專利名稱：蛋白酶體抑制劑及其用途的制作方法
蛋白酶體抑制劑及其用途技術領域和
背景技術：
本發明在其一些實施方式中涉及蛋白酶體抑制劑及其用途。蛋白酶體是真核細胞中的主要蛋白水解復合物，用于降解多種細胞蛋白質。該多蛋白復合物存在于細胞質和細胞核中，催化短壽命調節蛋白的ATP-依賴性蛋白水解，以及受損和異常蛋白質的快速消除。26S蛋白酶體是 2. 5MDa的大復合物。基于生物化學分析，該復合物可分解成兩 種具有不同功能的亞復合物，作為蛋白水解組分的20S核心顆粒(CP)和用于識別、展開多泛素化的底物并將其轉位至20S CP的19S調節顆粒(RP)，它們在那里被降解。20S CP是670kDa的桶狀蛋白質復合物，其由四個堆疊的七元環(4X7個亞基)，即兩個外部的α環和兩個內部的β環組成。兩個匹配的α環位于桶的外緣，朝向19S調節復合物。蛋白水解活性位點位于兩個相同的β_環上，它們位于20S復合物的中心。在真核細胞中，蛋白酶體的催化活性僅限于三個β_亞基。盡管蛋白酶體能夠催化大多數氨基酸之間的酰胺鍵，但是使用熒光底物測定的蛋白水解活性確定了三種不同(盡管不是結論性的)的裂解偏愛[5] :β 2具有胰蛋白酶活性(即在堿性殘基后裂解)；β 5表現出糜蛋白酶活性(chymotryptic activity)(即在疏水殘基后裂解)；以及β I具有“半胱天冬酶樣”或“酸性殘基后的”活性。在所有三個活性亞基中，蛋白水解活性與它們的N-端蘇氨酸殘基相關，其充當肽鍵水解中的親核劑。蛋白酶體抑制劑作為候選藥物的用途來自如下觀察結果在特定的濃度下，它們能夠在某些來自白血病和淋巴瘤的細胞中誘導凋亡而不會相似地影響它們的非轉化的對應細胞(counterpart)。進一步的研究和臨床試驗導致被稱作硼替佐米的經修飾的含硼的二肽Pyz-Phe-boroLeu被批準為用作治療多發性骨髓瘤的藥物。大多數合成的蛋白酶體抑制劑是模擬蛋白質底物的短肽。通常，與20S蛋白酶體活性位點內的蘇氨酸殘基反應并抑制該蘇氨酸殘基的藥效團結合該肽的羧基殘基。一些典型的合成抑制劑是醛基肽類(或肽醒類，peptide aldehyde)、乙烯砜肽類(peptide vinyl sulfone)、硼酸肽類(peptideboronate)以及環氧酮肽類(peptide epoxyketone)。大多數天然的來自細菌的非肽類抑制劑中值得注意的是裂-乳胱氨酸(乳胞素)-β -內酯(claso-lactacystin-β -lactone)(Omuralide)。相關的藥物例如 Salinosporamide A (NPI-0052)和 Carfilzomib (PR-171)目前正處于后期臨床試驗階段。但是，盡管已在蛋白酶體抑制劑的研發中付出了大量努力，但是由于耐藥性細胞的出現和現有抑制劑對不同細胞的不同作用，仍存在對新的抑制分子的不斷增加的需求。大多數現有的蛋白酶體抑制測定法是基于無細胞測定，其需要從不同的來源純化26S或20S蛋白酶體。在原理上此類測定法可適用于高通量篩選，但是它們難以預測活細胞中的抑制活性。為了解決這一問題，將基于細胞的篩選結合于藥物發現過程中。例如，目前可從Promega Corporation獲得用于測量培養的細胞中糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣或半胱天冬酶樣蛋白酶體活性的經修改的“經典”方法[Moravec RA et al.，2009，Anal Biochem387 :294-302]。還使用了多種熒光報告分子來監測蛋白酶體的活性。Dantuma等人使用位于N-端的標準的肽鍵構建了 GFP與泛素的融合物(Ubi [G76VJ-GFP)[Nat Biotechnol 18:538-543,2000]。Bence等人設計了另一種蛋白酶體傳感器構建體，其是GFP與的人工肽CLl(在酵母中鑒定出)的融合物(Science 292:1552-1555，2001) ο Andreatta研究小組和BD Biosciences Clontech提出了表達具有小鼠鳥氨酸脫羧酶(MODC)片段的GFP融合蛋白的傳感器細胞系，所述融合蛋白可在無需泛素化的情況下被蛋白酶體降解[Andreatta等人，2001, Biotechniques 30:656-660]。