干細胞靶向的制作方法

專利名稱：干細胞靶向的制作方法
干細胞靶向
背景技術：
心血管病是心臟和/或血管疾病，是發達國家發病率和死亡率的主要原因。心血管病的主要病因之一是缺血性心臟病(IHD或心肌缺血)，其特征在于心肌接受減少的血液供給，這通常是冠狀動脈疾病(諸如冠狀動脈的動脈粥樣硬化)的結果。減少的向心肌的血液供給可以導致心肌損傷和肌細胞死亡，這又可以導致心力衰竭。心力衰竭也可以由慢性高血壓、病毒感染、心瓣膜異常和遺傳原因以及其它原因造成。根據嚴重性，可以用多種方案治療心力衰竭。在心力衰竭的早期，與藥理學干預 (諸如ACE抑制劑和β-阻斷劑)一起推薦戒煙和體育活動。對于具有更嚴重的征狀的那些，可以采用植入型除顫器或起搏器，且在極端情況下，可以推薦心臟移植(Jessup等人， 2009，ACFF/AHA指南)。盡管目前的治療會減少心肌梗塞(MI)以后的發病率和死亡率，即使根據目前的指南進行治療，這些水平也保持較高。最近，已經開始開發心臟組織工程和細胞移植以再生心肌的方案。許多這樣的方案涉及，經由冠狀動脈內注射或心肌內注射，向心臟遞送干細胞(綜述參見，例如=Fazel等人Ann. Thorac. Surg. 2005 ；79 :S22238_47)。這些細胞(主要源自骨髓)能夠產生多種細胞類型，包括心肌和血管細胞，從而使它們成為促進損傷后心臟再生的有吸引力的工具。盡管動物研究已經證實了使用這些方案的一些效能，迄今為止幾乎沒有觀察到臨床益處。這些方案迄今為止幾乎沒有表現出心臟功能改善，存在許多原因。一個這樣的原因是，干細胞的無效尋靶(ineffective homing)和保留。實際上，許多研究已經證實，當在心臟損傷以后將骨髓細胞注射進心臟中時，這些細胞大部分將停止在其它器官中，包括肺、脾和肝。因而，需要改良的使干細胞靶向受損的肌肉的方法。

發明內容
本發明提供了用于使干細胞靶向包括肌肉在內的組織的組合物和方法。在一個實施方案中，本發明提供了用于使干細胞靶向心臟的組合物和方法。在一個方面，提供了一種構建體，其包含結合干細胞特異性的標志物分子的第一種藥劑，和結合組織特異性的標志物分子的第二種藥劑。在一個實施方案中，所述構建體是抗原-結合構建體。在一個實施方案中，所述第一種藥劑和/或第二種藥劑是抗體，諸如單克隆抗體。在另一個實施方案中，所述第一種藥劑和/或第二種藥劑是表位-結合域，且結合標志物分子上的表位。在一個實施方案中，所述表位-結合域是免疫球蛋白單個可變結構域。所述構建體可以包含其它藥劑或表位結合域，它們結合其它干細胞特異性的標志物分子或在這樣的干細胞特異性的分子上的表位、其它組織特異性的標志物分子或在這樣的組織特異性的標志物分子上的其它表位，或結合其它分子的藥劑或表位結合域。因此，在一個實施方案中，提供了雙靶向構建體，在另一個實施方案中，提供了多靶向構建體。在一個實施方案中，所述干細胞特異性的標志物分子和/或所述組織特異性的分子是人分子。干細胞特異性的標志物分子是本領域技術人員所熟知的，包括，例如，⑶34、⑶44、CD45、CD133 和 CD117(c_Kit)。因此，在一個實施方案中，所述干細胞特異性的標志物分子是c-Kit。在一個實施方案中，所述結合c-Kit的藥劑是抗體，諸如單克隆抗體。在另一個實施方案中，所述結合 c-Kit的藥劑是根據本發明任意方面的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，諸如本文所述的那些。因此，在一個實施方案中，提供了一種構建體，其包含本文所述的c-Kit dAb和結合組織特異性的標志物分子的藥劑。在一個實施方案中，所述組織特異性的標志物分子是肌肉特異性的標志物分子。在一個實施方案中，所述肌肉特異性的分子選自肌球蛋白衍生的分子，諸如肌球蛋白輕鏈(MLC)或肌球蛋白重鏈，包括但不限于人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl (v-MLCl、 vMLC-1)；也稱作cMLC或MLC 3)、MLC 2或肌球蛋白重鏈6 (肌球蛋白重鏈、心肌α同種型)。在一個實施方案中，所述肌肉特異性的標志物分子是心肌特異性的標志物分子。在一個實施方案中，所述“心肌-特異性的分子”是這樣的分子其僅在受損的心肌中表達或暴露，且在健康的未受損的心肌中不表達或暴露。在缺血性損傷(諸如心肌梗塞)以后，發生肌細胞損傷和壞死，導致細胞的破裂和細胞內結構蛋白或心臟結構蛋白暴露于環境中。 vMLCl(也稱作MLC 3)是這樣的分子的一個實例。其它心肌特異性的分子包括心臟肌鈣蛋白I或心臟肌鈣蛋白諸如心臟肌鈣蛋白T、在心肌損傷部位被向上調節的膜聯蛋白和分子 (諸如生腱蛋白C和肌酸激酶)。在一個實施方案中，所述結合肌肉特異性的標志物分子的藥劑是抗-MLC抗體。在一個實施方案中，所述抗-MLC抗體對人心臟肌球蛋白輕鏈具有高親和力。在一個實施方案中，所述抗-MLC抗體是單克隆抗體。抗-MLC抗體包括結合人心室肌球蛋白輕鏈1的抗體， 且在例如US 5，702，905中被描述為單克隆抗體39-15(可從ATCC HB 11709得到，或在商業上得到,例如MLM508 (Abeam))。在一個實施方案中，在根據本發明一個方面的構建體中的抗-MLC抗體是本文所述的和根據本發明任意方面的人源化的抗-MLC抗體。在另一個實施方案中，所述抗-MLC抗體是抗-MLC免疫球蛋白單個可變結構域抗體。本文描述了用于制備特異性的單個可變結構域抗體的方法。在一個實施方案中，本發明提供了一種構建體，其包含抗-MLC免疫球蛋白單個可變結構域和抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。這樣的構建體可以是“dAb-dAb”構建體。在另一個實施方案中，與結合c-Kit的藥劑結合c-kit的親和力相比，所述結合肌肉特異性的標志物分子的藥劑以更高的親和力進行結合。在一個實施方案中，本發明提供了一種構建體，其包含本文所述的抗-MLC單克隆抗體和抗-c-Kit單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發明提供了一種構建體，其包含與免疫球蛋白單個可變結構域(dAb)結合的單克隆抗體(MAb)。這樣的構建體被稱作“MAbdAb”(或“mAbdAb”、 “mAb-dAb”)。在一個實施方案中，根據本發明的構建體包含結合肌肉特異性的標志物分子的藥劑，諸如單克隆抗-MLC抗體和抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。在另一個實施方案中，本發明提供了一種構建體，其包含單克隆抗-c-Kit抗體和抗-MLC免疫球蛋白單個可變結構域。可以有利地使用包含dAb的構建體，因為mAb-dAb構建體可以表達為單個分子。另外，使用dAb可以允許與受體的單價相互作用，從而減少受體活化的可能性。在一個實施方案中，根據本發明的構建體選自在表對中所述的任意構建體。在另一個實施方案中，所述構建體包含dAb，它是來自D0iC8h-94譜系的dAb。在一個實施方案中，所述第一種藥劑和/或所述第二種藥劑與來自另一個物種的干細胞特異性的標志物分子或肌肉特異性的標志物分子交叉反應，所述另一個物種例如小鼠、大鼠、狗、豬和非人靈長類動物物種。在一個實施方案中，所述結合干細胞特異性的標志物分子的第一種藥劑和所述結合肌肉特異性的標志物分子的第二種藥劑連接到一起。合適的連接物包括化學連接劑諸如 SulfoSMCC和從諸如Pierce等生產商可得到的其它連接物。其它合適的連接物是本領域技術人員所熟知的。合適的連接物的其它實例包括這樣的氨基酸序列其長度可以是1個氨基酸至約 150個氨基酸，或1個氨基酸至約140個氨基酸，例如，1個氨基酸至約130個氨基酸，或1 至約120個氨基酸，或1至約80個氨基酸，或1至約50個氨基酸，或1至約20個氨基酸， 或1至約10個氨基酸，或約5至約18個氨基酸。這樣的序列可以具有它們自己的三級結構，例如，本發明的連接物可以包含單個可變結構域。在一個實施方案中，連接物的大小等于單個可變結構域。合適的連接物的大小可以是約1至約20埃，例如小于約15埃、或小于約10埃、或小于約5埃。在本發明的一個實施方案中，使用連接物，將至少一個表位結合域直接連接至Ig支架上，所述連接物包含1至約150個氨基酸，例如1至約20個氨基酸，例如1 至約10個氨基酸。這樣的連接物可以選自下述的任一種G4S連接物(GGGGS;SEQ ID NO 88) ；TVAAPS(SEQ ID NO 89) ；ASTKGPT(SEQ ID NO 90) ；ASTKGPS (SEQ ID NO 91)； EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO 92) ；ELQLEESCAEAQDGELDG(SEQ ID NO :93)，“AST”(SEQ ID NO 94), STGGGGGS(SEQ ID NO 95), STGGGGGSGGGGS(SEQ ID NO :96)，STGPPPPPS(SEQ ID NO 97), STGPPPPPPPPPPS (SEQ ID N0:98)，‘STG，(絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸；SEQ ID NO: 99)、‘GSTG，(SEQ ID NO :100)或 ‘RS，(SEQ ID NO :101)。在一個實施方案中，所述連接物選自STG、GGGGS和PPPPPS(SEQ ID NO :483)。在一個實施方案中，所述連接物可以是這樣的連接物其由于空間限制，減少dAb和Fc結構域之間的相互作用的潛力，從而增加Fc區域參與它的正常相互作用的機會。在該實施方案中，所述連接物可以是來自諸如人糖蛋白 VI (GPVI)等蛋白的莖區域，例如STGSRDPYLWSAPSDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTS PKESDSPAGPARQYYTKGNGSTG(SEQ ID NO :484)。在本發明的抗原結合構建體中使用的連接物可以包含單獨的或與其它連接物組合的一個或更多個GS殘基集合，例如‘GSTVAAPS’ (SEQ ID NO 102)或 ‘TVAAPSGS，(SEQ ID NO :103)或 ‘GSTVAAPSGS，(SEQ ID NO :104)。在另一個實施方案中，在表位結合域(例如dAb和Ig支架)之間沒有連接物。在另一個實施方案中，表位結合域(例如dAb)通過連接物‘TVAAPS’ (SEQ ID NO 89)連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，表位結合域(例如dAb)通過連接物‘TVAAPSGS’ (SEQ ID NO :103)連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，表位結合域(例如dAb)通過連接物‘GS’ (SEQ ID NO 105)連接至Ig支架上。本文描述了適用于制備根據本發明的MAbdAb構建體的方法。dAb連接至Mab上的不同位置，形成本發明該方面的實施方案。在圖15中，例證了這樣的dAb連接位置，且也包括dAb與MAb的可變結構域的連接。在另一個實施方案中，通過在例如EP 1864998中描述的Fc區域或重鏈恒定區，可以連接包含dAb-dAb的構建體。在一個實施方案中，一種構建體(其中靶向抗體之一是連接至Fc結構域上的單克隆抗體或dAb)具有足以減小構建體從血液中的清除速率的尺寸，即提供延長的半衰期(與單獨的dAb相比)。延長半衰期的其它方法和測定半衰期的方法，描述在例如WO 2008096158中。這樣的方法包括產生蛋白酶抗性，連接到血清蛋白(諸如血清白蛋白 AlbudAbs )上，等等。在一個實施方案中，所述構建體包含滅活的Fc或替代性的IgG同種型，其不會誘導 ADCC。在另一個方面，提供了一種核苷酸序列，其編碼根據本發明第一個方面的構建體。在本發明的另一個方面，提供了結合肌球蛋白輕鏈(MLC)的抗原結合蛋白。在一個實施方案中，所述結合MLC的抗原結合蛋白是這樣的抗原結合蛋白，其結合MLC的心臟同種型，例如心室MLC(vMLC、vMLC-l、MLC-3)或人心室MLC(HVMLC)。因此，在一個實施方案中， 所述抗原結合蛋白結合人心室肌球蛋白輕鏈1 (vMLCl)。在一個實施方案中，根據本發明該方面的抗原結合蛋白是與小鼠單克隆抗體 39-15 (ATCC HB11709)有關的、結合vMLCl的抗體。因此，在一個實施方案中，本發明提供了這樣的抗原結合蛋白其結合vMLCl，且其包含如SEQ ID N0:13或SEQ ID N0:17所述的 39-15的重鏈或輕鏈⑶R3序列，或其含有1、2或3個在⑶R3中的氨基酸置換的變體。在一個實施方案中，任意這樣的變體也結合vMLCl。在一個實施方案中，根據本發明的抗原結合蛋白包含下述的⑶R ⑶RHl (SEQ ID NO :18)CDRH2(SEQ ID NO :19)、CDRH3 (SEQ ID NO :20)、CDRLl (SEQ ID NO :14)、CDRL2 (SEQ ID NO :15)、CDRL3(SEQ ID NO :16)。在另一個實施方案中，所述抗原結合蛋白結合人vMLCl和另一種源自不同物種的 MLC1，所述不同物種諸如小鼠、狗或食蟹猴(cyno)。在一個實施方案中，根據本發明的抗原結合蛋白結合小鼠和人vMLCl。在本發明的上下文中，在來自人和其它物種的vMLCl之間的這種交叉反應性允許同一種抗體構建體用于動物疾病模型以及人類。在一個實施方案中，所述抗原結合蛋白是抗體，諸如人源化的或嵌合的抗體。在一個實施方案中，本發明的MLC抗原結合蛋白包括39-15的非-鼠等效物，諸如本文所述的人源化形式。在一個實施方案中，根據本發明的抗原結合蛋白包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、 diabody> triabody> tetrabody>itMi)l# (miniantibody)、^白勺 VH、^>|^白勺 VK dAb。在一個實施方案中，重鏈可變區可以與輕鏈可變區格式化(formatted)在一起， 以允許以常規免疫球蛋白方式(例如人IgG、IgA、IgM等)結合MLC，或以任意其它“抗體-樣”形式結合人MLC (例如單鏈FV、diabody Jandabs等(關于替代性的“抗體”形式的總結，參見 Holliger 和 Hudson，Nature Biotechnology, 2005, Vol. 23，No. 9，1126-1136)。在一個實施方案中，根據本發明的抗原結合蛋白包含選自SEQ ID剛22、25、觀或 31 WVh結構域，其與輕鏈可變區配對，形成結合MLC的抗原結合單位。在另一個實施方案中，根據本發明的抗原結合蛋白包含選自SEQ ID N0:34或37的Vk結構域，其與重鏈可變
