專利名稱：抗癌劑、癌細胞的凋亡誘導方法及抗癌劑的篩選方法
技術領域：
本發明涉及可以通過特異性抑制作為核內蛋白質的RBM8A或Magoh的表達來誘導癌細胞的細胞死亡的抗癌劑、使用了該抗癌劑的癌細胞的凋亡誘導方法、含有該抗癌劑作為有效成分的藥物組合物及通過測定RBM8A或Magoh的表達量的抗癌劑的篩選方法。
背景技術：
在癌的診斷及治療領域，目前為止，利用各種蛋白質組學分析，鑒定了在癌細胞中特異性表達的蛋白質。一直以來，在以所述蛋白質作為靶的癌治療的研究中，焦點集中在利用該蛋白質的表達及/或活性的增強或抑制進行控制。序列號1表示的核內蛋白質即人RBM8A(RNA binding motif protein 8A)為分子量比較低的蛋白質，與被報道了與各種因子的相互作用的黑腹果蠅的Y14具有同源性。此處，關于Y14，報道了其具有RNA結合基序，與作為其它核內蛋白質的Magoh形成異源二聚體，與RNA結合，通過在黑腹果蠅的培養細胞中抑制其表達，能夠抑制細胞增殖。但是，關于在其他物種中與Y14具有同源性的蛋白質，其功能不明確，特別是也沒有針對與DNA復制和細胞分裂相關功能的關聯性的任何報道等，也沒有明確是否在細胞周期的任一階段抑制細胞的增殖(參見非專利文獻1)。特別是，僅通過引起細胞的增殖抑制不能作為抗癌劑使用， 只有誘導凋亡等細胞死亡才能夠用作抗癌劑，所以也不明確抑制Y14在其它生物中的相同蛋白質的因子能否用于含有抗癌劑等的藥物組合物。另一方面，已知序列號5表示的蛋白質即人Magoh與人RBM8A形成異源二聚體，與 RNA結合。但是，尚不清楚抑制所述Magoh的因子是否能用于含有抗癌劑等的藥物組合物中。目前，RNA干擾(RNA interference =RNAi)技術被頻繁地用于生命科學領域的研究中，已經廣泛認識了其有用性。此處，所謂RNAi，是指通過雙鏈RNA其序列特異性地分解 mRNA，結果抑制基因的表達的現象。自2001年報道了作為21個堿基的低分子雙鏈RNA的 siRNA(small interference RNA)能夠在哺乳動物的細胞內介導RNAi以來，siRNA被頻繁用作靶基因的表達抑制方法，并且近年來也報道了用于在RNAi中獲得更高效果的、siRNA 的序列選擇基準(參見非專利文獻2及3)。也期待RNAi技術應用于藥品和包括癌的各種難治性疾病的治療。例如，專利文獻 1中公開了間質性肺疾病治療劑，其特征在于，含有siRNA等抑制特定的蛋白質的表達的物質作為有效成分。—直以來，已知很多抗癌劑顯示出在細胞周期的S期特異性抑制細胞周期的發展的活性，與此相對，紫杉醇等紫杉烷類抗癌劑通過與微管結合，抑制微管的解聚，由此抑制M 期的細胞周期的發展。如上所述，期待抑制M期的細胞周期的發展的抗癌劑能夠廣泛用于癌治療。專利文獻1 日本特開2007-319009號公報非專利文獻 1 :Herve Le Hir et al. , "The protein Mago provides a linkbetween splicing and mRNA”，EMBO reports, 12, p.1119-1124(2001)非專禾Ij 文獻 2 :Elbashir S. Μ. et al. ,"Duplexes of 21—nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells，，，Nature, 411 (6836), p. 494-498(2001)非專禾Ij 文獻 3 :Reynolds A. et al. ,"Rational siRNA design for RNA interference", Nature Biotechnol.，22(3)，p.326-330(2004)
發明內容
但是，擔心紫杉醇等紫杉烷類抗癌劑顯示白細胞和嗜中性粒細胞的減少、對末梢神經的損傷、惡心和嘔吐等副作用，尋求開發出與紫杉烷類抗癌劑不同、抑制M期的細胞周期的發展的抗癌劑。本發明人等鑒于上述課題進行了深入研究。結果發現人的Y14的相同蛋白質即 RBM8A局部存在于中心體、紡錘絲、收縮管，通過抑制RBM8A的表達來抑制微管蛋白的正常聚合，使癌細胞在M期集聚；通過抑制RBM8A的表達，在M期集聚的細胞中引起凋亡。另外， 還發現通過抑制Magoh的表達也抑制了 RBM8A的表達，引起凋亡。基于上述發現，本發明人等發現抑制RBM8A或Magoh的表達的物質能夠用作抗癌劑，完成了本發明。具體而言，本發明提供了以下方案。(1) 一種抗癌劑，含有特異性抑制序列號1表示的蛋白質或其同種型的表達及/或功能的化合物。(1)所述的抗癌劑，能夠特異性抑制序列號1表示的RBM8A或其同種型的表達及 /或功能。此處，通過抑制癌細胞中的RBM8A的表達及/或功能，能夠使細胞周期在M期停止，抑制細胞的增殖，因此，能夠抑制癌細胞的增殖，同時誘導癌細胞的凋亡，能夠治愈癌。