近期基于穩定表達p27kipl-GFP融合物的另一種報告細胞系被用于發現新的蛋白酶體抑制劑argyrinA[Nickeleit I等人，2008，Cancer Cell 14:23-35]。大多數這些GFP-融合報告子的共同特征為它們是基于在正常條件下被蛋白酶體快速降解的蛋白質，導致細胞產生非常低的熒光，而在蛋白酶體活性被抑制后，由于報告蛋白質的積累而使得細胞的總熒光信號迅速增加
發明內容
根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了治療抑制蛋白酶體對其有利的疾病的方法，所述方法包括向個體給予治療有效量的選自NSC321206、NSC310551、NSC99671和NSC3907的化合物，由此治療所述疾病。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了治療抑制蛋白酶體對其有利的疾病的方法，所述方法包括向個體給予治療有效量的結合細胞的蛋白酶體的化合物，所述化合物包含與配體結合的銅，所述配體被構造為使得與蛋白酶體結合后銅與蛋白酶體的β 2亞基的半胱氨酸31相互作用并且進而與蛋白酶體的β 3亞基的半胱氨酸118相互作用，由此治療所述疾病。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了鑒定蛋白酶體抑制劑的方法，所述方法包括(a)使候選抑制劑與表達本發明的分離多肽的細胞群接觸；和(b)分析所述多肽在細胞群中的細胞定位，其中多肽定位的變化是所述候選抑制劑為蛋白酶體抑制劑指征。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了在存在或不存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有不同細胞定位的包含P53氨基酸序列的分離多肽，所述多肽與可檢測的部分連接。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了表達本發明多肽的細胞群。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了包含作為活性成分的選自NSC321206、NSC310551、NSC99671和NSC3907的化合物和藥學可接受的載體的藥物組合物。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了包含作為活性成分的結合細胞的蛋白酶體的化合物的藥物組合物，所述化合物包含與配體結合的銅，所述配體被構造為使得與蛋白酶體結合后銅與蛋白酶體的β 2亞基的半胱氨酸31相互作用并且進而與蛋白酶體的β 3亞基的半胱氨酸118相互作用。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了包含作為活性成分的根據本發明方法鑒定的化合物和藥學可接受的載體的藥物組合物。根據本發明的一些實施方式的一方面，本文提供了包含編碼本發明多肽的核酸序列的分離的多聚核苷酸。根據本發明的一些實施方式，所述疾病是癌癥。根據本發明的一些實施方式，所述疾病是炎性疾病。根據本發明的一些實施方式，所述疾病是神經變性疾病。根據本發明的一些實施方式，所述分離的多肽包含SEQ ID NO :3列出的氨基酸序列。根據本發明的一些實施方式，所述分離的多肽包含SEQ ID NO :6列出的氨基酸序列。根據本發明的一些實施方式，所述分離物在存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有細胞核定位而在不存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有細胞質定位。