和防腐劑。片劑含有與適于制備片劑的無毒的藥學可接受賦形劑混合的活性組分。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；成粒劑和崩解齊U，例如，玉米淀粉或褐藻酸；粘合劑，例如，淀粉、明膠或阿拉伯樹膠；和潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。片劑可以是無包被的或可以用已知的技術進行包被以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而在更長的時期提供持續的作用。例如，可以使用時間延遲材料，諸如單硬脂酸甘油酯或雙硬脂酸甘油酯。用于口腔的制品還可以以硬明膠膠囊的形式提供，其中活性組分與諸如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土的惰性固體稀釋劑混合；用于口腔的制劑還可以以軟明膠膠囊的形式提供，其中活性組分與水或諸如花生油、液體石蠟或橄欖油的油介質混合。水性懸液含有活性物質與適于制備水性懸液的賦形劑的混合物。這類賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠。分散劑或潤濕劑可以是天然存在的磷脂，例如，卵磷脂；或環氧烷烴與脂肪酸的縮合物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；或環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合物，例如十七乙烯氧基十六烷醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)；或環氧乙烷與來自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合物，例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯；或環氧乙烷與來自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合物，例如聚乙烯脫水山梨聚醇單油酸酯。水性懸液也可以含有一種或多種防腐劑，例如苯甲酸鹽，如乙基或η-丙基P-羥基苯甲酸鹽，一種或多種著色劑，一種或多種調味劑，以及一種或多種增甜劑，如蔗糖或糖精。可以通過將活性組分懸浮于植物油或礦物油中來配制油性懸液，所述植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油；所述礦物油例如液體石蠟。油性懸液可以含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。可以添加調味劑和諸如上文列出的增甜劑，以提供符合味覺需要的口腔制品。通過添加諸如抗壞血酸的抗氧化劑可以使這些組合物防腐。為了更詳細地說明本發明，描述了下列實施例，以說明本發明的某些方面和實施方案。材料和方法肽的酶消化和純化通過緩慢添加于50°C、pH8.0的去離子水中同時持續攪拌溶解酪蛋白酸鹽-HCl(BonlacFoods,MelbourneAustralia)，從而得到終濃度為21.5g/L。一旦酪蛋白酸鹽溶解，將溫度降至37°C，并通過緩慢添加IMHCl將pH調整至6.3，以避免酪蛋白沉淀。為了啟動水解，添加Rennet(90%ChymosinEC3.4.23.4,145IMCU/ml,SingleStrength,Chr.Hanson)，至終濃度為1.2IMCU/g酪蛋白，并于37°C將溶液攪拌1小時。通過添加IMHCl和IMNaOH,將溶液的pH維持在6.3士0.2。通過添加4%終濃度的三氯乙酸，終止水解，通過離心(5，00(^，15分鐘，4°0使沉淀的蛋白成團。通過利用3000Da截留膜(S10Y3,Amicon)滲濾，來濃縮含有酪蛋白巨肽(CMP)的上清液。接著使該材料凍干。利用連接于ΑΚΤΑExplorer系統(AmershamPharmaciaBiotech,USA)的Superose12柱(AmershamBiosciences,USA)，使制品分級，并利用50mMTris-HCl(pH8.0)以0.5ml/分鐘的流速洗脫。以214ηπ^Π^0ηπι的波長監測洗脫液。每2分鐘收集級分。將所有的樣品在ChristFreezeDryer(OsterodeamHarz,Germany)中凍干，并保存于-70°C。