11區配對，形成結合MLC的抗原結合單位。本文例證了其它合適的配對。在另一個實施方案中，提供了這樣的抗原結合蛋白其包含選自SEQ ID而22、25、觀或31的￥11結構域，和選自SEQ ID N0:34或37的Vk結構域。在一個實施方案中，所述重鏈具有SEQ ID NO :31所述的序列，且所述輕鏈具有SEQ ID N0:37所述的序列。在其它實施方案中，提供了本文所述的任意\結構域或Vk結構域與任意輕鏈或重鏈可變區的組合。在一個實施方案中，所述\結構域或Vk結構域是圖5所述的任意序列。在一個實施方案中，根據本發明的抗原結合蛋白會以高親和力結合人MLC，例如 MLC的人心臟同種型，諸如HVMLC和HVMLC-1，通過Biacore測得，所述親和力是在約0. IpM 至約ΙΟΟηΜ、例如約0. IpM至約IOOpM范圍內。在另一個方面，提供了一種核酸分子，其編碼根據本發明的抗原結合蛋白或抗體。 還提供了用這樣的核酸分子轉化或轉染的宿主細胞。在另一個方面，提供了第一種載體和第二種載體，其中所述第一種載體包含編碼根據本發明的抗原結合蛋白或抗體的重鏈的核酸分子，所述所述第二種載體包含編碼根據本發明的抗原或抗體的輕鏈的核酸分子。在另一個方面，本發明提供了抗-C-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。在一個實施方案中，根據第一個方面的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域是以在下述范圍內的解離常數(Kd、KD、Kd)結合c-Kit的可變結構域約IOpM至約10微摩爾，例如約IOOpM至約 10微摩爾、約IOnM至約1微摩爾、或約InM至約ΙΟΟηΜ。在另一個方面，本發明提供了一種分離的多肽，其包含抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。在一個實施方案中，所述分離的多肽包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的至少一個氨基酸序列具有至少約70%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384、383-384 或 476 中的任一個所述的序列，且所述分離的多肽結合c-Kit。在另一個實施方案中，所述分離的多肽包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與 SEQ ID NO :148-163,247-269,283-295. 301-305,477-482 中的任一個所述的至少一個氨基酸序列具有至少70%同一性，且所述分離的多肽結合c-Kit。在一個實施方案中，所述分離的多肽包含與D0iC8h-94譜系氨基酸序列具有至少70%同一性的氨基酸序列。適當地，分離的多肽包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與SEQ ID NO 302-305、457、458或482中的任一個所述的至少一個氨基酸序列具有至少70%同一性。在一個方面，本發明提供了一種分離的多肽，其包含由具有SEQ ID NO =39-87, 224-246,270-282,297-300,383-384,383-384或476中的任一個所述序列的核酸編碼的氨基酸序列。在另一個方面，本發明提供了一種分離的多肽，其由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列與選自下述的核苷酸序列具有至少約60%同一性在圖6、16、17或20中所述的任一個核酸序列(SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384、383-384 或 476)，且所述分離的多肽結合c-Kit。在一個實施方案中，根據本發明任意方面的分離的多肽會結合人c-Kit。在另一個實施方案中，所述多肽會結合人c-Kit和來自另一個物種(諸如小鼠、 狗或食蟹猴)的c-Kit。在一個實施方案中，所述多肽會結合人和小鼠c-Kit。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列具有至少約90%同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282,297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。在一個實施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476所述的任意核酸序列編碼。在一個實施方案中，所述抗_c_Kit免疫球蛋白單個可變結構域包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與由鑒別為D0iC8h-5(SEQ ID NO 39)、D0M28h-43 (SEQ ID NO :51)、D0M28h_33 (SEQ ID NO :49)、D0M28h_94 (SEQ ID NO 65)、D0M28h-66 (SEQ ID NO :58)、D0M28h_110 (SEQ ID NO :70)、D0M28h_84 (SEQ ID NO 62)、D0M28m-23 (SEQ ID NO :81)、D0M28m_7 (SEQ ID NO :78)、D0M28m_52 (SEQ ID NO 84)、D0M28h-79 (SEQ ID NO :61)、D0M28h_7 (SEQ ID NO :41)、D0M28h_20 (SEQ ID NO :45)、 D0M28h-26 (SEQ ID NO :48)、D0M28h_78 (SEQ ID NO :60)、D0M28h_73 (SEQ ID NO :59)、 D0M28h-54 (SEQ ID NO :55)、D0M28h_113 (SEQ ID NO :72)、D0M28h_115 (SEQ ID NO :73)禾口 D0M28m-73 (SEQ ID NO :86)的任一個核酸序列編碼的氨基酸序列相同。在一個實施方案中， 根據本發明任意方面的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域會結合人c-Kit。在另一個實施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域會結合人c-Kit和來自另一個物種的c-Kit，所述另一個物種例如小鼠、狗或猴諸如食蟹猴(cyno)。在一個實施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域會結合人和小鼠c-Kit。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個所述的序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297_300、 383-384或476中的任一個所述的序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDR3序列所述CDR3序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個所述的序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個所述的序列，且包含這樣的⑶R2序列所述⑶R2序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個所述的序列，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個所述的序列，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過約25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDRl序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87中的任一個所述的序列，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR2序列具有至少約 50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297_300、 383-384或476中的任一個所述的序列，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列具有至少約50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的⑶R3 序列所述⑶R3序列與選自下述的⑶R3序列具有至少約50%同一性在由具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含選自下述的 CDR3 序列在由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383_384 或 476 中的任一個所述的序列的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列。在另一個方面，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含至少一個選自 CDR1、CDR2 和 CDR3 的 CDR，其中所述 CDRU CDR2 或 CDR3 與在由具有 SEQ ID NO 39-87、 224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的⑶R1、⑶R2或⑶R3序列相同。在一個實施方案中，根據本發明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域包含至少一個選自圖7所述CDR序列的CDR。在一個方面，提供了一種核酸分子，其包含根據本發明的編碼抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域的核酸序列。在一個實施方案中，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300,383-384或476中的任一個所述的核酸序列。在另一個方面，提供了一種配體，其具有對c-Kit的結合特異性，并抑制抗-c-Kit 免疫球蛋白單個可變結構域的結合，所述單個可變結構域包含由下述的核酸編碼的氨基酸序列，所述核酸具有 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。c-Kit的結構以及通過干細胞因子(SCF)結合的信號傳遞，描述在例如， Ronnstrand ；Cellular and Molecular Life Sciences,61 (2004),2535-2548 禾口 Yuzawa等人Cell 13(K2007)，323-334。干細胞因子會結合c_Kit的胞外結構域，導致酪氨酸激酶活化。在一個實施方案中，根據本發明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域會以基本上不抑制SCF的c-Kit受體結合和/或活化的方式，結合c-Kit。在另一個實施方案中，根據本發明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域會以基本上抑制SCF的c-Kit受體結合和/或活化的方式，結合c-Kit。在一個實施方案中，可以在本文所述的競爭性結合試驗中，測定SCF與c-Kit的結合的抑制。用于測定c-Kit活化的其它試驗是本領域技術人員所熟知的，且包括測量下游信號傳遞組分的試驗，例如如上面提及的Rormstrand所述。其它合適的試驗包括磷酸化試驗，諸如由MSD提供的試驗，目錄號K11119D-2。在一個實施方案中，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其結合c-Kit， 且對于SCF結合而言不是競爭性的。在該實施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域可以選自這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由D0iC8h-5(SEQ ID NO :39)、 D0M28h-33 (SEQ ID NO :49)、D0M28h_43 (SEQ ID NO :51)、D0M28h_66 (SEQ ID NO :58)、 D0M28h-84 (SEQ ID NO :62)、D0M28h_94 (SEQ ID NO :65)、D0M28h_110 (SEQ ID NO :70)、 D0M28m-7 (SEQ ID NO 78), D0M28m-23 (SEQ ID NO :81) ^P D0M28m-52 (SEQ ID NO :84)中的任一個所述的核酸序列編碼。本文例證了其它合適的非競爭性的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。在另一個實施方案中，提供了抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其結合 c-Kit，且對于SCF結合而言是競爭性的。在該實施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域可以選自這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由D0iC8h-7 (SEQ ID NO 41)、D0M28h-20(SEQ ID NO :45)、D0M28h_26 (SEQ ID NO :48)、D0M28h_54 (SEQ ID NO :55)、 D0M28h-73 (SEQ ID NO :59)、D0M28h_78 (SEQ ID NO :60)和D0M28h_79 (SEQ ID NO :61)中的任一個所述的核酸序列編碼。本文例證了其它合適的競爭性的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。在一個實施方案中，本發明的單個可變結構域表現出人c-Kit與來自另一個物種 (諸如小鼠、狗或食蟹猴)的c-Kit之間的交叉反應性。