血清淀粉樣蛋白p衍生物及其制備和用途的制作方法

專利名稱：血清淀粉樣蛋白p衍生物及其制備和用途的制作方法
血清淀粉樣蛋白P衍生物及其制備和用途相關申請的交叉參考本申請要求2009年6月4日提交的美國臨時申請系列號61/217，931的權益。上述申請的所有教導內容通過引用方式并入本文。
背景技術：
血清淀粉樣肽P(SAP)是五聚環蛋白(pentraxin)蛋白家族的成員。SAP是由肝臟分泌的，在血液中作為穩定的五聚體循環。之前的研究證明SAP在免疫應答的啟動和消退期中都具有重要作用。SAP能夠結合細菌表面上的糖殘基，從而促進它們的調理素作用和被抗原呈遞細胞的吞食。SAP還結合免疫應答消退的時候由調亡細胞產生的游離DNA和染色質，從而阻止針對這些抗原的繼發性炎性應答。由于SAP的結合所有三種經典Fc γ受體 (Fe y R)[其對于FcyRII (CD32) ^P FcyRIII (CD16)尤其具有親和性]的能力，由SAP結合的分子從細胞外區域中被除掉。與受體結合之后，SAP和任何附著的復合物一般會被細胞內化和處理。最近有人提出SAP可用作治療性試劑以治療多種病癥，包括纖維化相關的病癥， 超敏反應病癥，自身免疫病癥，粘膜炎，以及炎性病癥，例如由于微生物感染引起的那些。 見，例如美國專利申請系列號11/707，333、12/217，617、12/720，845和12/720,847。用于治療人類疾病的蛋白質治療劑已經使衛生保健行業發生了革命。然而，生產具有必要的效力的蛋白質治療劑和/或以足夠數量生產以用作治療性試劑的蛋白質治療劑具有很多困難。 修飾了很多潛在的治療性試劑以增加它們的生物學活性(相對于天然產生的蛋白質)，例如血漿半衰期。通常應用重組表達技術來生產足夠數量的多肽。不幸的是，很多重組系統產生與天然產生的形式相比具有不同生物學性質的多肽，這可能會影響治療性產品的藥代動力學、安全性和功效。因此，需要開發適合于人類治療的SAP多肽及其制備方法。

發明內容
本公開部分地提供了變體血清淀粉樣蛋白P(SAP)多肽及其生產方法。本發明包括用于體外和體內添加、刪除或修飾糖殘基以產生具有需要的糖基化模式的變體SAP多肽的方法和組合物。在一些方面，本公開提供了糖基化的人SAP多肽，其包含N-連接的或0-連接的寡糖鏈，所述寡糖鏈具有至少一個分支末端，所述分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。在一些方面，本公開提供了糖基化的人SAP多肽，其包含N-連接的或0-連接的寡糖鏈，所述寡糖鏈相對于分離自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α 2，6_連接的唾液酸部分。在一些方面，本公開提供了制備糖基化的人SAP多肽的方法，包括在細胞中表達 SAP多肽并從該細胞中分離所述SAP多肽。在優選實施方式中，所述細胞是CHO細胞。在一些方面，細胞是CHO-S細胞。
在一些方面，本公開提供了制備人SAP多肽的方法，包括在CHO細胞中表達人 SAP多肽并從該細胞中分離所述人SAP多肽。在一些方面，本公開提供了制備人SAP多肽的方法，包括提供包含N-連接的或 0-連接的寡糖鏈的糖基化的人SAP多肽；和酶促地或化學地改變SAP多肽的N-連接的或 0-連接的寡糖鏈以產生修飾的糖基化的SAP多肽。在一些方面，本公開提供了制備人SAP多肽的方法，包括提供人SAP多肽；和酶促地或化學地改變SAP多肽以產生包含N-連接或0-連接的寡糖的糖基化的SAP多肽。在一些方面，本公開提供了通過以下方法制備的人SAP多肽，所述方法包括在 CHO細胞中表達SAP多肽，并從該細胞中分離所述SAP多肽。在一些方面，本公開提供了 CHO細胞，其包含人SAP多肽，所述人SAP多肽具有 N-連接的寡糖鏈，所述寡糖鏈的至少一個分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。在一些方面，本公開提供了 CHO細胞，其包含編碼人SAP多肽的多核苷酸序列。在一些方面，本公開提供了人SAP多肽，其抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2，小于其1/3，小于其1/4，小于其 1/10，或小于其1/100。在優選實施方式中，本發明的人SAP多肽具有N-連接的寡糖鏈。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈的至少一個分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈相對于分離自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α2，6_連接的唾液酸部分。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈的所有分支都終止于α2，3_連接的唾液酸部分。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈實質上不含α 2，6_連接的唾液酸部分。 本發明的糖變體SAP多肽可以包含一個或多個分支，例如，N-連接的寡糖鏈的特征可以在于具有雙觸角、三觸角、四觸角或五觸角結構。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈包含 Man [ ( α l，6_)-(Man(a 1,3)]-Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc (β 1，N) -Asn 的五糖核心。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈包含具有結構NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6 的至少一個分支。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈的至少一個分支實質上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈的所有分支實質上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈的至少一個分支包含一個或多個甘露糖殘基。在一些實施方式中，N-連接的寡糖鏈包含至少一個巖藻糖殘基。本發明的任何糖變體SAP多肽可以包含至少一個修飾的糖基殘基。修飾的糖基殘基可以綴合于選自下列的一個或多個修飾基團水溶性和水不溶性聚合物、治療部分、診斷劑和生物分子。在一些方面，本發明的SAP多肽可以是重組多肽。本發明的SAP多肽可以包含與 SEQ ID NO :1、2、3 或 4 至少 85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或 100% 同一的氨基酸序列。優選地，SAP多肽是人SAP蛋白。本發明的人SAP多肽可以包含與SEQ ID N0:1至少 85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或 100% 同一的氨基酸序列。在一些方面，本發明的人SAP多肽是包含SAP結構域和一個或多個異源結構域的融合蛋白。所述異源結構域可以增強下列一項或多項體內穩定性、體內半衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形成、和/或純化。在一些方面，本發明的人SAP多肽包含一個或多個修飾的氨基酸殘基，例如PEG化的氨基酸，糖基化的(例如0-連接的糖基化)氨基酸，異戊烯化的氨基酸，乙酰化的氨基酸，生物素化的氨基酸，和/或綴合于有機衍生劑的氨基酸。修飾的氨基酸殘基可以增強下列一項或多項體內穩定性、體內半衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形成、和/或純化。在優選實施方式中，本發明的人SAP多肽相對于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品具有增加的生物學活性。在一些方面，本發明的SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2，小于其1/3，小于其1/4，小于其1/10，或小于其1/100。在一些方面，制備本發明的任意人SAP多肽的方法包括以下的另外步驟酶促地或化學地改變SAP多肽以向SAP多肽附著N-連接或0-連接的寡糖鏈，或修飾SAP多肽中已有的N-連接的或0-連接的寡糖鏈。在一些實施方式中，酶促地或化學地改變SAP多肽包括以選自糖基轉移酶、糖苷酶和磷酸酶的一種或多種酶蛋白處理SAP多肽。在一些實施方式中，酶促地或化學地改變SAP多肽的方法在存在一種或多種糖前體的情況下進行。合適的糖前體包括但不限于=UDP-N-乙酰葡萄糖胺，CMP-N-羥乙酰基神經氨酸、UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神經氨酸，UDP-半乳糖和⑶P-巖藻糖。在一些實施方式中，酶促地或化學地改變SAP多肽的方法從N-連接或0-連接的寡糖鏈除掉一個或多個末端的α 2， 6-連接的唾液酸部分。在一些實施方式中，酶促地或化學地改變SAP多肽的方法將寡糖鏈上的一個或多個末端的α 2，6_連接的唾液酸部分替換為一個或多個α2，3_連接的唾液酸部分。在一些方面，本公開還提供了適合用于哺乳動物的本發明的人SAP多肽的藥學制備物。本發明的藥學制備物包括本文公開的至少一種SAP多肽和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，藥學制備物還包含另外的活性試劑。在一些實施方式中，藥學制備物配制為緩釋制劑。在一些實施方式中，本公開的藥學制備物適合于表面地、通過注射、通過靜脈內注射、通過吸入、通過持續貯庫或通過泵施用至患者。本公開還提供了通過向有此需要的患者施用治療有效量的一種或多種本發明的 SAP多肽而治療或預防SAP響應性病癥或病況的方法。SAP響應性病癥或病況包括但不限于纖維變性或纖維增殖性病癥或病況，超敏反應病癥或病況，自身免疫病癥或病況，炎性疾病或病況，和粘膜炎。本發明的SAP多肽可以表面地、通過注射、通過靜脈內注射、通過吸入、通過持續貯庫或通過泵或其組合方式施用至患者。在一些實施方式中，本發明的SAP多肽與一種或多種另外的活性試劑一起施用。


圖1 纖維細胞分化測驗。使用基于ELISA的測驗法來測定單核細胞與SAP多肽一起溫育之后MDC的產生。Y軸表明了相對于源自人血清的SAP (hSAP)，分離自CHO-S細胞的重組人SAP(rhSAP)的平均效力(即，7個獨立實驗的平均值)。hSAP的相對活性設定為 1. 0。圖2 變體SAP多肽的聚糖結構分析。使用液體色譜質譜(LCMS)分析法㈧和陰離子交換高效液體色譜(AEX-HPLC)分析法(B)測定分離自CHO-S細胞的糖改組的重組人 SAP上的唾液酸連接情況。使用液體色譜質譜(LCMQ分析法(C)和陰離子交換高效液體色譜(AEX-HPLC)分析法(D)測定糖改組的hSAP(源自人血清的SAP)上的唾液酸連接情況。使用液體色譜質譜(LCMQ分析法(E)和陰離子交換高效液體色譜(AEX-HPLC)分析法(F) 測定以α2，3_唾液酸轉移酶處理(以增加SAP聚糖上的末端的2，3_連接的唾液酸的數目)的rhSAP上的唾液酸連接情況。對于LCMS圖，X軸代表質量，單位為道爾頓；Y軸代表相對強度。對于HPLC跡線，X軸是時間，單位為分鐘；Y軸是吸收單位(mAU)。圖3 纖維細胞分化測驗。使用基于ELISA的測驗法來測定單核細胞與SAP變體多肽一起溫育之后MDC的產生。Y軸表明了相對于hSAP參考標準物，每種SAP變體的平均相對活性，hSAP的活性設定為1. 0 (見最左側的條柱)。圖4 纖維細胞分化測驗。以hMCSF處理單核細胞，然后定量纖維細胞分化情況。 X軸代表與供體單核細胞一起溫育的hMCSF的濃度。Y軸代表第5天時纖維細胞增殖的量 通過纖維細胞計數/5. OxlO4個細胞所測定。圖5 纖維細胞分化測驗。以hSAP處理單核細胞，然后定量纖維細胞分化情況。X 軸代表與供體單核細胞一起溫育的hSAP的濃度。Y軸代表第5天時纖維細胞增殖的量通過纖維細胞計數/5. OxlO4個細胞所測定。