另外，本發明中“特異性抑制”是指在機體內，抗癌劑僅抑制序列號1表示的蛋白質的表達及/或功能，不具有脫靶效應。(2)如(1)所述的抗癌劑，其中，上述化合物為特異性抑制序列號1表示的蛋白質或其同種型的表達的雙鏈siRNA，構成上述雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號 2表示的mRNA互補結合。(2)所述的發明中，作為特異性抑制序列號1表示的蛋白質或其同種型的表達的化合物，規定了雙鏈siRNA。如果為具有能夠與編碼序列號1表示的蛋白質的、序列號2表示的mRNA互補結合的RNA鏈的雙鏈siRNA，則能夠抑制序列號1表示的蛋白質或其同種型的表達，因此能夠優選用作(1)所述的抗癌劑。需要說明的是，本發明中“siRNA”是能夠介導RNAi的短鏈RNA分子，具有21 27 個堿基。(3) —種抗癌劑，含有特異性抑制序列號3表示的蛋白質或其同種型的表達及/或功能的化合物。(3)所述的抗癌劑能夠特異性抑制序列號3表示的Magoh或其同種型的表達及/ 或功能。此處，抑制癌細胞中的Magoh的表達及/或功能時，也抑制RBM8A的表達及/或功能。因此，能夠抑制癌細胞的增殖，同時誘導癌細胞的凋亡，能夠治愈癌。(4)如(3)所述的抗癌劑，其中，上述化合物是特異性抑制序列號3表示的蛋白質或其同種型的表達的雙鏈siRNA，構成上述雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號 4表示的mRNA互補結合。(4)所述的發明中，作為特異性抑制序列號3表示的蛋白質或其同種型的表達的化合物，規定了雙鏈siRNA。如果為具有能夠與編碼序列號3表示的蛋白質的、序列號4表示的mRNA互補結合的RNA鏈的雙鏈siRNA，則能夠抑制序列號3表示的蛋白質或其同種型的表達，因此能夠優選用作( 所述的抗癌劑。(5)如(1) (4)中任一項所述的抗癌劑，用于非小細胞肺癌或乳癌的治療。本發明的抗癌劑特別優選用于非小細胞肺癌或乳癌的治療。因此，根據(5)所述的發明，能夠特異性抑制癌細胞的增殖，特異性誘導癌細胞的凋亡。(6) 一種藥物組合物，以(1) (5)中任一項所述的抗癌劑作為有效成分。(6)所述的發明中，將(1) (5)所述的發明以藥物組合物的發明的形式進行了規定。因此，根據(6)所述的發明，能夠得到與(1) (5)所述的發明同等的效果。(7) 一種癌細胞的凋亡誘導方法，使用(1) (5)中任一項所述的抗癌劑。(7)所述的發明中，將(1) (5)所述的發明以癌細胞的凋亡誘導方法的發明的形式進行了規定。因此，根據(7)所述的發明，能夠得到與(1) (5)所述的發明同等的效^ ο(8) 一種抗癌劑的篩選方法，包括下述步驟使分離的癌細胞與候補物質接觸的步驟；在上述癌細胞中，檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的步驟；及從上述候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及 /或功能下降的候補物質的步驟。(9)如(8)所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的上述步驟中，檢測序列號1或3表示的上述蛋白質、及在機體內與序列號1或3表示的上述蛋白質相互作用的其它蛋白質的相互作用或復合體形成，在從上述候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能下降的候補物質的上述步驟中，選擇使序列號1或3表示的上述蛋白質與上述其它蛋白質的相互作用或復合體形成下降的候補物質。(10)如(8)所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的上述步驟中，測定表達序列號2或4表示的mRNA的基因的表達量，在從上述候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能下降的候補物質的上述工序中，選擇使表達序列號2或4表示的mRNA的基因的表達量下降的候補物質。(8)至(10)所述的發明中，規定了以序列號1表示的RBM8A、或序列號3表示的 Magoh的表達及/或功能的抑制活性作為指標的抗癌劑的篩選方法。如上所述，通過抑制癌細胞中的RBM8A的表達，能夠使細胞周期在M期停止，抑制細胞的增殖，誘導凋亡。另外，通過抑制癌細胞中的Magoh的表達，能夠抑制細胞的增殖，誘導凋亡。因此，根據(8)至(10) 所述的發明，能夠篩選可以通過抑制RBM8A或Magoh的表達來抑制細胞增殖的抗癌劑。(11)如(10)所述的抗癌劑的篩選方法，其中，上述候補物質為具有3’懸突體的雙鏈siRNA，構成上述雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號2或4表示的mRNA互補結合。
