專利名稱：治療神經退化之方法
治療神經退化之方法背景技術
神經壓迫綜合征(Nerve compressive syndrome)，也稱為絞扼性神經病 (entrapment neuropathy)，是一種由直接壓迫、神經或鄰近組織的結構性改變或單一神經的機械性損傷引起的醫學狀況。其癥狀包括疼痛、刺痛、麻木及肌肉萎縮。取決于受到影響的神經，這些癥狀僅影響機體的一個特定部位。盡管公知的實例是在腕部的正中神經的壓迫(腕管綜合癥)，但是其它神經，例如腕部或肘部的尺骨神經及錐孔的脊神經根也非常容易受影響。神經壓迫的長期影響可能導致神經元退化及神經系統功能的喪失。
減壓手術是常規的治療方法，通過該方法除去壓迫源，例如骨頭或軟骨，從而緩解壓力和減輕神經性痛疼。手術后，癥狀可能完全消除，但是如果壓迫足夠嚴重或者時間足夠持久，神經可能不會完全恢復，某些癥狀可能還會持續。而且，手術后患者將需要較長的時間才能實現功能恢復。大多情況下，減壓手術無法修復神經纖維的退化。
因此，需要開發一種在絞扼性神經病的早期或在減壓手術之后用于使退化的神經功能改善或恢復的方法。發明內容
本發明預料不到地發現酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)在神經再生中起到重要的作用。當對罹患神經壓迫綜合征的對象施予aFGF時，觀察到退化或損傷的神經的功能性恢復。與傳統的減壓手術相比較，注射aFGF是更加有效和安全的治療方法。
因此，本發明提供一種用于治療由神經壓迫綜合征或絞扼性神經病引起的神經退化之方法，其包含對需要治療的對象施予人酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)。
應理解到，上述的總體說明和下述的詳細說明僅是示例性的，僅用于解釋本發明而不是對本發明的限制。
結合附圖，將更好地理解本發明的上述內容及下述的詳細說明。
在附圖中
圖1是示出對通過枕骨大孔注射生理鹽水或人aFGF施行壓迫手術的大鼠進行的抓力測試的示意圖。*表示aFGF處理組合對照組之間具有顯著性差異(ρ < 0. 05)，#表示 aFGF處理前和aFGF處理后具有顯著性差異(ρ < 0. 05)。
具體實施方式
除非說明書中明確指明所使用的冠詞“一”僅表示單數之外，本發明中所使用的冠詞“一”表示一個或多個(也就是，至少一個)該冠詞所修飾的對象。
本發明提供一種用于治療由神經壓迫綜合征或絞扼性神經病引起的神經退化之方法，其包含對需要治療的對象施予人酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)。
本發明中所使用的術語“神經壓迫綜合征”或“絞扼性神經病”指由微脈管功能的局部干涉和神經或鄰近組織中結構性變化造成的外周神經功能性障礙。長時間的或反復的外力可能壓迫神經壓迫綜合征，例如將手臂擱在桌椅的后背上(橈神經)，頻繁地將肘支在桌子上(尺神經)，或者不合適的投擲或翹腿(腓神經)。隨著時間的推移，壓迫會越來越嚴重，發生病灶性脫髓鞘，隨后將發生軸突損傷，最后形成創傷。而且，一些情況引起神經對壓迫尤其敏感。這些情況包括糖尿病，這種情況下，供應給神經的血液已經受到壓迫，使得神經對較小的壓迫度變得更加敏感。
常見的神經壓迫綜合征包括椎間盤突出(herniated intervertebral disc)、頸神經壓迫綜合征(cervical nerve compression syndrome)、胸廓出口綜合征(thoracic outlet syndrome)及腕管綜合癥(carpal tunnel syndrome)。