具體實施例方式概述多數天然產生的肽具有通過連接至原始肽鏈長度上的某些氨基酸的特定鍵而附著至肽的碳水化合物部分(即聚糖)，從而形成“糖肽”。任何給定肽上的糖基化模式都可能對于該肽的功能具有多種影響。例如，肽上的N-連接的聚糖的結構能夠影響肽的多種特性，包括蛋白酶易感性、細胞內運輸、分泌、組織靶向、生物半衰期，和抗原性。這些特性中的一項或多項的改變大大影響肽在其天然環境下的功效。天然產生的糖肽中存在的聚糖結構通常被分成兩類N-連接的和0-連接的聚糖。 真核細胞中表達的肽通常在肽初級結構中的包含序列天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸的位點處的天冬酰胺殘基上有N-糖基化，其中X可以是除了脯氨酸和天冬氨酸之外的任意氨基酸。此類肽的碳水化合物部分被稱作N-連接的聚糖或N-連接的寡糖。N-糖基化的早期事件發生于內質網(ER)并且在哺乳動物、植物、昆蟲和其它高等真核細胞中是保守的。首先，在載脂分子上構建包含14個糖殘基的寡糖鏈。隨著初生肽被翻譯并轉運至ER，整個寡糖鏈通過與膜結合的糖基轉移酶催化的反應被轉移至天冬酰胺殘基的酰胺基團上。N-連接的聚糖進一步在ER和高爾基體中被處理。進一步處理一般會除掉一些糖殘基并添加其它的糖殘基這是通過特異于除掉的和添加的糖殘基的糖基化酶和糖基轉移酶催化的反應進行的。通常而言，N-連接的聚糖的最終結構取決于肽所產生自的生物體。例如，在細菌中產生的肽一般是非糖基化的。在昆蟲細胞中表達的肽通常含有大量甘露糖或少量甘露糖 N-連接的寡糖鏈。在哺乳動物細胞培養物中產生的肽通常差別化糖基化，取決于物種和細胞培養條件。即時在相同的物種并在相同的條件下，有時也會發生糖基鏈中一定量的異質性。一般地，在植物細胞中產生的肽包含的聚糖結構顯著不同于在動物細胞中產生的肽。在本領域中已經提出了多種方法來定制肽的糖基化模式，包括在公布的國際申請號W 99/22764、WO 98/58964和WO 99/54342以及美國專利號5，047, 335中描述的那些。 基本上而言，已經克隆并測序了用于在體外糖基化肽所需的很多酶。在一些情況下，已經在體外使用這些酶以向肽上的聚糖添加特定的糖。在其它情況下，已經對細胞進行了遺傳工程化以表達酶與所需肽的組合，從而在細胞內實現向表達的肽添加所需的糖部分。在合成碳水化合物時主要使用兩類酶糖基轉移酶和糖苷酶。糖基轉移酶添加或修飾肽上已有的寡糖結構。糖基轉移酶對于產生具有良好的立體化學和區域化學控制的特定產物是有效的。已經使用糖基轉移酶來制備寡糖和修飾末端的N-和0-連接的碳水化合物結構，尤其是在哺乳動物細胞中產生的肽上的那些。例如，可以使用糖基轉移酶使糖肽的末端寡糖完全唾液酸化和/或巖藻糖化，以提供更一致的糖結構，這可以改善糖肽的藥代動力學和多種其它生物學性質。糖苷酶進一步分類為外切糖苷酶(例如，例如β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶)， 和內切糖苷酶(例如，Endo-A、Endo-M)。糖苷酶通常催化糖苷鍵的水解。然而，在合適的條件下，它們可用于形成該鍵。用于合成碳水化合物的多數糖苷酶是外切糖苷酶糖基轉移發生在底物的非還原末端。糖苷酶結合糖基-酶中間體中的糖基供體，其被水截獲以產生水解產物，或被受體截獲以產生新的糖苷或寡糖。使用外切糖苷酶的示例性途徑是所有的 N-連接的糖肽的核心三糖的合成，包括甘露糖苷鍵，其是通過甘露糖苷酶的作用形成的(Singh等人，Chem. Commun. 993-994(1996))。雖然內切糖苷酶的用途不如外切糖苷酶常見，但是內切糖苷酶也用于制備碳水化合物。內切糖苷酶可用于將整個寡糖鏈而非單糖轉移至多肽上。已經使用內-β -N-乙酰葡萄糖胺、例如endo-F和endo-M將寡糖片段添加到了底物上(Wang 等人，Tetrahedron Lett. 37 :1975-1978 ；和 Haneda 等人，Carbohydr. Res. 292 :61-70(1996)) 0已經成功地使用這些類別的酶中的每一種產生了糖基化的肽。關于一般綜述，見 Crout 等人，Curr. Opin. Chem. Biol. 2 :98-111 (1998)。血清淀粉樣蛋白P (SAP)是哺乳動物中天然產生的血清蛋白，其由5個相同的亞基或“原體”組成，它們非共價地結合于圓盤樣復合物中。SAP屬于五聚環蛋白(pentraxin) 蛋白超家族，其特征在于該環式五聚結構。經典的短的五聚環蛋白包括SAP以及C-反應性蛋白(0smand，A. P.，等人，Proc. Nat. Acad. ki.，74 :739_743，1997)。SAP 通常在肝臟中合成，并且具有M小時的生理半衰期。以下公開了人SAP亞基的序列，其對應于Gene bank 登記號NP_001630的氨基酸20-223 (未顯示信號序列)。HTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLQNFTLCFRAYSDLSRAYSLFSYNTQGRDNELLVYKERVG EYSLYIGRHKVTSKVIEKFPAPVHICVSWESSSGIAEFWINGTPLVKKGLRQGYFVEAQPKIVLGQEQDSYGGKFDR SQSFVGEIGDLYMWDSVLPPENILSAYQGTPLPANILDWQALNYEIRGYVIIKPLVffV(SEQ ID NO :1)。以下公開了原雞(Gallus gallus) SAP亞基的序列QEDLYRKVFVFREDPSDAYVLLQVQLERPLLNFTVCLRSYTDLTRPHSLFSYATKAQDNEILLFKPKPG EYRFYVGGKYVTFRVPENRGEWEHVCASWESGSGIAEFWLNGRPffPRKGLQKGYEVGNEAVVMLGQEQDAYGGGFDV YNSFTGEMADVHLWDAGLSPDKMRSAYLALRLPPAPLAW GRLRYEAKGDVVVKPRLREALGA(SEQ ID NO :2)。以下公開了牛(Bos taurus)SAP亞基的序列QTDLRGKVFVFPRESSTDHVTLITKLEKPLKNLTLCLRAYSDLSRGYSLFSYNIHSKDNELLVFKNGIG EYSLYIGKTKVTVRATEKFPSPVHICTSWESSTGIAEFWINGKPLVKRGLKQGYAVGAHPKIVLGQEQDSYGGGFDK NQSFMGEIGDLYMWDSVLSPEEILLVYQGSSSISPTILDffQALKYEIKGYVIVKPMVffG(SEQ ID NO :3)。以下公開了灰倉鼠(Cricetulus migratorius) SAP亞基的序列QTDLTGKVFVFPRESESDYVKLIPRLEKPLENFTLCFRTYTDLSRPHSLFSYNTKNKDNELLIYKERMGEYGLYIENVGAIVRGVEEFASPVHFCTSWESSSGIADFWVNGIPWVKKGLKKGYTVKTQPSIILGQEQDNYGGGFDK SQSFVGEMGDLNMWDSVLTPEEIKSVYEGSWLEPNILDWRALNYEMSGYAVIRPRVffH(SEQ ID NO :4)。本發明的一個方面涉及以下令人驚奇的發現修飾人SAP多肽上的聚糖結構能夠相對于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品而言增加SAP多肽的生物學活性。如本公開的實施例所證實，分離自人血清的SAP僅含有α 2，6-連接的唾液酸殘基。與此相反，在 CHO細胞中產生的重組人SAP僅包含α 2，3-連接的唾液酸殘基。使用體外的基于細胞的生物測驗法證明α 2，3-連接的唾液酸SAP多肽比野生型SAP (即含有α 2，6_連接的唾液酸部分的SAP)具有一貫地較高的活性。本發明的變體SAP多肽作為治療試劑將更加有效，因為它們具有增加的生物學效力。例如，效力更強的SAP變體相對于分離自人血清的野生型 SAP可能需要更低的配量和/或頻率更低的配量。本公開提供了變體人SAP多肽及其制備方法。特別地，本公開包括用于體外和體內添加、刪除或修飾糖殘基以產生具有需要的糖基化模式的人SAP多肽的方法和組合物。定義除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語一般具有如本領域普通技術人員通常理解的相同含義。一般地，本文使用的命名法以及細胞培養、分子遺傳學、有機化學和核酸化學與雜交中使用的實驗程序是本領域熟知并通常使用的。使用標準技術用于核酸和肽的合成。一般根據本領域的常規方法和多項一般性的參考文獻進行技術和程序操作(例如 Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning :ALaboratory Manual, 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.),在該文獻中通篇有提供。冠詞"a"和"an"在本文中用于指一個或多個該冠詞的語法客體(即至少一個)。舉例而言，“an element"意指一個元件或多個元件。如本文使用的術語“處理”是指獲得需要的藥理學和/或生理學效應。該效應可以是預防性的完全或部分預防其病癥或癥狀；和/或，可以是治療性的部分或完全治愈病癥和/或歸因于病癥的不利影響。如本文使用的“治療”涵蓋了哺乳動物、尤其是人類的疾病的任何治療，包括(a)延長生存時間；(b)降低由于疾病造成的死亡風險；(c)抑制疾病，即，阻抑其發展或降低疾病進展速率；和(d)減輕疾病，即，引起疾病消退。如本文使用的“抑制”或“預防”病癥或病況的治療劑是這樣的化合物在統計樣本中，使經處理的樣品中的病癥或病況的發生相對于未經處理對照樣品降低；或使疾病或病況的一種或多種癥狀的發生延緩或使其嚴重性相對于未經處理的對照樣品降低。如本文使用的術語“受試者”和“患者”是指動物，包括哺乳動物，例如人。術語 “哺乳動物”包括靈長類，馴養的動物，包括狗、貓、綿羊、牛、馬、山羊、豬、小鼠、大鼠、兔子、 豚鼠，俘獲的動物，例如動物園的動物，和野生動物。如本文使用的術語“組織”是指器官或特化細胞的集合，例如皮膚組織、肺組織、腎組織和其它類型的細胞。術語“治療效應”是本領域認識到的，是指動物、尤其是哺乳動物、更特別是人類中的由藥理學活性物質引起的局部或全身效應。詞語“治療有效量”是指在適用于任何治療的合理的利弊比率下，產生一些期望的局部或全身效應的此類物質的量。此類物質的治療有效量將根據所治療的受試者和疾病狀況、受試者的體重和年齡、疾病狀況的嚴重性、給藥方式而變化，其可以由本領域普通技術人員容易地確定。例如，本文描述的一些組合物可以按照在適用于此類治療的合理的利弊比率下，足以產生期望效應的量來施用。如本文使用的術語“核酸”是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)，以及，在適當情況下，是指核糖核酸(RNA)。該術語應該被理解為包括從核苷酸類似物制備的RNA或 DNA的等同物、類似物，以及，在適用于所描述的實施方式的情況下，包括單鏈(例如正義或反義)和雙鏈多核苷酸。術語“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文中相互替換地使用。術語“純化的蛋白，，是指蛋白制備物，其優選分離自在細胞或細胞裂解物中通常與該蛋白結合的其它蛋白，或實質上不含在細胞或細胞裂解物中通常與該蛋白結合的其它蛋白。術語“實質上不含其它細胞性蛋白”或“實質上不含其它污染性蛋白”定義為包括每種蛋白的各制備物，其中包含20% 以下(干重)的污染性蛋白，優選包含5%以下的污染性蛋白。可以使用本領域熟知的克隆的基因以純化的制備物的形式制備每種蛋白的功能形式。“純化的”意指所述分子在實質上不存在其它生物大分子、例如其它蛋白(特別是可能實質上掩蓋、減少、混淆或改變成分蛋白的特性的其它蛋白它們作為純化的制備物，或在對象重構混合物中發揮作用)的情況下存在。如本文使用的術語“純化的”優選意指存在至少80%干重、更優選85%干重、更優選95% -99%干重，最優選至少99. 8%干重的相同類型的生物大分子(但是可以存在水、 緩沖液和其它小分子，尤其是具有小于5000分子量的分子)。如如本文使用的術語“純的” 優選具有與上述“純化的”相同的數值限制。“N-連接的”寡糖是通過天冬酰胺連接至肽骨架的寡糖通過天冬酰胺-N-乙酰葡萄糖胺鍵連接。N-連接的寡糖也被稱作“N-聚糖”。天然產生的N-連接的寡糖具有下列的共同的五糖核心:Man [(α 1,6-)- (Man (α 1,3)] -Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc ( β 1， N)。它們的區別在于是否存在外周糖例如N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖和唾液酸的分支(也稱作觸角)，以及分支的數目。任選地，該結構還可以包含核心巖藻糖分子和/或木糖分子。術語“唾液酸”是指九碳羧化糖家族的任意成員。最常見的唾液酸家族成員是 N-乙酰-神經氨酸(通常簡寫為Neu5AC、NeuAC或NANA)。該家族的第二個成員是N-羥乙酰基-神經氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羥化。唾液酸家族的第三個成員是 2-酮-3-脫氧-nonulosonic acid (KDN) (Nadano 等人(1986) J. Biol. Chem. 261 11550-11557 ；Kanamori 等人，J. Biol. Chem. 265 :21811-21819 (1990))。還包括 9-取代的唾液酸，例如9-0-C1C6-酰基-Neu5Ac，例如9-0-乳酰基-Neu5Ac或9-0-乙酰基_Neu5Ac， 9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮-9-脫氧-Neu5Ac。關于唾液酸家族的綜述，見，例如，Varki, Glycobiology 2 :25-40(1992) ；Sialic Acids Chemistry, Metabolismand Function, R.Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))。“遺傳工程化的”或“重組的”細胞是具有對于細胞的遺傳物質的一個或多個修飾的細胞。此類修飾包括但不限于插入遺傳物質、刪除遺傳物質和插入染色體外的遺傳物質，無論此類物質是否是穩定維持的。如本文使用的術語“修飾的糖”是指在本發明的方法中酶促地添加至肽的氨基酸或糖基殘基上的天然或非天然產生的碳水化合物。修飾的糖選自多種酶底物，包括但不限于糖核苷酸(單、雙和三磷酸酯)，激活的糖(例如，糖基鹵化物、糖基甲磺酸酯)，以及既非激活也非核苷酸的糖。“修飾的糖”可以被“修飾基團”共價官能化。有用的修飾基團包括但不限于水溶性和水不溶性的聚合物，治療部分，診斷部分，生物分子。將被修飾基團官能化的位置選擇為其不阻止“修飾的糖”被酶促地添加至肽或肽的糖基殘基。變體SAP多肽本公開部分地提供了變體血清淀粉樣蛋白P(SAP)多肽。特別地，本發明的SAP變體包括糖基化的人SAP多肽，其包含一個或多個N-連接的或0-連接的寡糖鏈，每個寡糖鏈獨立地具有1、2、3、4、5或更多個分支，所述分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。在一些實施方式中，N-連接的或0-連接的寡糖鏈的所有分支都終止于α2，3_連接的部分。本發明的其它SAP變體包括糖基化的人SAP多肽，其含有N-連接的或0-連接的寡糖鏈，相對于源自人血清的野生型SAP多肽，所述寡糖鏈具有低至少20 %，25 %，30 %，35 % 40 %， 45%, 50%, 55%,60%,65% 75%，80%，85%或甚至低至少95%的α 2，6_連接的唾液酸部分。在一些實施方式中，N-連接的或0-連接的寡糖鏈實質上不含α2，6_連接的唾液酸部分，例如相對于源自人血清的野生型的SAP多肽，具有低80 %，85 %，90 %，95 %，97 %，98 % 或甚至低99%的α 2，6_連接的唾液酸部分。