專利名稱：凝集素樣氧化型ldl受體抑制用醫藥品以及動脈硬化預防醫藥品的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制凝集素樣氧化型LDL受體與氧化型LDL結合的抑制用醫藥品、以及含有該抑制用醫藥品的動脈硬化預防醫藥品。近年來，在包括日本在內的發達國家，隨著生活環境的變化、飲食生活的變化，各種生活習慣病患者不斷增加。作為主要的生活習慣病，可以列舉糖尿病、高血壓癥、高脂血癥等，這些疾病的發病者日益增多。此外，還有跡象表明雖然未出現嚴重癥狀但卻顯示了這樣的征兆的所謂預備軍呈現增加的趨勢。而且，這樣的生活習慣病常常成為重癥疾病的原因。本申請要求基于2009年6月23日在日本提出的日本特愿2009-148658號的優先權，在此援引其內容。
背景技術：
動脈硬化疾病是由生活習慣病引起的疾病之一，高脂血癥、特別是高膽固醇血癥是主要成因。目前，以動脈硬化疾病等循環器官疾病的預防、治療為目的的藥劑、特定的保健用食品，是以降低血中的膽固醇、中性脂肪的濃度(量)為指標的。例如，膽固醇合成抑制藥中的他汀類、降低中性脂肪的血中濃度的PPAR激動劑對缺血性心臟病等循環器官疾病顯示出療效，得到廣泛的使用。由于動脈硬化疾病及其主要成因的生活習慣病是慢性疾病，為了有效地預防，期待可以長期安全服用的有效的預防劑。例如，作為有效預防動脈硬化的藥劑，公開了含有蘋果來源的多酚作為有效成分的脂聯素調節劑(例如，參考專利文獻1。)。發現脂聯素 (adiponectin)是在脂肪細胞中特異性高表達的分泌蛋白，在隨后的研究中才明確其可抑制單核細胞與血管內皮細胞的粘著、平滑肌細胞的增殖等，具有抗動脈硬化的作用，通過調節血中的脂聯素量可以實現抗動脈硬化的作用。已有文獻報道蘋果來源的多酚具有各種各樣的功效，其中，具有與脂質代謝有關的功效。例如，有報道稱蘋果來源的多酚中含有的原花青素，可抑制胰脂肪酶，因此其可抑制甘油三酯的吸收(例如，參考非專利文獻1。)。此外，可知LDL(低密度脂蛋白)氧化生成的氧化型LDL對動脈硬化具有促進功能，通過降低血中的氧化型LDL量，可實現抗動脈硬化的作用。例如，公開了一種動脈硬化預防劑，按照干燥重量換算，其以含有低于95重量％比例的原花青素的松樹皮提取物為有效成分(例如，參考專利文獻2。)。松樹皮提取物對血管中的高脂質具有氧化抑制效果，因此，通過服用松樹皮提取物可以降低氧化型LDL的血中含量。另一方面，認為氧化型LDL的動脈硬化促進作用，是氧化型LDL介由凝集素樣氧化型LDL受體(L0X-1 ；凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1)被血管內皮細胞攝取而產生的。L0X-1被鑒定為血管內皮細胞的氧化型LDL受體，目前公知其是促進炎癥、動脈硬化、血栓、心筋梗塞、支架治療后的血管再狹窄等的循環器官疾病的因子。即，也可以通過抑制氧化型LDL與L0X-1結合以及被血管內皮細胞攝取，來實現抗動脈硬化作用。作為具有這樣的L0X-1抑制作用的預防劑，公開了含有屬于碗蕨科 (Dennstaedtiaceae)的蕨菜的植物提取物作為有效成分的具有L0X-1拮抗作用的組合物 (例如，參考專利文獻3。)，含有屬于蕓香科的植物提取物作為有效成分的具有L0X-1拮抗作用的動脈硬化抑制劑(例如，參考專利文獻4。)，現有技術文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2006-193502號公報專利文獻2 日本特開2005-23032號公報專利文獻3 日本特開2007-297381號公報專利文獻4 日本特開2007-320956號公報非專利文獻非專利文獻1 7 ￥ Y (Sugiyama)、外6名、夕Y — f卟·才歹· 7夕’丨J力化千工 y >l· , 7 > Y 7 一 F · Vr 彡 7 卜 1J 一 (Journal of Agricultural and Food Chemistry)、 2007年、第55卷、第4604 4609頁。
發明內容
發明要解決的問題專利文獻1和2中記載的預防劑與他汀類等相同，其目的在于通過抑制血中脂質水平來預防動脈硬化。與其相比，專利文獻3和4中記載的預防劑，是以阻斷氧化型LDL等的引起動脈硬化的脂蛋白的作用點為目的的全新機制的預防、治療方法。然而，上述預防劑對氧化型LDL與L0X-1的結合以及被血管內皮細胞攝取的抑制效果并不充分，需要尋找更有效的動脈硬化預防劑。本發明是鑒于上述問題而進行的，其目的在于鑒定一種具有優異的凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用的化合物，并提供一種對于治療或預防那些以L0X-1為惡化因素發揮作用的疾病、特別是動脈硬化疾病有用的醫藥品。需要說明的是，本發明和本申請說明書中的“凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用” 意指抑制L0X-1與氧化型LDL結合、抑制氧化型LDL被攝取至細胞內的作用。解決問題的方法本發明人等基于上述現有技術，進一步研究了具有高凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用的物質，其結果發現在原花青素中，三聚體以上的物質具有很強的效果，從而完成了本發明。S卩，本發明提供(1) 一種凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品，其特征在于，以3倍體以上的原花青素作為有效成分。(2)上述(1)所述的凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品，其特征在于，所述原花青素來源于包括蘋果、葡萄種子、花生內皮以及松樹皮在內的植物。(3) 一種動脈硬化預防醫藥品，其特征在于，含有三聚體以上的原花青素作為有效成分，具有凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用。