在一個實施方案中，本發明的單個可變結構域表現出人和小鼠c-Kit之間的交叉反應性。在該實施方案中，所述可變結構域特異性地結合人和小鼠c-Kit。在一個實施方案中，對人和小鼠c-Kit交叉反應性的可變結構域選自這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由D0iC8h-5(SEQ ID NO 39) ,D0M28h-94(SEQ ID NO :65)、D0M28m-7(SEQ ID NO :78)、D0M28m_23 (SEQ ID NO :81)和 D0M28m_52 (SEQ ID NO 84)中的任一個所述的核酸序列編碼。本文例證了其它交叉反應性的可變結構域。如上所述，交叉反應性是特別有用的，因為藥物開發通常需要在動物系統(諸如小鼠模型)中測試先導藥物候選物，然后才能在人類中測試該藥物。可以結合人蛋白以及物種同源物(諸如等效的小鼠蛋白)的藥物的提供，允許測試在這些系統中的結果，并使用相同的藥物，進行數據的并行對比。這會避免需要發現對例如小鼠c-Kit起作用的藥物和對人c-Kit起作用的單獨藥物的復雜性，并避免了對使用非相同藥物或替代藥物對比在人和小鼠中的結果的需要。任選地，免疫球蛋白單個可變結構域對至少小鼠c-Kit的結合親和力和對人 c-Kit的結合親和力相差不超過約5、約10、約50或約100的倍數。在本發明的另一個方面，提供了一種用于生產根據本發明的抗原結合構建體(例如，雙特異性的配體、多特異性的配體)、抗-MLC抗體或抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體的方法，所述方法包括在適合表達重組核酸的條件下，維持包含本發明的重組核酸的重組宿主細胞，由此表達重組核酸，并生產配體。在有些實施方案中，所述方法另外包括分離所述配體。關于適用于本發明實施方案的公開內容的細節，參照W0200708515第161頁第M 行至第189頁第10行。其公開內容特此通過引用并入本文，如同它明確地出現在本公開內容的文本中，并涉及本發明的實施方案，并明確地支持公開內容并入下面的權利要求中。這包括在W0200708515第161頁第M行至第189頁第10行中呈現的公開內容，其提供了“基于免疫球蛋白的配體的制備”、“文庫載體系統”、“文庫構建”、“組合單個可變結構域”、“配體的表征”、“配體的結構”、“骨架”、“蛋白支架”、“用于構建配體的支架”、“規范序列的多樣化” 和“治療性和診斷性組合物和應用”的細節、以及“可操作地連接”、“首次用于實驗的”、“預防”、“抑制”、“治療”、“變態反應性疾病”、“Th2-介導的疾病”、“治療有效劑量”和“有效”的定義。在一個方面，提供了根據本發明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體，其用于靶向c-Kit，用于治療與c-Kit受體活化有關的疾病或障礙。在一個實施方案中，所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域是這樣的可變結構域其在競爭性結合試驗中與SCF競爭，從而抑制SCF對c-Kit的活化。本文公開了合適的競爭性的dAb。與c-Kit活性有關的疾病或障礙包括肥大細胞障礙和癌癥。具體地，已經提示， c-Kit活性涉入腫瘤血管生成。因此，靶向c-Kit可以允許在抗癌治療中抑制腫瘤血管生成。另外，已經在許多癌癥中鑒別出了 c-Kit和SCF自分泌環(其中腫瘤表達c-Kit 和SCF)，所述癌癥包括小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、婦科腫瘤和神經母細胞瘤(參見 Ronnstrand ；Cellular and Molecular Life Sciences,61(2004),2535-2548)。在另一個方面，提供了一種藥物組合物，其包含根據本發明的免疫球蛋白單個可變結構域多肽或配體。在一個實施方案中，根據本發明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體可以連接到裝置(諸如支架)上。在例如WO 03/065881中，描述了合適的這樣的裝置。 在一個實施方案中，根據本發明的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體可以
16連接到支架的表面上，使得它可用于干細胞尋靶。在一個實施方案中，在該實施方案中，所述c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域是非競爭性地結合c-Kit的單個可變結構域，即對于 C-Kit的SCF活化而言是非競爭性的。在另一個方面，提供了用于使干細胞靶向靶組織的根據本發明的抗原-結合構建體。在一個實施方案中，所述靶組織會表達組織特異性的標志物分子。在一個實施方案中， 所述抗原-結合構建體是用于將干細胞募集至靶組織，以便再生靶組織。因此，本發明的構建體是用于治療患病的靶組織。在一個實施方案中，根據本發明的構建體是用于治療肌肉病。在一個實施方案中，提供了用于治療心臟病的根據本發明的抗原-結合構建體。在另一個方面，提供了一種藥物組合物，其包含根據本發明的抗原-結合構建體。 在一個實施方案中，細胞因子療法可以用于動員骨髓干細胞和祖細胞。細胞因子療法描述在例如，Kang 等人 Lancet (2004)，363 ；751-6。合適的細胞因子包括 SCF、G-CSF, SDF-U AMD3100 (商品名=Mozobil)、VEGF, FGF 和 DPP-IV 抑制劑。在另一個方面，提供了一種治療心臟病的方法，所述方法包括施用根據本發明的抗原-結合構建體。在一個實施方案中，所述方法另外包括施用細胞因子，在一個實施方案中，所述細胞因子選自SCF、G-CSF, SDF-I、AMD3100、VEGF, FGF和DPP-IV抑制劑。在另一個實施方案中，可以從要治療的患者提取骨髓細胞。在一個實施方案中， 可以從患者的胸骨或髂嵴提取骨髓細胞，或者可以從血液分離出細胞。未分級的骨髓細胞可以用于隨后的全身/局部遞送，或者可以使用細胞分選技術(例如，FACS或磁珠免疫選擇)，分離出特定的細胞群體。也可以在體外培養細胞，然后注射回患者，以促進多種機制， 例如，通過用有絲分裂劑處理來增加細胞數目，用諸如VEGF等因子和他汀類藥物增強細胞功能，以增加存活、分化或生成血管能力。也可以遺傳地工程化細胞，以調節例如存活因子或促再生因子的基因表達。使用磁性細胞分選技術(例如，參見Losordo等人Circulation 2007 Jun 26 ；115(25) :3165-72)，基于對細胞表面標志物的選擇，可以純化細胞。可以在體外制備細胞群集，諸如心臟球狀體(cardiospheres)(描述在，例如，Barile等人，Nature Clinical Practice，2007年2月，第4卷，增刊1)。根據本發明使用的其它細胞包括成血管細胞、間質干細胞、造血干細胞或內皮祖細胞。因此，在一個實施方案中，提供了一種用于治療心臟病的方法，所述方法包括從患者提取骨髓細胞，在體外處理所述細胞，并使所述細胞返回患者，然后施用構建體。使用靜脈內施用，或者，例如，通過經由導管的心肌內施用或冠狀動脈內遞送，可以將細胞施用給患者。在一個實施方案中，可以在外科手術過程中，局部地施用細胞。在一個實施方案中，根據本發明的構建體會將干細胞募集至靶組織，諸如肌肉。在一個實施方案中，所述構建體會將干細胞募集至心肌。在一個實施方案中，募集C-Kit+細胞。在一個實施方案中，所述干細胞是可以產生成肌細胞或肌細胞的細胞，使得肌肉可以被修復。在一個實施方案中，所述干細胞可以產生血管細胞(包括內皮細胞和平滑肌細胞)，其將修復受損的脈管系統，其本質上會促進肌肉的存活和從干細胞分化肌細胞。在一個實施方案中，所述干細胞會修復心肌。具體地，本發明的分子所靶向的干細胞是可以分化成心肌細胞、血管內皮細胞或平滑肌細胞的細胞。在另一個實施方案中，所述干細胞可以產生成肌細胞或肌細胞，使得骨骼肌的損傷可以得到修復。因而，在一個實施方案中，干細胞是成年干細胞諸如造血干細胞、間質干細胞、心臟干細胞、內皮祖細胞、誘導的多能干細胞(iPS)。在另一個實施方案中，干細胞是胚胎干細胞。除了干細胞的分化成心血管細胞類型的作用以外，這些干細胞還具有以旁分泌方式起作用的能力，分泌出生長因子、細胞因子和其它分子，它們可以作用于損傷部位，以促進細胞存活、細胞修復、組織再生、血管生成和心肌再生。在一個實施方案中，所述干細胞是造血干細胞。用于本發明中的干細胞可以源自患者自身(即自體的)，或者可以是同種異基因的(即源自別人)。在一個實施方案中， 所述干細胞是CD34+細胞。在另一個實施方案中，所述干細胞可以是任意哺乳動物干細胞， 包括，例如，來自靈長類動物(諸如人)的干細胞，或來自嚙齒動物、貓、豬、綿羊、狗、牛或馬的干細胞。在另一個實施方案中，可以遺傳地修飾干細胞，使得它們包括用于基因療法的轉導基因。另一個實施方案提供了一種用于治療肌肉病或心臟病的方法，所述方法另外包括施用化合物來增強干細胞存活、分化或增殖。合適的化合物包括VEGF、FGF、他汀類藥物、SDF-I、CXCR4(描述在例如 Tan 等人，Cardiovascular Res.(于 2009 年 2 月 24 日公開的提前訪問版(Advance Access) ；doi :doi :10. 1093/cvr/cvp044))或 SDF-1 β P2G。這樣的化合物會提高這些細胞的促進心臟再生的能力，并防止心肌損傷以后觀察到的長期損傷，綜述參見，例如，Ballard 和 Edelberg，Circulation Research 2007,100(8) :1116_27。


圖1顯示了人和小鼠vMLCl-(6xHIS標簽)的氨基酸和核酸序列。圖2顯示了人、小鼠、狗和食蟹猴c-Kit E⑶-hlgGl Fc融合體的氨基酸序列 (c-Kit E⑶(胞外結構域)顯示為粗體)。圖3顯示了人和小鼠SCF_6xHIS標簽的氨基酸。圖4顯示了抗-MLC抗體小鼠κ鏈(V κ基因顯示為粗體；⑶R序列標有下劃線) 和抗-MLC抗體小鼠IgGl重鏈(Vh基因顯示為粗體；⑶R序列標有下劃線)。圖5顯示了人源化的39_15mAb V基因(⑶R序列標有下劃線)。圖6顯示了結合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖7顯示了從選擇的dAb的對應氨基酸序列預測的⑶R序列。使用Kabat編號， CDR 測定如下(VH-CDR1 (30-35)、VH-CDR2 (50-56)、VH-CDR3 (94-102)、VK-CDRl (26-34)、 VK-CDR2(49-56)、VK-CDR3(89-97)。圖8顯示了非競爭性地結合人c-Kit的dAb的BIAcore結合跡線。在固定化在抗生蛋白鏈菌素芯片上的生物素化的人c-Kit (His-標記的)上，評估dAb結合。跡線允許視覺地對比dAb的相對解離速率和結合速率，使用動力學模型來擬合曲線，允許計算dAb的親和常數。圖9和10顯示了競爭性受體結合試驗(RBA)的結果。在該試驗中，評估dAb，以確定它們是否可以抑制人c-Kit和人干細胞因子(SCF)之間的相互作用。與SCF競爭的那些dAb會抑制相互作用，隨著dAb濃度增加而減小信號，而與SCF不競爭的那些dAb沒有影響，因此隨著dAb濃度增加，信號保持恒定。圖Ila和lib顯示了通過流式細胞術證實的非競爭性的dAb與KU812細胞的結合。該試驗測定dAb是否可以特異性地結合在細胞表面上展示的c-Kit，其中觀察與KU812 細胞系的結合，所述KU812細胞系已經被證實是c-Kit+ve的。在圖Ila中顯示了 2點曲線 (2pt curve) (100_500nM)，在圖 lib 中顯示了 2 點曲線(80_400nM)。圖1 和12b顯示了通過流式細胞術證實的非競爭性的dAb與Jurkat細胞的結合。該試驗測定dAb是否可以特異性地或非特異性地結合細胞，其中觀察與Jurkat細胞系的結合，所述Jurkat細胞系已經被證實是c-Kit-ve的。在圖12a中顯示了 2點曲線 (100-500nM)，在圖 12b 中顯示了 2 點曲線(80_400nM)。圖13顯示了通過流式細胞術證實的競爭性的dAb與KU812的結合。該試驗測定 dAb是否可以特異性地結合在細胞表面上展示的c-Kit，其中觀察與KU812細胞系的結合， 所述KU812細胞系已經被證實是c-Kit+ve的。顯示了 3點曲線^)0nM-2uM_10uM)。圖14顯示了通過流式細胞術證實的競爭性的dAb與Jurkat細胞的結合。該試驗測定dAb是否可以特異性地或非特異性地結合細胞，其中觀察與Jurkat細胞系的結合，所述Jurkat細胞系已經被證實是c-Kit-ve的。顯示了 3點曲線G00nM-2uM_10uM)。圖15顯示了通過流式細胞術證實的dAb集合與c-Kit+ve門控的小鼠骨髓細胞的結合。該試驗測定dAb是否可以結合鼠骨髓細胞，所述鼠骨髓細胞已經在是cKIT+ve的基礎上進行篩分。顯示了 2點曲線(5uM-10uM)。圖16顯示了結合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖17顯示了結合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖18顯示了在細胞中有活性且與mAbdAb相容的13種dAb的BIAcore結果。圖19顯示了通過序列-結構對比得出的表位作圖。圖20顯示了結合c-Kit的dAb的核酸和氨基酸序列。圖21顯示的示意解了不同的抗體形式。圖22顯示的示意解了 mAbdAb重鏈(上圖)或mAbdAb輕鏈(下圖)的構建。圖23顯示了在實施例5中所述的mAb-dAb的示意圖。圖M顯示的示意解了假的mAb-cKIT dAb mAb-dAb的克隆。圖25顯示了在實施例5中所述的構建體的核酸和氨基酸序列。圖沈顯示了 c-Kit dAb的表位分析。圖27顯示了典型的BIAcore表位作圖實驗的BIAcore實施例，其中商業抗體2B8 禾口 4552(D0iC8m-107，在假的框架Mab中)的表位沒有重疊。圖28顯示了典型的BIAcore表位作圖實驗的BIAcore實施例，其中假的框架Mab 4505 (D0M28m-7)和 4503 (D0iC8h_94)的表位部分地重疊。圖四顯示了在10%小鼠血清中的雙特異性的mAb-dAb、對照分子和D0iC8h_94親和力成熟的克隆的對比。圖30例證了細胞表面染色、細胞表面和細胞內染色以及細胞內染色模式。圖31顯示了在本文中鑒別出的序列表的列表。