本發明的糖變體SAP多肽可以包含具有一個或多個分支的N-連接的寡糖或0-連接的鏈(例如，具有雙觸角、三觸角、四觸角、五觸角等結構)。在一些實施方式中，本發明的SAP多肽包含N-連接的或0-連接的寡糖鏈，其中寡糖鏈的1、2、3、4、或5個分支實質上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺(例如，相對于源自人血清的野生型SAP多肽，具有低80 %，85 %，90 %，95 %，97 %，98 %或甚至低99 %的N-乙酰葡萄糖胺)。本發明的某些SAP多肽具有N-連接的或0-連接的寡糖鏈，所述寡糖鏈實質上不含半乳糖和和N-乙酰葡萄糖胺(例如，相對于源自人血清的野生型SAP多肽，具有低80 %， 85%,90%,95%,97%,98%或甚至低99%的半乳糖和/或N-乙酰葡萄糖胺)。在一些實施方式中，本發明的SAP多肽包含N-連接的或0-連接的寡糖鏈，其中寡糖鏈的1、2、3、4或5 個分支包含一個或多個甘露糖殘基。在一些實施方式中，本發明的SAP多肽包含N-連接的寡糖，所述寡糖具有以下五糖核心:Man[(a l,6)-(Man(a 1,3)]-Man(^ l,4)-GlcNAc(^ 1, 4)-GlcNAc(i3 1，N)-Asn。該五糖核心也可以包含一個或多個巖藻糖或木糖殘基。在一些實施方式中，本發明的SAP多肽包含N-連接的寡糖鏈，其中寡糖鏈的1、2、3、4或5個分支具有結構NeuNAc2 a 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6。本發明的SAP多肽還可以包含N-連接的寡糖鏈，其中所有分支具有結構NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6。本發明的變體SAP多肽可以包含一個或多個“修飾的”糖殘基。修飾的糖在允許附著修飾部分或基團的任意位置被取代。在優選方面，修飾的糖在仍然允許糖作為那些用于將修飾的糖偶聯至SAP肽的酶之底物的位置被取代。修飾基團可以通過酶促方式、化學方式及其組合方式附著至糖部分，從而產生修飾的糖，例如修飾的半乳糖、巖藻糖或唾液酸。 適合用于本發明的修飾基團以及用于將這些修飾基團綴合至糖殘基的方法如下文所描述。在優選方面，本發明的變體SAP多肽在體外抑制單核細胞分化為纖維細胞的IC5tl 小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。在一些實施方式中，本發明的變體SAP 多肽在體外抑制單核細胞分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的 1/3、1/4、1/10 或 1/100。本發明的變體SAP多肽可以與SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少60%、至少70%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少 100% 同一，如使用基于 Brutlag 等人的算法(Comp. App. Biosci.，6 :237-245(1990))的FASTDB計算機程序所測定。在優選實施方式中，用于計算氨基酸比對的同一性和相似性的百分率的參數包括Matrix = PAM 150，k_元組=2，錯配罰分=1，連接罰分=20，隨機組長度=0，截止分數=1，空隙罰分=5，空隙大小罰分=0. 05。術語“SAP多肽”包括功能片段和包含上述任意項的融合蛋白。一般地，SAP多肽將被設計為在含水溶液中在生物相關的溫度、PH水平和滲透性時是可溶的。非共價地結合在一起以形成五聚體SAP復合物的SAP原體可以具有相同的氨基酸序列和/或翻譯后修飾，或，備選地，單一復合物內的各個SAP原體可以具有不同的序列和/或修飾。術語SAP 多肽包括任何天然產生的SAP多肽及其任何變體(包括突變體、片段和融合物)。本發明的 SAP多肽可以是重組多肽。在優選實施方式中，本發明的SAP多肽是人SAP多肽。在一些實施方式中，提供了藥物組合物，其包含本發明的變體SAP多肽，或其功能片段。在一些方面，SAP變體的氨基酸序列可以是這樣的相對于SEQ ID NO :1具有一個或多個保守性或非保守性置換。如本文使用的“保守性置換”是物理上或功能上類似于對應的參考殘基的殘基，即，保守性置換與其參考殘基具有相似的大小、形狀、電荷和/或化學性質(例如，形成共價鍵或氫鍵的能力)。優選的保守性置換是滿足在Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure5 :345-352(1978 & Supp.)中就接受的點突變定義的標準的那些置換。保守性置換的實例為下列組內的置換(a)纈氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f) 絲氨酸、蘇氨酸；(g)賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。關于哪些氨基酸變化可能是表型上沉默的另外的指導可以見Bowie等人，Science247 :1306-1310(1990)。變體SAP多肽及其保留生物學功能的片段用于本文描述的藥物組合物和方法中。 在一些實施方式中，變體SAP多肽或其片段結合Fc γ RI、Fc γ RIIA和/或Fc γ RIIIB0在一些實施方式中，變體SAP多肽或其片段抑制纖維細胞、纖維細胞前體、肌成纖維細胞前體和/或造血單核細胞前體中的一項或多項的分化。SAP變體可以通過修飾SAP多肽的結構來產生，以實現例如增強治療功效或穩定性的目的(例如，離體保質期和在體內的針對蛋白水解降解的抗性)。在一些方面，本公開的變體SAP多肽除了天然存在于SAP多肽中的任何修飾之外還可以包含翻譯后修飾。此類修飾包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化(例如0-連接的寡糖、N-連接的寡糖等)、磷酸化和脂化。結果是，修飾的SAP多肽可以包含非氨基酸元件，例如聚乙二醇、脂、多糖或單糖和磷酸酯。在一些方面，本文描述的SAP多肽的一種或多種修飾可以增強SAP多肽的穩定性。 例如，此類修飾可以增強SAP多肽的體內半衰期或減少SAP多肽的蛋白水解降解。在一些方面，本發明的變體SAP多肽包括融合蛋白，其具有人SAP多肽的至少一部分和一個或多個融合結構域或異源部分。此類融合結構域的熟知的實例包括但不限于聚組氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G和免疫球蛋白重鏈恒定區(Fe)、麥芽糖結合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以將融合結構域選擇為用于賦予所需的性質。例如，一些融合結構域對于通過親和層析分離融合蛋白是特別有用的。為了親和純化的目的，使用親和層析的相關基質，例如谷胱甘肽_、淀粉酶-和鎳-或鈷-綴合的樹脂。作為另一個實例，可以將融合結構域選擇為用于促進SAP多肽的檢測。此類檢測結構域的實例包括多種熒光蛋白(例如GFP)以及“表位標簽)，它們通常是短的肽序列，針對它們的特異性抗體是可獲得的。熟知的表位標簽(針對它們的特異性單克隆抗體可容易地獲得)包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc標簽。在一些情況下，融合結構域具有這樣的蛋白酶切割位點其允許相關的蛋白酶部分地消化融合蛋白，從而從其中釋放重組蛋白。然后可以通過隨后的色譜分離從融合結構域分離釋放的蛋白。在一些情況下，SAP 多肽可以與異源結構域融合，所述異源結構域在體內使SAP多肽穩定化。“穩定化”意思是增加血清半衰期的任意事項，而不論其是通過減少破壞、減少腎對其的清除，還是其它藥代動力學效應。已知與免疫球蛋白的Fc部分和血清白蛋白形成的融合物會賦予增強的穩定性。理解到融合蛋白的不同元件可以按照與所需的功能一致的任何方式排列。例如， SAP多肽可以置于異源結構域的C-末端，或，備選地，異源結構域可以置于SAP多肽的C-末端。SAP多肽和異源結構域無需在融合蛋白中彼此鄰近，可以在任一結構域的C-或N-末端或結構域之間包括另外的結構域或氨基酸序列(例如接頭序列)。產生改變的N-糖基化分子的方法本文描述了產生變體人SAP多肽的方法。該方法一般包括下列步驟將SAP多肽與一種或多種化學或酶學試劑接觸以產生或修飾SAP多肽上的糖基化結構。該方法可以是基于細胞的或非基于細胞的。用于產生或修飾聚糖結構的酶是本領域熟知的。用于本公開的方法中的多數酶/ 蛋白可以歸類為下列兩個功能類別之一糖基轉移酶和糖苷酶。如本文使用的糖基轉移酶 (例如N-乙酰葡萄糖胺轉移酶、半乳糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、葡萄糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶等)是指具有將供體糖轉移至受體部分的任何酶/蛋白。如本文使用的糖苷酶(例如葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、唾液酸酶、巖藻糖苷酶等)是指具有催化糖部分之間的糖苷鍵水解的能力的任何酶/蛋白。用于產生改變的糖形式的SAP多肽的基于細胞的方法使用野生型(例如CHO細胞)或相對于人類細胞具有至少一種修飾的糖基化活性的經遺傳工程化的細胞。適合于本公開的方法的細胞包括例如真菌細胞、原核細胞(即，細菌、古生菌)、植物細胞或動物細胞(例如，線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物或哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠、 沙鼠、狗、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴子或人)。細胞可以是原代細胞、永生化細胞或轉化的細胞。此類細胞可以獲自多種商業來源和研究來源機構，例如，美國典型培養物保藏中心 (Rockville, Md.)。在一些方面，用于產生變體SAP多肽的細胞是CHO細胞。術語“糖基化活性”是指下列任何活性⑴能夠向靶分子添加N-連接的或0-連接的聚糖(即寡糖基轉移酶活性)；(ii)從靶分子除掉N-連接的或0-連接的聚糖；(iii) 修飾靶分子上的一個或多個N-連接的或0-連接的聚糖；(iv)修飾多萜醇連接的寡糖；(ν) 能夠輔助一種或多種i-iv的活性的活性。相應地，糖基化活性包括例如，糖苷酶活性，糖基轉移酶活性，糖核苷酸合成，修飾或轉移活性。靶分子上的一個或多個N-連接或0-連接的聚糖的修飾包括甘露糖基磷酰基轉移酶活性，激酶活性，或磷酸酶活性，例如改變靶分子上的聚糖的磷酸化狀態的甘露糖基磷酰基轉移酶活性，激酶活性，或磷酸酶活性。本公開的方法中有用的工程化細胞可以具有一種或多種遺傳修飾，包括但不限于(i)刪除編碼具有糖基化活性的蛋白的內源基因；(ii)導入編碼具有糖基化活性的蛋白(例如內源或外源蛋白)的突變形式的重組核酸；(iii)導入或表達干擾具有糖基化活性的蛋白的功能性表達的RNA分子；(iv)導入編碼具有糖基化活性的野生型蛋白(例如內源性或外源性)的重組核酸；或(ν)改變編碼具有糖基化活性的蛋白的一個或多個內源基因的啟動子或增強子元件，從而改變所編碼的蛋白的表達。以上描述的RNA分子包括，例如，小干擾RNA(siRNA)、短發夾RNA(shRNA)、反義RNA或微RNA(miRNA)。要理解，項目(ii) 包括例如，將內源基因替換為(例如通過同源重組)編碼相對于所替換的內源基因具有更高的糖基化活性的蛋白的基因。本文描述的遺傳工程化的細胞具有一種或多種改變的糖基化活性，例如(i)遺傳修飾的細胞中的一種或多種糖基化活性的增加；(ii)遺傳修飾的細胞中的一種或多種糖基化活性的降低；(iii)遺傳修飾的細胞中的一種或多種糖基化活性的定位或細胞內分布的改變；或(iv)遺傳修飾的細胞中的一種或多種糖基化活性相對于相同來源的未經修飾的細胞的比例的變化。要理解糖基化活性的量的增加可以是由于具有糖基化活性的一種或多種蛋白的過表達，內源基因的拷貝數的增加(例如基因復制)，或內源基因的啟動子、 增強子或阻抑子的改變，其刺激該基因編碼的蛋白的表達的增強。一種或多種糖基化活性的降低可以是由于具有糖基化改變活性的一種或多種蛋白的突變體形式(例如顯性陰性形式)的過表達，降低具有糖基化活性的一種或多種蛋白的表達的一種或多種干擾RNA分子的導入或表達，或，編碼具有糖基化活性的蛋白的一種或多種內源基因的刪除。本公開的方法使用的遺傳工程化的細胞能夠表達(例如過表達)編碼具有糖基化活性的蛋白的野生型或突變基因。此類基因包括但不限于ALG7、ALG13、ALG14、ALG1、ALG2、 ALGl 1、RFT1、ALG3、ALG9、ALGl2、ALG6、ALG8、ANLl、ALGlO、ALG5、0ST3、0ST4、0ST6、STT3、 OST1、0ST5、WBP1、SffPU 0ST2、DPMI、SEC59、0CH1、MNN9、VAN1、MNN8、MNNlO、MNNl 1、HOCl、 MNN2、MNN5、MNN6、KTRl、YURI、MNN4、KRE2、KTR2、KTR3、MNNl、MNSl、MNN4、PNOl、MNN9,葡萄糖苷酶I，葡萄糖苷酶II，或內甘露糖苷酶。編碼具有糖基化活性的蛋白的基因可以來自任何物種(例如，低等真核生物(例如真菌(包括酵母)或錐蟲)，原核生物(即細菌或古生菌)，植物，或動物(例如昆蟲、鳥、爬行動物或哺乳動物，例如小鼠或大鼠、狗、貓、馬、山羊、 牛、豬、非人靈長類或人)。要理解用于本公開的方法中的遺傳工程化的細胞可以表達任意數目的基因(例如編碼具有糖基化活性的蛋白的基因)和/或一種或多種(例如2、3、4、 5、6、7、8、9 10、11、12、15或20或更多種)本文提及的任何基因的任何組合。此外，本公開的方法中使用的任何遺傳工程化的細胞可以包含改變或消除一種或多種糖基化活性的任何數目的突變。在一些實施方式中，術語“基因表達”或“表達”是指這樣的細胞過程生物學活性多肽從DNA序列中產生出來并在細胞中顯示出生物學活性。因此，基因表達包括轉錄和翻譯過程，但也包括能夠影響基因或基因產物的生物學活性的轉錄后和翻譯后過程。