(4)上述(3)所述的動脈硬化預防醫藥品，其特征在于，所述原花青素來源于包括蘋果、葡萄種子、花生內皮以及松樹皮在內的植物。發明的效果本發明的凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品及使用了該凝集素樣氧化型LDL 受體抑制用醫藥品的動脈硬化預防醫藥品，可以有效地抑制氧化型LDL與凝集素樣氧化型 LDL受體的結合，抑制氧化型LDL被攝取至細胞內。此外，作為本發明的凝集素樣氧化型LDL 受體抑制用醫藥品等的有效成分的原花青素，一直以來是飲食品中含有的化合物，即使長期服用也幾乎未見報道有副作用，是安全性高的化合物。因此，期待可以通過持續地攝取本發明的凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品等，有效地預防動脈硬化疾病，降低罹患該疾病的風險。
[圖1]是表示實施例1中各聚合度的原花青素在450nm處的吸光度(0D450)的測定結果的圖。[圖2]是表示實施例2中各聚合度的原花青素的算出的氧化型LDL攝取率(％) 的圖。[圖3]是表示實施例3中添加了各種多酚時的氧化型LDL攝取率(％)的圖。[圖4]是表示實施例4中的添加了各種原花青素時的氧化型LDL結合率(％)的圖。[圖5]是表示實施例5中添加了4種不同結構的三聚體原花青素時的氧化型LDL 結合率(％ )的圖。[圖6]是表示實施例7中的口服攝取AP的大鼠腸系膜動脈中脂質的染色圖像 (A)、以及在腸系膜動脈中觀察到的脂質沉積個數(B)的圖。[圖7]表示的是實施例7中的口服攝取AP的大鼠血中的氧化型LDL濃度。發明的
具體實施例方式原花青素是具有下述結構的化合物黃烷-3-醇在4-8位或4-6位的碳之間反復縮合，代表性的原花青素具有下述結構(+)_兒茶素和(-)_表兒茶素在4-8位或4-6位的碳之間反復縮合。原花青素會因黃烷-3-醇結合位置的不同(結合在6位或8位的位置上的)、結合的是何種黃烷-3-醇即結合種類的不同、以及結合的單體間產生的立體構象的影響而具有復雜的結構。本發明人等使用測定人L0X-1蛋白質和氧化型LDL結合的ELLSA系統，對從約500 種食品素材中得到的具有凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用(以下稱作“L0X-1抑制作用”) 的化合物進行了研究。ELISA系統是對&ito等人的方法(參考Atherosclerosis、2008年、 第200卷第2號、第303 309頁。)改良進行的。結果發現蘋果來源的多酚具有L0X-1抑制作用。進一步有新發現對于在細胞表面表達L0X-1的細胞而言，在蘋果來源的多酚的存在下，使氧化型LDL發生反應時，L0X-1與氧化型LDL的結合被抑制，進而抑制氧化型LDL被細胞攝取，即，蘋果來源的多酚具有L0X-1抑制作用。此外還發現主要在原花青素、特別是三聚體以上的原花青素中觀察到了強烈的所述蘋果來源的多酚的L0X-1抑制作用。本發明的凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品(以下稱作“L0X-1抑制用醫藥品”)的特征在于以三聚體以上的原花青素作為有效成分。原花青素具有的L0X-1抑制作用依賴于原花青素的聚合度，聚合度大的原花青素具有較高的L0X-1抑制作用。本發明的 L0X-1抑制用醫藥品以聚合度為3以上的較大的原花青素類化合物作為有效成分，由此能夠達到比聚合度為2以下的原花青素類化合物(二聚體或單體原花青素)或未按照聚合度另行純化的原花青素明顯優異的L0X-1抑制作用。需要說明的是，本發明人等首先發現原花青素具有的L0X-1抑制作用依賴于原花青素的聚合度。本發明的L0X-1抑制用醫藥品，可以僅以特定聚合度的原花青素作為有效成分， 也可以以聚合度不同的多種原花青素的混合物作為有效成分。本發明的L0X-1抑制用醫藥品，優選使用從后述的原料植物中提取/純化得到的原花青素中除去了單體及二聚體原花青素的聚合度為3以上的全部原花青素作為有效成分。需要說明的是，在本申請說明書中的“單體原花青素”意指兒茶素類(兒茶素、表兒茶素)。此外，作為本發明的L0X-1抑制用醫藥品的有效成分，只要是聚合度為3以上的原花青素即可，并不限定于具有特定結構的化合物。這是因為只要聚合度在3以上，具有上述任意結構的原花青素均具有L0X-1抑制作用。需要說明的是，結構為至少1個縮合部位在黃烷-3-醇的4-6位碳間進行縮合的原花青素、末端為表兒茶素的原花青素具有較強的L0X-1 抑制作用，因此優選包含具有上述結構的原花青素作為有效成分。三聚體以上的原花青素可以是通過公知的有機合成法合成的原花青素，也可以將含有原花青素的植物作為原料，從該原料植物得到原花青素級分后，使用基于聚合度純化的天然原花青素。天然原花青素可以通過下述方法得到例如，從原料植物中提取原花青素得到提取物，然后從提取物中獲得含有原花青素的原花青素級分后，通過柱色譜法從所述原花青素級分中純化聚合度為3以上的原花青素。作為原料植物，可以列舉如下例如，薔薇科的蘋果、金絲桃科的山竹果、木犀科的橄欖、葡萄科的葡萄、杜鵑花科的蔓越莓、越橘、石榴科的石榴、虎耳草科的黑茶子、梧桐科的可可樹、豆科的大豆(黑豆)、落花生(花生)、松等的樹皮等。