具體實施例方式在本說明書中已經參照實施方案描述了本發明，描述方式使得本說明書能夠既清楚又簡明。但是應當理解，在不偏離本發明的情況下，可以對這些實施方案進行各種組合或分開。除非另有說明，否則本文所用的所有科技術語都具有本領域(例如細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)普通技術人員公知的相同含義。將標準技術用于分子、遺傳和生化方法(一般參見Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology (1999)第 4 版，John ffiley&Sons, Inc.，所述文獻通過引用并入本文)和化學方法。命名法和縮寫本文使用的命名法和縮寫包括單克隆抗體(MAb，mAb)；單克隆抗體(mAbs)；結構域抗體(dAb)；結構域抗體(dAbs)；重鏈(H鏈)；輕鏈(L鏈)；重鏈可變區 (Vh)；輕鏈可變區(Vl) ； κ輕鏈可變區(Vk) ;A IgGl重鏈恒定區I(CHl)；人IgGl重鏈恒定區2(CH2)；人IgGl重鏈恒定區3 (CH3)；輕鏈/κ輕鏈恒定區(CL/CK)；和互補性決定區 (CDR)；重鏈的互補性決定區(CDRH)；輕鏈的互補性決定區(CDRL)；互補性決定區的區域 1、2、3(CDR1、CDR2、CDR3)。靶組織和組織特異性的標志物分子合適的靶組織包括肌肉組織，包括心肌和骨骼肌、上皮組織、皮膚、結締組織、肝組織、神經元組織、心臟或心臟組織和關節組織。每種這樣的組織的組織特異性的標志物是本領域技術人員已知的。在一個實施方案中，組織特異性的標志物包括炎癥標志物，瘢痕組織的組分，或對組織特異性的標志物，所述組織諸如肌肉組織(包括心肌)上皮組織、皮膚、結締組織、肝組織、神經元組織、心臟組織和關節組織。在一個實施方案中，本發明提供了用于使干細胞靶向心臟組織的組合物和方法，所述心臟組織包括心肌組織、成纖維細胞、冠狀脈管系統、和在間質間隙或基膜中的蛋白。肌肉特異性的標志物分子肌球蛋白肌球蛋白是一個大動力蛋白家族，它們存在于肌肉肌節中，且負責基于肌動蛋白的運動性。肌球蛋白分子在三維結構中由互連的重鏈和輕鏈組成。已經描述了肌細胞中的輕鏈分子的細胞溶質前體庫，且認為它們在例如心肌損傷以后泄漏進循環中(描述在，例如US 5，702，905)。在肌肉中，肌球蛋白分子中的肌球蛋白輕鏈(MLC)成對出現。心臟和骨骼MLC在免疫學上是不同的。心臟MLC存在于心肌和心肌梗塞中(描述在，例如，Lyn等人Wiysiol. Genomics 2000 ；2 :93-100 ；Mair 等人 Clin Chim Acta 1994 ；229 :153-159 和 Khaw 等人 J Clin. Invest. 1976 ；58 :439-446)。當組織膜在心肌梗塞中受損時，它們變得可被抗-MLC 抗體接近。肌球蛋白輕鏈包括MLC-I、MLC-2、MYL、MYL-2/3、人心室肌球蛋白輕鏈(vMLC)、 vMLC-l(Uniftx)tKB/Swiss-Prot 入口 P08590)。US 5，702，905 描述了人心室肌球蛋白輕鏈的小鼠單克隆抗體，其具有對肌球蛋白輕鏈的心臟同種型的高親和力。在心肌、骨骼肌、 血管平滑肌、臍動脈平滑肌細胞中，以及在腎、結腸、輸卵管、直腸、精囊、前列腺、皮膚、腸內皮、胰腺、脂肪組織、視網膜內皮細胞和膀胱上皮的肌肉組織中，表達vMLC(也稱作MLC-I， MLC-3)。參見，例如，Bicer 和 Reiser, J Muscle Res Cell Motil. 2004 ；25 (8) :623_33。本文使用的“MLC”也包括MLC的一部分或片段。MLC包括天然存在的或內源的哺乳動物MLC蛋白，以及其氨基酸序列與天然存在的或內源的對應哺乳動物MLC蛋白相同的蛋白(例如，重組蛋白、合成蛋白(即，使用合成有機化學方法生產))。因此，如本文定義的，該術語包括成熟的MLC蛋白、多形變體或等位變體、MLC的其它同種型以及前述物質的修飾的或未修飾的形式(例如，脂質化、糖基化)。
干細胞特異性的標志物分子干細胞特異性的標志物分子包括在干細胞上表達的那些分子。這樣的分子包括⑶30、巢蛋白、Stro-1、PSA-NCam、p75、神經營養因子、⑶；34、 Sca-UABCG2,CD133 和 c_Kit。c_Kit (也稱作 CDl 17 和 SCFR(干細胞因子受體)；人 c-Kit 描述在UniProtKB/Swiss-Prot記錄P10721))是細胞和膜結合的酪氨酸激酶受體。干細胞因子(SCF)是通過結合c-Kit來發信號的糖蛋白，該信號傳遞途徑在血細胞生成中起關鍵作用，作為正調節物負調節物起作用，經常與其它細胞因子協同地起作用。可溶性的脫落的 c-Kit受體可以在調節SCF中起作用。在一個實施方案中，所述結合干細胞特異性的標志物分子的藥劑可以是受體結合蛋白或生長因子諸如SCF。c_Kit(也稱作c-Kit、cKIT、c_Kit、ckit、cKit)在多能造血干細胞上表達，所述多能造血干細胞是屬于淋巴譜系和紅細胞譜系的成熟細胞的前體。c-Kit在來自骨髓的干細胞和祖細胞上以及在心臟干細胞上的表達，以及這些細胞在心肌修復中的作用，描述在例如，Fazel 等人 Journal of Clinical Investigation，116 (2006)，7，1865-1876。c-Kit M 一種早期干細胞標志物，其存在于大部分干細胞群體上，由大約的循環白血細胞表達。 已經證實，表達c-Kit的細胞會產生心肌細胞和血管細胞類型。另外，c-Kit在動物模型中的缺失會導致心肌梗塞后心臟修復的損害，提示這些細胞在心血管再生中起關鍵作用。 c-Kit+細胞存在于骨髓中，并隨后在損傷或施用動員劑以后，運動至血流中(綜述參見，例如，Bearzi 等人 PNAS (2007) 104 ；35 ；14068-14073)。本文使用的“c-Kit”也包括c-Kit的一部分或片段。c-Kit包括天然存在的或內源的哺乳動物c-Kit蛋白，以及其氨基酸序列與天然存在的或內源的對應哺乳動物c-Kit 蛋白相同的蛋白(例如，重組蛋白、合成蛋白(即，使用合成有機化學方法生產))。因此，如本文定義的，該術語包括成熟的c-Kit蛋白、多形變體或等位變體、c-Kit的其它同種型以及前述物質的修飾的或未修飾的形式(例如，脂質化、糖基化)。使用的哺乳動物c-Kit包括大鼠 c-Kit (也稱作 rc-Kit、rcKIT、re-Kit)和小鼠 / 鼠 c_Kit(也稱作 mcKIT、mc-Kit、 mc-Kit)ο免疫球蛋白本文使用的“免疫球蛋白”表示這樣的多肽家族其保留抗體分子的免疫球蛋白折疊特征，含有兩個β折疊，通常還含有保守的二硫鍵。結構域本文使用的“結構域”表示這樣的折疊的蛋白結構它保留了獨立于蛋白的其余部分的三級結構。通常，結構域負責蛋白的離散的功能性質，并且在許多情況下可以添加、去除或轉移給其它蛋白，而不喪失該蛋白和/或該結構域的其余部分的功能。免疫球蛋白單個可變結構域短語“免疫球蛋白單個可變結構域”或單個抗體可變結構域表示這樣的抗體可變結構域(VH、VHH、^或結合域其獨立于不同的或其它的V區或結構域而特異性地結合抗原或表位。這樣的“免疫球蛋白單個可變結構域”是折疊的多肽結構域，其包含抗體可變結構域特有的序列。因此，它包括完整的抗體可變結構域和修飾的可變結構域(例如，其中一個或更多個環已經被不是抗體可變結構域特有的序列所置換)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗體可變結構域，以及至少部分保留全長結構域的結合活性和特異性的可變結構域的折疊片段。免疫球蛋白單個可變結構域可以以含有其它可變區或可變結構域的形式(例如，同源多聚體或異源多聚體)存在，其中其它區域或結構域不是單個免疫球蛋白可變結構域的抗原結合所必需的(即其中免疫球蛋白單個可變結構域與抗原的結合獨立于另外的可變結構域)。“結構域抗體”或“dAb”與本文所用的術語“免疫球蛋白單個可變結構域”同義。“單個抗體可變結構域”或“抗體單個可變結構域”與本文所用的術語“免疫球蛋白單個可變結構域”同義。在一個實施方案中，免疫球蛋白單個可變結構域是人抗體可變結構域，但是也包括來自其它物種的單個抗體可變結構域，諸如嚙齒動物(例如，如在WO 00/29004中所公開的，其內容通過引用整體并入本文)、鉸口鯊和駱駝科(Camelid) Vhh dAb。駱駝科Vra是這樣的免疫球蛋白單個可變結構域多肽其源自包括駱駝、美洲駝羊、羊駝、單峰駱駝和原駝在內的物種，且生產天然地缺少輕鏈的重鏈抗體。 所述Vhh可以是人源化的。在本發明的所有方面，所述或每個免疫球蛋白單個可變結構域獨立地選自抗體重鏈和輕鏈單個可變結構域，例如VH、Vl和V,抗體本文使用的“抗體”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例如Fab、 F (ab’)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、scFv、閉合構象多特異性抗體、二硫鍵連接的scFv、 diabody)，無論是源自天然地產生抗體的任何物種，還是通過重組DNA技術制備；無論分離自例如下列哪種樣品血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌。抗體形式在一個實施方案中，可以以任意抗體形式提供根據本發明的抗體、免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體。本文使用的“抗體形式”表示任意合適的多肽結構，其中可以摻入一個或更多個抗體可變結構域，從而賦予該結構對抗原的結合特異性。多種合適的抗體形式是本領域已知的，例如，嵌合的抗體、人源化的抗體、人抗體、單鏈抗體、雙特異性的抗體、抗體重鏈、抗體輕鏈、抗體重鏈和/或輕鏈的同源二聚體和異源二聚體、任意前述物質的抗原-結合片段(例如，Fv片段(例如，單鏈Fv(SCFv)、二硫鍵連接的Fv)、Fab 片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)、單個抗體可變結構域(例如，dAb、VH、Vffin Vj和任意前述物質的修飾形式(例如，通過共價連接聚乙二醇或其它合適的聚合物或人源化的Vhh進行修飾)。在一個實施方案中，替代性的抗體形式包括替代性的支架，其中根據本發明的任意分子的⑶R可以被移植到合適的蛋白支架或骨架上，諸如親和體(affibody)、SpA支架、LDL 受體A類結構域、avimer (參見，例如，美國專利申請公開號2005/0053973、2005/0089932、 2005/0164301)或EGF結構域。此外，所述配體可以是本文所述的二價的(異二價的)或多價(異多價的)。在其它實施方案中，可以使用“通用框架”，其中“通用框架”表示這樣的單個抗體框架序列其與 Kabat ( “Sequences of Proteins of Immunological Interest，，， 美國衛生和人類服務部)所定義的序列中保守的抗體區域相對應，或與Chothia和Lesk， (1987) J. Mol. Biol. 196 :910-917所定義的人種系免疫球蛋白所有組分或結構相對應。本發明提供了單個框架或一組這樣的框架的應用，已經發現，通過僅高變區中的變化，允許衍生出基本上任意的結合特異性。如果需要的話，“抗體”可以另外包含一個或更多個額外的部分，所述部分可以各自獨立地是肽、多肽或蛋白部分或非肽部分(例如，聚亞烷基二醇、脂質、碳水化合物)。例如，所述配體可以另外包含半衰期延長部分(例如，聚亞烷基二醇部分，包含白蛋白、白蛋白片段或白蛋白變體的部分，包含轉鐵蛋白、轉鐵蛋白片段或轉鐵蛋白變體的部分，結合白蛋白的部分，結合新生的Fc受體的部分)。合適的半衰期延長部分描述在， 例如，W02008096158。另一個方案是，包括額外的結合部分，諸如結合肽、多肽或蛋白部分(諸如血清白蛋白)的抗體或免疫球蛋白單個可變結構域，其描述在，例如EP1517921、 W003002609、W004003019、W02008096158、W004058821 和 W02007080392。合適的結合血清白蛋白的路馬它科VHH包括在WO 2004041862 (Ablynx N. V.)和W02007080392中公開的那些。提及免疫球蛋白單個可變結構域、多肽、配體、融合蛋白等時，“抗-MLC”或 “抗-c-Kit”是指識別和結合MLC或c-Kit的部分。具體地，“抗-MLC”包括結合任意MLC 變體(包括vMLC-1等)的部分。表位“表位”是被免疫球蛋白VH/\對常規地結合的結構單元。表位限定了抗體的最小結合位點，因此代表抗體特異性的靶標。在單個結構域抗體的情況下，表位代表與分離的可變結構域結合的結構單元。表位結合域術語“表位-結合域”表示這樣的結構域其獨立于不同的V區或結構域而特異性地結合抗原或表位，這可以是結構域抗體(dAb)，例如人、駱駝科或鯊魚免疫球蛋白單個可變結構域，或它可以是作為選自下述的支架的衍生物的結構域 CTLA-4(Evibody)；脂質運載蛋白；蛋白A衍生出的分子諸如蛋白A的Z-結構域(親和體、SpA)、A-結構域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白諸如GroEl和GroES ；轉鐵蛋白 (trans-body)；錨蛋白重復蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結構域(四連接素)；人 Y -晶體蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ結構域；人蛋白酶抑制劑的全蝎toxinkunitz型結構域；和纖連蛋白(adnectin)；其已經進行蛋白工程化，以便實現與除了天然配體以外的配體的結合。結合用解離常數(Kd)來指示結合。通過合適的試驗，可以測定抗原-結合蛋白與抗原或表位的特異性結合，所述試驗包括，例如，Scatchard分析和/或競爭性結合試驗， 諸如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定諸如ELISA和夾心競爭測定和它們的不同變體。結合親和力任選地，使用表面等離子體共振(SPR)和Biacore (Karlsson等人， 1991)，使用Biacore系統(Uppsala，Sweden)，測定結合親和力。Biacorc系統使用表面等離子體共振(SPR, Welford K. 1991，Opt. Quant. Elect. 23 :1 ；Morton 禾口 Myszka，1998，Methods in Enzymology四5 J68)來實時監測生物分子相互作用，并使用表面等離子體共振來檢測在玻璃支持物上的薄金膜的表面處的光共振角的變化(由離開最多300nm的表面的折光指數的變化引起)。Biacore分析會方便地產生結合速率常數、解離速率常數、平衡解離常數和親和常數。