這些過程包括但不限于RNA合成、加工和轉運，以及多肽合成、轉運和多肽的翻譯后修飾。例如，本公開提供了通過在細胞中表達SAP基因而制備本發明的SAP多肽的方法。 在一些實施方式中，細胞可以包含內源SAP基因或其片段。在其它實施方式中，可以向細胞中導入(例如轉化或轉染)編碼外源SAP多肽或其片段的多核苷酸。可以導入細胞中的合適的SAP多核苷酸包括核酸片段以及核酸構建體或表達載體。在優選實施方式中，內源或外源基因編碼人SAP多肽。在一些實施方式中，用于轉化宿主細胞的核酸片段、例如編碼人SAP多肽的核酸片段可以包括Siine-Dalgarno位點(例如核糖體結合位點)和起始位點(例如，密碼子 ATG)以起始轉錄的信息的翻譯以產生酶。其還可以包括終止序列以使翻譯停止。終止序列通常是這樣的密碼子沒有對應于它的氨基乙酰基-tRNA，從而多肽合成終止。在一些實施方式中，編碼SAP多肽的核酸構建體可以遞送例如表達質粒，當該表達質粒在細胞中被轉錄時，會產生SAP多肽。在一些實施方式中，合適的表達載體包含編碼可操作地連接于至少一個調節序列的編碼本發明的SAP多肽的核苷酸序列。調節序列是本領域所知的，并且被選擇為指導本公開的任意多肽的表達。相應地，術語“調節序列”包括啟動子、增強子和其它表達控制元件。示例性的調節序列描述于 Goeddel ;Gene Expression Technology =Methodsin Enzymology, Academic Press, San Diego，CA(1990)。例如，這些載體中可以使用這樣的任意表達控制序列以表達本公開的任何多肽當可操作地連接于DNA序列時，其調節DNA序列的表達。此類有用的表達控制序列包括，例如，SV40早期和晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒立即早期啟動子、Iac系統、trp系統、TAC或TRC系統、T7啟動子(其表達由 T7 RNA聚合酶指導)、噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區，fd被膜蛋白的控制區，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，酸性磷酸酶例如Wio5的啟動子，酵母α交配因子的啟動子，桿狀病毒系統的多角體啟動子，和已知的控制原核或真核細胞或其病毒的基因表達的其它序列，以及上述項的各種組合。應該理解表達載體的設計可以取決于下列因素， 例如所選的待轉化的宿主細胞，和/或希望表達的蛋白的類型。此外，還應該考慮，載體的拷貝數，控制該拷貝數的能力，以及載體編碼的任何其它蛋白例如抗生素標志物的表達。在一些實施方式中，用于轉化宿主細胞的核酸片段或表達系統可選地可以包括一個或多個標志物序列。一般而言，合適的標志物序列通常編碼基因產物，通常是使生長培養基中的化合物滅活或檢測該化合物或被該化合物檢測的酶。例如，加入標志物序列可以賦予經轉化的細胞對于抗生素的抗性，或者其可以賦予經轉化的細胞化合物特異性代謝。賦予抗性的合適的標志物序列的實例包括卡那霉素、氨比西林、氯霉素和四環素。備選地，除了選擇壓力之外，可以使用允許檢測含有基因例如半乳糖苷酶的特定集落的標志物基因，其中使用提供有色產物的底物。有多種方法適合于以核酸片段或表達載體轉化本發明的細胞。常見的轉化方法包括電穿孔、脂質體介導的轉化、鈣介導的轉化和病毒介導的轉化。在一些方面，當以本發明的核酸片段或表達系統轉化宿主細胞時，所述系統中的基因(例如人SAP)可以通過所謂的同源重組整合進入宿主細胞的染色體DNA，宿主將穩定攜帶該表達系統。為了使載體中的表達系統整合進入宿主細胞的染色體DNA，可以使用合適的選擇標志物基因，其中所述標志物基因具有同源于特定宿主細胞的染色體DNA上的基因的序列。本領域技術人員可以容易地選擇用于此目的的選擇標志物。舉例而言，優選的標志物是存在于染色體上并且與宿主細胞的代謝相關的基因。即，優選使用這樣的宿主其經過了修飾，從而使得染色體上的上述基因將被適當的方式例如突變滅活。然后，宿主可以經歷與含有相應的完整基因的表達載體的同源重組，只有含有正常代謝基因的轉化子能夠生長以被選擇。因此，如果此類標志物基因已經被導入至表達載體中，在所述表達載體中的標志物基因與染色體DNA的對應部分之間將發生同源重組，其中異源基因的表達盒將同時被整合進入染色體DNA。在一些實施方式中，術語在細胞中“表達”蛋白還包括將蛋白本身導入細胞的方法。因此，在一些方面，本公開提供了通過將SAP多肽導入細胞而制備本發明的SAP多肽的方法。將多肽直接導入細胞的技術是本領域已知的，一般包括細胞膜通透化過程。此類技術包括但不限于微注射SAP多肽；將SAP多肽包裹在膜囊泡內(例如，脂質體、莢膜體、紅細胞影、原生質體等)并將其與細胞膜接觸，從而通過融合實現SAP多肽的細胞內導入；使用物理學方法(例如機械的、化學的、電學的等)，其依賴于大分子經由細胞質膜上短暫導入的孔通過擴散進入細胞(例如刮擦-載入、珠子-載入等)；通過自然胞吞(由于細胞吞噬作用)而攝取。細胞內導入方法可以利用受體介導的途徑，其中細胞表面上表達的多個受體之一作為靶標，SAP多肽附著至(共價或非共價地)作為載體部分的同源配體。已經描述了使用靜電吸附將蛋白導入活細胞的方法，其中首先將蛋白陽離子化，然后與細胞的帶負電的表面接觸(見日本專利公開號2004/049214)。在一些方面，本公開提供了表達SAP多肽的CHO細胞。在一些實施方式中，CHO細胞表達外源SAP多肽。在優選實施方式中，CHO細胞表達人SAP多肽。在一些實施方式中， 本公開提供了包含編碼SAP多肽的多核苷酸序列的CHO細胞。在優選實施方式中，多核苷酸序列編碼人SAP多肽。前述任意技術都可用于在CHO細胞或本文公開的任何其它合適的細胞中“表達”本發明的SAP多肽。當野生型或遺傳工程化的細胞的任意糖基化活性在存在誘導刺激(例如化學或物理刺激)時可誘導或條件化時，任選可以在導入編碼SAP多肽的核酸之前、之時或之后、 在存在誘導劑的情況下培養野生型或遺傳工程化的細胞。例如，將SAP多肽導入細胞之后， 可以暴露于能夠促進具有野生型或改變的N-糖基化活性的一種或多種蛋白表達的化學誘導劑。當多個誘導刺激誘導具有野生型和/或改變的N-糖基化活性的一種或多種蛋白之條件化表達時，可以將細胞與多個誘導劑接觸。在一些實施方式中，可以修改培養基以產生 SAP多肽上的需要的聚糖結構。例如，可以修改培養基的血清、葡萄糖和/或脂質(例如多萜醇)濃度以最佳地產生所需的SAP糖變體。在一些實施方式中，可以改變培養基的溫度、 PH和/或滲透壓以最佳地產生所需的SAP糖變體。 在從細胞或細胞培養基中分離之前或之后，可以在體內或在體外進一步處理本發明的變體SAP多肽。進一步處理可以包括修飾SAP多肽的一個或多個聚糖殘基，或除了聚糖結構之外對SAP多肽的修飾。在一些實施方式中，SAP多肽的另外的處理可以包括添加 (共價或非共價連接)一個或多個異源部分。在一些實施方式中，進一步處理包括酶促或化學處理SAP多肽。酶促處理可以包括將SAP多肽與一種或多種糖苷酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、糖基轉移酶或蛋白酶接觸足以誘導SAP多肽上的聚糖殘基(例如半乳糖、甘露糖、巖藻糖、唾液酸、木糖、N-乙酰葡萄糖胺等)的修飾、添加或刪除的時間段。可以通過使用本領域熟知的技術依次修飾、添加或刪除所需的糖部分以完成N-連接的寡糖鏈的定制。可以通過使用多種內切和外切糖苷酶實現肽變體上的碳水化合物部分的酶促切割，如Thotakura 等人，1987，Meth. Enzymol. 138 :350所描述。添加糖部分的示例性方法公開于美國專利號 5，876，980,6, 030，815,5, 728，554 和 5，922，577。 在一些實施方式中，SAP聚糖結構的修飾需要一種或多種糖核苷酸的存在。用于本發明中的示例性的糖核苷酸包括核苷酸單、二或三磷酸酯或其類似物。在優選實施方式中，修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更優選地，糖核苷酸選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸、CMP-N-羥乙酰基神經氨酸或CMP-NeuAc。在一些實施方式中，修飾的糖核苷酸用于將修飾的糖殘基添加至SAP多肽。糖核苷酸的N-乙酰胺衍生物也用于本發明的方法。化學添加或除掉糖基部分可以通過任意合適的方法進行。例如，化學去糖基化可以包括將SAP多肽暴露于三氟甲磺酸或其它強酸。該處理導致多數或全部糖的切割，除了連接糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)；同時保留肽的完整性。化學去糖基化的方法描述于 Haldmuddin 等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 :52 和 Edge 等人，1981， Anal. Biochem. 118 :131。化學處理可以包括，例如將改變的SAP多肽與酸例如氫氟酸接觸足以誘導SAP多肽被修飾的時間段。在一定的條件下，氫氟酸處理特異性地除掉通過磷酸二酯連接至聚糖的甘露糖殘基，同時保留聚糖上的磷酸酯。可以通過從一個或多個N-聚糖添加或除掉磷酸酯基團而進一步處理改變的SAP多肽。例如，可以將改變的SAP多肽與甘露糖基激酶或甘露糖基磷酸酶接觸。在一些方面，理想的是，僅修飾SAP多肽聚糖結構(N-連接的或0-連接的寡糖)上的末端的糖部分。在一些實施方式中，通過添加、刪除、置換或修飾至少一個末端的唾液酸殘基來修飾SAP聚糖結構的一個或多個分支。修飾如本文描述的聚糖的合適的方法可用于僅改變SAP聚糖結構上的末端的糖部分。在一些實施方式中，具有α2，6-鍵、α2，8-鍵或 α 2，9-鍵的末端的唾液酸殘基被替換為一個或多個末端的α 2，3-連接的唾液酸殘基。在具體的方面，根據本公開的方法之一修飾包含末端的α 2，6-連接的唾液酸殘基的人SAP， 以便將一個或多個末端的α 2，6_連接的唾液酸殘基替換為一個或多個α 2，3_連接的唾液酸殘基。在一些實施方式中，修飾末端的α 2，3_連接的唾液酸殘基以添加一個或多個α 2， 6-連接的、α 2，8-連接的和/或α 2，9-連接的唾液酸殘基。在一些方面，制備本發明的SAP多肽的方法包括使SAP多肽去糖基化的第一步驟。 SAP多肽可以被部分或完全去糖基化。在一些實施方式中，去糖基化的第一步驟包括從SAP 多肽上的聚糖結構的至少一個分支僅除掉末端的糖部分。在一些實施方式中，去糖基化的第一步驟除掉至少一個α 2，6-連接的唾液酸殘基。在一些實施方式中，去糖基化的第一步驟除掉至少一個0-連接的聚糖。在一些實施方式中，去糖基化的第一步驟除掉至少一個 N-連接的聚糖。在一些實施方式中，去糖基化的第一步驟除掉所有的0-連接的和N-連接的聚糖。在一些實施方式中，根據本公開的方法進一步處理去糖基化的SAP多肽(部分或完全)，其包括但不限于酶促或化學地修飾經部分或全部去糖基化的SAP多肽，將經部分或全部去糖基化的SAP多肽導入細胞，或其組合，其中所述方法產生本發明的變體SAP多肽。在一些實施方式中，在將經部分或全部去糖基化的SAP多肽導入細胞之后，可以根據本公開的方法在體外或在體內進一步修飾它，以產生本發明的變體SAP多肽。類似地，可以將使用本文描述的酶促或化學方法在體外修飾的經部分或完全去糖基化的SAP多肽導入細胞中，以產生本發明的變體SAP多肽。要理解，本發明的SAP多肽可以在細胞內加工，但無需一定這樣。例如，本公開還提供了無細胞的生產本發明的變體SAP多肽的方法。在一些方面，所述無細胞的方法包括下列步驟在糖基化條件下，將SAP多肽與從野生型細胞(例如真菌細胞、植物細胞或動物細胞)或經遺傳工程化的具有至少一種修飾的糖基化活性的細胞制備的細胞裂解物接觸，其中SAP多肽與該細胞裂解物的接觸使得N-連接或0-連接的寡糖附著至SAP多肽，或修飾SAP多肽上已有的N-連接或0-連接的寡糖。“N-糖基化條件”意指在允許所需的改變的N-糖基化的條件下溫育混合物(例如，SAP多肽與細胞裂解物的混合物)。用于獲得在裂解物中保留一種或多種糖基化活性或其完整性的細胞裂解物的合適的方法可以包括使用適當的緩沖液和/或抑制劑，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑， 它們防止細胞裂解物中N-糖基化活性變化或使該變化最小化。此類抑制劑包括，例如，螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇雙(P-氨基乙醚)N，N, Ni，Nl-四乙酸(EGTA)；蛋白酶抑制劑，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)，抑肽酶(aprotinin)，亮抑酶肽(Ieup印tin)，抗蛋白酶(antipain)；和磷酸酶抑制劑，例如磷酸鹽，氟化鈉和釩酸鹽。可以選擇那些不干擾感興趣的N-糖基化活性或對于該活性僅有極小的不利影響的抑制劑。用于獲得含有酶活性的裂解物的合適的緩沖液和條件描述于，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47), Johnffiley & Sons, New York(1999) ；Harlow and Lane, Antibodies :ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)； Harlow and Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press(1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry,3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W. B. Saunders, Philadelphia, (1999)。視需要，可以進一步處理細胞裂解物以消除干擾性物質的存在或使其最小化。 