可以使用上述植物中的原花青素含量較多的組織、容易提取的組織作為原料。作為本發明的L0X-1抑制用醫藥品的有效成分，優選蘋果、葡萄、花生、或松樹來源的原花青素，進一步優選從蘋果的果實、葡萄的種子、花生的內皮、松樹的樹皮提取/純化而成的原花青素。其中特別優選蘋果的果實來源的原花青素。從原料植物提取原花青素，只要是可以在不損害原花青素的條件下從植物中提取的方法即可，并無特殊限定，可以按照常規方法進行。例如，從原料植物采集果實、種子、葉、 莖、樹皮等組織，進行適當的碎斷、粉碎處理等以后，在水、醇類等有機溶劑中進行加熱提取，得到含有原花青素的提取物。使用有機溶劑提取的情況下，可以通過蒸餾法等從提取物中除去有機溶劑。此外，對于蘋果等果實的情況下，可以將按照常規方法得到的原料果實的榨汁果汁作為提取物。需要說明的是，榨汁果汁、除去了有機溶劑的提取物，可以直接使用， 但優選使用經過離心分離、過濾等工序得到的澄清的果汁或提取物。可以按照常規方法從上述得到的提取物中獲得原花青素級分。原花青素級分可以通過1步純化操作來制備，也可以通過多步純化操作來制備。例如，使用可吸附多酚的吸附劑等從由原料植物得到的提取物中分離純化多酚級分，再使用吸附色譜法等從得到的多酚級分中純化原花青素級分。作為可吸附多酚的吸附劑，可以列舉如下例如，離子交換樹脂、合成吸附樹脂、硅膠等吸附劑、凝膠過濾劑等。提取物中的多酚向吸附劑的吸附、洗脫可以按照常規方法進行。例如，使由原料植物得到的提取物通過填充有吸附劑的柱子，使多酚類吸附。需要說明的是，向柱子通液之前，預先將該提取物的PH調整至4 9、優選5 7、進一步優選5 6。接著在該柱子中充分地通液純水或去離子水(PH5 7)，除去柱子中的非吸附物質(糖類、有機酸類等)后，可以使用醇類溶劑、例如，10 90%、優選30 80%的醇類將多酚洗脫。按照上述得到的多酚級分以原花青素為主要成分，此外，還含有氯原酸等咖啡酸衍生物 (酯)、對香豆酸衍生物、黃烷-3-醇類(兒茶素類)、槲皮黃素糖苷等黃酮醇類、根皮素糖苷等查耳酮類等的多酚類。作為用于從多酚級分中分離純化原花青素級分的吸附色譜柱的固定相，可以使用與前述吸附劑相同的物質。需要說明的是，向柱子通液前，預先將該多酚級分的PH調節為 4 9、優選5 7、進一步優選5 6。進一步地，優選在洗脫前預先使用純水或去離子水 (pH5 7)對柱子進行充分清洗。此外，作為洗脫溶劑(流動相)，只要是能夠將原花青素從柱子固定相上洗脫的時間、原花青素以外的多酚從柱子固定相上洗脫的時間完全區分開的溶劑即可，可以考慮柱子固定相的種類、使用的裝置等適當確定。例如，對于溶解在甲醇中的多酚級分，以硅膠作為柱子固定相，通過以己烷-甲醇-丙酮為洗脫溶劑的二元梯度洗脫吸附色譜，使原花青素以外的多酚在原花青素之前洗脫出來，而且，可以按照從原花青素聚合度小的成分開始依次進行洗脫(例如，參考非專利文獻1。)。因此，通過使用標準品等預先檢測各聚合度的原花青素的洗脫時間，可以得到僅含有所需聚合度的原花青素的原花青素級分。此外，通過回收三聚體原花青素以后的所有洗脫級分，可以得到含有聚合度在3以上的全部原花青素的級分。此外，例如，回收二聚體原花青素以后的洗脫級分，并進行濃縮、冷凍干燥后，使其再次溶解在甲醇中，同樣地，通過吸附色譜進行分離，能夠以更高的純化度狀態回收所需聚合度的原花青素級分。作為本發明的L0X-1抑制用醫藥品的有效成分，可以直接使用按照上述方法得到的原花青素級分，也可以使用將該原花青素級分濃縮后的濃縮液。例如，通過在25 100°C、優選35 90°C下減壓濃縮，從該原花青素級分中除去甲醇等溶劑，將其濃縮。此夕卜，也可以使用通過下述處理制成的粉末狀物質將所得原花青素級分濃縮后，直接將得到的濃縮液噴霧干燥或冷凍干燥處理、或向其中添加糊精等粉末助劑后進行噴霧干燥或冷凍干燥處理。進一步地，也可以將粉末狀原花青素溶解在乙醇等有機溶劑、檸檬酸等有機酸等中，以溶解在優選溶劑中的原花青素的形式使用。需要說明的是，作為使原花青素溶解的溶齊U，可以使用例如，乙醇等有機溶劑、檸檬酸等有機酸等。關于本發明L0X-1抑制用醫藥品中含有的三聚體以上的原花青素的量，只要是足以實現L0X-1抑制作用的量即可，并無特殊限定，可以考慮到原花青素的純化度、劑型、或攝取方法等適當確定。本發明中為了實現更充分的L0X-1抑制作用，三聚體以上的原花青素的含有比例優選為L0X-1抑制用醫藥品的50%以上，進一步優選為80%以上，更優選為 100%。此外，本發明的L0X-1抑制用醫藥品只要不損害三聚體以上原花青素的L0X-1抑制作用，還可以含有其他成分。例如，可以添加賦形劑、穩定化劑、防腐劑、粘度調節劑等通常使用的輔助原料、添加劑。服用本發明的L0X-1抑制用醫藥品可以取得優異的L0X-1抑制效果，因此，基于治療或預防以LDL為惡化因素發揮作用的疾病、例如炎癥、動脈硬化、血栓、心筋梗塞、支架治療后的血管再狹窄等目的，優選添加本發明的L0X-1抑制用醫藥品作為攝取的醫藥品有效成分。特別是通過將本發明的L0X-1抑制用醫藥品作為有效成分，即，以三聚體以上的原花青素作為有效成分，可以制造安全性優異且預防效果高的動脈硬化預防醫藥品。以本發明的L0X-1抑制用醫藥品作為有效成分的動脈硬化預防醫藥品(以下稱作本發明的動脈硬化預防醫藥品)可以按照常規方法制造。此外，制造上述藥品時，可以添加通常所使用的輔助原料、添加劑。