通過使用Biacore表面等離子體共振系統(Biacore，Inc.)來評估結合和解離速率常數，得到結合親和力。根據生產商的(Biacore)說明書，活化生物傳感器芯片，用于共價偶聯靶物。然后稀釋靶物，并注射到芯片上，以得到固定化的物質的響應單位中的信號。由于共振單位(RU)中的信號與固定化的物質的質量成比例，這代表基質上的固定化的靶物密度范圍。將解離數據擬合至單位點模型，得到k。ff+/-S. d.(測量的標準差)。計算每條結合曲線的假一階速率常數(Kd’s)，并繪制為蛋白濃度的函數，以得到k。n+/-s. e.(擬合的標準誤差)。從sra測量結果計算結合的平衡解離常數，Kd' S = k0ff/k0nOCDR 本文所述的抗原結合蛋白、抗體和免疫球蛋白單個可變結構域(dAbs)含有互補性決定區(CDR1、CDR2 和 CDR3)。Kabat 等人(Kabat，E. A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛生和人類服務部，美國政府印刷局(1991))已經定義了 CDR區和框架(FR)區的位置和編號系統。基于眾所周知的Kabat氨基酸編號系統和CDR的定義，本領域技術人員會容易地明白本文公開的Vh(CDRH1等)和VJCDRL1等) (VJdAb的⑶R(⑶Rl、⑶R2、⑶R3)的氨基酸序列。根據Kabat編號系統，即最常用的基于序列差異性的方法，重鏈CDR-H3具有變化的長度，用字母編號在殘基HlOO和HlOl之間的插入物，直到K (即H100，H100A…H100K，H101)。或者，可以使用Chothia系統(基于結構環區域白勺位置)(Chothia等人，(1989)Conformations of immunoglobulin hypervariable regions ；Nature 342, p877_883)，測定 CDR，根據 AbM(在 Kabat 和 Chothia 之間的折中)， 或根據如下的Contact方法(基于晶體結構和預測與抗原的接觸殘基)。關于適用于測定 CDR 的方法,參見 http //www. bioinf. org. uk/abs八已經將一個殘基編號以后，然后可以應用下述的⑶R定義Kabat CDR Hl :31_35/35A/35BCDR H2 :50-65CDR H3 :95-102CDR Ll :24-34CDR L2 :50-56CDR L3 :89-97Chothia CDR Hl 26—32CDR H2 52-56CDR H3 :95-102CDR Ll 24—34CDR L2 50-56CDR L3 89—97AbM (使用Kabat編號)(使用Chothia編號)CDR Hl :26_33/33A/33B 26-33CDR H2 :50-58-CDR H3 :95-102-CDR Ll :24-34-CDR L2 :50-56-CDR L3 :89-97-Contact(使用Kabat編號)(使用Chothia編號)CDR Hl :30_35/35A/35B 30-35CDR H2 :47-58-CDR H3 :93-101-CDR Ll :30-36-CDR L2 :46-55-CDR L3 :89-96-(“- “是指與Kabat相同的編號)競爭本文提到的術語“競爭”是指，在有對同源靶物特異性的第二結合域(例如， 免疫球蛋白單個可變結構域)存在下，第一靶物(例如，c-Kit)與它的所述同源靶物結合域(例如，免疫球蛋白單個可變結構域)的結合受到抑制。例如，可以空間地抑制結合，例如，通過物理地阻斷結合域，或通過改變結構或結合域的環境，使得它對靶物的的親和力或親合力減小。關于如何進行競爭ELISA和競爭BIACore實驗來測定第一結合域和第二結合域之間的競爭的細節，參見W02006038027，它的細節通過引用并入本文，以提供用于本發明中的明確公開內容。使dAb連接至IgG:用于本發明中的結構域抗體可以連接在常規IgG的重鏈和/或輕鏈的C-端末端。另外，有些dAb可以連接至常規抗體的重鏈和輕鏈的C-端末端。在將dAb的N-端與抗體恒定結構域((^或仏)融合的構建體中，肽連接物可以幫助dAb結合抗原。實際上，dAb的N-端末端的位置緊密靠近參與抗原-結合活性的互補性-決定區(CDR)。因而，短的肽連接物會起蛋白支架的表位-結合域和恒定結構域之間的隔離物的作用，這可以允許dAb CDR更容易地到達抗原，其因此可以以高親和力進行結合。使dAb連接至IgG上的環境隨它們所融合的抗體鏈而異當融合在IgG支架的抗體輕鏈的C-端末端處時，預期每個dAb位于抗體鉸鏈和Fc 部分附近。這樣的dAb的位置可能彼此遠離。在常規抗體中，Fab片段之間的角度以及每個Fab片段和Fc部分之間的角度可以存在非常顯著的差異。對于mAbdAb，Fab片段之間的角度可能不存在很大差異，同時關于每個Fab片段和Fc部分之間的角度，也可以觀察到一些角度限制。當融合在IgG支架的抗體重鏈的C-端末端處時，預期每個dAb位于Fc部分的CH3 結構域附近。預期這不會影響Fc對Fc受體(例如Fc y RI,II> III, FcRn)的結合性質，因為這些受體會與Ch2結構域(對于Fc γ RI、II和III類受體)嚙合，或與CH2和CH3結構域之間的鉸鏈(例如Fcfoi受體)嚙合。這樣的抗原-結合構建體的另一個特征是，預期兩種 dAb在空間上彼此靠近，條件是，通過提供適當的連接物來提供柔性，這些dAb甚至可以形成同型二聚體物質，因此產生Fc部分的‘拉鏈樣’四級結構，這可以增強構建體的穩定性。這樣的結構考慮可以輔助選擇最合適的位置，以將表位-結合域(例如dAb)連接到蛋白支架(例如抗體)上。連接物通過使用連接物，可以將本發明的蛋白支架連接到表位-結合域上。合適的連接物的實例包括長度在下述范圍內的氨基酸序列1個氨基酸至150個氨基酸，或1個氨基酸至140個氨基酸，例如，1個氨基酸至130個氨基酸，或1-120個氨基酸，或1_80個氨基酸，或1-50個氨基酸，或1-20個氨基酸，或1-10個氨基酸，或5-18個氨基酸。這樣的序列可以具有它們自己的三級結構，例如，本發明的連接物可以包含單個可變結構域。在一個實施方案中，連接物的大小等于單個可變結構域。合適的連接物的大小可以是1-20埃，例如小于15埃、或小于10埃、或小于5埃。在本發明的一個實施方案中，至少一個表位結合域通過連接物直接連接至Ig支架上，所述連接物包含1-150個氨基酸，例如1-20個氨基酸，例如1-10個氨基酸。這樣的連接物可以選自SEQ ID NO :3-8所述的那些中的任一個，例如所述連接物可以是‘TVAAPS’，或者所述連接物可以是‘GGGGS’或多個這樣的連接物。在本發明的抗原-結合蛋白中使用的連接物可以包含單獨的或與其它連接物組合的一個或更多個 GS 殘基集合，例如 iGSTVAAPS' (SEQ ID NO :102)或 ‘TVAAPSGS，(SEQ ID NO :103)或 ‘GSTVAAPSGS，(SEQ ID NO 104)或多個這樣的連接物。在一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘ (PAQn(GS)m'連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘ (GGGGS)n(GQm’連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘ (TVAAPS) n (GS) m’連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘ (GS) ffl (TVAAPSGS) n’連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘ (GS)m(TVAAPQp(GS)m，連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘(PAVPPP)n(GQm’連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘(TVSDVP) n (GS) m’連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘(TGLDSP)n(GS)n/連接至Ig支架上。在所有這樣的實施方案中，η = l_10，m = 0-4, 且ρ = 2-10。
這樣的連接物的實例包括= (PAS)n(GS)m，其中η = 1，且m= 1，(PAS)n(GS)m，其中η =2，且111= 1，(PAS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m= 1，(PAS)n(GS) m，其中 η = 4，且 m = 1，(PAS) n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(PAS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0，(PAS)n(GS)m，其中 η = 4， 且 m = 0。
這樣的連接物的實例包括(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 1，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m, 其中 η = 2，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 4，且 m = 1，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(GGGGS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0，(GGGGS) n(GS)m，其中η = 4，且m = 0。這樣的連接物的實例包括(GS)m(TVAAPS)p，其中ρ = 1，且 m = 1, (GS)m(TVAAPS)p，其中 ρ = 2，且 m = 1，(GS)m(TVAAPS)p，其中 ρ = 3，且 m = 1，(GS) m(TVAAPS)p，其中 ρ = 4，且 m= 1)，(GS)m (TVAAPS)p，其中 ρ = 5，且 m= 1，或(GS)m(TVAAPS) ρ,其中 P = 6，且 m = 1。
這樣的連接物的實例包括(TVAAPQn (GQm，其中η = 1，且m = 1，(TVAAPS)n(GS) m，其中 η = 2，且 m = 1，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 1，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 4，且 m = 1，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0， (TVAAPS)n(GS)m，其中 η = 4，且m = 0。
這樣的連接物的實例包括(GS)m(TVAAPSGS)n,其中η = 1，且m = 1，(GS) m (TVAAPSGS)n,其中 n = 2，且 m=l，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n = 3，且 m=l，或(GS) m (TVAAPSGS)n,其中 n = 4，且 m=l，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n = 5，且 m=l，(GS) m (TVAAPSGS)n,其中 n = 6，且 m=l，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n=l，且 m = 0，(GS) m (TVAAPSGS) n，其中 η = 2，且 m = 10，(GS)m(TVAAPSGS)n,其中 n = 3，且 m = 0，或(GS) m(TVAAPSGS)n，其中 η = 0。
這樣的連接物的實例包括(TVAAPSGS)p(GS)m，其中ρ = 2，且m = 1，(TVAAPSGS) ρ(Gs)m，其中 ρ = 3，且 m = 1，(Tvaapsgs)p(GS)m，其中 ρ = 4，且 m = 1，(Tvaapsgs)p(GS)m, 其中 P = 2，且 m = 0，(TVAAPSGS)p(GS)m，其中 P = 3，且 m = 0，(TVAAPSGS)p (GS)m，其中 ρ = 4，且 m = 0。
這樣的連接物的實例包括(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 1，且 m = 1，(PAVPPP)n(GS) m，其中 η = 2，且 m = 1(SEQ ID NO :65)，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 1，(PAVPPP) n(GS)m，其中 n = 4，且 m= 1，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 2，且 m = 0，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 3，且 m = 0，(PAVPPP)n(GS)m，其中 η = 4，且 m = 0。
這樣的連接物的實例包括(TVSDVP)n(GQm，其中η = 1，且m= 1(SEQ ID NO :67)，26(TVSDVP) n (GS) m，其中 η = 2，且 m=l，(TVSDVP) n (GS) m，其中 n = 3，且 m=l，(TVSDVP) n (GS) m，其中 η = 4，且 m = 1，(TVSDVP)n(GQm，其中 η = 2，且 m = 0，(TVSDVP)n(GQm，其中 η = 3，且 m = 0，(TVSDVP)n(GQm，其中 η = 4，且 m = 0。
這樣的連接物的實例包括(TGLDSP)n (GQm，其中η = 1，且m = 1，(TGLDSP)n(GS) m，其中 η = 2，且 m = 1，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 3，且 m = 1，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 4，且 m = 1，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 2，且 m = 0，(TGLDSP)n(GQm，其中 η = 3，且 m = 0， (TGLDSP)n(GS)m，其中 η = 4，且m = 0。