如果需要，可以通過本領域技術人員熟知的多種方法中的任何方法使細胞裂解物分為級份，包括亞細胞分級和色譜技術，例如離子交換色譜、疏水和反相色譜，尺寸排阻色譜， 親和色譜和疏水電荷誘導色譜(見，例如Scopes，Protein Purification principles andPractice, third edition, Springer-Verlag, New York (1993) ；Burtonand Harding, J. Chromatogr. A 814 :71-81 (1998))，或任何其它合適的純化技術。可以制備這樣的細胞裂解物，其中全部細胞器保持完整和/或保持功能性。例如， 裂解物可以包含下列一項或多項完整的糙面內質網，完整的光面內質網，或完整的高爾基體。用于獲得包含完整細胞器并測試細胞器功能的方法描述于，例如，Moreau等人(1991) J. Biol. Chem. 266(7) :4329-4333 ;Moreau 等人(1991) J. Biol. Chem. 266 (7) :4322-4328 ； Rexach 等人(1991) J. Cell Biol. 114(2) :219-2 ；和 Paulik 等人(1999)Arch. Biochem. Biophys. 367(2) :265-273 ；各自通過引用方式全文并入本文。SAP多肽可以僅與一種具有糖基化活性的純化蛋白接觸。在一些實施方式中，SAP 多肽可以與多種具有糖基化活性的純化蛋白接觸。可以使用標準蛋白分離技術純化一種或多種具有糖基化活性的一種或多種蛋白。SAP多肽可以與合適的緩沖液中的一種或多種蛋白接觸足以誘導如上所述的SAP多肽修飾的時間段。SAP多肽可以同時或依次與多種蛋白接觸。當SAP多肽依次與多種具有糖基化活性的蛋白接觸時，可以在一個或多個步驟之后對SAP多肽進行純化，但無需一定如此。S卩，SAP多肽可以與蛋白活性“A”接觸，然后進行純化，然后將該分子與蛋白活性“B”接觸。修飾肽的此類方法是本領域已知的，例如Lee and Park (2002)30(6) :716-720 and Fujita and Takegawa(2001)Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(3) :678_682，其公開內容通過引用方式全文并入本文。在一些方面，本公開的方法包括分離SAP多肽的步驟，例如，從細胞或從細胞裂解物的成分中分離。用于蛋白分離的很多標準技術是本領域已知的。例如，分離多肽的方法包括但不限于尺寸排阻色譜，反相色譜，液體色譜(例如HPLC)，親和色譜(例如金屬螯合或免疫親和色譜)，離子交換色譜，疏水相互作用色譜，沉淀，差別溶解，免疫沉淀，離心(例如超離心，蔗糖梯度離心等)，或其任何組合。在一些實施方式中，SAP多肽可以綴合于親和標簽以促進多肽的純化。用于純化SAP的適當的親和標簽包括但不限于幾丁質結合蛋白 (CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、鏈霉親和素、生物素和多聚組氨酸。親和標簽可以作為重組蛋白的一部分而產生(即，作為包含異源親和標簽結構域和SAP 多肽結構域的融合蛋白)或在體內或體外附著(共價或非共價)至SAP多肽。在一些實施方式中，可以使用多個純化步驟分離SAP多肽。例如，可以使用親和純化方法從細胞裂解物或多成分混合物中親和-純化包含純化標簽的SAP多肽。然后可以通過另外的純化步驟、 例如尺寸排阻色譜或RP-HPLC進一步純化該親和-純化的SAP多肽以除掉任何微小的不希望的污染物。當本發明的多肽在細胞中產生時，可以從細胞本身分離SAP多肽或從培養細胞的培養基中分離它。在一些實施方式中，本發明的SAP多肽從細胞中產生并且分泌進入培養基中。在一些實施方式中，分離可以包括從可溶性的包含SAP的級份中分離細胞級份 (例如通過離心)。在一些方面，在將靶分子與一種或多種N-糖基化活性接觸之前使SAP多肽連接于固相支持物可能是有利的。此類連接可以允許在N-糖基化修飾之后更容易進行純化。合適的固相支持物包括但不限于多孔檢測平板、顆粒(例如磁性或編碼的顆粒)、色譜柱或膜。在一些實施方式中，可以使用酶促或化學方式將本文描述的任意的改變的SAP多肽附著至異源部分。“異源部分”是指連接(共價或非共價地)于改變的靶分子的任何成分，所述成分不同于最初存在于SAP多肽中的成分。異源部分包括，例如，水溶性的和水不溶性的聚合物，靶向部分，治療部分，診斷部分和生物分子。本發明的SAP多肽可以包含一個或多個“修飾的”糖殘基。可以通過酶學方式、 化學方式或其組合將修飾基團附著至糖部分，從而產生修飾的糖，例如修飾的半乳糖、巖藻糖或唾液酸。當使用修飾的唾液酸時，這些方法中可以使用唾液酸轉移酶或轉唾液酸酶 (trans-sialidase)。可以在允許附著修飾部分、但仍然允許糖擔當用于將修飾的糖附著至肽的酶的底物的任何位置進行糖的取代。一般地，通過使用反應性基團將糖部分和修飾基團連接在一起，通常是通過連接新的有機官能團或非反應性物質而轉化。糖反應性官能團可以位于糖部分上的任意位置。 用于實施本發明的反應性基團和反應類別一般是生物綴合化學領域中熟知的。與反應性糖部分一起可用的目前受歡迎的反應類別是那些在相對溫和條件下進行的反應。這些包括但不限于親核取代(例如胺和醇與酰基鹵、活性酯的反應)，親電子取代(例如，烯胺反應)和碳-碳以及碳-雜原子多鍵的加成(例如邁克爾反應，狄耳士-阿德爾加成)。 這些和其它有用的反應描述于，例如，Smith and March, Advanced Organic Chemistry, 5th Ed. , Johnffiley & Sons, New York,2001 ；Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 ；禾口 Feeney 等人，Modification ofProteins ；Advances in Chemistry Series, Vol. 198,American ChemicalSociety, Washington, D.C.,1982。懸于糖核或修飾基團的有用的反應性官能團包括但不限于(a)羧基及其多種衍生物(例如，N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基苯并三唑酯、酸性鹵化物、酰基咪唑、硫酯、對硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香酯)；(b)羥基，其可以轉化為酯、醚、醛等；(C)鹵代烷基， 其中鹵素可以隨后被親核基團替換，所述親核基團是例如胺、羧酸陰離子、硫醇陰離子、負碳離子或醇鹽離子，從而引起新的基團在鹵素原子的官能團上附著；(d)親二烯基團，其能夠參與狄耳士-阿德爾反應，例如馬來酰亞胺基團；(e)醛或酮基團，從而使得可以通過羰基衍生物例如亞胺、腙、縮氨基脲或肟的形成或通過例如格里尼亞加成或烷基鋰加成而進行后續衍生；(f)磺酰基鹵化物基團，用于與胺進行后續反應，例如，形成硫胺類；(e)硫醇基，其能夠例如被轉化為二硫化物或與烷基和酰基鹵化物反應；(h)胺或巰基，其能夠例如被酰基化、烷基化或氧化；(i)鏈烯，其可以進行例如環式加成、酰基化、邁克爾加成、復分解反應，Heck反應等；(j)環氧化物，其能夠與例如胺和羥基化合物反應。可以將反應性官能團選擇為它們不參與或干擾那些組裝反應性糖核或修飾基團必需的反應。備選地，可以通過保護基的存在對反應性官能團進行保護使其不參與反應。本領域技術人員理解如何保護某特定的官能團從而使其不干擾所選的一組反應條件。關于有用的保護基的實例，見例如Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York,1991。在一些實施方式中，修飾的糖是活化的糖。用于本發明中的活化的修飾的糖通常是糖苷，其通過合成被改變以包含激活的離去基團。如本文使用的術語“激活的離去基團” 是指在酶調節的親核取代反應中容易地被置換的那些部分。很多激活的糖是本領域已知的° 見，例如 Vocadlo 等人，In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol. 2, Ernst 等人編，Wiley-VCH Verlag :ffeinheim, Germany, 2000 ；Kodama 等人，Tetrahedron Lett. 34 6419(1993) ；Lougheed，等人，J. Biol. Chem. 274 :37717 (1999)。此類離去基團的實例包括 氟、氯、溴、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、triflate等。用于本發明中的優選的激活的離去基團是那些對于糖苷向受體的酶促轉移沒有顯著空間位阻的那些。因此，激活的糖苷衍生物的優選實施方式包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，糖基氟化物是特別優選的。在糖基氟化物中，α -半乳糖基氟化物、α -甘露糖基氟化物、α -葡萄糖基氟化物、α -巖藻糖基氟化物、 α -木糖基氟化物、α -唾液酸基氟化物、α -N-乙酰葡萄糖胺氟化物、α -N-乙酰半乳糖胺氟化物、β-半乳糖基氟化物、β-甘露糖基氟化物、β-葡萄糖基氟化物、β-巖藻糖基氟化物、β -木糖氟化物、β -唾液酸基氟化物、β -N-乙酰葡萄糖胺氟化物和β -N-乙酰半乳糖胺氟化物是最優選的。在一些方面，修飾的糖殘基綴合于一種或多種水溶性聚合物。很多水溶性聚合物是本領域技術人員已知的，并且可用于實施本發明。術語“水溶性聚合物”包括例如下列物質糖(例如葡聚糖，淀粉，透明質酸，聚唾液酸、類肝素，肝素等)；聚氨基酸；核酸；合成的聚合物(例如，聚(丙烯酸)、聚(酯)，例如，聚乙二醇)；肽、蛋白等。可以使用任何水溶性聚合物實施本發明，唯一條件是該聚合物必須包括綴合物的其余部分能夠綴合的點。用于激活水溶性聚合物和糖以及用于將糖和聚合物綴合至多種物質的方法和化學知識見于文獻中的描述。用于激活聚合物的通常使用的方法包括使用溴化氰、高碘酸鹽、戊二醛、雙-環氧化物、表氯環氧丙烷、二乙烯基砜、碳二亞胺、磺酰基商化物、三氯三嗪等激活官能團(B R. F. Taylor, (1991), Protein Immobilization, Fundamentalsand Applications, Marcel Dekker, N. Y. ；S.S.Wong, (1992), Chemistryof Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton ;G. T. Hermanson 等人，(1993),Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press，N. Y. ；Dunn，R. L，等人， Eds.Polymeric Drugs andDrug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469， AmericanChemical Society, Washington, D.C. 1991) 0在一些方面，修飾的糖殘基綴合于一種或多種水不溶性聚合物。在一些實施方式中，綴合至水不溶性聚合物可用于以受控方式遞送治療肽。多聚物的藥物遞送系統是本領域已知的。見，例如 Dunn 等人，Eds. Polymeric drugs and Drug Delivery Systems, ACS SymposiumSeries Vol. 469, American Chemical Society，Washington，D. C. 1991。本令頁域技術人員將認識到，基本上任何已知的藥物遞送系統都適用于本發明的綴合物。代表性的水不溶性聚合物包括但不限于聚膦腈、聚(乙烯醇)、聚酰胺類、聚碳酸酯、聚亞烷基、聚丙烯酰胺、聚亞烷基二醇、聚亞烷基氧化物、聚亞烷基對苯二甲酸酯，聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯鹵化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、 聚甲基丙烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普郎尼克類和聚對羥基苯乙烯，及其共聚物。本文討論的這些和其它聚合物可以容易地從商業來源獲得，例如Sigma Chemical Co. (St.Louis, Mo.), Polysciences (ffarrenton, Pa.), Aldrich (Milwaukee, Wis.), Fluka (Ronkonkoma, N. Y.)和 BioRad (Richmond，Calif.)，或者使用標準技術從獲自這些供應商的單體合成。用于本發明的綴合物中的代表性的生物可降解聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物，聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共聚-己內酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、及其共混物和共聚物。特別有用的是形成凝膠的成分，例如，包括，膠原和普郎尼克類。在優選實施方式中，一個或多個修飾的糖殘基綴合于一個或多個PEG分子。在一些方面，修飾的糖綴合于生物分子。本發明的生物分子可以包括但不限于功能性蛋白、酶、抗原、抗體、肽、核酸(例如單一核苷酸或核苷，寡核苷酸，多核苷酸和單鏈和更高鏈的核酸)，血凝素，受體或其組合。一些優選的生物分子基本上是非熒光的，或發射極小量的熒光，以致它們不適合在測驗中用作熒光標志物。其它生物分子可以是熒光的。在一些實施方式中，生物分子是靶向部分。如本文使用的“靶向部分”和“靶向試劑”是指將選擇性定位于身體的特定組織或區域的物質。在一些實施方式中，生物分子被選擇為指導本發明的SAP多肽至特定的細胞內區室，從而增強肽至該細胞內區室的遞送 (相對于遞送至組織的非衍生肽的量)。定位是由分子決定簇的特定識別、靶向試劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水相互作用等調節的。將某試劑靶向特定組織或區域的其它機制是本領域技術人員已知的。在一些實施方式中，修飾的糖包括治療部分。本領域技術人員將認識到，治療部分與生物分子這兩個類別彼此有重疊，即，很多生物分子具有治療性質或潛力。有用的治療部分的類別包括，例如非甾族抗炎藥物；甾族抗炎藥物；佐劑；抗組胺藥；鎮咳藥；止癢藥；抗膽堿能藥；鎮吐藥和止惡心藥；減食欲藥；中樞興奮藥；抗心律失常藥物；β -腎上腺素能阻滯藥；強心藥；抗高血壓藥；利尿藥；血管擴張藥；血管收縮藥；抗潰瘍藥；麻醉藥；抗抑郁藥；強安定劑和鎮靜劑；抗精神病藥物；和抗微生物藥物。用于實施本發明的其它藥物部分包括抗腫瘤藥、殺細胞試劑、抗雌激素類和抗代謝物。該類別中還包括基于放射性同位素的試劑，其用于診斷(例如成像)和治療，以及綴