通過反向HPLC、利用C18柱，對級分進一步分級，并用90%乙腈/0.v/vTFA洗脫。利用Agilent1100S二極管陣列和多波長檢測器(AgilentTech.，PaloAlto,California)，用214nm的主波長，監測洗脫液。凍干所有收集的級分并保存于_70°C。每一級分的特性通過質譜分析證實。非糖基化κ-酪蛋白(106-169)通過凝乳酶消化獲得，如以前所述(Malkoskietal.,2001)。通過將在具有來自金黃色葡萄球菌Gtaphylococcusaureus)菌株V8(Roche，PenzbergGermany)的內切蛋白酶-Glu-C的50mM乙酸銨(pH4.0)緩沖液中溶解了的非糖基化κ-酪蛋白(106-169)于37°C(ES；1200)水解Mh，獲得κ-酪蛋白(106-137)。通過添加2ΜNaOH將pH增加到6.0，而終止水解，并利用分析(C18)RP-HPLC，分離肽。利用MS/MS分析，分析收集的級分，并鑒定肽。MALDIT0F/T0FMS用標準緩沖液(50%乙腈、0.1%TFA)中的飽和2，5_二羥基苯甲酸(DHB)基質，在MTP384型不銹鋼非拋光靶板(targetgroundsteelplate)上使肽樣品共結晶(11vol/vol)。在UltraflexMALDIT0F/T0F質譜儀(Bruker,Bremen,Germany)上分析樣品。利用BrukerDaltonicsflexAnalysis2.4禾口BrukerDaltonicsBioTools3.O軟件，用與本地MASCOT服務器所建立的酪蛋白數據庫匹配的片段化譜，進行分析。固相肽分析利用標準的Fmoc化學方案在Liberty微波肽合成儀(Microwavepeptidesynthesizer,CEMCorporation,NorthCarolina)上，制備asl-酪蛋白(11-23)、β-酪蛋白(193-205)、β-酪蛋白(193-209)、κ-酪蛋白(106-137)、κ-酪蛋白(109-137)、κ-酪蛋白(117-137)、κ-酪蛋白(117-123)和κ-酪蛋白(127-137)肽。肽合成發生于與各自C末端氨基酸結合的Wang樹脂上的酰胺末端。通過反向HPLC、利用C18柱，純化肽。電噴霧MS利用在電噴霧質譜模型中運轉的hquire-LCMS/MS系統(BrukerDaltonics)，分析從RP-HPLC收集的級分。以340μL/h進行樣品注射，氮流為5L/分鐘，且干燥氣溫度為300"C。細菌菌株和生長條件于37°C使牙齦卟啉單胞菌W50和ATCC33277細胞的甘油或凍干培養物在厭氧條件下生長于馬血瓊脂(HorseBloodAgar,HBA；Oxoid)上。通過傳代維持牙齦卟啉單胞菌細胞，且僅用第3-7代接種20mL和200mL腦心浸液肉湯(37g/L)，該肉湯補充有氯高鐵血紅素(5mg/L)和半胱氨酸(0.5g/L)，并且對于ATCC33277，補充維生素K3(甲萘醌)(5mg/L)(BHI)。通過測量650nm波長處的培養物光密度(OD)，測定生長。對培養物進行革蘭氏染色以檢測任何污染。在指數生長期，通過離心(8000g，20分鐘，4°C)，收獲牙齦卟啉單胞菌細胞，并用含有0.5g/L半胱氨酸的TC150緩沖液(50mMTris-HCl、150mMNaCl、5mMCaCl2、pH8.0)洗滌一次。將洗滌的細胞重懸浮于2mLTC150緩沖液(具有0.5g/L半胱氨酸)中，并保存于4°C，以便在蛋白水解測定中直接使用。牙齦卟啉單胞菌RgpA-Kgp蛋白酶粘附素復合體和RgpB的純化使牙齦卟啉單胞菌W50細胞在2L批量培養物中生長至對數晚期，并利用Arg-瓊脂糖親和層析基于之前所述方法(Pathiranaetal.，2006)，從TritonX114提取物中純化RgpA-Kgp蛋白酶粘附素復合體。利用之前公開的方法(Chenetal.,2002；Pikeetal.,1994)，從牙齦卟啉單胞菌菌株HG66中純化RgpB。利用顯色底物測定牙齦卟啉單胞菌Arg-和Lys-特異性蛋白水解活性利用為牙齦卟啉單胞菌的全細胞Arg-和Lys-特異性蛋白水解活性而研發的測定，測定細菌蛋白酶抑制活性，該測定經過改良并且適合利用孵育體積減少的96孔板進行(O'Brien-Simpsonetal.,1998；0'Brien-Simpsonetal.,2001)利用合成顯色底物N-α-苯甲酰-Arg-p-硝基苯胺(L-BapNA)和N-(ρ-甲苯磺酰基)-Gly-Pro-Lys4-硝基苯胺乙酸鹽(GPK-NA)(SigmaAldrich)，測定Arg-和Lys-特異性蛋白水解活性。