作為上述原料及添加劑，可以列舉如下例如，葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、山梨糖醇、甜菊糖、甜茶素、玉米糖漿、乳糖、L-抗壞血酸、dl-α -生育酚、 異抗壞血酸鈉、甘油、丙二醇、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、阿拉伯膠、角叉菜膠、酪蛋白、明膠、果膠、瓊脂、維生素C、維生素B群、維生素Ε、煙酰胺、泛酸鈣、氨基酸類、鈣鹽類、表面活性劑、色素、香料、防腐劑等。此外，作為本發明的L0X-1抑制用醫藥品或本發明的動脈硬化預防醫藥品的劑型，只要是可以實現L0X-1抑制作用的劑型即可，并無特殊限定，可列舉如下片劑、液劑、 膠囊劑、飲料劑、含片等。本發明動脈硬化預防醫藥品中的三聚體以上的原花青素的量，只要是足以實現 L0X-1抑制作用的量即可，并無特殊限定。可以考慮原花青素的純化度、劑型、或攝取方法、 攝取對象的性別、年齡、體重、健康狀況等適當確定。為了達到L0X-1抑制效果及動脈硬化預防效果，可以使本發明的L0X-1抑制用醫藥品或動脈硬化預防醫藥品中含有的三聚體以上的原花青素為例如，以干燥重量來計，成年人每日攝取的三聚體以上的原花青素的攝取量為10 3000mg、優選30 lOOOmg。此外， 本發明的LOX-I抑制用醫藥品及動脈硬化預防醫藥品可以1日分為1 數次口服攝取。
實施例下文將示出實施例對本發明作以更為詳細的說，但本發明并不限定于以下的實施例。[制備例1蘋果來源的多酚(AP)的制備]將青森縣產的蘋果幼果300kg粉碎，壓榨得到果汁210kg。向得到的果汁中加入果膠酶使其量為30ppm，進行澄清化，離心分離后，用硅藻土(Silika300S、中央Silika公司制造)進行過濾，進一步澄清化，得到澄清果汁。將澄清果汁通液至填充有吸附樹脂(DIAI0N SP-850、三菱化學公司制造)的柱子中，使多酚類吸附。接著通液純水，除去柱子中的非吸附物質(糖類、有機酸類等)后，使用40%乙醇洗脫多酚類。從得到的多酚級分中將乙醇減壓濃縮，制備提取粉末(AP)約^^。使用反相高效液體色譜分析提取粉末中的成分，結果確認包含氯原酸類(約20重量％ )、根皮素糖苷類(約5重量％ )、黃酮醇類(約15重量％ )、原花青素(約50重量％ )及其他褐變物質(約10重量％ )。進一步地，由基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF/MS、Applied Biosystems公司制造)解析的結果可以確認該原花青素類為黃酮醇類的兒茶素、表兒茶素所構成的二聚體-十五聚體的寡聚物、聚合物(參考 M. Ohnishi-kameyama, et. al. Mass Spectrometry、1997 年、第 11卷、第31 36頁。)以下實施例中使用AP的情況下，將該提取粉末AP混懸于生物化學用試劑級別的二甲基亞砜(DMSO)(和光純藥公司制造)中，并使用超純水適當稀釋，使得反應溶液的DMSO 終濃度為以下。[制備例2聚合度不同的原花青素的制備]基于非專利文獻1中記載的方法(吸附色譜法)，從AP中分離純化各聚合度的原
花青素。首先，將上述制備的粉末狀AP溶解于甲醇中，然后將其上樣于填充有硅膠的柱子 Inertsil PREP-SIL(GL Science公司制造)上，并使用己烷-甲醇-丙酮作為洗脫溶劑進行二元梯度洗脫。由此，首先將原花青素以外的多酚洗脫下來，然后，將原花青素從聚合度小的開始依次洗脫出來。將洗脫下來的二聚體原花青素以后的級分全部回收，將其作為原花青素級分。然后，將該原花青素級分濃縮、冷凍干燥后，再次溶解在甲醇中，同樣地使用吸附色譜進行分離，分別回收各聚合度的原花青素級分。但是，將八聚體以上的原花青素作為 1個級分進行回收。將上述回收的級分濃縮、冷凍干燥以后，使用生物化學用試劑級別的 DMSO(和光純藥公司制造)將其混懸。需要說明的是，在以下的實施例中使用時，使用超純水對該DMSO混懸液進行適當稀釋，使得反應溶液的DMSO終濃度為1 %以下。需要說明的是，本制備例中使用AP，但是，在使用其他植物來源的多酚時，也可以同樣地分別制備各聚合度的原花青素級分。[制備例3ex-hL0X_l的制作]將人 L0X-1 CDNA (Genbank :NM002543)中編碼細胞外域(ex_hL0X_l)的區域 (61 273號的堿基序列)插入表達用載體pSecTag/FRT/V5His (Invitrogen公司制造)， 進一步插入編碼Ig K selection signal的堿基序列，使得在ex-hLOX-lN末端附加上該信號以制作 ex-hLOX-1 表達用質粒。使用 FreeStyle 293 Expression System(Invitrogen 公司制造)將該質粒轉染至細胞，使ex-hLOX-Ι表達。將轉染的細胞培養4天以后，使用Ni-NTA superflow cartride (Qiagen公司制造)從培養液中回收表達的蛋白質 ex-hL0X-l。[制備例4固定了ex-hLOX-Ι的ELISA用板的制作]首先，使用PBS將制備例3制作的ex-hLOX-Ι調節為5 μ g/mL，將得到的蛋白質溶液以50 μ L/孔分別注入384孔EIA Plate (GREINER公司制造、制品編號781061)。將該平板在4°C靜置一晚，使ex-hLOX-Ι固定于孔內。然后，使用PBS清洗各孔3次，接著分別向各孔以80 μ L/孔的量注入含有3% BSA的HEPES緩沖液，進行阻斷處理。然后，再使用PBS將各孔清洗3次，將其作為ELISA用板。需要說明的是，BSA使用Sigma公司的A-7888，HEPES 緩沖液使用GIBCO公司的15630和WAKO公司的191-01665調制為IOmM HEPES, 150mM NaCl， 并將其調節為PH7.0。[制備例5氧化型LDL的制作]首先，將血漿從采集至添加了含有ACD (acid-citrate-dextrose)緩沖液的采血管中的健康人血液中分離回收。向得到的血漿中加入溴化鉀，將比重調節為1.019，然后以 58000rpm離心分離處理20小時。將得到的下層液轉移至其他的管中，用溴化鉀將比重調節