在另一個實施方案中，在表位結合域和Ig支架之間沒有連接物。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘TVAAPS’ (SEQ ID NO 89)連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘TVAAPSGS’ (SEQ ID NO 103)連接至Ig支架上。 在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘GS’ (SEQ ID NO :10 連接至Ig支架上。在另一個實施方案中，所述表位結合域通過連接物‘ASTKGPT’ (SEQ ID NO 91)連接至 Ig支架上。
同源性與本文公開的序列具有相似性或同源性(例如，至少約70%序列同一性)的序列也是本發明的一部分。在有些實施方案中，在氨基酸水平的序列同一性可以是約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。在核酸水平，序列同一性可以是約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94^^95%,96^^97%,98^^99%或更高。或者，當核酸區段在所選雜交條件(例如極高嚴謹性雜交條件)下與鏈的互補體雜交時，存在相當大的同一性。核酸可以存在于完整細胞中，存在于細胞裂解物中，或者呈部分純化或基本上純的形式。
本文所用的術語“低嚴謹性”、“中等嚴謹性”、“高嚴謹性”或“極高嚴謹性”條件描述了核酸雜交和洗滌的條件。進行雜交反應的指南，可以參見Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6，所述文獻通過引用全部并入本文。該參考文獻中描述了含水方法和無水方法，都可以采用。本文提及的具體雜交條件如下(1)低嚴謹性雜交條件在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45°C，再在0.2X SSC、0. 1%SDS中在至少50°C (對于低嚴謹性條件，洗滌溫度可升高至55°C)洗滌兩次；(2) 中等嚴謹性雜交條件在6X SSC中在約45°C，再在0. 2X SSC、0. 1 % SDS中在60V洗滌一次或更多次；(3)高嚴謹性雜交條件在6X SSC中在約45°C，再在0. 2X SSC、0. SDS中在65°C洗滌一次或更多次；和優選地，(4)極高嚴謹性雜交條件是0. 5M磷酸鈉、7% SDS在 650C，再在0. 2X SSC、1 % SDS中在65°C洗滌一次或更多次。
如下進行兩個序列之間的“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(這些術語在本文可互換使用)的計算。為了最佳比較目的，比對序列(例如對于最佳比對，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個或兩個中引入缺口，為了比較目的，非同源序列可以忽略不計)。在一個實施方案中，為了比較目的所比對的參照序列的長度是參照序列長度的至少約30%、任選至少約40%、任選至少約50%、任選至少約60%和任選至少約70%、80%、 90%或100%。然后，比較在相應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的某個位置被與第二序列中的相應位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據時，那么分子在該位置是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。兩個序列之間的同一性百分比隨考慮缺口數和各缺口長度后的序列共享的相同位置數而變化，需要弓I入這些缺口以進行兩個序列的最佳比對。
使用采用默認參數的算法BLAST 2Sequences (Tatusova，Τ. Α.等人，FEMS Microbiol Lett, 174 :187-188 (1999)，可以任選地準備和測定氨基酸和核苷酸序列比對以及如本文定義的同源性、相似性或同一性。或者，采用BLAST算法版)進行序列比對，參數設定為默認值。BLAST(基本局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool))是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的探索式檢索算法；這些程序都采用 Karlin 和 Altschul，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(6) :2264-8 的統計學方法給它們的發現結果確定顯著性。
核酸分子、載體、宿主細胞和構建體的蛋白表達本發明也提供了分離的和/或重組的核酸分子，其編碼本文所述的配體(單個可變結構域、融合蛋白、多肽、雙特異性的配體和多特異性的配體)。
本發明也提供了一種載體，其包含本發明的重組核酸分子。在某些實施方案中，所述載體是含有一個或更多個與本發明的重組核酸可操作地連接的表達控制元件或序列的表達載體。本發明也提供了一種重組宿主細胞，其包含本發明的重組核酸分子或載體。合適的載體(例如質粒、噬粒)、表達控制元件、宿主細胞和生產本發明的重組宿主細胞的方法，是本領域眾所周知的。
通過用包含本發明的抗原結合構建體的編碼序列的表達載體轉染宿主細胞，可以生產本發明的抗原結合構建體。通過將抗原結合構建體的這些編碼序列置于與常規的調節控制序列的可操作關聯下，生產表達載體或重組質粒，所述調節控制序列能夠控制在宿主細胞中的復制和表達和/或從宿主細胞的分泌。調節序列包括啟動子序列，例如CMV啟動子和信號序列，其可以源自其它已知的抗體。類似地，可以產生具有DNA序列的第二表達載體，所述DNA序列編碼互補的抗原結合構建體輕鏈或重鏈。在某些實施方案中，除了所涉及的編碼序列和選擇標記之外，這種第二表達載體與第一表達載體相同，以確保盡可能地有功能地表達每條多肽鏈。或者，抗原結合構建體的重鏈和輕鏈編碼序列可以存在于單個載體上，例如在相同載體的2個表達盒中。
通過常規技術，用第一載體和第二載體共轉染選定的宿主細胞(或僅用單個載體轉染)，以創建包含重組的或合成的輕鏈和重鏈的本發明的轉染的宿主細胞。然后通過常規技術，培養轉染的細胞，以生產本發明的工程化的抗原結合構建體。通過合適的試驗，例如 ELISA或RIA，從培養物篩選包括重組重鏈和/或輕鏈的結合體的抗原結合構建體。可以采用相似的常規技術，構建其它抗原結合構建體。
本領域技術人員可以選擇適用于在本發明的方法和組合物構建中采用的克隆和亞克隆步驟的載體。例如，可以使用常規的PUC克隆載體系列。一種載體pUC19可從供應點商業獲得，例如 Amersham (Buckinghamshire，United Kingdom)或 Pharmacia (Uppsala， Sweden) 0另外，能夠容易地復制的、具有豐富的克隆位點和選擇基因(例如，抗生素抗性) 并且易于操作的任何載體，可以用于克隆。因而，克隆載體的選擇不是本發明的限制因素。
通過適用于放大異源DNA序列的表達的基因，例如，哺乳動物二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，也可以表征表達載體。其它載體序列包括聚腺苷酸(poly Α)信號序列，例如來自牛生長激素(BGH)的，以及β珠蛋白啟動子序列(betaglopro)。通過本領域技術人員公知的技術，可以合成在本文中有用的表達載體。
這些載體的組件，例如復制子、選擇基因、增強子、啟動子、信號序列等，可以從商業來源或天然來源獲得，或通過已知的方法合成，用于指導重組DNA的產物在選定的宿主中的表達和/或分泌。為了這個目的，也可以選擇其它合適的表達載體，其中許多類型在本領域已知用于哺乳動物、細菌、昆蟲、酵母和真菌表達。
本發明還包括用含有本發明的抗原結合構建體的編碼序列的重組質粒轉染的細胞系。對于這些克隆載體的克隆和其它操作而言有用的宿主細胞也是常規的。然而，來自各種大腸桿菌菌株的細胞可以用于克隆載體的復制和本發明的抗原結合構建體的構建中的其它步驟。
用于表達本發明的抗原結合構建體的宿主細胞或細胞系的實例包括哺乳動物細胞,諸如 NSO、Sp2/0、CHO(例如，ATCC 登記號 CRL-9096，CHO DG44(Urlaub, G.和 Chasin， LA.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77 (7) :4216-4220 (1980))))、COS 諸如 C0S-1(ATCC 登記號 CRL-1650)和 C0S-7 (ATCC 登記號 CRL-1651)、HEK、293(ATCC 登記號 CRL-1573)、 HeLa(ATCC 登記號 CCL-2)、CVl (ATCC 登記號 CCL-70)、WOP(Dailey, L.，等人，J. Virol.， 54 :739-749(1985)、3T3、293T (Pear，W. S.,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. , 90 8392-8396 (1993))NSO細胞、SP2/0、HuT 78細胞等，或植物(例如，煙草)(參見，例如， Ausubel, F. M.等人，編· Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates和John ffiley&Sons Inc. (1993))，成纖維細胞(例如，3T3)和骨髓瘤細胞。可以使用人細胞，因而允許分子用人糖基化模式來修飾。或者，可以采用其它真核細胞系。合適的哺乳動物宿主細胞的選擇，以及用于轉化、培養、擴增、篩選和產物生產和純化的方法， 是本領域已知的。參見，例如，以上引述的Sambrook等人。
可以證明，細菌細胞可用作宿主細胞，其適合表達本發明的重組Fab或其它實施方案(參見，例如，PlUckthun，A. , Immunol. Rev.，130 151-188 (1992))。但是，由于在細菌細胞中表達的蛋白傾向于未折疊的形式或不正確地折疊的形式或非糖基化形式，必須篩選在細菌細胞中生產的任何重組Fab，以保留抗原結合能力。如果細菌細胞表達的分子以適當地折疊的形式產生，該細菌細胞將是期望的宿主，或者，在替代性的實施方案中，可以在細菌宿主中表達分子，然后進行重新折疊。例如，用于表達的各種大腸桿菌菌株，是生物技術領域中公知的宿主細胞。枯草芽孢桿菌、鏈霉菌屬、其它芽孢桿菌屬等的各種菌株，也可以用于該方法中。
當希望時，本領域技術人員已知的真菌或酵母細胞的菌株也可用作宿主細胞(例如，巴氏畢赤酵母、曲霉菌屬、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、粗糙鏈孢霉)，以及昆蟲細胞(例如果蠅和鱗翅目昆蟲)和病毒表達系統(例如，Drosophila Schnieder S2細胞、Sf9昆蟲細胞 (W0 94/26087(0' Connor))。參見，例如，Miller 等人，Genetic Engineering, 8 :277-298, Plenum Press (1986)和其中引用的參考文獻。
可以構建載體的一般方法、生產本發明的宿主細胞所需的轉染方法、從這些宿主細胞生產本發明的抗原結合構建體所必需的培養方法，都可以是常規技術。通常，本發明的培養方法是無血清培養方法，通常通過在懸浮液中無血清地培養細胞。同樣地，生產以后， 可以根據本領域的標準方法，從細胞培養物內容物純化本發明的抗原結合構建體，所述方法包括硫酸銨沉淀、親和柱、柱色譜法、凝膠電泳等。這些技術屬于本領域技能，不會限制本發明。例如，在WO 99/58679和WO 96/16990中描述了改變的抗體的制備。
表達抗原結合構建體的又一個方法可以利用在轉基因動物中的表達，例如如美國專利號4，873，316所述。這涉及利用動物的酪蛋白啟動子的表達系統，當其被轉基因地摻入哺乳動物中時，允許雌性動物在它的奶中產生希望的重組蛋白。
在本發明的另一個方面，提供了一種生產本發明的抗體的方法，所述方法包括下述步驟培養用編碼本發明的抗體的輕鏈和/或重鏈的載體轉化或轉染的宿主細胞，并回收由此生產的抗體。
根據本發明，提供了一種生產本發明的抗原結合構建體的方法，所述方法包括下述步驟
(a)提供編碼抗原結合構建體的重鏈的第一載體；
(b)提供編碼抗原結合構建體的輕鏈的第二載體；
(c)用所述第一載體和第二載體轉化哺乳動物宿主細胞(例如，CH0)；
(d)在有助于所述抗原結合構建體從所述宿主細胞分泌到所述培養基中的條件下，培養步驟(c)的宿主細胞；
(e)回收步驟(d)的分泌的抗原結合構建體。
通過希望的方法表達以后，然后使用合適的試驗，檢查抗原結合構建體的體外活性。采用當前常規的ELISA試驗形式或BIAcore來評估抗原結合構建體與它的靶物的定性和定量結合。另外，也可以使用其它體外試驗來證實中和效力，然后進行人類臨床研究，以評價抗原結合構建體在體內的持久性，盡管有一般的清除機制。
有利地，本發明的抗原結合構建體可以在細胞表達系統中表達為單個分子。在一個實施方案中，在抗原結合構建體是形成mAbdAb分子的雙靶向構建體的情況下，將mAb的重鏈表達為包含dAb的單個分子。例如，在根據本發明的MAbdAb構建體是結合與抗-c-Kit 免疫球蛋白單個可變結構域相連的MLC的單克隆抗體的情況下，將抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域表達為抗-MLC抗體重鏈的一部分。在另一個實施方案中，將抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域表達為抗-MLC抗體輕鏈的一部分。
有利地，與其中使用化學連接物連接2個抗原結合組分的分子相比，可以更有效地生產這樣的表達構建體。這是因為，當使用化學連接物時，得到的終產物會包含代表不完全的化學連接反應的分子的混合群體。也就是說，在將結合組分A與結合組分B相混合并加入連接劑χ來確保化學交聯的情況下，連接反應后得到的反應混合物將包含A、B、χ、A-x 和B-x以及希望的化合物A-x-B。因此，在生產過程中使用該方法，會需要純化步驟來去除所有部分地反應的組分，并得到正確的希望的化合物A-x-B。
用于表達雙靶向構建體的體外表達系統會提供一種生產系統，因為由此得到的所有分子都是希望的化合物。這樣的系統會提供一種簡化的生產方法(其提供更均一的產物群體)，并提供一種更常規的生產方法(其可以滿足安全性要求)。