合的毒素。治療部分也可以是激素、肌肉松弛藥、鎮痙劑、骨激活劑、內分泌調節劑、糖尿病調節劑、雄激素、抗利尿藥或降鈣藥。其它有用的修飾部分包括免疫調節藥物、免疫抑制劑等。具有抗炎活性的基團， 例如舒林酸、依托度酸、酮洛芬和酮咯酸，也是有用的。用于本發明中的其它藥物將是本領域技術人員顯而易見的。通過本公開的方法產生的改變的N-糖基化SAP多肽可以是勻質的(S卩，SAP多肽的樣品在特定的N-聚糖結構上是單一的)或實質上勻質的。“實質上勻質”意思是至少大約25% (例如，至少大約27%，至少大約30%，至少大約35%，至少大約40%，至少大約45%，至少大約50%，至少大約55%，至少大約60%，至少大約65%，至少大約70%，至少大約75 %，至少大約80 %，至少大約85 %，至少大約90 %，或至少大約95 %，或至少大約 99% )的SAP多肽含有相同的特定的N-聚糖結構。在一些實施方式中，本發明的變體SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl與分離自人血清的野生型SAP的對應樣品相比，小于其1/2，小于其1/3，小于其 1/4，小于其1/10，或小于其1/100。有很多完善確立了的用于測定外周血單核細胞(PBMC) 或單核細胞對于SAP的響應性(就纖維細胞分化而言)的方法。這些方法可用于確定本發明的任意SAP變體多肽相對于源自人血清的SAP樣品、任何其它SAP變體多肽或其它纖維細胞抑制劑或激活劑的相對效力。適合用于這些方法中的PBMC或單核細胞可獲自多種組織培養系。備選地，適合于纖維細胞分化測定的細胞可以獲自包含PBMC或單核細胞的任何生物樣品。生物樣品可以獲自血清、血漿、健康組織或纖維變性組織。一般地，通過將培養基中的PBMC或單核細胞與多種濃度的SAP多肽一起溫育來進行纖維細胞分化測定，以確定纖維細胞分化程度。SAP的濃度可以介于0. 0001 μ g/mL至lmg/ml，在一些實施方式中是 0. 001 μ g/mL,1. 0 μ g/mL,5 μ g/mL,10 μ g/mL,15 μ g/mL,20 μ g/mL,25 μ g/mL,30 μ g/mL, 35 μ g/mL,40 μ g/mL,45 μ g/mL,50 μ g/mL,100 μ g/mL,200 μ g/mL,300 μ g/mL 或 500 μ g/ mL。在一些測驗中，培養基中可以補充l-100ng/ml hMCSF ;hMCSF的優選濃度是25ng/mL。 本領域技術人員可以確定PBMC和單核細胞已經分化為纖維細胞的指征。一般地，纖維細胞在形態上確定為粘附細胞，具有延長的紡錘形狀，并存在橢圓形細胞核。在一些測驗中，固定細胞并以Hema 3染色，然后通過直接計數法計數纖維細胞，例如使用倒置顯微鏡。本領域技術人員通過判讀纖維細胞分化的量而作為細胞對于SAP應答的指示。如本公開的實施例中所示，纖維細胞分化的較大的抑制表示較大程度的SAP應答。測定纖維細胞分化的備選方法包括測定纖維細胞特異性細胞表面標志物或分泌的因子的表達，例如細胞因子(例如IL-lra，ENA-78/CXCL-5，PAI-l)、纖連蛋白、膠原_1。檢測和/或定量細胞表面標志物或分泌的因子的方法是本領域熟知的，包括但不限于多種基于ELISA和FACS的技術使用針對一種或多種纖維細胞特異性標志物的免疫反應性抗體。如本公開的實施例中所描述， 測定巨噬細胞衍生的趨化因子(MDC)是測定纖維細胞分化的有效方法。用于檢測和/或表征SAP多肽的N-糖基化(例如，改變的N-糖基化)的方法包括DNA測序儀輔助的(DSA)、熒光團輔助的碳水化合物電泳(FACE)或表面增強的激光解吸附電離-飛行時間-質譜(SELDI-TOF MS)。例如，分析可以采用DSA-FACE，其中，例如，將糖蛋白變性，然后固定于例如膜上。然后使用合適的還原劑例如二硫蘇糖醇(DATA)或β-巰基乙醇將糖蛋白還原。可以使用酸例如碘代乙酸羧化蛋白的巰基。接下來，可以使用酶、例如 N-糖苷酶F使N-聚糖從蛋白上釋放。任選地，可以通過還原性胺化使N-聚糖重構和衍生。
然后可以濃縮衍生的N-聚糖。適合于分析N-聚糖的儀器包括，例如ABI PRISM 377 DNA 測序儀(Applied Biosystems)。可以使用例如軟件GENESCAN . 3. 1 (Applied Biosystems)進行數據分析。任選地，可以使用一種或多種酶進一步處理分離的甘露糖蛋白以確認它們的N-聚糖狀態。示例性的酶包括，例如，α-甘露糖苷酶或α-1，2甘露糖苷酶。分析N-聚糖的另外的方法包括，例如，質譜(例如，MALDI-T0F-MS)，正常相位上的高壓液體色譜(HPLC)，反相色譜和離子交換色譜(例如，當聚糖不被標記時，使用脈沖化電流計檢測；如果聚糖被適當標記，則使用紫外吸收或熒光)。另外參考Callewaert等人Q001) Glycobiology 11(4) :275-281 和 Freire 等人(2006)Bioconjug. Chem. 17(2) :559-564, 們各自的公開內容通過引用方式全文并入本文。治療方法在一些方面，本公開提供了通過向有此需要的患者施用治療有效量的本發明的變體SAP多肽而治療SAP響應性病癥的方法。治療的劑量和頻率可以由本領域技術人員確定，并且將根據患者的癥狀、年齡和體重以及待治療或預防的病癥的性質和嚴重性而變化。 在一些實施方式中，變體SAP多肽向患者施用為每天1或2次，每周1或2次，每月1或2 次，或僅在癥狀發作前或發作時施用。劑量可以通過本領域技術人員已知的技術或按照本文教導來容易地確定。SAP 的毒性和治療功效可以通過實驗動物中的標準藥學程序來確定，例如，測定LD5tl和ED5tlt5 ED5tl(有效劑量50)是在50%的動物群體中產生指定效應所需的藥物的量。LD5tl(致死劑量 50)是殺死50%的樣品群體的藥物劑量。在一些實施方式中，SAP響應性病癥是纖維化。SAP用作纖維化的治療性處理的用途描述于美國專利申請號2007/0M3163，通過引用方式并入本文。可以根據本發明的方法治療的纖維化相關的病癥包括但不限于膠原疾病、間質性肺病、人纖維變性肺病(例如， 閉塞性細支氣管、特發性肺纖維化、病因已知的肺纖維化、肺病中的腫瘤間質、影響肺的系統性硬化病、赫曼斯基-普德拉克綜合征、煤工塵肺、石棉肺、矽肺、慢性肺高壓、AIDS-相關的肺高壓、肉瘤樣病、中度至重度哮喘等)、纖維變性性血管疾病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、 靜脈曲張、冠狀梗死、大腦梗塞、心肌纖維化、肌骨骼纖維化、手術后黏著、人腎病(例如，腎病綜合征、奧爾波特綜合征、HIV-相關的腎病、多囊腎病、法布里病、糖尿病腎病、慢性腎小球腎炎、與全身性紅斑狼瘡相關的腎炎等)、進行性系統性硬化(PSS)、原發性硬化性膽管炎(PSC)、肝纖維化、肝硬變、腎纖維化、肺纖維化、囊性纖維化、慢性移植物抗宿主病、硬皮病(局部和全身)、格雷夫斯眼病、糖尿病視網膜病變、青光眼、Peyronie病、陰莖纖維化、膀胱鏡后尿道狹窄、手術后內粘連、結瘢、骨髓纖維化、特發性腹膜后纖維化、已知病因的腹膜纖維變性、藥物誘導的麥角中毒、伴隨良性或惡性癌癥的纖維化、伴隨微生物(例如，病毒、 細菌、寄生蟲、真菌等)感染的纖維化、阿爾茨海默病、伴隨炎性腸病的纖維化(包括克羅恩病和微觀結腸炎中的狹窄形成)、間質細胞腫瘤、粘膜炎、化學或環境刺激誘導的纖維化 (例如，癌癥化療、殺蟲劑或放射(例如，癌癥的放療))。在一些實施方式中，纖維化相關的病癥選自全身或局部硬皮病、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、動脈粥樣硬化、再狹窄、肺炎癥和纖維化、特發性肺纖維化、肝硬化、由于慢性乙肝或丙肝感染造成的纖維化，腎疾病、由于瘢痕組織造成的心臟疾病、黃斑變性以及視網膜和玻璃體視網膜病變。在一些實施方式中，纖維化相關病癥是由于下列造成的化療藥物、放射誘導的纖維化和損傷及燒傷。在一些實施方式中，纖維化相關的病癥或病況是由于手術后結痂，例如小梁切除術或眼睛的其它過濾外科手術之后造成的。在一些實施方式中，SAP響應性病癥是超敏反應病癥，例如由Thl或Th2應答介導的那些。SAP用作超敏反應病癥的治療性處理的用途也描述于美國臨時申請號 61/209，795，通過引用方式并入本文。可以通過SAP治療的超敏反應相關病癥包括但不限于變態反應性鼻炎、變應性鼻竇炎、變應性結膜炎、變應性支氣管收縮、變應性呼吸困難、 肺中粘液產量的變應性增力Π、特應性濕疹、皮炎、蕁麻疹、過敏反應、肺炎和變應性哮喘。在一些實施方式中，本發明的變體SAP多肽可用于治療變應原特異性免疫應答， 例如針對多種抗原的過敏反應，包括但不限于抗微生物試劑(例如，頭孢菌素類，磺胺類、 青霉素和其它β-內酰胺類)，抗驚厥藥(例如，苯妥英、苯巴比妥、卡馬西平、氨苯砜、別嘌呤醇和米諾環素)，化療劑(例如，紫杉烷類、鉬化合物、天冬酰胺酶和表鬼白毒素)，肝素、 胰島素、魚精蛋白、阿斯匹林和其它非留族抗炎藥物，肌肉松弛劑(例如，琥珀酰膽堿、阿曲庫銨、維庫溴銨和泮庫溴銨)，誘導劑(例如，巴比土酸鹽、依托咪酯、二異丙酚)，麻醉品 (例如，芬太尼、哌替啶、嗎啡)，用于靜脈內體積擴張的膠體，放射對比物質，血液制品，膠乳，動物制品，動物屑，塵螨，昆蟲(例如，叮咬、螫傷或毒液)，化妝品，金屬(例如，鎳、鈷和鉻酸鹽)，植物，孢子，花粉，食物(例如，牛奶、雞蛋、小麥、大豆、花生和堅果、海鮮)，疫苗接種和真菌抗原(例如，曲霉菌屬、彎孢霉屬、明臍菌屬和鏈格孢屬)。在一些實施方式中，SAP響應性病癥是自身免疫病癥，例如由Thl或Th2應答介導的那些。SAP用作自身免疫病癥的治療性處理的用途也描述于美國臨時申請號 61/209，845，通過引用方式并入本文。可以通過SAP治療的自身免疫相關病癥包括但不限于1型糖尿病、多發性硬化、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、自身免疫心肌炎、天皰瘡、 重癥肌無力、喬本氏甲狀腺炎、格雷夫斯病、阿狄森病、自身免疫性肝炎、慢性萊姆關節炎、 家族性擴張型心肌病、青少年型皮肌炎、多軟骨炎、干燥綜合征、牛皮癬、青少年特發性關節炎、炎性腸病、系統性紅斑狼瘡、慢性阻塞性肺病和移植物抗宿主病。在一些實施方式中，SAP響應性病癥是粘膜炎。SAP用作粘膜炎的治療性處理的用途也描述于美國申請號12/217，614，通過引用方式并入本文。本發明的方法可用于治療口的、食道的和胃腸的粘膜炎，以及胃和十二指腸潰蕩，或胃和食道的侵蝕。在一些實施方式中，本發明的變體SAP多肽可用于治療炎性疾病或病況。在一些實施方式中，炎性疾病可以是病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染。SAP用作病毒感染的治療性處理的用途也描述于美國專利6，406，698和國際專利申請號W01997/(^6906，二者通過引用方式并入本文。藥學制備物和制劑在一些實施方式中，本文描述的方法包括向受試者施用至少一種本發明的變體SAP多肽，作為治療劑。本發明的治療劑可以按照常規方式配制使用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑。例如，治療劑及其生理上可接受的鹽和溶劑化物可以配制為用于通過例如注射(例如SubQ、IM、IP)、吸入或噴灑(通過口或鼻)或口、口腔、舌下、透皮、鼻、胃腸外或直腸施用。在一些實施方式中，治療劑可以局部施用，在靶細胞所存在的位點，即，在特定組織、器官或液體(例如，血液、腦脊髓液、腫瘤質等)。本發明還提供了本發明的任意變體SAP多肽在制備用于治療或預防患者中的如本文描述的病癥或病況的藥物中的用途，例如，變體SAP多肽在制備用于治療本文描述的病癥或病況的藥物中的用途。在一些方面，本發明的任意變體SAP多肽可用于制備用于治療或預防如本文描述的疾病或病況的藥學制備物。治療劑可以配制為通過多種方式給藥，包括全身性和表面或局部給藥。一般地，技術禾口制劑可以見 Remington’s PharmaceuticalSciencesjMeade Publishing Co. ,Easton, PA。對于胃腸外給藥，注射是優選的，包括肌內、靜脈內、腹膜內和皮下。就注射而言，化合物可以配制于溶液中，優選為生理相容的緩沖液，例如Hank溶液或Ringer溶液。另外，化合物可以配制為固體形式并在臨使用前溶解或懸浮。也包括凍干的形式。在一些實施方式中，可以通過本領域熟知的多種方法向細胞施用治療劑，包括但不限于包裹于脂質體中， 通過離子電滲法，或通過摻入其它介質中，例如水凝膠、環糊精、生物可降解的納米膠囊以及生物粘附性的微球體。對于口服給藥，藥物組合物可以采取下列形式，例如，片劑、錠劑或膠囊，其通過常規方式使用藥學上可接受的賦形劑制備，例如，粘合劑(例如，預膠凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、云母或硅石)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。可以通過本領域熟知的方法包被片劑。用于口服給藥的液體制備物可以采取以下形式，例如，溶液、糖漿或懸浮液，或者它們可以呈現為干燥產品，在使用前以水或其它合適的介質復原。此類液體制備物可以通過常規方式制備，使用藥學上可接受的添加劑，例如，懸浮劑(例如山梨醇漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性介質(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾的植物油)；和防腐劑(例如甲基或丙基-對-羥基苯甲酸酯或山梨酸)。制備物還可以視需要包含緩沖鹽、香味劑、 著色劑和甜味劑。用于口服給藥的制備物可以適宜地配制以提供活性化合物的受控釋放。對于通過吸入施用(例如肺部遞送)，治療劑可以方便地以氣霧劑噴霧劑的形式遞送，從加壓包或霧化器中制得，并使用合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它的合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單元可以通過提供閥門來確定，以遞送計量的量。用于吸入器或吹入器的膠囊和藥筒(例如明膠的)可以配制為包含化合物與合適的粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合物。在本發明的方法中，藥學化合物也可以通過鼻內或支氣管內途徑施用，包括吸Λ法、粉末和氣霧劑制劑(例如，類固醇吸入劑，見Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacology. 35 :1187-1193 ；Tjwa(1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75 :107-111)。例如，可以將氣霧劑制劑置于加壓的可接受的推進劑、例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等之中。 它們也可以配制為非加壓制備物的藥物，例如在噴霧器或霧化器中。通常而言，此類施用方式是在含水的藥學可接受的緩沖液中。