(11)所述的發明是抗癌劑的篩選方法，所述篩選方法以具有能夠與編碼RBM8A或 Magoh的mRNA互補結合的RNA分子的雙鏈siRNA作為候補物質。具有能夠與編碼蛋白質的mRNA互補結合的RNA分子的雙鏈siRNA有抑制該蛋白質的表達的傾向，因此，通過使用上述雙鏈siRNA作為候補物質，能夠有效地篩選抗癌劑。(12)如(8) (11)中任一項所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在使分離的癌細胞與候補物質接觸的上述步驟中，在候補物質的存在下培養癌細胞。(13)如(8) (12)中任一項所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在檢測序列號1或 3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的上述步驟中，使用針對序列號1或3表示的蛋白質的抗體，測定上述蛋白質的表達及/或功能。(12)及(13)所述的發明中，規定了⑶ (11)所述的發明中的具體的方法。因此，根據(12)及(13)所述的發明，能夠獲得與(8) (11)所述的發明同等的效果。本發明的抗癌劑能夠特異性抑制序列號1表示的RBM8A、序列號5表示的Magoh、 或它們的同種型的表達及/或功能。此處，通過抑制癌細胞中的RBM8A的表達及/或功能， 能夠使細胞周期在M期停止，抑制細胞的增殖。另外，通過抑制癌細胞中的Magoh的表達， 能夠抑制細胞的增殖。因此，能夠抑制癌細胞增殖，同時誘導癌細胞的凋亡，能夠治愈癌。
圖1為表示細胞內的RBM8A的局部存在部位的圖。圖2為表示細胞內的RBM8A的局部存在部位的圖。圖3為表示轉染了 RBM8A_siRNA(IG-B)的細胞的光學顯微鏡圖像的圖。圖4為表示轉染了 RBMSA-siRNA⑴ (3)的細胞的利用抗磷酸化組蛋白H3抗體的免疫染色的結果的圖。圖5為表示用抗磷酸化組蛋白H3抗體染色后的細胞(M期的細胞)相對于用DAPI 染色后的細胞的比例的圖。圖6為表示轉染了 RBM8A-siRNA(l) (3)的細胞的RBM8A的表達量的圖。圖7為表示轉染了 RBMSA-siRNA⑵的細胞的流式細胞術的結果的圖。圖8為表示轉染了 RBMSA-siRNA⑵的細胞的相差顯微鏡圖像的圖。圖9為表示轉染了 RBMSA-siRNA O)的細胞的利用抗Y -微管蛋白抗體的免疫染色的結果的圖。圖10為表示顯示出轉染了 RBMSA-SiRNA(I) (3)的細胞中的異常的微管形態的細胞的比例的圖。圖11為表示轉染了 RBM8A-siRNA⑴ (3)的細胞中的胱天蛋白酶3/7的活性的圖。圖12為表示轉染了 RBM8A-siRNA(IG-B)、(IG-F)的細胞中的RBM8A的表達量的圖。圖13為表示轉染了 RBM8A-siRNA(IG-B)、(IG-F)的細胞的吉姆薩染色圖像的圖。圖14為表示轉染了 Magoh-siRNA(l)、(2)的細胞中的RBM8A及Magoh的表達量的圖。圖15為表示對轉染了 Magoh-SiRNA(I)、(2)的細胞的細胞周期進行分析的結果的圖。
具體實施例方式以下，詳細說明本發明的實施方式。<抗癌劑>本發明的抗癌劑含有特異性抑制序列號1或3表示的蛋白質的表達及/或功能的化合物。作為上述化合物，例如可以舉出特異性抑制序列號1或3表示的蛋白質的表達的雙鏈siRNA，且構成上述雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號2或4表示的mRNA
互補結合。如下所述，序列號1表示的蛋白質即RBM8A局部存在于細胞核內、中心體、紡錘絲、 收縮環內。而且，通過在癌細胞內抑制RBM8A的表達，細胞周期在M期停止，該癌細胞因凋亡導致細胞死亡。因此，通過特異性抑制序列號1表示的蛋白質即RBM8A的表達及/或功能，能夠抑制癌細胞增殖，同時誘導癌細胞的凋亡。另外，序列號3表示的蛋白質即Magoh能與RBM8A形成異源二聚體。而且，通過在癌細胞中抑制Magoh的表達，該癌細胞因凋亡導致細胞死亡。因此，通過特異性抑制序列號 3表示的蛋白質即Magoh的表達及/或功能，能夠抑制癌細胞增殖，同時誘導癌細胞的凋亡。