根據本發明的一些實施方式，所述分離的多聚核苷酸包含SEQ ID NO :4中列出的核酸序列。根據本發明的一些實施方式，所述分離的多聚核苷酸包含SEQ ID NO :5中列出的核酸序列。根據本發明的一些實施方式，所述細胞群包含H1299非小細胞肺癌細胞。除非另外定義，本文使用的所有技術和/或科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。盡管可使用與本文所述實施方式相似或相同的方法和材料實施或檢測本發明的實施方式，但是仍在下文描述了示例性方法和/或材料。如有沖突，以包括定義在內的專利說明書為準。另外，所述材料、方法和實施例僅為示例性的并且不一定具有限制性。
通過結合附圖和圖像僅以舉例說明的方式在本文中描述本發明的一些實施方式。在具體結合附圖的詳細內容時，應強調的是所顯示的細節僅為示例性的并且用于舉例說明本發明的實施方式。就此而言，描述與附圖一起使得如何實施本發明的實施方式對本領域技術人員是顯而易見的。在所述附圖中圖I是PIR蛋白的示意圖。PIR蛋白由與人類突變的(R175H)p53的C-端融合的黃色熒光蛋白(YFP)組成，其在雙組分核定位信號中(SEQ ID NO 7)攜帶三聯突變，其中三個連續的賴氨酸殘基Lys-319、Lys-320和Lys_321被丙氨酸置換。圖2A-圖21是圖解說明用蛋白酶體抑制劑處理后PIR蛋白的細胞核積累的照片。A-H :將PIR細胞暴露于指定濃度的MG132、硼替佐米和ALLN 6小時并監測PIR報告子的YFP-熒光(上圖)或者用抗-β_連環蛋白抗體染色(下圖)。I :將PIR細胞在無蛋白酶體抑制劑的情況下(對照)或與IOyM MG132溫育6h。分離細胞質和核組分的細胞裂解物。通過免疫印記法用多克隆抗-P53抗體檢測到對應于PIR報告子的條帶。
圖3A-圖3H是圖解說明鼠雙微體2 (MDM2)促進PIR核易位的照片。在無另外的刺激下，MDM2的過表達引起PIR核定位。用野生型MDM2、p53結合缺陷的MDM2突變體(D9-58)或E3連接酶位點(Ser440)被破壞的MDM2突變體轉染PIR細胞。通過用抗-MDM2單克隆抗體進行免疫熒光染色使表達P53和MDM2 二者的細胞可視化。PIR在表達wt MDM2和MDM2(Ser 440)的細胞中具有核定位，而在用MDM2 (D 9-58)轉染的細胞中保留在細胞質內。圖4A-圖4H是圖解說明Mdm2siRNA防止硼替佐米誘導的PIR向核易位的照片。用200pmol對照-siRNA或Mdm2-siRNA瞬時轉染PIR細胞。轉染后四十八小時，加入硼替佐米(O. I μ Μ)并再持續6小時，并且如材料和方法中所述進行MDM2的免疫熒光染色。圖5是篩選操作的流程圖。對于篩選測定，將H11299-PIR報告細胞接種至384-孔板24小時并在兩個濃度(I μ M和10 μ Μ)下用NCI Diversity Set library的化合物處理,每孔一種化合物。溫育12小時后，用3%多聚甲醛固定細胞并通過自動化顯微鏡系統篩選PIR蛋白的定位。分析細胞圖像的PIR核易位并通過顯微鏡和生物化學方法驗證所選的選中物(hit)，然后檢測化合物的細胞毒性。圖6是圖解說明在篩選中鑒定的候選抑制劑對PIR核定位的作用的表格。
圖7A-圖7B是圖解說明用選中化合物處理后全細胞裂解物的泛素化蛋白增加的照片。用以下濃度的選中化合物將PIR細胞處理6小時NSC3907-20 μ M、NSC99671_50 μ Μ、NSC310551-0. 3μΜ、NSC321206-0. 15 μ Μ。已知的蛋白酶體抑制劑 MG132 (5 μ Μ)用作陽性對照。對PIR細胞的全細胞裂解物進行免疫印跡分析以測定泛素(上圖)和連環蛋白(中圖)。微管蛋白(下圖)信號表示內載荷參照。圖8是圖解說明候選抑制劑的體外蛋白酶體抑制的圖。在存在30 μ M候選抑制劑的情況下(NSC3907為100 μ Μ)將從兔肌肉純化的26S蛋白酶體溫育指定的時間，將5 μ M濃度的MG-132用作對照。圖9是圖解說明候選抑制劑的細胞毒性活性的圖。