適合于呼吸道遞送(例如鼻內、吸入等)變體SAP多肽的藥物組合物可以配制為固體或液體形式。本發明的SAP多肽可以配制為通過注射而用于胃腸外施用，例如通過推注或持續滴注。用于注射的制劑可以是單元劑量形式，例如在安瓿或多劑容器中，使用添加的防腐劑。組合物可以采取下列形式，例如，油性或水性介質中的懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制試劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。備選地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前通過合適的介質、例如無菌的無熱源的水來復原。此外，本發明的SAP多肽還可以配制為貯庫制劑。此類長效制劑可以通過移植(例如皮下或肌內)或通過肌內注射來施用。因此，例如，治療劑可以與合適的聚合材料或疏水性材料一起配制(例如，作為可接受的油中的乳液)，或與離子交換樹脂一起配制，或作為略溶性衍生物，例如，作為略溶性的鹽。控釋制劑也可以包括貼劑。在一些實施方式中，本文描述的化合物可以配制為遞送至中樞神經系統(CNS) (綜述見 Begley，Pharmacology & Therapeutics 104 :29-45 (2004)) 用于將藥物遞送至 CNS的常規方法包括神經外科方法(例如大腦內注射或腦室內注入)；試劑的分子操作 (例如，產生嵌合的融合蛋白，其包含具有針對內皮細胞表面分子的親和性的轉運肽，以及在嘗試利用血腦屏障的內源性轉運途徑之一時本身不能跨越血腦屏障的試劑)；設計為增加試劑在液體中的溶解性的藥理學策略(例如，將水溶性試劑綴合于脂或膽固醇載體)；以及，通過高滲破壞(由于甘露醇溶液浸入頸動脈或由于使用生物活性試劑例如血管緊張素肽而引起)短暫破壞血腦屏障的完整性。在一些實施方式中，本發明的SAP多肽摻入包含表面載體的表面制劑中，所述表面載體一般適合于表面藥物施用并且包括本領域已知的任何此類材料。可以將表面載體選擇為以所需的形式提供組合物，例如膏、洗液、霜、微乳劑、膠、油、溶液等，并且可以包含天然產生的或合成來源的物質。優選的是，所選的載體對于表面制劑的活性試劑或其它成分沒有不利影響。用于本文的合適的表面載體的實例包括水、醇和其它無毒性有機溶劑，甘油，礦物油，硅酮，凡士林，羊毛脂，脂肪酸，植物油，對羥苯甲酸酯，蠟等。藥物組合物(包括美容制備物)可以包含大約0. 00001%至100%重量的一種或多種本文描述的變體SAP多肽，例如0.001%至10%，或0. 至5%。在一些表面制劑中，活性試劑的存在量是制劑的大約0. 25wt. %至75wt. %，優選為制劑的大約0. 25wt. % 至30wt. %，更優選為制劑的大約0. 5wt. %M 15wt. %，最優選為制劑的大約1. Owt. %M IOwt. %。眼睛的病況可以通過例如全身性、表面性、眼內注射治療劑，或通過插入釋放治療劑的持續釋放裝置來治療或預防。本發明的SAP多肽可以通過藥學上可接受的眼科介質來遞送，從而化合物保持與眼睛表面接觸足以允許化合物進入眼睛的角膜和內部區域的時間段，例如，前房、結膜、后房、玻璃體、眼房水、玻璃體液、角膜、虹膜/睫、晶狀體、脈絡膜/視網膜和鞏膜。藥學上可接受的眼科介質可以是，例如，膏、植物油或封裝材料。備選地，化合物可以直接注射進入玻璃體液和眼房水。在進一步的備選方案中，化合物可以全身施用，例如通過靜脈內注入或注射，以治療眼睛。本文描述的治療劑可以根據本領域的方法儲存于無氧環境下。示例性的組合物包含SAP多肽和一種或多種藥學上可接受的載體，以及，可選地包含其它治療成分。載體必須是“藥學上可接受的”，其意指與組合物中的其它成分兼容并且不在受試者中引發不能接受的有害的效應。此類載體在本文中有描述或者是藥理學技術領域技術人員熟知的。在一些實施方式中，藥物組合物是無熱源的，并且適合于向人類受試者施用。在一些實施方式中，藥物組合物是無刺激物的并且適合于向人類患者施用。在一些實施方式中，藥物組合物是無變應原的并且適合于向人類患者施用。組合物可以通過藥學領域熟知的任何方法制備。在一些實施方式中，SAP多肽以時間釋放制劑施用，例如，包括緩釋聚合物的組合物。可以使用保護SAP多肽免于迅速釋放的載體來制備SAP多肽。實例包括控釋介質，例如聚合物、微膠囊化遞送系統或生物粘附性凝膠。備選地，可以通過在組合物中加入延遲吸收的試劑、例如單硬脂酸鋁水凝膠和明膠來實現SAP多肽的延長的遞送。用于遞送核酸化合物的方法是本領域已知的(見，例如Alchtar等人，1992， Trends Cell Bio. ,2,139 ；and Delivery Strategies forAntisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995 ；Sullivan 等人’ International Application No. WO 94/02595)。這些程序可用于遞送基本上任何核酸化合物。可以通過本領域技術人員熟悉的多種方法將核酸化合物施用于細胞，包括但不限于封裝于脂質體中，通過離子電滲法， 或通過摻入其它介質中，例如水凝膠、環糊精、生物可降解的納米膠囊以及生物粘附性的微球體。備選地，通過直接注射或通過使用輸液泵局部遞送核酸/介質組合。其它的遞送途徑包括但不限于口服(藥片或藥丸形式)和/或鞘內遞送(Gold，1997，Neuroscience, 76,1153-1158)。其它方法包括使用多種轉運子和載體系統，例如通過使用綴合物和生物可降解聚合物。關于藥物遞送方法的全面綜述，見Ho等人，1999，Curr. Opin. Mol. Ther. , 1,336-343 and Jain, DrugDelivery Systems !Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 禾口 Groothuis 等人，1997, J. Neuro Virol. ,3, 387-400。在 Sullivan 等人，見上文，Draper 等人，PCT W093/23569, Beigelman 等人，國際申請號W099/05094和Klimuk等人，國際公開號W099/04819中提供了關于核酸遞送和給藥的更詳細的描述。以下實施例用于更詳細地描述使用上述發明的方式，并給出了用于實施本發明的多個方面的最佳方式。應該理解，這些實施例不是為了限制本發明的真實范圍，而是為了示例性的目的。實施例實施例1 重組SAP效力比源自人血清的SAP更高使用體外生物測驗法分析了分離自CHO-S細胞的重組人SAP (rhSAP)和源自人血清的SAP(hSAP)的生物活性。在該測驗中，將富含外周血單核細胞(PBMC)的單核細胞與不同濃度的rhSAP或hSAP —起溫育96小時。溫育之后，收集得到的培養上清液并通過ELISA 測定以定量所產生的巨噬細胞衍生的趨化因子(MDC)的量。MDC是由纖維細胞產生的，因此其是單核細胞分化為纖維細胞的指示。通過比較樣品與hSAP參考標準物的抑制性濃度， 50% (IC5tl),可以測定SAP糖變體的相對效力。結果表示為樣品的IC5tl值與hSAP參考標準物之比。在經補充的FibroLife 培養基(Supplemented FibroLife Media)中將所有的 SAP 樣品和標準物的最初濃度稀釋至1. Omg/mL。連續稀釋SAP標準物以產生下列工作標準濃度:60, 30，20，13. 4，8. 8，6. 0，3. 0，1. 5 和 0. 75 μ g/mL (最終標準物的濃度為 30，15，10，6. 7， 4. 4,3. 0. 1. 5,0. 75 和 0. 375 μ g/mL)。見下表 1。
權利要求
1.糖基化的人血清淀粉樣蛋白P(SAP)多肽，其包含N-連接的寡糖鏈，其中所述寡糖鏈的至少一個分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。
2.糖基化的人SAP多肽，其包含N-連接的寡糖鏈，其中所述寡糖鏈相對于分離自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α 2,6-連接的唾液酸部分。
3.權利要求1的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈的所有分支終止于α2，3-連接的唾液酸部分。
4.權利要求2的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈實質上不含α2，6-連接的唾液酸部分。
5.權利要求1-4任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈具有雙觸角結構。
6.權利要求1-4任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈具有三觸角結構。
7.權利要求1-4任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈具有四觸角結構。
8.權利要求1-4任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈具有五觸角結構。
9.權利要求1-8任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述N-連接的寡糖鏈包含以下的五糖核心:Man [(α 1,6)-(Man (α 1,3)] -Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc (β 1, N) -Asn0
10.權利要求1-9任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈包含具有結構 NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6 的至少一個分支。
11.權利要求1-10任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈的至少一個分支實質上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
12.權利要求11的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈的所有分支實質上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
13.權利要求1-12任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈的至少一個分支包含一個或多個甘露糖殘基。
14.權利要求1-13任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈包含至少一個巖藻糖殘基。
15.權利要求1-14任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖鏈包含至少一個修飾的糖基殘基。
16.權利要求15的糖基化的人SAP多肽，其中至少一個修飾的糖基殘基綴合于選自下列的一個或多個修飾基團水溶性和水不溶性的聚合物、治療部分、診斷試劑和生物分子。
17.權利要求1-16任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述SAP多肽是重組多肽。
18.權利要求1-17任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽包含與SEQID NO=I 至少85%同一的氨基酸序列。
19.權利要求1-17任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽包含與SEQID NO=I 至少95%同一的氨基酸序列。
20.權利要求1-19任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽是包含SAP結構域和一個或多個異源結構域的融合蛋白。
21.權利要求20的糖基化的人SAP多肽，其中所述一個或多個異源結構域增強下列一項或多項體內穩定性、體內半衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形成，和/ 或純化。
22.權利要求1-21任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽包含一個或多個修飾的氨基酸殘基。