作為抑制RBM8A的本發明的抗癌劑，可以舉出如下得到的雙鏈siRNA，S卩，使在序列號5 9中任一個表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸(Thymidine ribonucleotide) 的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、和在序列號5 9中任一個表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈配對得到。由于上述雙鏈siRNA能夠與編碼RBM8A且序列號2表示的mRNA特異性結合，所以含有該雙鏈siRNA的抗癌劑在癌細胞內能夠特異性抑制序列號1表示的蛋白質即RBM8A的表達。另外，作為抑制Magoh的本發明的抗癌劑，可以舉出如下得到的雙鏈siRNA，即，使在序列號10或11表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA 鏈、和在序列號10或11表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈配對得到。由于上述雙鏈siRNA能夠與編碼Magoh、且序列號4表示的mRNA特異性結合，所以含有該雙鏈siRNA的抗癌劑在癌細胞內能夠特異性抑制序列號3表示的蛋白質即Magoh的表達。此處，構成本發明的抗癌劑的雙鏈SiRNA可以在體外化學或酶合成，也可以在體內合成，其制造方法沒有特別限定，但優選利用現有公知的方法化學合成進行制造。如果為化學合成的雙鏈siRNA，則雙鏈siRNA的濃度調節和用于防止雜菌混入的操作變得容易，能夠得到RNA干擾的效果優異、安全性高的雙鏈siRNA。例如，19個堿基對的一方的互補鏈用序列號5表示，關于2個堿基的3’懸突體為胸苷核苷酸的二聚體的雙鏈siRNA，優選如下配對分別化學合成在序列號5表示的RNA鏈的3’末端加入了 2個堿基的胸苷核苷酸所得的序列、及在與序列號5表示的RNA鏈互補結合的RNA鏈的3’末端加入了 2個堿基的胸苷核苷酸所得的序列，將上述二條RNA鏈在配對的條件下進行配對。
本發明的抗癌劑適用的疾病只要為癌癥即可，沒有特別限定，可以舉出非小細胞肺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌及食道癌。其中，優選非小細胞肺癌及乳癌。<藥物組合物>本發明還涉及以本發明的抗癌劑作為有效成分的藥物組合物。本發明的抗癌劑能夠在體外對細胞和組織進行使用，除此之外，也可以對人進行臨床應用。對人進行臨床應用時，優選根據需要混合藥學上允許的載體，以含有抗癌劑的藥物組合物的形態給予。其中， 作為藥學上允許的載體，沒有特別限定，可以優選使用能夠提高本發明的抗癌劑向作為靶的癌組織或癌細胞中浸透的效率的載體等。作為上述載體，可以舉出用于防止在機體內的雙鏈SiRNA的分解、提高細胞內透過性的陽離子脂質體(例如參見Yano J. et al.，Clin Cancer Res. ,10(22), p. 7721-7726(2004))。另外，對于構成本發明的抗癌劑的雙鏈siRNA，為了防止在機體內的分解，可以進行化學修飾(例如參見 Rossi J. J.，Nature, 432 (7014), p. 155-156(2004)； Soutschek J. et al.，Nature,432(7014)，p.173-178(2004)等)。本發明的藥物組合物的劑型沒有特別限定，可以舉出注射劑、膏劑、軟膏、混懸劑寸。<癌細胞的凋亡誘導方法>本發明還涉及使用了本發明的抗癌劑的癌細胞的凋亡誘導方法。所述癌細胞的凋亡誘導方法通過使本發明的抗癌劑與分離的癌細胞、或含有癌細胞的細胞群接觸而進行。本發明的癌細胞的凋亡誘導方法中，使本發明的抗癌劑接觸時，使至少含有癌細胞的細胞群與以50 80%的濃度含有本發明的抗癌劑的溶液接觸，在36 37°C下放置 4 72小時。通過進行上述操作，構成本發明的抗癌劑的雙鏈siRNA被攝入細胞內，抑制了序列號1表示的蛋白質即RBM8A、或序列號3表示的蛋白質即Magoh的表達，由此能夠抑制癌細胞增殖，同時誘導癌細胞的凋亡。〈抗癌劑的篩選方法〉本發明還涉及抗癌劑的篩選方法。本發明的抗癌劑的篩選方法包括下述步驟使分離的癌細胞與候補物質接觸的步驟(接觸步驟)；在上述癌細胞中，檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的步驟(測定步驟)；及從上述候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能下降的候補物質的步驟(選擇步驟)。(接觸步驟)在接觸步驟中，使分離的癌細胞與候補物質接觸。對于接觸步驟中使用的癌細胞， 沒有特別限定，例如可以舉出肺癌細胞、子宮頸癌細胞、胰腺癌細胞等。另外，對于使癌細胞與候補物質接觸的方法，可以在候補物質的存在下培養癌細胞，也可以在癌細胞內產生候補物質。例如，可以舉出下述方法，S卩，在候補物質的存在下培養癌細胞時，用96孔微孔板等培養癌細胞，向其中加入候補物質，在36 37°C下培養4 72小時，之后，除去候補物質。另外，候補物質為雙鏈siRNA時，可以在規定的條件下，將產生作為候補物質的雙鏈siRNA的DNA片段導入載體，在導入了該DNA片段的癌細胞內誘導雙鏈siRNA的產生。