9為1. 063后，以58000rpm離心分離處理20小時。需要說明的是，超速離心機使用Beckman公司制造的 L-80。使用 SliDe-A-Ly ζ er (注冊商標)Dialysis Cassettes IOK MWCO (takara 公司制造)，以PBS作為外液，對回收的上層液進行透析(外液更換4次)，得到純化人LDL。使用BCA Protein Assay Kit (pierce公司制造)測定蛋白質量，向以PBS調節后的純化人LDL濃度為3mg/mL的溶液中添加硫酸銅，使其為7. 5 μ M，然后在37°C的CO2培養箱內培養16小時。接著，以含有2mMEDTA的0. 15M氯化鈉溶液作為外液，對該溶液進行透析(外液更換4次)，得到人氧化型LDL。[制備例6DiI標記氧化型LDL的制備]使用含有2mM EDTA的0. 15M氯化鈉溶液對制備的人氧化型LDL進行稀釋，調節其為lmg/mL。向該人氧化型LDL溶液中分別添加DiI (#D282、Invitrogen公司制造)，使其終濃度為0. ;3mg/mL，添加Lipoprotein Deficient Serum (Sigma公司制造)，使其終濃度為 5mg/mL，使其在37。C反應18小時。需要說明的是，DiI使用懸浮在DMSO中濃度為30 μ g/ mL的溶液。反應后，使用氯化鈉和溴化鉀將比重調節為1. 15，然后以58000rpm離心分離處理 20 小時。使用 Slide-A-Lyzer (注冊商標)Dialysis Cassettes IOK M WC0(takara 公司制造)，以含有2mM EDTA的0. 15M氯化鈉溶液作為外液，對回收的上層液進行透析(外液更換4次)、得到DiI標記氧化型LDL。[制備例7TetOn hLOX-1 CHO細胞的制備]使用四環素調控表達系統(Clontech公司制造)，制備能夠通過添加多西環素實現hLOX-Ι的表達誘導的培養細胞。需要說明的是，作為細胞的培養基，使用分別添加了 Antibiotics-Antimicotics (GIBC0公司制造)且其終濃度為1%、添加了 FBS且其終濃度為 10%的 Ham ‘S F-12+GlutaMAX(GIBC0 公司制造)。首先，制備將人L0X-1 cDNA(Genbank :NM002543)插入表達載體 pTRE2hy g(Contech公司制造)中得到的hLOX-Ι表達用載體。使用Lipofectamin 2000轉染試劑 anvitrogen公司制造)將上述hLOX-Ι表達用載體轉染至CH0-K1 Tet-On細胞(Clontech 公司制造)。向培養基中分別添加潮霉素B (WAK0公司制造)，使其終濃度為400 μ g/mL,添加G418(calbi0chem公司制造)，使其終濃度為100 μ g/mL，由此可以選擇出導入了 hL0X_l 表達用載體的細胞，將其用作iTetOn hLOX-1 CHO細胞。[制備例8抗L0X-1抗體的制備]以Sawamura等的方法(參考NAture、1997年、第386卷、第73 7頁。)為基準制造抗L0X-1抗體。S卩，以5mM EDTA-PBS對表達hL0X_l的CHO細胞進行處理(室溫、5分鐘)后，將其混懸于含有蛋白酶抑制劑的緩沖液〔25mM HEPES (pH 7. 4)、IOmM氯化鎂、0. 25M蔗糖以及蛋白酶抑制劑(10U/mL抑肽酶、2 μ g/mL抑肽素、50 μ g/mL亮肽素、和0. 35mg/mL APMSF)〕中， 使用Potter式勻漿器進行破碎，并進行低速離心分離處理(1500rpm、10分鐘、4°C)。接著， 回收上清液，進行超離心分離處理(100，OOOXgU小時、4°C )，將沉淀的膜級分回收，在磷酸緩沖液中混懸，并保存在-20°C。將上述混懸液用于制作人抗體(免疫源)。用得到的細胞膜級分對正常小鼠進行免疫，制備對hLOX-Ι的小鼠單克隆抗體。單克隆抗體的制備，是按照實驗醫學(增刊)細胞工學手冊(黑木登志夫等編撰、 羊土社發行、p66-74、1992年)及單克隆抗體實驗操作入門(安東民衛等著、講談社發行、1991年)中記載的一般方法制備。需要說明的是，抗L0X-1抗體是以L0X-1作為抗原的特異抗體，是通過抗原抗體反應對L0X-1顯示拮抗作用的物質。[實施例1通過ELISA對L0X-1和原花青素的結合進行評價]通過對&ito等人的方法(Atherosclerosis、2008年、第200卷第2號、第303 309頁參照。)進一步改良而成的方法，對制備例1和2中制備的AP和各聚合度原花青素與L0X-1的結合性進行評價。具體而言，使用在制備例4中制備的ELISA用板和制備例5 中制備的氧化型LDL，在向反應溶液中添加原花青素等的情況下，研究是否抑制了 L0X-1和氧化型LDL的結合。首先，將各樣品以每孔40 μ L的量分別注入至ELISA用板，所述樣品是向上述 ELISA測定用緩沖液中分別添加氧化型LDL且終濃度為250ng/mL，添加各種原花青素(包含AP)且終濃度為12. 5、25、50、100、200、或^Oyg/mL。將該板在室溫下靜置2小時后，用 PBS清洗各孔5次。然后，將用含有1 % BSA和2mM EDTA的HEPES緩沖液稀釋了 500倍的抗人載脂蛋白B抗體AntiHuman Apolipoprotein B PEROX (結合位點PP086)的稀釋液，以每孔50 μ L分別注入各孔，然后在室溫下靜置1小時。