其它的神經壓迫綜合征可以包括但不限于骨間前神經綜合征(anterior interosseous syndrome)、旋前圓肌綜合癥(pronator teres syndrome)、韋刃帶斯特拉瑟斯綜合征(ligament of Struthers syndrome)、月寸管綜合征(cubital tunnel syndrome)、腕尺管綜合(Guyon ‘ s canal syndrome)、|^神經Bi迫癥(radial nerve compression)、骨間后神經卡Bi癥(posterior interosseous nerve entrapment)、Wartenberg 氏綜合征(ffartenberg ‘ s syndrome) > 肩月甲上神經卡壓癥(suprascapular nerve entrapment)、]]非神經壓迫癥(peroneal nerve compression)、踝管綜合征(tarsal tunnel syndrome)、感覺異常性股痛(meralgia paraesthetica)、骨客腹下神經卡壓癥(iliohypogastric nerve entrapment)、閉孑L神經卡壓癥(obturator nerve entrapment)、陰部神經卡壓癥(pudendal nerve entrapment)及腹部皮神經卡壓綜合征(abdominal cutaneous nerve entrapment syndrome)。
本發明中的術語“人aFGF，，指天然的人aFGF或任何由天然的人aFGF修飾的肽。 修飾的肽可以例如通過在天然的人aFGF中刪除、插入或取代一個或多個氨基酸或這些方式的組合而得到。在本發明的一個實施例中，修飾的人aFGF是這樣一種肽，其包含從天然的人aFGF的N端刪除20個氨基酸、并且在截短后的天然的aFGF的前端添加丙氨酸的天然的人aFGF。例如，人aFGF可以是具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的肽，其公開于美國第12/482,041號申請中，其全部內容通過引用的方式合并于此。
根據本發明，人aFGF可以制備成任何適于所選擇的施予模式的形式。優選地，通過局部給藥、神經內給藥或肌肉內給藥施予人aFGF。根據本發明，本領域的技術人員根據他的經驗或罹患神經壓迫綜合征的患者的生理狀況，即年齡、體重、嚴重性或服用量而能夠容易地確定施予途徑和劑量。在本發明的一實施例中，將0. lmg/ml的人aFGF注射到左拇收肌。
已知的是多肽或蛋白質在體外容易降解。為了延長人aFGF在對象中的作用，可以將人aFGF包含于能夠持續釋放的任何載體或組合物中。例如，纖維蛋白膠已經成功地廣泛應用于外科手術領域，例如皮膚移植固定、神經修復、軟骨重附著及微脈管愈合。研究還顯示活性劑能夠從纖維蛋白膠中較長的時間地釋放。
因此，在本發明的一個實施例中，將人aFGF包含于纖維蛋白膠混合物中并將其施予給罹患神經壓迫癥或絞扼性神經病的對象。aFGF在纖維蛋白膠混合物中的濃度最好在大約0. 0lmg/ml到100mg/ml。在本發明的一個實施例中，通過拇收肌注射施予時纖維蛋白膠包含0. lmg/ml的aFGF。在本發明的另一實施例中，通過枕骨大孔注射施予時纖維蛋白膠包含0. 04mg/ml的aFGF。對本領域的技術人員來說，基于本發明的公開內容，根據他的知識及常規試驗的標準方法能夠容易地確定治療的有效量及劑量和施予頻率。
本發明的纖維蛋白膠混合物是指一能夠提供生物適應性和持續釋放性能的藥學組合物，其包含人aFGF、纖維蛋白原、抑肽酶及二價鈣離子。在本發明的一個實施例中，二價鈣離子可以是任何的鈣離子來源，例如可以通過添加氯化鈣或碳酸鈣提供的鈣離子。
根據本發明，纖維蛋白膠混合物包含0. 01-100mg/ml的人酸性成纖維細胞生長因子，以及含10-1000mg/ml的纖維蛋白原、10_500KIU/ml的抑肽酶及0. I-IOmM的二價鈣離子的纖維蛋白膠。在本發明的一個實施例中，為了提供更好的凝結效果，纖維蛋白膠混合物可進一步包含10-100IU/ml的凝血酶。