A :在O. 1-100 μ M的11個濃度下用選中化合物將PIR-H1299細胞處理48小時。如(材料和方法)所述進行細胞活力測定。將結果表示為GI5tl，相對于未處理的對照將被處理的細胞的生長減少50%的濃度。所有結果顯示為六個重復實驗孔的平均值和標準偏差。圖10是圖解說明NSC321206對癌細胞活性的作用的圖。圖11是顯示候選抑制劑對NCI-60組人腫瘤細胞系的體外細胞毒性的圖表。所述結果是基于作為Developmental Therapeutics Program的一部分在國家癌癥研究所(National Cancer Institute)進行的針對全組60種人癌細胞系的抗癌藥物篩選的數據。將所述組分為代表不同組織的九個亞組白血病、黑色素瘤、以及肺癌、結腸癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和中樞神經系統癌。將從該檢測獲得的結果表示為將細胞生長抑制50%的摩爾濃度的-log(活性化合物的-log GI50 > 4. 00)。圖12A-圖12B是與胰蛋白酶樣活性位點相關的NSC321206的潛在對接位點(docking site)的圖解。圖12A圖解說明了所述胰蛋白酶樣活性位點的深疏水口袋以及其中對于NSC321206的Cu原子而言位于理想構象的兩個Cys殘基。圖12B是胰蛋白酶樣活性位點的空間填充圖。將催化性蘇氨酸描繪為橙色斑塊，以紅色示出萬珂(Velcade)骨架。顯示出三個能量上最優選的NSC321206群簇。
具體實施例方式本發明在其一些實施方式中涉及蛋白酶體抑制劑及其用途。在詳細闡述本發明的至少一種實施方式之前，應理解本發明的應用并不限于下文說明中所列出的或實施例中所舉例說明的細節。本發明還有其他實施方式或能夠以各種方式實踐或實施。
蛋白酶體是具有復合結構和功能的酶。它們大量存在于所有細胞中，無論是正常細胞還是癌性細胞，并且其功能是降解所有調節蛋白。由于調節蛋白對于包括細胞周期進程、轉錄和凋亡在內的許多細胞過程的活化或抑制是關鍵性的，所以蛋白酶體已成為用于治療多種疾病的潛在抑制靶標。使用新的基于圖像的篩選方法，本發明人檢測了一系列的化學物質并且鑒定出四種具有明顯的蛋白酶體抑制活性的化合物(圖7A-圖7B和圖8)。該篩選是基于使用穩定表達熒光蛋白酶體抑制報告(PIR)蛋白的H1299報告細胞系。該篩選的原理是基于在以下的發現在蛋白酶體活性受到抑制后，該報告子向細胞核易位，引起明顯的并且可檢測的核熒光信號。該發現證明了該方法是非常靈敏的并且與高通量顯微鏡法相容。本發明人還證明了這些抑制劑中至少之一(NSC321206)能夠選擇性殺死癌性細胞，而不殺死非癌性細胞(圖10)。將蛋白酶體和NSC321206抑制劑的3D結構的計算機分析用于鑒定抑制劑在蛋白酶體上的推定對接位點。本發明人假定所鑒定的位點可用于設計能夠與這些結合位點發生強相互作用并且因此可抑制蛋白酶體活性的基于NSC321206的另外的小分子。如下文實施例部分所述，從這些研究推斷所述蛋白酶體在該蛋白酶體的胰蛋白酶樣活性位點內或其附近包含兩個與NSC321206抑制劑的銅相互作用的半胱氨酸(圖12A-圖12B)。因此我們推斷為了實現與這些結合位點的相互作用的數量和強度最大化，應設計小分子使得它們在與這些結合位點適合的距離和取向包含銅。因此，根據本發明的一方面，本文提供了分離的多肽，其包含在存在或不存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有不同細胞定位的P53氨基酸序列，所述多肽與可檢測的部分連接。術語“p53”是指與SEQ ID NO 1具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同源性的人P53多肽。本發明人設想了細胞定位受到蛋白酶體抑制劑存在影響的所有p53序列，例如可溶的(即胞質的)或膜結合的P53序列、特定的細胞器或者特定的生物化學途徑例如復制、轉錄或翻譯等中的p53序列。示例性細胞器包括細胞核、線粒體、葉綠體、核糖體、ER、高爾基體、溶酶體、蛋白酶體、分泌小泡、液泡以及微粒體。