靜置后，使用PBS清洗各孔5次，使用TMB Peroxidase EIA substrate kit (BiO-RAD 公司制造、產品編號:68-12-2 (A) 2722-84-1 (B)) 使TMB顯色。向各孔添加2M硫酸使顯色反應停止，然后測定450nm的吸光度。圖1是表示各聚合度的原花青素在450nm處吸光度(0D450)的測定結果的圖。圖中，“Xmer”意指X聚體的原花青素，“彡8mer”意指八聚體以上的原花青素。吸光度越小，與L0X-1結合的氧化型LDL越少，表示L0X-1與氧化型LDL的結合被原花青素或 AP抑制。該結果表明AP抑制了 L0X-1與氧化型LDL的結合，S卩，具有L0X-1抑制作用。此夕卜，在原花青素中也觀察到了上述L0X-1抑制作用，因此，推測AP的L0X-1抑制作用主要是原花青素產生的。特別是，發現三聚體以上的原花青素具有強L0X-1抑制作用。[實施例2L0X-1表達細胞的氧化型LDL的攝入抑制評價]接著，通過表達L0X-1的細胞中攝入氧化型LDL的量，對原花青素以怎樣的程度抑制L0X-1與氧化型LDL的結合進行評價。具體而言、利用使人L0X-1強制過剩表達的CHO細胞(以下稱L0X-1表達細胞)攝取氧化型LDL，觀察AP及原花青素對介由L0X-1的熒光標記氧化型LDL的攝取所產生的影響。需要說明的是，使用制備例7中制備的TetOn hLOX-lCHO 細胞作為L0X-1表達細胞，使用制備例6中制備的DiI標記氧化型LDL作為熒光標記氧化型LDL。此外，AP和原花青素使用制備例1和2中制備的AP以及各聚合度的原花青素。首先，將使用上述培養基調節至IX IO5細胞/mL的L0X-1表達細胞溶液以每孔 IOOyL分別注入96孔板(Costar公司制造、產品編號3603)的各孔中。此外，為了進行 L0X-1的誘導表達，添加多西環素(Calbiochem公司制造)且終濃度為1 μ g/mL。將該96 孔板在CO2培養箱內于37°C下培養M小時，然后，使用FBS(-)培養基清洗各孔。需要說明的是，FBS(-)培養基是僅從上述培養基中除去了 ras的培養基。然后，以IOOyL每孔分別向各孔中注入用FBS(-)培養基調節至0. 3、1、3、或 10 μ g/mL的各種原花青素(包含AP)，然后，在CO2培養箱內于37°C下培養1小時。使用 FBS (-)培養基清洗各孔，然后以IOOyL每孔向各孔中分別注入用FBS(-)培養基調節至 1 μ g/mL的DiI標記氧化型LDL，在(X)2培養箱內于37°C下培養2小時。使用FBS (-)培養基清洗各孔2次，然后向各孔中添加10%中性緩沖福爾馬林液(WAK0公司制造)，進行細胞固定處理，進一步地，添加1 μ g/mL的DAPI溶液(Sigma公司制造)，進行核染色。使用In Cell Analyzer 1000 System(GE healthcare 公司制造)，測定該 96 孔板中各孔的DiI熒光強度及核數。由測定結果，按照下式(1)，求出每個細胞的熒光強度。式(1)每個細胞的熒光強度=[一個孔的DiI熒光強度]/[ 一個孔的核數]進一步地通過下式(2)計算出氧化型LDL攝取率(％ )。需要說明的是，A為未添加各種原花青素(包含AP)的孔的每個細胞的熒光強度，B為未添加DiI標記氧化型LDL的孔的每個細胞的熒光強度，X為未添加各種原花青素(包含AP)和DiI標記氧化型LDL的孔的每個細胞的熒光強度。式(2)氧化型LDL 攝取率(% ) = (X-B)/(A-B) X 100圖2表示的是各聚合度原花青素的計算出的氧化型LDL攝取率(％)的圖。圖中的“Xmer”和“彡8mer”與圖1相同。其結果為氧化型LDL攝取率降低，可以確認與實施例 1的結果相同，AP和二聚體以上的原花青素依賴于濃度地抑制L0X-1和氧化型LDL的結合。 特別是，三聚體以上的原花青素在低于AP的低濃度下達到了較高的L0X-1抑制效果。另一方面，在單體原花青素中未觀察到L0X-1抑制作用。需要說明的是，如本實施例所示，通過使用了 L0X-1表達細胞和熒光標記氧化型 LDL的檢測系統，不同于將是否抑制動脈硬化作為指標的其他動脈硬化抑制劑的篩選方法， 以與各種循環器官疾病惡化相關的L0X-1為焦點，能夠篩選出對L0X-1具有抑制作用的物質。[實施例3其他植物來源的原花青素氧化型LDL的攝取抑制評價]同樣地，對蘋果以外的其他植物來源的原花青素是否具有L0X-1抑制作用也進行了研究。需要說明的是，代替原花青素，使用含有大量原花青素的各種多酚〔AP (制備例1中制備的物質)、葡萄種子來源多酚(ΚΙΚΚ0ΜΑΝ公司制造、商品名=Gravinol)、花生內皮來源的多酚(岸本產業公司制造)、及松樹皮來源多酚(TRADEPIA公司制造)〕作為測定試樣。具體而言，除了使用以FBS(-)培養基調節為10 μ g/mL的各種多酚代替各種原花青素以外，其他按照與實施例2相同的方法進行測定，計算出氧化型LDL攝取率(％)。需要說明的是，以替代各種多酚添加了相同濃度的DMSO溶液而得到的樣品作為空白。圖3是表示空白或添加了各種多酚時的氧化型LDL攝取率(％)的圖。結果發現 在AP中觀察到的對氧化型LDL與L0X-1的結合抑制作用，在其他含有原花青素的素材即松樹皮、葡萄種子、花生內皮來源的多酚中也能觀察到，可確認它們具有L0X-1抑制作用。與AP相同，各種多酚含有大量原花青素，因此，由本實施例的結果可知從各種多酚中分離純化的三聚體以上的原花青素具有和各種多酚一樣的L0X-1抑制作用。