本發明的纖維蛋白膠混合物可以制備成任何適于所選擇的施予模式的形式。優選地，通過局部給藥、神經內給藥或肌肉內給藥施予纖維蛋白膠混合物。根據本發明，本領域的技術人員根據他的經驗或罹患神經壓迫綜合征的患者的生理狀況，即年齡、體重、嚴重性或服用量而能夠容易地確定施予途徑。
根據本發明，神經病變動物模型設計成顯示在促進神經纖維突觸生長和功能性恢復中的效果。在本發明的一個實施例中，用8-0尼龍縫合線結扎左頸椎背根神經節(dorsal root ganglion,DRG)。結扎損傷一周后，將6 μ 1含0. 6 μ g aFGF的生理鹽水全部注入左拇收肌。
在本發明的另一實施例中，結扎損傷一周后，將含0. 04mg/ml的aFGF (5 μ 1生理鹽水中含0. 2 μ g aFGF)、10mg/ml的纖維蛋白原及200KIU/ml的抑肽酶的51纖維蛋白膠混合物直接注射到施行手術的大鼠的枕骨大孔中。第一次注射后5分鐘，將含0.45mM氯化鈣及 10IU/ml凝血酶的10 μ 1補充組合物用同一注射器注射到枕骨大孔中。
通過抓力測試測定功能改善。處理后2周和3周進行測試從而獲取結果，施予aFGF 的組根據顯著高抓力比率(損傷側-L/正常側-R)比對照組(僅施予生理鹽水)在恢復神經功能方面具有更好的效果。鑒于這種結果，本發明提供了用于恢復神經功能的預料不到的治療方法。
因為神經再生需要很長時間，因此需要持續施予，以修復神經退化。在本發明的一個實施例中，建議每月一次向對象施予包含人aFGF的纖維蛋白膠混合物。本領域的技術人員能夠根據標準方法和公知常識及施予對象的表現確定劑量。
通過下述的實施例能夠更詳細地解釋本發明。但是應當注意的是，本發明并不以任何形式限于這些實施例。
實施例aFGF修復壓迫性神經病大鼠模型中的神經功能
動物
使用年齡在8至10周、體重250_300g的共20只成熟雌性Sprague-Dawley大鼠。 將這些動物置于加熱墊上用氟烷全身麻醉(1. Oliter/min,以保持大約60/分鐘的呼吸頻率)施行手術。在手術中監測并保持直腸溫度。使用雙極電烙術使出血減少到最小。手術之前皮下注射抗生素，之后每天一次持續一周。手術后，將動物保持在通風、濕度和溫度可控的室內12個晝夜。
大鼠的壓迫性手術
臥姿放置大鼠，并暴露它們的C4-C8椎骨。切除左C4至C7的半椎板。在顯微鏡下，確定頸根，移走重疊的小面后，在這些部位中輕輕地在側向鉆孔。然后小心地打開腦膜，拉緊動C5至C7神經根，暴露左頸椎背根神經節(dorsal root ganglion,DRG)的C5、C6及 C7部位并用8-0尼龍縫合線與末梢部位結扎。手術后，將這些大鼠分成兩個實驗組。
在A組，將大鼠分成對照組(用生理鹽水處理，η = 6)及aFGF組(用6 μ 1生理鹽水中的0.6yg aFGF處理，η =。。壓迫手術后一周，用異氟烷麻醉大鼠并將它們保持在溫暖的墊上以維持它們的體溫，在aFGF處理組將6 μ 1生理鹽水中的共0. 6 μ g aFGF緩慢地肌肉注射到拇收肌(從第1至第4趾肉，1.5μ1/趾肉)，對照組注射生理鹽水。通過抓力測試評估神經能恢復(表1)。
選擇性地，在B組，將大鼠也分為兩組用生理鹽水處理的對照組(n = 4)及aFGF 處理組(5 μ 1生理鹽水中的0. 2 μ g aFGF, η = 4)。壓迫手術后一周，將與包含1. 5mg纖維蛋白原(Beriplast P，德國)、抑肽酶溶液(200KIU/ml，20 μ 1)及HBSS(漢克平衡鹽緩沖液，80 μ 1)的5 μ 1的雞尾酒溶液混合的aFGF緩慢注射到aFGF處理組中的枕骨大孔中，對照組注射與5 μ 1的上述雞尾酒溶液混合的生理鹽水。用含有aFGF或生理鹽水的雞尾酒溶液注射5分鐘后，將10 μ 1的包含0. 45mM氯化鈣和10IU/ml凝血酶的第二溶液注射到枕骨大孔中，幾秒鐘后移走注射器。同樣通過抓力測試評估神經功能恢復(圖1)。
抓力測試