23.權利要求22的糖基化的人SAP多肽，其中所述一個或多個修飾的氨基酸殘基包括 PEG化的氨基酸，異戊烯化的氨基酸，乙酰化的氨基酸，生物素化的氨基酸，和/或綴合于有機衍生劑的氨基酸。
24.權利要求23的糖基化的人SAP多肽，其中所述一個或多個修飾的氨基酸殘基增強下列一項或多項體內穩定性、體內半衰期、攝取/施用、組織定位或分布、蛋白復合物的形成、和/或純化。
25.權利要求I-M任一項的糖基化的人SAP多肽，其中所述SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。
26.適合用于哺乳動物的藥學制備物，其包含權利要求1-25任一項的人SAP多肽和藥學上可接受的載體。
27.權利要求沈的藥學制備物，其還包含另外的活性試劑。
28.權利要求沈的藥學制備物，其中所述藥學制備物配制為緩釋制劑。
29.權利要求沈的藥學制備物，其中所述藥學制備物適合于表面地、通過注射、通過靜脈內注射、通過吸入、通過持續貯庫或通過泵施用至患者。
30.治療或預防患者中的纖維變性或纖維增殖性病癥或病況的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的權利要求1-25任一項的SAP多肽。
31.治療或預防患者中的超敏反應病癥或病況的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的權利要求1-25任一項的SAP多肽。
32.治療或預防患者中的粘膜炎的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的權利要求1-25任一項的SAP多肽。
33.治療或預防患者中的自身免疫病癥或病況的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的權利要求1-25任一項的SAP多肽。
34.權利要求30-33任一項的方法，其中所述SAP多肽表面地、通過注射、通過靜脈內注射、通過吸入、通過持續貯庫或通過泵或其組合施用。
35.權利要求30-33任一項的方法，還包括向患者施用另外的活性試劑。
36.制備糖基化的人SAP多肽的方法，包括i)在細胞中表達權利要求1- 任一項的SAP多肽；和 )從細胞中分離SAP多肽。
37.制備人SAP多肽的方法，包括i)在CHO細胞中表達人SAP多肽；和 )從細胞中分離人SAP多肽。
38.權利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-連接的寡糖鏈，并且其中所述寡糖鏈的至少一個分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。
39.權利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-連接的寡糖鏈，并且其中所述寡糖鏈相對于分離自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α 2,6-連接的唾液酸部分。
40.權利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-連接的寡糖鏈，并且其中所述寡糖鏈的所有分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。
41.權利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-連接的寡糖鏈，并且其中所述寡糖鏈實質上不含α 2，6-連接的唾液酸部分。
42.權利要求38-41任一項的方法，其中所述寡糖鏈具有雙觸角結構。
43.權利要求38-41任一項的方法，其中所述寡糖鏈具有三觸角結構。
44.權利要求38-41任一項的方法，其中所述寡糖鏈具有四觸角結構。
45.權利要求38-44任一項的方法，其中所述分離的人SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。
46.權利要求38-45任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖鏈包含以下的五糖核心 Man [ ( α 1，6)-(Man (α 1,3)]—Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc (β 1，N)_Asn。
47.權利要求38-46任一項的方法，其中所述寡糖鏈包含具有結構 NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6 的至少一個分支。
48.權利要求38-47任一項的方法，其中所述寡糖鏈的至少一個分支實質上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
49.權利要求48的方法，其中所述寡糖鏈的所有分支實質上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
50.權利要求38-49任一項的方法，其中所述寡糖鏈的至少一個分支包含一個或多個甘露糖殘基。
51.權利要求38-50任一項的方法，其中所述寡糖鏈包含至少一個巖藻糖殘基。
52.權利要求38-51任一項的方法，其中所述寡糖鏈包含至少一個修飾的糖基殘基。
53.權利要求52的方法，其中至少一個修飾的糖基殘基綴合于選自下列的一個或多個修飾基團水溶性和水不溶性的聚合物、治療部分、診斷試劑和生物分子。
54.權利要求36的方法，其中所述細胞是CHO細胞。
55.權利要求35或36的方法，進一步包括酶促地或化學地改變分離的SAP多肽以產生具有修飾的寡糖鏈的SAP多肽。
56.權利要求55的方法，其中酶促地或化學地改變分離的SAP多肽的方法包括以選自糖基轉移酶、糖苷酶和磷酸酶的一種或多種酶蛋白處理分離的SAP多肽。
57.權利要求55的方法，其中酶促地或化學地改變分離的SAP多肽的方法在存在一種或多種糖前體的情況下進行。
58.權利要求57的方法，其中一種或多種糖前體選自=UDP-N-乙酰葡萄糖胺， UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神經氨酸，UPD-半乳糖和⑶P-巖藻糖。
59.權利要求55的方法，其中酶促地或化學地改變分離的SAP多肽的方法從寡糖鏈除掉一個或多個末端的α 2，6_連接的唾液酸部分。
60.權利要求55的方法，其中酶促地或化學地改變分離的SAP多肽的方法將寡糖鏈上的一個或多個末端的α 2，6_連接的唾液酸部分替換為一個或多個α2，3_連接的唾液酸部分。
61.權利要求36-60任一項的方法，其中所述分離的SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。
62.制備SAP多肽的方法，包括i)提供糖基化的SAP多肽，其中所述糖基化的SAP多肽包含N-連接的寡糖鏈；和 )酶促地或化學地改變SAP多肽的N-連接的寡糖鏈以產生修飾的糖基化的SAP多肽。
63.權利要求62的方法，其中酶促地或化學地改變SAP多肽的N-連接的寡糖鏈的方法從寡糖鏈除掉一個或多個末端的α 2，6-連接的唾液酸部分。
64.權利要求62的方法，其中酶促地或化學地改變SAP多肽的N-連接的寡糖鏈的方法將寡糖鏈上的一個或多個末端的α 2，6_連接的唾液酸部分替換為一個或多個α 2，3_連接的唾液酸部分。
65.權利要求62-64任一項的方法，其中酶促地或化學地改變SAP多肽的N-連接的寡糖鏈的方法包括以選自糖基轉移酶、糖苷酶和磷酸酶的一種或多種酶蛋白處理SAP多肽。
66.權利要求62-65任一項的方法，其中酶促地或化學地改變SAP多肽的N-連接的寡糖鏈的方法在存在一種或多種糖前體的情況下進行。
67.權利要求66的方法，其中一種或多種糖前體選自=UDP-N-乙酰葡萄糖胺， UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神經氨酸，UPD-半乳糖和⑶P-巖藻糖。
68.權利要求62-67任一項的方法，其中N-連接的寡糖鏈相對于分離自人血清的野生型人SAP蛋白具有低至少50%的α 2，6-連接的唾液酸部分。
69.權利要求62-67任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖鏈實質上不含α2，6_連接的唾液酸部分。
70.權利要求62-69任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有雙觸角結構。
71.權利要求62-69任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有三觸角結構。
72.權利要求62-69任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有四觸角結構。
73.權利要求62-69任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有五觸角結構。
74.權利要求62-73任一項的方法，其中寡糖鏈的至少一個分支終止于α2，3-連接的唾液酸部分。
75.權利要求74的方法，其中寡糖鏈的所有分支終止于α2，3-連接的唾液酸部分。
76.權利要求62-75任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖鏈具有至少一個修飾的糖基殘基。
77.權利要求76的方法，其中至少一個修飾的糖基殘基綴合于選自下列的一個或多個修飾基團水溶性和水不溶性的聚合物、治療部分、診斷試劑和生物分子。
78.權利要求62-77任一項的人SAP多肽，其中所述修飾的糖基化的SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。
79.制備SAP多肽的方法，包括i)提供SAP多肽；和 )酶促地或化學地改變SAP多肽以產生包含N-連接的寡糖的糖基化的SAP多肽。
80.權利要求79的方法，其中酶促地或化學地改變SAP多肽的方法包括以選自糖基轉移酶、糖苷酶和磷酸酶的一種或多種酶蛋白處理SAP多肽。
81.權利要求79或80的方法，其中酶促地或化學地改變SAP多肽的方法在存在一種或多種糖前體的情況下進行。
82.權利要求81的方法，其中一種或多種糖前體選自UDP-N-乙酰葡萄糖胺， UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神經氨酸，UPD-半乳糖或⑶P-巖藻糖。
83.權利要求79-82任一項的方法，其中N-連接的寡糖鏈相對于分離自人血清的野生型SAP蛋白具有低至少50%的α 2，6-連接的唾液酸部分。
84.權利要求79-82任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖鏈實質上不含α2，6_連接的唾液酸部分。
85.權利要求79-84任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有雙觸角結構。
86.權利要求79-84任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有三觸角結構。
87.權利要求79-84任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有四觸角結構。
88.權利要求79-84任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖具有五觸角結構。
89.權利要求79-88任一項的方法，其中寡糖鏈的至少一個分支終止于α2，3-連接的唾液酸部分。
90.權利要求89的方法，其中寡糖鏈的所有分支終止于α2，3-連接的唾液酸部分。
91.權利要求79-90任一項的方法，其中所述N-連接的寡糖鏈具有至少一個修飾的糖基殘基。
92.權利要求91的方法，其中至少一個修飾的糖基殘基綴合于選自下列的一個或多個修飾基團水溶性和水不溶性的聚合物、治療部分、診斷試劑和生物分子。
93.權利要求79-92任一項的人SAP多肽，其中所述糖基化的SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。
94.通過包括下列的方法制備的人SAP多肽 i)在CHO細胞中表達SAP多肽；和 )從細胞中分離SAP多肽。
95.權利要求94的人SAP多肽，其中所述SAP多肽的抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。
96.權利要求94或95的人SAP多肽，其中所述方法還包括改變分離的SAP多肽的糖基化結構。
97.包含人SAP多肽的CHO細胞，所述人SAP多肽包含N-連接的寡糖鏈，其中所述寡糖鏈的至少一個分支終止于α 2，3-連接的唾液酸部分。
98.包含編碼異源SAP多肽的核酸的CHO細胞。
99.人SAP多肽，其抑制單核細胞在體外分化為纖維細胞的IC5tl小于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的1/2。
100.治療或預防患者中的炎性病癥或病況的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治療有效量的權利要求1-15任一項的SAP多肽。
全文摘要
本發明的一個方面涉及如下的令人驚奇的發現修飾人SAP多肽上的聚糖結構能夠增強SAP多肽相對于分離自人血清的野生型SAP的對應樣品的生物學活性。本公開提供了變體人SAP多肽及其制備方法。特別地，本發明提供了用于體外和體內添加、刪除或修飾糖殘基以產生具有需要的糖基化模式的SAP多肽、例如人SAP多肽的方法和組合物。
文檔編號A61P29/00GK102574902SQ201080028923
公開日2012年7月11日 申請日期2010年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者R·J·凱梅, W·S·維萊特 申請人:普羅麥迪奧股份有限公司