Arg-和Lys-特異性反應緩沖液含有2mML-BapNA或GPK-NA，其分別溶解于30%ν/ν異丙醇、0.93mML-半胱氨酸、400mMTris-HCl(pH8.0)和IOOmMNaCl中。用TC150緩沖液，稀釋酪蛋白肽，這取決于所需的濃度。添加10μLIOmML-半胱氨酸(ρΗ8.0)，并添加牙齦卟啉單胞菌全細胞懸浮液、純化的RgpA-Kgp蛋白酶-粘附素復合體(0.Olyg/μL)或純化的RgpB(0.00116μg/μL)，至終體積為100μL。接著，在添加Arg-或Lys-特異性反應緩沖液之前(總體積200yL)，將樣品于37°C孵育15分鐘。通過用PerkinElmer1420MultilabelCounterVICT0R3(ffaltham,MA)，于37°C、pH8.0，以IOs間隔持續約20分鐘，測量405nm處的吸光度，測定活性。在去離子吐0中制備8mMZnCl2溶液的母液，并以具體測定所需的濃度溶解凍干的酪蛋白肽。對照樣品與測試樣品相同，然而它們缺少任何蛋白酶抑制物質，即肽和/或鋅。孵育后，通過RP-HPLC、利用分析(C18)柱和0-100%緩沖液B的線性梯度，分析測定內容物來確定在測定過程中是否存在酪蛋白肽的降解。利用ESI-MS和MS/MS分析，分析洗脫的級分。用熒光標記的牛血清白蛋白測定牙齦卟啉單胞菌的蛋白水解活性還利用DQGreenBSA(MolecularProbes,Eugene,OR)，同時對以前所公開的方法(Grenieretal.，2002；Yoshiokaetal.，2003)做了改良，測定細菌蛋白酶抑制活性。用在指數生長期(0.D65tlnm=0.6)收獲的牙齦卟啉單胞菌ATCC33277全細胞進行測定，每孔5.6x109cfu/mL。測定混合物含有牙齦卟啉單胞菌細胞(100μL培養物)、TC150和抑制劑(終體積80μ1)以及DQBSA(20μL；200μg/mL)。用ImMNα-ρ-甲苯磺酰基-1-賴氨酸氯甲基酮(TLCK)處理的細胞作為對照。已知TLCK抑制Rgp和Kgp活性(Fletcheretal.,1994,Pikeetal.，1994)。在利用熒光計(PerkinElmer1420MultilabelCounterVICT0R3)測量熒光(Em535nm,Ex485nm)之前，將測定混合物在黑暗中于37°C孵育濁。從所有值中減去從陰性對照(TLCK-處理的細胞)獲得的熒光值。除非另有聲明，用2-3個生物復制品進行所有測定，一式三份。分級抑制濃度指數分級抑制濃度指數(FIC指數)是定義兩種或多種抑制劑或抗菌劑協同、加成或拮抗相互作用的標準(Berenbaum,1978)0FIC指數計算為:FIC指數=[(A+B)/A]+[(A+B)/B]，其中A表示κ-酪蛋白(109-137)的作用，B表示氯化鋅的作用，且A+B表示兩種組合的作用。FIC指數>1表示拮抗作用，FIC指數=1表示加成作用，而FIC指數<1表示協同作用。抑制類型和抑制常數(κ0的確定以0.15,0.25和ImM的底物(BapNA)濃度，獲得以OD4tl5/秒表示的初始反應速率。抑制劑(肽)濃度的變化范圍為0、25、50、75和100μΜ。將數據作成萊恩威佛-伯克(雙倒數)圖，并利用一階線性回歸，測定斜率。萊恩威佛-伯克圖可以用于測定Km(酶親和性)和Vmax(最大反應速度)值和酶抑制類型，從而區分競爭性抑制劑、非競爭性抑制劑以及反競爭性抑制劑(Stryeretal.，2002)。通過萊恩威佛-伯克圖的斜率針對抑制劑濃度作圖，測定抑制常數(Ki)。分子建模用程序FUGUE(Shietal.，2001)針對含有10；34個蛋白家族和10230個比對結構的專業(curated)蛋白數據庫H0MSTRAD鑒定抑制劑肽的可能結構基序(Mizuguchietal.，1998)。FUGUE掃描結構特征數據庫，計算序列結構相容性得分并產生一列潛在的同系物和比對結果。根據Z-得分計算特異性、敏感性和等級。Z-得分閾值為6表示99%的特異性，且Z-得分閾值為5表示95%的特異性。利用STOnVTripos構建抑制劑肽模型。利用內部軟件，通過金屬原子位置相對于模型肽的主鏈和C原子位置的位置，鑒定抑制劑肽中潛在的金屬結合位點。