本發明人已證明p53多肽的核定位信號內的突變可將該多肽的天然核定位變成細胞質定位。但是，在蛋白酶體抑制劑存在下，p53多肽恢復其核定位。因此，根據一種實施方式，p53多肽在存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有細胞質定位而在不存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有核定位。就具體的位點而言，本發明設想至少70%、更優選至少75%、更優選至少80%、更優選至少85%、至少90%甚至更優選至少95%的所述多肽位于特定的位置，其中其余的多肽位于細胞內的任何其他位置。所設想的突變包括例如對應于SEQ ID NO 1的賴氨酸319的位置處的突變、對應于SEQ ID NO : I的賴氨酸320的位置處的突變以及對應于SEQ ID NO : I的賴氨酸321的位置處的突變。
本文使用的術語“突變”是指與野生型序列(GeneBank登錄號NP_000537. 3-SEQID NO:I)相比氨基酸序列中的變化。
所述突變可包含缺失或替換。示例性突變包括對應于319位賴氨酸的丙氨酸、對應于320位賴氨酸的丙氨酸和對應于321位賴氨酸的丙氨酸中的至少之一。因此，例如，本發明人設想了具有SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列的多肽的用途。所述p53多肽還包含能夠延長其半衰期的突變。因此，本發明人設想了具有對應于175位組胺酸的精氨酸突變的p53多肽的用途。因此，例如，本發明人設想了具有SEQ ID NO :3中列出的氨基酸序列的多肽的用途。能夠延長p53半衰期的其他突變包括Joerger AC, Fersht AR. Structuralbiology of the tumor suppressor p53 和 cancer-associated mutants. Adv CancerRes. 2007 ；97 :1-23)中描述的那些，其通過引用并入本文。另外，本發明的p53多肽可包含SEQ ID NO : I的其他保守變異。本文使用的短語“保守變異”是指氨基酸殘基被另一生物學上相似的殘基替換。保守變異的實例包括例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的一個疏水殘基被另一疏水殘基置換，或者一個極性殘基(solar residue)被另一個極性殘基置換,例如賴氨酸置換精氨酸、天冬氨酸置換谷氨酸、或者天冬酰胺置換谷氨酰胺等。術語“保守變異”還包括用取代的氨基酸替換未取代的母體氨基酸，條件是產生取代的多肽的抗體也與未取代的多肽發生免疫反應。利用計算生物學可發現使p53具有穩定性或者將其細胞定位變成胞質定位的其他突變。例如，使用多種三維計算工具可通過計算機分析多個突變的P53肽序列的提供穩定性和細胞定位的能力。可使用可用于展示三維結構模型的軟件程序例如RIBBONS (Carson, Μ. , 1997. Methods in Enzymology 277, 25)、0 (Jones, TA.等人，1991.Acta Crystallogr. A47,110) > DINO(DIN0 Visualizing Structural Biology(2001)www.dino3d. org)；以及 QUANTA、INSIGHT、SYBYL, MACR0M0DE、I CM, M0LM0L, RASMOL 和 GRASP (綜述于Kraulis, J. , 1991. Appl Crystallogr. 24,946)建模預測的突變肽序列從而鑒定有用的突變。本文說明書中和下文權利要求部分中使用的術語“氨基酸”或“多個氨基酸”應理解為包括20種天然氨基酸；通常在體內被翻譯后修飾的那些氨基酸，包括例如羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其他非天然氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。另外，術語“氨基酸”包括既D-氨基酸也包括L-氨基酸。下文中的表I列出了可與本發明一起使用的天然氨基酸。表I