治療治療的劑量和持續時間與本發明的分子在人循環中的相對持續時間有關， 可以由本領域技術人員根據要治療的病癥和患者的一般健康來調整。預見到，可能需要在延長的時間段(例如，四到六個月)內的重復給藥(例如，每3天一次、每周一次或每2周一次)來實現最大治療效果。理想的給藥是，在心肌梗塞以后(即心肌梗塞后)第一個周內單次給藥。
本發明的治療劑的給藥模式可以是向宿主遞送藥劑的任何適合的途徑。本發明的抗原結合構建體、免疫球蛋白單個可變結構域和藥物組合物特別適用于腸胃外施用，即，皮下地(s. c.)、鞘內地、腹膜內地、肌肉內地(i.m.)、靜脈內地(i.v.)或鼻內地，或在外科手術過程中。
本發明的治療劑可以制備成藥物組合物，其含有在藥學上可接受的載體中的有效量的本發明的抗原結合構建體或免疫球蛋白單個可變結構域作為活性成分。在一個實施方案中，本發明的預防藥劑是水混懸液或溶液，其含有準備好給藥的形式的抗原結合構建體。 在一個實施方案中，所述混懸液或溶液在生理PH下緩沖。用于腸胃外施用的組合物包含溶于藥學上可接受的載體中的本發明的抗原結合構建體或其混合物的溶液。在一個實施方案中，所述載體是水性載體。可以使用多種水性載體，例如，0.9%鹽水、0.3%甘氨酸等。這些溶液可以制成無菌的，一般沒有顆粒物質。通過常規的公知的滅菌技術(例如，過濾)，可以將這些溶液滅菌。組合物可以含有接近生理條件所需的藥學上可接受的輔助物質，例如PH 調節劑和緩沖劑等。本發明的抗原結合構建體在這種藥物制劑中的濃度可以廣泛地變化， 即，從低于約0. 5%、通常在或至少約到多達約15或約20% (按重量計算)，主要根據液體體積、粘度等，根據選定的特定給藥模式，進行選擇。
因而，用于肌肉內注射的本發明的藥物組合物可以制備成含有約ImL無菌緩沖水，和約Ing至約IOOmg(例如，約50ng至約30mg，或約5mg至約25mg)本發明的抗原結合構建體。類似地，用于靜脈內輸注的本發明的藥物組合物可以制備成含有約250ml無菌林格氏溶液，和約1至約30或約5mg至約25mg本發明的抗原結合構建體/ml林格氏溶液。用于制備腸胃外施用的組合物的實際方法是公知的，或者對于本領域技術人員而言是顯而易見的，更詳細地描述在，例如，Remington' s Pharmaceutical Science, 第 15 片反，Mack Publishing Company, Easton, PermsylvEiniEi0內 HM 的* 發明抗原結合構建體制劑的制備，參見Lasmar U和Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci. Tech. today,第 129-137 β , M 3 ^ (2000 年 4 月 3 日)；Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int.J.Pharm 185(1999) 129-188 ；Stability of Protein Pharmaceuticals A 部禾口 B 部，Ahern Τ. J. , Manning Μ. C.編，New York, NY Plenum Press(1992) ；Akers, Μ. J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002)2283-2300 ；Imamura, K φ A"Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92(2003)266-274 ;Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze—drying，，，J Pharm. Pharmacol, 54(2002) 1033-1039 ；Johnson,R,"Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization，，，J. Pharm. Sci，91 (2002)914-922 ；和 Ha，E Wang W, Wang Y. J. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability",J. Pharm Sci, 91,2252-2264, (2002)，它們的所有內容通過引用并入本文，并向讀者特別地提及。
在一個實施方案中，當在藥物制品中時，本發明的治療劑以單位劑量形式存在。本領域技術人員可容易地確定合適的治療有效劑量。根據患者的體重，可以為患者計算合適的劑量，例如合適的劑量可以是在下述范圍內約0. 01至約20mg/kg，例如約0. 1至約 20mg/kg,例如約1至約20mg/kg，例如約10至約20mg/kg，或例如約1至約15mg/kg，例如約10至約15mg/kg。為了有效地治療本發明適用的人類病癥，合適的劑量可以是在下述范圍內的本發明的抗原結合構建體約0. 01至約lOOOmg，例如約0. 1至約lOOOmg，例如約0. 1 至約500mg,例如約500mg,例如約0. 1至約IOOmg,或約0. 1至約80mg,或約0. 1至約60mg, 或約0. 1至約40mg，或例如約1至約lOOmg，或約1至約50mg，其可以腸胃外地(例如皮下地、靜脈內地或肌肉內地)施用。如果必要，可以按照醫師酌情選擇的合適時間間隔，重復這種劑量。
可以低壓凍干本文所述的抗原結合構建體進行保存，并在使用前在適合的載體中重構。已經證實，這種技術對于常規的免疫球蛋白是有效的，且可以采用本領域已知的低壓凍干法和重構技術。
疾病本發明的藥物組合物可以治療的疾病包括這樣的疾病，其中，心肌、骨骼肌、 血管平滑肌、臍動脈平滑肌細胞和腎、結腸、輸卵管、直腸、精囊、皮膚、視網膜內皮細胞或膀胱上皮中的肌肉組織受損。在一個實施方案中，可以治療的疾病包括心血管病；心肌梗塞、慢性心力衰竭、缺血性心臟病、慢性缺血性或非缺血性心肌病、高血壓、冠狀動脈疾病、 糖尿病性心臟病、出血性中風、血栓性中風、栓性中風、肢缺血、外周血管病或其中組織已經缺血的另一種疾病。在一個實施方案中，可以治療脊髓損傷。在另一個實施方案中，可以治療肌疾病或肌肉障礙。肌疾病/肌肉障礙包括例如少肌癥、肌營養不良癥、脊髓性肌萎縮。
在一個實施方案中，所述疾病是心肌梗塞，尤其是急性心肌梗塞(AMI)。在心肌梗塞中，由血液供給不足導致的氧缺乏，會損傷心肌的肌細胞。
通過心臟功能參數的改善，可以測量成功的治療，所述參數包括射血分數、縮短分數、左心室收縮末期容積和舒張末期容積和局部室壁活動、或心臟形態學測量諸如梗塞面積的減少。通過超聲心動描記術或MRI、核成像，可以測量這些參數。另外，通過不利事件的減少和生活質量和運動耐量的提高，可以測量成功，所述不利事件包括住院、隨后的心肌梗塞和死亡。
僅僅為了例證目的，在下面的實施例中進一步描述了本發明。
實施例
實施例1 蛋白的克隆和表達
1.重組小鼠和人vMLC-1的克隆和表達
使用PCR，合成了心室肌球蛋白輕鏈1 (vMLCl)的基因(UniProt登錄號 P08590 (人)、P09542 (小鼠))，還摻入了 C-端 GlySer (His) 6 標簽。
使用下述的PCR引物
權利要求
1.一種抗原-結合構建體，其包含結合干細胞特異性的標志物分子的第一種藥劑，和結合組織特異性的標志物分子的第二種藥劑。
2.如在權利要求1中要求保護的構建體，其中所述組織特異性的標志物是肌肉特異性的標志物分子。
3.如在權利要求2中要求保護的構建體，其中所述組織特異性的標志物是心肌-特異性的標志物分子。
4.如在權利要求1-3中的任一項中要求保護的構建體，其中所述第一種藥劑或所述第二種藥劑是單克隆抗體。
5.如在權利要求1-3中的任一項中要求保護的構建體，其中所述第一種藥劑或所述第二種藥劑是表位-結合域。
6.如在權利要求5中要求保護的構建體，其中所述表位-結合域是免疫球蛋白單個可變結構域。
7.如在權利要求1-6中的任一項中要求保護的構建體，其中所述干細胞特異性的標志物分子和所述組織特異性的標志物分子是人的。
8.如在權利要求1-7中的任一項中要求保護的構建體，其中所述干細胞特異性的標志物分子是c-Kit。
9.如在權利要求1-8中的任一項中要求保護的構建體，其中所述肌肉-特異性的標志物分子選自肌球蛋白-衍生的分子諸如肌球蛋白輕鏈(MLC)、心臟肌球蛋白、人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl)、MLC UMLC 2和MLC 3、心臟肌鈣蛋白I、心臟肌鈣蛋白、生腱蛋白C或肌酸激酶。
10.如在權利要求9中要求保護的構建體，其中所述結合肌肉特異性的標志物分子的藥劑是抗-MLC抗體。
11.如在權利要求10中要求保護的構建體，其中所述抗-MLC抗體是可從ATCCHB 11709得到的單克隆抗體。
12.如在前述權利要求中的任一項中要求保護的構建體，其中所述第一種藥劑是抗-c-Kit單克隆抗體，所述第二種藥劑是抗-MLC單克隆抗體。
13.如在權利要求1-12中的任一項中要求保護的構建體，它是MAbdAb。
14.如在權利要求13中要求保護的構建體，其中所述第一種藥劑是抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，所述第二種藥劑是單克隆抗-MLC抗體。
15.如在權利要求1-11、13或14中的任一項中所述的構建體，其中所述結合c-Kit的表位結合域是如在權利要求30-52、56-61中的任一項中要求保護的免疫球蛋白單個可變結構域或多肽、或如在權利要求陽中要求保護的配體。
16.如在權利要求1-11、13-15中的任一項中所述的構建體，其中所述結合c-Kit的表位結合域是具有SEQ ID N0:302-305、457、458或482中的任一個所述的氨基酸的免疫球蛋白單個可變結構域或多肽。
17.如在前述權利要求中的任一項中要求保護的構建體，其中所述抗-MLC抗體是如在權利要求22- 中的任一項中要求保護的、結合人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl)的抗原結合蛋白或抗體。
18.如在前述權利要求中的任一項中要求保護的構建體，其中所述第一種藥劑和所述第二種藥劑連在一起。
19.如在權利要求15或16中要求保護的構建體，其中所述連接物選自下述任一種 G4S 連接物(GGGGQ ；TVAAPS ；ASTKGPT ；ASTKGPS ；EPKSCDKTHTCPPCP ；ELQLEESCAEAQDGELDG, AST, STGGGGGS,STGGGGGSGGGGS, STGPPPPPS, STGPPPPPPPPPPS, STG，PPPPPS，STGSRDPYLffSAP SDPLELVVTGTSVTPSRLPTEPPSSVAEFSEATAELTVSFTNKVFTTETSRSITTSPKESDSPAGPARQYYTKGNGS TG, iSTG'(絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸)、iGSTG'或‘RS，。
20.如在權利要求13中要求保護的構建體，其中所述構建體選自在表M中所述的構建體中的任一種。
21.一種核酸分子，其編碼如在權利要求1-19中的任一項中要求保護的構建體。
22.—種抗原結合蛋白，其結合人心室肌球蛋白輕鏈l(vMLCl)，且其包含SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 17的⑶R3，或它們的含有⑶R3中的1、2或3個氨基酸置換的變體。
23.如在權利要求22中要求保護的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白包含下述的 CDR CDRHl(SEQ ID NO 18)、CDRH2(SEQ ID NO :19)、CDRH3(SEQ ID NO 20)、CDRLl(SEQ ID NO :14)、CDRL2(SEQ ID NO15)、CDRL3(SEQ ID NO :16)。
24.如在權利要求22或23中要求保護的抗原結合蛋白，其會結合小鼠和人vMLCl。
25.如在權利要求22-24中的任一項中要求保護的抗原結合蛋白，其中所述抗原結合蛋白是抗體。
26.如在權利要求25中要求保護的抗體，其中所述抗體是人源化的或嵌合的抗體。
27.如在權利要求2216中的任一項中要求保護的抗原結合蛋白或抗體，其包含選自 SEQ ID NO :22、25、28 或 31 的 VH 結構域，和選自 SEQ ID NO :34、37 或 440 的 V κ 結構域。
28.如在權利要求27中要求保護的抗原結合蛋白或抗體，其包含具有在SEQID NO 31中所述的序列的VH結構域，和具有在SEQ ID NO 37中所述的序列的Vk結構域。
29.如在權利要求22-28中的任一項中要求保護的抗原結合蛋白或抗體，其中所述抗原結合蛋白包括 Fab、Fab，、F (ab，)2、Fv、diabody、triabody、tetrabody、微型抗體、分離的 VH、分離的VK或dAb。
30.一種核酸分子，其編碼如在權利要求22-29中的任一項中要求保護的抗原結合蛋白或抗體。
31.一種用第一種載體和第二種載體轉化或轉染的宿主細胞，其中所述第一種載體包含編碼根據權利要求22-29中的任一項所述的抗原結合蛋白或抗體的重鏈的核酸分子，且所述第二種載體包含編碼根據權利要求22-29中的任一項所述的抗原或抗體的輕鏈的核酸分子。
32.—種抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。
33.如在權利要求30中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其以在下述范圍內的解離常數(Kd)結合c-Kit IOpM至10微摩爾，在一個實施方案中，IOOpM至10微摩爾，或0. 1微摩爾至1微摩爾。
34.一種分離的多肽，其包含抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域。
35.如在權利要求34中要求保護的分離的多肽，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的至少一個氨基酸序列具有至少70%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列，且所述分離的多肽結合c-Kit。
36.一種分離的多肽，其包含由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼的氨基酸序列。
37.一種分離的多肽，其由核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列與在圖6、SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384或476中所述的任一個核酸序列具有至少60% 同一性，且所述分離的多肽結合c-Kit。