[實施例4利用L0X-1表達細胞進行氧化型LDL的結合抑制評價]氧化型LDL向細胞內的攝取，據報道除了介由L0X-1以外，小凹(Caveolae)、網格蛋白(clathrin)也起到一定作用。因此，為了更直接地對L0X-1和氧化型LDL結合的抑制效果進行評價，將細胞置于低溫條件下，在抑制內吞作用的條件下，對原花青素是否抑制 L0X-1和氧化LDL的結合進行評價。首先，將使用上述培養基調節至IX IO5細胞/mL的L0X-1表達細胞溶液以每孔 IOOyL分別注入96孔板(Costar公司制造、產品編號3603)的各孔中。此外，為了實現L0X-1的誘導表達，添加多西環素(Calbiochem公司制造)且使其終濃度為1 μ g/mL。需要說明的是，也制備了不添加多西環素、不誘導表達的孔作為對照。將該96孔板在(X)2培養箱內于37°C下培養M小時，然后，使用冷卻至4°C的上述FBS (-)培養基清洗各孔。將該96孔板在冰上靜置30分鐘，放入冰箱中靜置，然后使用冷卻至4°C的FBS (-) 培養基調節各種原花青素(包含AP)至0.1 μ g/mL，將其以100 μ L每孔分別注入各孔中， 然后在冰上靜置1小時，放入冰箱中靜置。此時，將分別注入了冷卻至4°C的FBS(-)培養基(其中，代替各種原花青素添加了等濃度的DMS0)得到的樣品，作為空白。此外，代替各種原花青素，分別注入用冷卻至4°C的FBS (-)培養基調節至0. 3 μ g/mL的抗L0X-1抗體溶液，將其作為陽性對照。需要說明的是，抗L0X-1抗體使用制備例8中制備的物質。使用冷卻至4°C的FBS (-)培養基清洗各孔，然后以100 μ L每孔向各孔中分別注入用冷卻至4°C的FBS (-)培養基調節至1 μ g/mL的DiI標記氧化型LDL，在冰上靜置1小時， 放入冰箱中靜置。使用冷卻至4°C的FBS(-)培養基清洗各孔2次，然后向各孔中添加冷卻至4°C的10%中性緩沖福爾馬林液(WAK0公司制造)，進行細胞固定處理，回到常溫后，添加 1 μ g/mL的DAPI溶液(Sigma公司制造)，進行核染色。使用In Cell Analyzer 1000 System(GE healthCare 公司制造)測定該 96 孔板中每孔的DiI熒光強度及核數，按照與實施例2相同的方法，求出每個細胞的熒光強度。進一步地，通過下式(3)計算出氧化型LDL結合率(% )。需要說明的是，A、B和 X與上式(2)相同。式(3)氧化型LDL 結合率(% ) = (X-B)/(A-B) XlOO圖4是表示添加了各種原花青素時氧化型LDL結合率(％ )的圖。圖中的“Xmer” 及“彡Smef與圖1相同。此外，“未誘導”是指，未添加多西環素，未進行表達誘導的孔的結果。該結果在未誘導L0X-1表達的孔中，幾乎不結合氧化型LDL。此外，在添加了與L0X-1 結合的抗L0X-1抗體的孔中，氧化型LDL結合率為53%左右，可確認抑制了與氧化型LDL的結合。由上述結果可知，確認本實施例的檢測系統能夠測定各種原花青素對L0X-1與氧化型LDL結合的影響。如圖4所示，確認AP和二聚體以上的原花青素能夠抑制L0X-1和氧化型LDL的結合。特別是，三聚體以上的原花青素達到了比AP更高的L0X-1抑制效果。相比之下，單體原花青素未觀察到L0X-1抑制作用。[實施例5不同結構原花青素對氧化型LDL的結合抑制評價]對不同結構的原花青素對L0X-1抑制作用的效果是否有差異進行了研究。使用反相色譜，將制備例2中制備的三聚體原花青素按其結構進一步分離純化， 使用上述物質，按照與實施例4相同的方法，評價其對氧化型LDL的結合抑制。首先，將制備例2中制備的三聚體原花青素溶解在水中，然后上樣至柱子 Inertsil 0DS-3 (GL Science 公司制造、4 μ m Cp20><250mM )，以 20 % 甲醇作為流動相， 在流速為12. OmL/min、柱子溫度為40°C的條件下進行洗脫。使用UV檢測器測定洗脫液在 280nm下的吸光度，檢測出保留時間為14 M分鐘之間有3個峰，40 55分鐘之間有1 個峰。對各峰的級分進行再純化。首先，將保留時間為14 M分鐘的級分濃縮、冷凍干燥，然后使其再次溶解于水中，上樣至柱子hertsil ODS-3 (GLScience公司制造、4um920x250mM)上，以15%甲醇作為流動相，在流速為12. OmL/min、柱子溫度為40°C 的條件進行洗脫。使用UV檢測器測定洗脫液在^Onm下的吸光度，分別檢測出保留時間為33 37分鐘之間有1個峰(峰1)、40 44分鐘之間有1個峰(峰幻、及48 58分鐘之間有1個峰(峰3)。與其不同，將第1次的反相色譜中保留時間為40 55分鐘之間的級分濃縮、冷凍干燥，然后使其再次溶解于水中，上樣至柱子hertsil ODS-3 (GLScience公司制造、 4μπιφ20χ250π Μ)，以20%甲醇作為流動相，在流速為12. OmL/min、柱子溫度為40°C的條件進行洗脫。使用UV檢測器測定洗脫液在^Onm下的吸光度，檢測出保留時間為40 55分鐘之間有1個峰(峰4)。分別將峰1 4的各級分濃縮、冷凍干燥，然后使用生物化學用試劑級別的 DMSO(和光純藥公司制造)使其混懸后使用。測定氧化型LDL的結合抑制時，使用超純水對其進行適當稀釋，使反應溶液中DMSO的終濃度為以下。對各峰的三聚體原花青素結構進行研究可知為表1的化合物(J. Agric. Food Chem.，2003，vol. 51, p3806_3813)。表中，“印i”意指表兒茶素，“cat”意指兒茶素， "(4β - 8) ”意指在4-8位的碳之間縮合而成的結構。[表1]