作為候補物質，例如可以舉出下述雙鏈siRNA，所述雙鏈SiRNA具有3’懸突體，且構成雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號2或4表示的mRNA互補結合。此時， 對于候補物質，可以在體外化學或酶合成，也可以在體內合成。特別是在體外酶合成時，可以以RBM8A的cDNA作為原料，進行限制酶反應或連接反應，由此合成。(測定步驟)在測定步驟中，在癌細胞中檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能。作為檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達的方法，沒有特別限定，可以舉出測定蛋白質的表達量的免疫印跡法、測定mRNA的表達量的RNA印跡法、 或抗體染色法等。另外，作為檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的功能的方法，例如可以舉出下述方法使用免疫沉降法，從癌細胞的提取液中使序列號1表示的蛋白質即 RBM8A、或序列號3表示的蛋白質即Magoh沉降，通過免疫印記法確認有無與RBM8A或Magoh 共沉降的蛋白質，檢測有無RBM8A或Magoh與其他蛋白質的相互作用及復合體形成的方法； 將RBM8A或Magoh、及已知與其相互作用的蛋白質通過抗體染色法進行染色，確認兩者是否共同局部存在的方法等。特別是，使用免疫印跡法或抗體染色法時，在測定步驟中，優選使用針對序列號1 或3表示的蛋白質的抗體測定上述蛋白質的表達量。此時，作為該抗體，可以使用單克隆抗體，也可以使用多克隆抗體，但優選使用單克隆抗體。(選擇步驟)在選擇步驟中，從候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能下降的候補物質。在選擇步驟中，具體而言，根據測定步驟中具體實施的方法，選擇使表達序列號2或4表示的mRNA的基因的表達量下降的候補物質，或者可以選擇使序列號1或3表示的蛋白質與上述其他蛋白質的相互作用或復合體形成下降的候補物質，可以根據測定步驟中實施的方法，利用現有公知的選擇方法選擇候補物質。實施例以下，參照附圖詳細說明本發明的實施例。需要說明的是，本發明并不限定于以下所示的實施例。在以下的實施例中，作為抑制RBM8A的雙鏈siRNA，使用下述5種物質。RBM8A-siRNA(IG-B)使在序列號5表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、與在序列號5表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈進行配對得到的雙鏈siRNA。RBM8A-siRNA(IG-F)使在序列號6表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、與在序列號6表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈進行配對得到的雙鏈siRNA。RBM8A_siRNA⑴使在序列號7表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、與在序列號7表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈進行配對得到的雙鏈siRNA (Invitrogen公司制，商品編碼 “HSS115051”)。RBM8A_siRNA⑵使在序列號8表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、與在序列號8表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈進行配對得到的雙鏈siRNA (Invitrogen公司制，商品編碼 “HSS115052”)。RBM8A_siRNA(3)使在序列號9表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、與在序列號9表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈進行配對得到的雙鏈siRNA (Invitrogen公司制，商品編碼 “HSS115053”)。