抓力測試是Bertelli 和 Mira 的方法(J.A. Bertelli et al.，and J. C. Mira, Neurosci Methods 58 151_5，199 的改進。為了評估抓力強度，將一線棒連接到一普通的電子秤上。測試兩個前爪，每次測試一個前爪。不測試的前爪用膠帶纏住以暫時防止抓動，測試的前爪保持自由。在提起尾巴時允許大鼠抓棒，逐漸增加力度，直到它們松開抓握， 記錄抓握力。抓握力指數是損失側/正常側的比率(損失側-L/正常側-R)。數值越大，說明功能恢復越好。
表1示出肌肉注射到拇收肌中的A組的抓力結果。觀察到aFGF處理組的大鼠比對照組的大鼠表現出更好的抓力。
表IA組(肌肉注射)的抓力測試結果
權利要求
1.一種用于治療由神經壓迫綜合征或絞扼性神經病引起的神經退化之方法，其特征在于，包含對需要治療的對象施予人酸性成纖維細胞生長因子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經壓迫綜合征或絞扼性神經病由慢性或急性壓迫或機械性損傷而引起。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述神經壓迫綜合征或絞扼性神經病包含椎間盤突出、頸神經壓迫綜合征、胸廓出口綜合征及腕管綜合癥。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過局部給藥、神經內給藥或肌肉內給藥施予所述人酸性成纖維細胞生長因子。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，通過從天然的人酸性成纖維細胞生長因子的N端刪除20個氨基酸且在截短后的天然的人酸性成纖維細胞生長因子的前端添加丙氨酸獲得所述人酸性成纖維細胞生長因子。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人酸性成纖維細胞生長因子的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述人酸性成纖維細胞生長因子進一步與纖維蛋白原、抑肽酶及二價鈣離子混合，形成纖維蛋白膠混合物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，通過添加氯化鈣或碳酸鈣提供所述二價鈣離子。
9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述纖維蛋白膠混合物包含0.Ol-IOOmg/ ml的人酸性成纖維細胞生長因子和含10-1000mg/ml的纖維蛋白原10_500KIU/ml的抑肽酶及0. I-IOmM的二價鈣離子的纖維蛋白膠。
10.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述纖維蛋白膠混合物包含0.04mg/ml 的人酸性成纖維細胞生長因子，10mg/ml的纖維蛋白原，200KIU/ml的抑肽酶及0. 45mM的氯化鈣。
11.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述纖維蛋白膠混合物進一步包含 10-100IU/ml 凝血酶。
12.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，通過局部給藥、神經內給藥或肌肉內給藥施予所述纖維蛋白膠混合物。
全文摘要
本發明提供一種用于治療由神經壓迫綜合征或絞扼性神經病引起的神經退化之方法，其包含對需要治療的對象施予人酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、纖維蛋白原、抑肽酶及二價鈣離子。
文檔編號A61P25/00GK102497876SQ201080028394
公開日2012年6月13日 申請日期2010年8月16日 優先權日2009年8月14日
發明者劉一強, 羅明吉, 鄭宏志 申請人:雅祥生技醫藥股份有限公司