結果利用顯色底物測定牙齦卟啉單胞菌Arg-和Lys特異性蛋白水解活性在200μΜ肽濃度時，κ-酪蛋白(109-137)表現出最有效的結果，對全細胞Arg-和Lys-特異性蛋白水解活性的抑制為約90%，而Qsi-酪蛋白(11_23)對全細胞Arg-和Lys特異性蛋白水解活性分別表現出約70%和約60%的抑制(圖1、圖2和表1、表2;參見上文“附圖簡要說明”標題下陰影(shadingkey)的)。β-酪蛋白(193-209)抑制50%的全細胞Arg-和Lys-特異性蛋白水解活性，而較短的β-酪蛋肽(193-205)僅抑制15%的Arg-特異性蛋白水解活性(圖1、圖2以及表1、表2；參見上文“附圖簡要說明”標題下陰影的)。分析各種濃度的肽，蛋白水解活性的％抑制證明對肽濃度的劑量響應(圖1、圖2；參見上文“附圖簡要說明”標題下陰影的)。隨后，將包含RgpA和Kgp的純化的外膜蛋白酶復合體用于蛋白水解測定中，以確保所觀察的蛋白水解抑制不是可能存在于全細胞中的其他蛋白酶的假象。因此，肽抑制Arg-和Lys特異性蛋白水解活性，并且甚至僅用100μM肽就表現出抑制潛力的增加(圖3、表1、表2;參見上文“附圖簡要說明”標題下陰影的)。κ-酪蛋白(109-137)對Arg-和Lys-特異性蛋白水解活性表現出最顯著的抑制，對其做進一步評估。針對純化的RgpB評估肽，以確定肽的結合位置。RgpB蛋白水解活性的抑制表明，肽結合蛋白酶自身而非蛋白酶復合體(圖4、表1)。表1具有各種濃度的合成肽的精氨酸牙齦菌蛋白酶的蛋白酶活性(％)權利要求1.用于抑制、降低或防止細菌酶活性的化合物、肽或肽模擬物，其中所述化合物、肽或肽模擬物基本上由選自以下的氨基酸序列和其中的保守取代組成SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO4禾口SEQIDNO:5。2.如權利要求1所述的化合物、肽或肽模擬物，其中所述氨基酸序列選自SEQIDNOUSEQIDNO:2,SEQIDN0:3、SEQIDNO:4禾口SEQIDNO:5。3.如權利要求1所述的化合物、肽或肽模擬物，其中所述氨基酸序列是SEQIDNO:5。4.用于抑制、降低或防止細菌酶活性的化合物、肽或肽模擬物，其由與NOs1-32中任一個至少60%相同的氨基酸序列組成。5.如權利要求1-4中任一項所述的化合物、肽或肽模擬物，其中所述細菌酶是牙齦菌蛋白酶。6.如權利要求5所述的化合物、肽或肽模擬物，其中所述牙齦菌蛋白酶來自牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)07.用于抑制細菌酶的藥物組合物，其包含化合物、肽或肽模擬物和藥學上可接受的載體，所述化合物、肽或肽模擬物包含酪蛋白的氨基酸序列或其片段。8.如權利要求7所述的藥物組合物，其中所述氨基酸序列基本上由SEQIDNO=USEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO4或SEQIDNO5中的任何一個或多個和其中的保守取代組成。9.如權利要求7或8所述的藥物組合物，其還包含二價陽離子。10.如權利要求9所述的藥物組合物，其中所述二價陽離子是鋅。11.用于治療牙周病的藥物組合物，其包含權利要求1-6中任一項所述的化合物、肽或肽模擬物和藥學上可接受的載體。12.如權利要求11所述的藥物組合物，其還包含二價陽離子。13.如權利要求12所述的藥物組合物，其中所述二價陽離子是鋅。14.權利要求1-6中任一項所述的化合物、肽或肽模擬物在制備治療牙周病的藥物中的用途。15.預防或治療牙周病的方法，其包括給予有需要的個體有效量的權利要求1-6中任一項所述的化合物、肽或肽模擬物。16.抑制細菌酶的方法，其包括使所述酶與包含化合物、肽或肽模擬物的組合物接觸，所述化合物、肽或肽模擬物包含選自SEQIDNOs:1-32中任一個的氨基酸序列和其中的保守取代。全文摘要本發明涉及抑制蛋白酶活性的化合物、肽、肽模擬物和藥物組合物以及這些化合物、肽、肽模擬物和藥物組合物治療或預防疾病狀態的用途。特別是，所述疾病狀態是牙周病。所述化合物、肽和肽模擬物可以來源于各種酪蛋白，如α-酪蛋白、β-酪蛋白以及κ-酪蛋白。本發明的化合物、肽、肽模擬物和藥物組合物抑制的蛋白酶活性包括牙齦菌蛋白酶的活性。文檔編號A61K38/10GK102459321SQ201080035149公開日2012年5月16日申請日期2010年6月18日優先權日2009年6月19日發明者埃里克·查爾斯·雷諾茲,斯圖爾特·杰弗里·達斯弗申請人:口腔健康澳洲私人有限公司