另外，作為抑制Magoh的雙鏈siRNA，使用下述2種物質。Magoh-siRNA(l)使在序列號10表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、與在序列號10表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈進行配對得到的雙鏈siRNAanvitrogen公司制，商品編碼“HSS142861”)。Magoh-siRNA(2)使在序列號11表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈、與在序列號11表示的RNA的互補鏈的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚體形成的懸突體的RNA鏈進行配對得到的雙鏈siRNAanvitrogen公司制，商品編碼“HSS142862”)。另外，作為對照的雙鏈siRNA，使用下述5種物質。對照-siRNA(L):"Stealth(注冊商標)RNAi Negative Control Low GC Duplex，，(商品名，Invitrogen 公司制)對照-siRNA(M):"Stealth(注冊商標)RNAi Negative Control Med GC Duplex，，(商品名，Invitrogen 公司制)對照-siRNA(H):"Stealth(注冊商標)RNAi Negative Control Hi GC Duplex，，(商品名，Invitrogen 公司制)對照-siRNA(SNC2) =Takara Bio 公司制，商品編碼"SNC2，，對照-siRNA(SNC5) =Takara Bio 公司制，商品編碼"SNC5，，<實施例1 ；細胞內的RBM8A的局部存在部位的確認>在確認RBM8A的細胞內的局部存在部位時，使用A549細胞，所述A549細胞在添加了 10%胎牛血清的 Dulbecco 改進的 eagle 的培養基(Dulbecco' s Modified Eagle，s Medium)中、于37°C下培養16小時。培養后的A549細胞用磷酸緩沖生理鹽水(PBQ清洗 3次后，用4%低聚甲醛溶液或冷卻至_20°C的甲醇固定。經固定的A549細胞使用0. 2%的 Triton(注冊商標)XlOO溶液進行處理，用PBS洗滌，用牛血清白蛋白(BSA)溶液封閉。 之后，使用抗RBM8A小鼠或兔抗體、抗α-微管蛋白大鼠抗體、抗Y-微管蛋白兔或小鼠抗體、抗磷酸化AuroraB兔抗體、抗Magoh山羊抗體或抗FLAG肽小鼠抗體作為一次抗體，稀釋抗體溶液，處理封閉后的A549細胞。接下來，使用抗兔IgG抗體及/或抗大鼠IgG抗體作為二次抗體，將RBM8A、或RBM8A和各種細胞內小器官染色。在染色后的培養細胞中添加4’， 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對比染色后，使用“!Oolong Gold antifade Reagents，，(商品名，封入劑、^witrogen公司制)進行封入。對于封入后的試樣，使用“LSM710”或 "Axiovert 200M”(均為商品名，熒光顯微鏡、Carl Zeiss公司制)，確認到RBM8A及各細胞內小器官的局部存在。將單獨對RBM8A進行了抗體染色的熒光顯微鏡圖像示于圖1，將對RBM8A和Y-微管蛋白進行了二重染色的熒光顯微鏡圖像示于圖2。如圖1所示，RBM8A的染色圖案和DAPI的染色圖案重復，可知RBM8A在間期的細胞中局部存在于核內。另外，在M期的細胞中，顯示與紡錘體同樣的局部存在圖案的局部存在，暗示了 RBM8A和紡錘絲的相互作用。進而，如圖2所示，RBM8A特別在M期與微管蛋白共同局部存在，表示RBM8A局部存在于紡錘體內。<實施例2 ；利用雙鏈siRNA的RBM8A的表達抑制1>將RBM8A-siRNA (IG-B)或對照-siRNA (L)轉染到A549細胞中，所述A549細胞在添加了 10%胎牛血清的 Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium 中、于 37°C下培養 16 小時，進而進行胰蛋白酶處理回收細胞。使用低滲溶液使細胞膨潤后，用卡諾液固定。將細胞的懸浮液滴到載玻片上使其干燥后，使用吉姆薩染色液進行染色。在光學顯微鏡下測定形成染色體的細胞的比例。結果示于圖3。根據圖3，在轉染了 RBM8A-siRNA(IG-B)的細胞中，與轉染了對照-siRNA(L)的細胞相比，觀察到染色體聚集的細胞的比例明顯較多。由此表明通過RBM8A的表達抑制，細胞在M期集聚。