氨基酸三字母縮寫單字母符號
丙氨酸Al^A
權利要求
1.一種治療抑制蛋白酶體對其有利的疾病的方法，所述方法包括向個體給予治療有效量的選自NSC321206、NSC310551、NSC99671和NSC3907的化合物，從而治療所述疾病。
2.一種治療抑制蛋白酶體對其有利的疾病的方法，所述方法包括向個體給予治療有效量的結合于細胞的蛋白酶體的化合物，所述化合物包含與配體結合的銅，所述配體被構造為使得與所述蛋白酶體結合后，所述銅與所述蛋白酶體的β 2亞基的半胱氨酸31相互作用，并且進而與所述蛋白酶體的β 3亞基的半胱氨酸118相互作用，從而治療所述疾病。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其中，所述疾病是癌癥。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其中，所述疾病是炎性疾病。
5.根據權利要求I或2所述的方法，其中，所述疾病是神經變性疾病。
6.一種包含ρ53氨基酸序列的分離多肽，其在存在或不存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有不同的細胞定位，所述多肽與可檢測的部分連接。
7.根據權利要求6所述的分離多肽，包含SEQID NO 3列出的氨基酸序列。
8.根據權利要求6所述的分離多肽，包含SEQID NO 6列出的氨基酸序列。
9.根據權利要求6所述的分離多肽，其在存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有核定位而在不存在蛋白酶體抑制劑的情況下具有胞質定位。
10.一種分離的多聚核苷酸，其包含編碼權利要求6所述的多肽的核酸序列。
11.根據權利要求10所述的分離的多聚核苷酸,其包含SEQID NO 4中列出的核酸序列。
12.根據權利要求10所述的分離的多聚核苷酸，其包含SEQID NO :5中列出的核酸序列。
13.一種細胞群，其表達權利要求6所述的多肽。
14.根據權利要求13所述的細胞群，其包含Η1299非小細胞肺癌細胞。
15.一種鑒定蛋白酶體抑制劑的方法，所述方法包括 (a)使候選抑制劑與表達權利要求6所述的分離多肽的細胞群接觸；和 (b)分析所述多肽在所述細胞群中的細胞定位，其中多肽定位的變化是所述候選抑制劑為蛋白酶體抑制劑的指征。
16.一種藥物組合物，包含作為活性成分的選自NSC321206、NSC310551、NSC99671和NSC3907的化合物和藥學可接受的載體。
17.一種藥物組合物，包含作為活性成分的結合于細胞的蛋白酶體的化合物，所述化合物包含與配體結合的銅，所述配體被構造為使得與所述蛋白酶體結合后，所述銅與所述蛋白酶體的β 2亞基的半胱氨酸31相互作用，并且進而與所述蛋白酶體的β 3亞基的半胱氨酸118相互作用。
18.—種藥物組合物，包含作為活性成分的根據權利要求15所述的方法鑒定的化合物和藥學可接受的載體。
全文摘要
本發明提供了治療抑制蛋白酶體對其有利的疾病方法。所述方法包括向個體給予治療有效量的結合于細胞的蛋白酶體的化合物，所述化合物包含與配體結合的銅，所述配體被構造為使得與蛋白酶體結合后，所述銅與所述蛋白酶體的β2亞基的半胱氨酸31相互作用，并且進而與所述蛋白酶體的β3亞基的半胱氨酸118相互作用，從而治療所述疾病。還提供了另外的新的蛋白酶體抑制劑以及鑒定蛋白酶體抑制劑的方法。
文檔編號A61K39/00GK102639146SQ201080033618
公開日2012年8月15日 申請日期2010年5月26日 優先權日2009年5月27日
發明者伊里納·拉維林, 摩舍·奧倫, 本杰明·蓋爾, 澤維·卡姆, 瓦爾達·羅特爾, 阿米·納沃恩 申請人:耶達研究及發展有限公司