峰 1 epi(4g — 8)epi(4g — 8) cat~ 峰 2 epi(4g 6)epi(4g 8) cat~ 峰 3 epi(4g — 6)epi(4g — 8) epi~ 峰 4 epi (4 β — 8) epi (4 β — 8) epi~然后，對上述4種三聚體原花青素對于L0X-1和氧化型LDL結合的抑制效果進行了評價。具體而言，除了使用通過冷卻至4°C的FBS (-)培養基調節至0. 1 μ g/mL的各種三聚體原花青素以外，其他按照實施例4相同的方法進行。圖5為表示空白或添加了 4種不同結構的三聚體原花青素時的氧化型LDL結合率 (%)的圖。圖中的‘‘3mer”和“未誘導”與圖4相同。結果表明“對各結構進行純化了的4 種三聚體原花青素(峰1 4)均顯示出高L0X-1抑制效果。特別是，峰2和3的三聚體原花青素的L0X-1抑制作用比峰1和4的三聚體原花青素的L0X-1抑制作用更強，由此可知 具有縮合部位在黃烷-3-醇的4-6位碳之間的縮合結構的原花青素、末端為表兒茶素的原花青素具有較強的L0X-1抑制作用。需要說明的是，峰1 4中的任一種的L0X-1抑制作用均比分離純化前的三聚體原花青素(圖5中“3mer”)的L0X-1抑制作用更強。認為原因在于在分離純化前的三聚體原花青素中混入了除表1記載的4種三聚體原花青素以外的某些雜質。實際上，在第1 次的反相色譜中，在峰1前、峰3和峰4之間、以及峰4后，無法檢測到明確的峰，但在^Onm 下的吸光度高于基線，由此可知，洗脫下來了某些化合物，認為含有原花青素以外的某些雜質。
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[實施例6利用BIAC0RE測定對L0X-1和原花青素的結合進行評價]使用BIAC0RE，對原花青素和L0X-1的直接結合進行了評價。L0X-1蛋白質使用制備例3中制備的蛋白質ex-hLOX-Ι。另一方面，原花青素使用制備例2中制備的各聚合度的原花青素(1 7倍體)、從實施例5中的三聚體原花青素中分離純化的作為峰3的 θρ (4β — 6)印Η4β — 8) epi (以下將其稱作“三聚體峰3”。)。將L0X-1固定在傳感器芯片上，以原花青素作為液相進行BIAC0RE測定。使用 BIAC0RE2000 (GE Healthcare社)進行BIAC0RE測定及解析。此外，使用傳感器芯片CM5作為傳感器芯片，使用胺偶合法，將蛋白質ex-hLOX-Ι在傳感器芯片上固定化。將HEPES溶液 (IOmM HEPES、150mMNaCl、2mM CaCl2)脫氣后用作電泳緩沖液。對于在芯片中流動的原花青素中的1 7倍體原花青素，使用電泳緩沖液分別將其調節為20 μ Μ，用于測定。另一方面，對于三聚體峰3，同樣地使用電泳緩沖液將其分別調節為20、10、5、2· 5,1. 25 μ M的濃度用于測定。此外，原花青素在傳感器芯片上發生反應時，在20 μ L/min的流速、結合120秒、解離120秒的條件下測定解離常數。另一方面，再生時，以60 μ L/min的流速，流通50mM NaOH 5秒鐘，使原花青素和L0X-1的結合發生解離。各原花青素解離常數的測定結果如表2所示。結果發現單體以外的原花青素與 L0X-1發生結合。此外，聚合度越高，解離常數變小，可知與L0X-1強力地結合。該結果與使用ELISA法、L0X-1表達細胞測定的結果一致。由該結果可知，原花青素類直接與L0X-1結合，抑制了氧化型LDL和L0X-1的結合。
權利要求
1.一種凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品，其以三聚體以上的原花青素作為有效成分。
2.根據權利要求1所述的凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品，其中，所述原花青素來源于選自蘋果、葡萄種子、花生內皮以及松樹皮的植物。
3.一種動脈硬化預防醫藥品，其含有三聚體以上的原花青素作為有效成分，具有凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用。
4.根據權利要求3所述的動脈硬化預防醫藥品，其中，所述原花青素來源于選自蘋果、 葡萄種子、花生內皮以及松樹皮的植物。
5.一種凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品，其以原花青素作為有效成分，所述原花青素具有至少1個縮合部位是在黃烷-3-醇的4-6位碳間發生縮合的結構。
6.一種凝集素樣氧化型LDL受體抑制用醫藥品，其以末端為表兒茶素的原花青素作為有效成分。
全文摘要
本發明鑒定了一種具有優異的凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用的化合物，本發明提供一種凝集素樣氧化型LDL抑制用醫藥品、以及含有三聚體以上的原花青素為有效成分且具有凝集素樣氧化型LDL受體抑制作用的動脈硬化預防醫藥品，所述凝集素樣氧化LDL受體抑制用醫藥品對于治療或預防那些以凝集素樣氧化型LDL受體作為惡化因素發揮作用的疾病、特別是動脈硬化疾病有用，其以三聚體以上的原花青素(Procyanidin)為有效成分，所述原花青素來源于選自蘋果、葡萄種子、花生內皮以及松樹皮的植物。
文檔編號A61P43/00GK102459218SQ20108002766
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月23日 優先權日2009年6月23日
發明者澤村達也, 西塚太一 申請人:獨立行政法人國立循環器病研究中心