<實施例3 ；利用雙鏈siRNA的RBM8A的表達抑制2>與實施例2同樣地，分別將RBM8A-siRNA(l) (3)、對照-siRNA(L)、(M)轉染到 A549細胞中，與實施例1同樣地使用抗磷酸化組蛋白H3抗體(抗P-H3抗體)進行免疫染色。染色后的熒光顯微鏡圖像如圖4所示。另外，用抗磷酸化組蛋白H3抗體染色的細胞(M 期的細胞)相對于用DAPI染色的細胞的比例(％ )如圖5所示。進而，測定轉染了各雙鏈 siRNA的細胞中的RBM8A的表達量的結果示于圖6。由圖4 圖6可知，在轉染RBM8A-siRNA(l) (3)、抑制了 RBM8A的表達的細胞中，與轉染了對照-siRNA(L)、(M)的細胞相比，使用抗磷酸化組蛋白H3抗體染色的細胞的數量明顯較多。由該結果暗示通過RBM8A的表達抑制，細胞在M期集聚。<實施例4 ；利用雙鏈siRNA的RBM8A的表達抑制3>與實施例2同樣地，將RBM8A_siRNA⑵或對照-siRNA (L)轉染到Hela細胞中，利用雙胸苷阻斷法使Hela細胞的細胞周期在G1/S期停止，之后開放。用流式細胞儀“FACS Calibur"(商品名，Becton-Dickenson公司制)測定在細胞周期中通過G2/M期再次變為 Gl期的細胞的比例。結果示于圖7。由圖7可知，在轉染了 RBM8A-siRNAQ)的細胞中，與轉染了對照-siRNA(L)的細胞相比，在M期移行后再次發展至Gl期的細胞的比例明顯較少。由該結果可知，在轉染了 RBM8A-siRNA (2)的細胞中，有細胞周期在M期停止的傾向。另外，用相差顯微鏡觀察轉染了 RBMSA-siRNA(2)或對照-siRNA(L)的細胞時的顯微鏡圖像如圖8所示。由圖8可知，在轉染了 RBMSA-siRNAO)的細胞中，與轉染了對照-SiRNA(L)的細胞相比，誘導了凋亡的細胞即浮游細胞的比例明顯較多。<實施例5 ；利用雙鏈siRNA的RBM8A的表達抑制4>與實施例2同樣地，將RBM8A-siRNA(2)轉染到A549細胞中，之后進行胰蛋白酶處理，之后對于回收的細胞，與實施例1同樣地將Y-微管蛋白染色。在熒光顯微鏡下確認到微管蛋白的局部存在。利用抗Y-微管蛋白抗體的抗體染色圖像示于圖9。需要說明的是，圖9中，白色箭頭是顯示異常的微管形態的細胞。使用RBM8A_siRNA(l) (3)、對照-siRNA(M)、(H)同樣地將Y-微管蛋白染色， 在熒光顯微鏡下確認到微管蛋白的局部存在。在熒光顯微鏡下觀察到的顯示異常的微管形態的細胞的比例(％)示于圖10。由圖9、圖10可知，在通過RBM8A-siRNA(l) (3)抑制了 RBM8A的表達的細胞中， 觀察到許多微管的形態變得異常。<實施例6 ；利用雙鏈siRNA誘導凋亡>將A549 細胞在添加了 10%胎牛血清的 Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium 中、于37°C下培養48小時，胰蛋白酶處理并回收后，以單個細胞的形式接種到培養板上。向其中分別轉染 RBM8A-siRNA(l) (3)、對照-siRNA(L)、(M)、(H)，使用 “Apo-one Caspase-Glo 3/7 assey”(商品名，凋亡檢測試劑盒，Promega公司制)經時檢測胱天蛋白酶3、7的活性。表示各細胞中的胱天蛋白酶3/7的活性量的熒光強度示于圖11。由圖11可知，對于轉染了 RBM8A_siRNA(l) (3)的細胞，與轉染了對照-SiRNA(L)、(M)、(H)的細胞相比，胱天蛋白酶3/7的活性較高。由該結果可知，在轉染了 RBM8A-siRNA(l) ⑶的細胞中，有誘導凋亡的傾向。<實施例7 ；利用雙鏈siRNA的RBM8A的表達抑制5>與實施例2 同樣地分別將 RBM8A-siRNA (IG-B)、(IG-F)、對照-siRNA (SNC2)、 (SNC5)轉染到A549細胞中，之后進行胰蛋白酶處理并回收，之后以單個細胞的形式接種在培養板上。測定各試樣中的RBM8A的表達量的結果示于圖12。另外，培養2周后，用PBS洗滌細胞，用甲醇固定，用吉姆薩染色液染色，結果示于圖13。由圖12、圖 13 發現在轉染了 RBM8A-siRNA(IG-B)、(IG-F)、抑制了 RBM8A 的表達的細胞中，活細胞減少。該結果暗示通過RBM8A的表達抑制來誘導凋亡。<實施例8 ；利用雙鏈siRNA的Magoh的表達抑制1>與實施例2同樣地，分別將Magoh-s iRNA⑴、(2)、對照_s iRNA (M)、(H)轉染到 A549細胞中，之后進行胰蛋白酶處理，回收細胞。測定各試樣的RBM8A及Magoh的表達量的結果示于圖14。另外，使用流式細胞儀“FACS Calibur”(商品名，Becton-Dickenson公司制)分析細胞周期的結果示于圖15。由圖14可知，在轉染了 Magoh-siRNA(l)、(2)的細胞中，不僅抑制了 Magoh的表達，也抑制了 RBM8A的表達。另外，由圖15可知，對于轉染了 Magoh-SiRNA(I)、⑵的細胞，與轉染了對照-siRNA(M)、(H)的細胞相比，集中在圖表的低值處。由該結果表明，通過 Magoh的表達抑制也抑制了 RBM8A的表達，誘導凋亡。產業上的可利用性本發明的抗癌劑能夠特異性抑制序列號1表示的RBM8A、或序列號3表示的Magoh 的表達。其中，通過抑制癌細胞中的RBM8A或Magoh的表達及/或功能，能夠使細胞周期在 M期停止，抑制細胞的增殖，因此，能夠抑制癌細胞的增殖，同時誘導癌細胞的凋亡，能夠治愈癌。
權利要求
1.一種抗癌劑，含有特異性抑制序列號1表示的蛋白質或其同種型的表達及/或功能的化合物。
2.如權利要求1所述的抗癌劑，其中，所述化合物為特異性抑制序列號1表示的蛋白質或其同種型的表達的雙鏈siRNA，構成所述雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號2表示的mRNA互補結合。
3.一種抗癌劑，含有特異性抑制序列號3表示的蛋白質或其同種型的表達及/或功能的化合物。
4.如權利要求3所述的抗癌劑，其中，所述化合物是特異性抑制序列號3表示的蛋白質或其同種型的表達的雙鏈siRNA，構成所述雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號4表示的mRNA互補結合。
5.如權利要求1 4中任一項所述的抗癌劑，用于非小細胞肺癌或乳癌的治療。
6.一種藥物組合物，以權利要求1 5中任一項所述的抗癌劑作為有效成分。
7.一種癌細胞的凋亡誘導方法，使用權利要求1 5中任一項所述的抗癌劑。
8.一種抗癌劑的篩選方法，包括下述步驟使分離的癌細胞與候補物質接觸的步驟；在所述癌細胞中，檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的步驟；及從所述候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能下降的候補物質的步驟。
9.如權利要求8所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的所述步驟中，檢測序列號1或3表示的所述蛋白質、及在機體內與序列號1或3表示的所述蛋白質相互作用的其他蛋白質的相互作用或復合體形成，在從所述候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能下降的候補物質的所述步驟中，選擇使序列號1或3表示的所述蛋白質與所述其它蛋白質的相互作用或復合體形成下降的候補物質。
10.如權利要求8所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的所述步驟中，測定表達序列號2或4表示的mRNA的基因的表達量，在從所述候補物質中選擇使序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能下降的候補物質的所述步驟中，選擇使表達序列號2或4表示的mRNA的基因的表達量下降的候補物質。
11.如權利要求10所述的抗癌劑的篩選方法，其中，所述候補物質為具有3’懸突體的雙鏈siRNA，構成所述雙鏈siRNA的RNA分子的至少一方能夠與序列號2或4表示的mRNA互補結口 O
12.如權利要求8 11中任一項所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在使分離的癌細胞與候補物質接觸的所述步驟中，在候補物質的存在下培養癌細胞。
13.如權利要求8 12中任一項所述的抗癌劑的篩選方法，其中，在檢測序列號1或3表示的蛋白質或它們的同種型的表達及/或功能的所述步驟中，使用針對序列號1或3表示的蛋白質的抗體，測定所述蛋白質的表達及/或功能。
全文摘要
本發明提供一種與紫杉烷類抗癌劑不同的、抑制細胞周期在M期發展的抗癌劑。本發明的抗癌劑含有下述化合物，所述化合物特異性抑制序列號1表示的RBM8A、序列號3表示的Magoh、或它們的同種型的表達及/或功能。其中，通過抑制癌細胞中的RBM8A或Magoh的表達及/或功能，能夠使細胞周期在M期停止，抑制細胞的增殖，因此，能夠抑制癌細胞的增殖，同時誘導癌細胞的凋亡，能夠治愈癌。
文檔編號A61K31/7088GK102470174SQ20108003197
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月14日 優先權日2009年7月15日
發明者友杉直久, 石垣靖人 申請人:Mcp生物技術株式會社