38.如在權利要求32-35中要求保護的分離的多肽，其結合人c-Kit。
39.如在權利要求34-38中的任一項中要求保護的分離的多肽，其結合人和小鼠 c-Kit。
40.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列具有至少90%同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300,383-384 或 476 中的任一個所述的序列。
41.如在權利要求40中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由 SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300,383-384 或476所述的任意核酸序列編碼。
42.如在權利要求41中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列與由鑒別為D0iC8h-5(SEQ ID NO :39)、D0M28h-43 (SEQ ID NO 51)、D0M28h-33 (SEQ ID NO :49)、D0M28h_94 (SEQ ID NO :65)、D0M28h_66 (SEQ ID NO 58)、D0M28h-110(SEQ ID NO :70)、D0M28h_84 (SEQ ID NO :62)、D0M28m_23 (SEQ ID NO 81)、D0M28m-7 (SEQ ID NO :78)、D0M28m_52 (SEQ ID NO :84)、D0M28h_79 (SEQ ID NO 61)、D0M28h-7 (SEQ ID NO :41)、D0M28h_20 (SEQ ID NO :45)、D0M28h_26 (SEQ ID NO :48)、 D0M28h-78 (SEQ ID NO :60)、D0M28h_73 (SEQ ID NO :59)或D0M29h_54 (SEQ ID NO :55)的任一個核酸序列編碼的氨基酸序列相同。
43.如在權利要求40-42中的任一項中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域結合人c-Kit。
44.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶Rl序列所述⑶Rl序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDRl序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個所述的序列。
45.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶R2序列所述⑶R2序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR2序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個所述的序列。
46.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個所述的序列。
47.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個氨基酸位置處被修飾， 且包含這樣的⑶Rl序列所述⑶Rl序列與由下述核酸編碼的任一個氨基酸序列中的⑶Rl 序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO 39-87、2對_246、270-282、297-300、 383-384或476中的任一個所述的序列，且包含這樣的⑶R2序列所述⑶R2序列與由下述核酸編碼的任一個氨基酸序列中的⑶R2序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。
48.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶Rl序列所述⑶Rl序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDRl序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個所述的序列。
49.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含這樣的氨基酸序列所述氨基酸序列由具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282,297-300, 383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼，其在不超過25個氨基酸位置處被修飾，且包含這樣的⑶R3序列所述⑶R3序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87,224-246,270-282, 297-300、383-384或476中的任一個所述的序列。
50.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含在不超過 25 個氨基酸位置處被修飾的 SEQ ID NO 39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或476的氨基酸序列，且包含這樣的CDRl序列所述CDRl序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的⑶Rl序列具有至少50%同一性，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、 224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個所述的序列，且包含這樣的CDR2序列所述CDR2序列與由下述的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR2序列具有至少50% 同一性，所述核酸具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。
51.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含與下述任一個所述的序列具有至少50%同一性的⑶R3序列在由具有SEQ ID NO =39-87, 224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列。
52.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含選自下述的 CDR3 序列在由具有 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383_384 或 476中的任一個所述的序列的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的CDR3序列。
53.如在權利要求32中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含至少一個選自CDR1、CDR2和CDR3的CDR，其中所述CDRU CDR2或CDR3與在由具有SEQ ID NO 39-87,224-246,270-282,297-300,383-384或476中的任一個所述的序列的核酸編碼的任一個氨基酸序列中的⑶Rl、⑶R2或⑶R3序列相同。
54.如在權利要求40-53中的任一項中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含至少一個選自圖7所述⑶R序列的⑶R。
55.一種核酸分子，其包含編碼如在權利要求32-54中的任一項中要求保護的多肽或抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域的核酸序列。
56.一種核酸分子，其包含 SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476中的任一個所述的核酸序列。
57.一種配體，其具有對c-Kit的結合特異性，并抑制抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域的結合，所述單個可變結構域包含由下述的核酸編碼的氨基酸序列，所述核酸具有SEQ ID NO :39-87、224-246、270-282、297-300、383-384 或 476 中的任一個所述的序列。
58.如在權利要求32-57中的任一項中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體，其以基本上不抑制SCF的c-Kit受體結合和/或活化的方式，結合c-Kit。
59.如在權利要求58中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體，其包含選自下述的氨基酸序列由D0M28h-5 (SEQ ID NO :39)、D0M28h-33 (SEQ ID NO 49)、D0M28h-43 (SEQ ID NO :51)、D0M28h_66 (SEQ ID NO :58)、D0M28h_84 (SEQ ID NO 62)、D0M28h-94 (SEQ ID NO :65)、D0M28h_110 (SEQ ID NO :70)、D0M28m_7 (SEQ ID NO :78)、 D0M28m-23 (SEQ ID NO :81)或 D0iC8m_52 (SEQ ID NO :84)中的任一個所述的核酸序列編碼的氨基酸序列。
60.如在權利要求32-57中的任一項中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體，其以基本上抑制SCF的c-Kit受體結合和/或活化的方式，結合c-Kit。
61.如在權利要求60中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其包含選自下述的氨基酸序列由 D0iC8h-7(SEQ ID NO :41)、D0M28h_20 (SEQ ID NO :45)、 D0M28h-26 (SEQ ID NO :48)、D0M28h_54 (SEQ ID NO :55)、D0M28h_73 (SEQ ID NO :59)、 D0M28h-78 (SEQ ID NO :60)或 D0iC8h_79 (SEQ ID NO :61)中的任一個所述的核酸序列編碼的氨基酸序列。
62.如在權利要求32-61中的任一項中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體，其顯示出人和小鼠c-Kit之間的交叉反應性。
63.如在權利要求62中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體，其包含選自下述的氨基酸序列由D0iC8h-5(SEQ ID NO 39), D0M28h-94 (SEQ ID NO: 65)、D0M28m-7 (SEQ ID NO 78), D0M28m-23 (SEQ ID NO :81) ^P D0M28m-52 (SEQ ID NO :84) 中的任一個所述的核酸序列編碼的氨基酸序列。
64.一種用于生產如任一項前述權利要求要求保護的抗原結合構建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個可變結構域或配體的方法，所述方法包括在適合表達重組核酸的條件下，維持包含重組核酸的重組宿主細胞，所述重組核酸編碼所述抗原結合構建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個可變結構域或配體，由此表達重組核酸，生產抗原結合構建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個可變結構域或配體。
65.如在權利要求64中要求保護的方法，所述方法另外包括分離所述抗原結合構建體、蛋白、抗體、多肽、免疫球蛋白單個可變結構域或配體。
66.如在權利要求32-M或57-63中的任一項中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域、多肽或配體，其用于靶向c-Kit，用于治療與c-Kit受體活化有關的疾病或障礙。
67.如在權利要求66中要求保護的抗-c-Kit免疫球蛋白單個可變結構域，其中所述疾病或障礙是肥大細胞障礙或癌癥，包括小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、婦科腫瘤或神經母細胞瘤。
68.一種藥物組合物，其包含如在權利要求32-M或57-63中的任一項中要求保護的免疫球蛋白單個可變結構域多肽或配體。
69.一種裝置，其包含如在權利要求32-M或57-63中的任一項中要求保護的免疫球蛋白單個可變結構域多肽或配體，其中所述免疫球蛋白單個可變結構域連接在所述裝置的表面上。
70.如在權利要求69中要求保護的裝置，其中所述裝置是支架。
71.如在權利要求1-19中的任一項中要求保護的抗原-結合構建體，其用于治療心臟病。
72.如在權利要求1-19中的任一項中要求保護的抗原-結合構建體，其用于治療肌肉病。
73.一種藥物組合物，其包含如在權利要求1-19中的任一項中要求保護的構建體。
74.如在權利要求73中要求保護的藥物組合物，其另外包含細胞因子。
75.如在權利要求74中要求保護的藥物組合物，其中所述細胞因子選自SCF、G-CSF, SDF-I、AMD3100、VEGF, FGF 和 DPP-IV 抑制劑。
76.一種治療心臟病的方法，所述方法包括施用如在權利要求1-19中的任一項中要求保護的抗原-結合構建體。
77.如在權利要求76中要求保護的方法，所述方法另外包括施用細胞因子。
78.如在權利要求77中要求保護的方法，其中所述細胞因子選自SCF、G-CSF、SDF-I、 AMD3100、VEGF, FGF 和 DPP-IV 抑制劑。
79.如在權利要求76-78中的任一項中要求保護的治療心臟病的方法，所述方法包括 從患者提取骨髓細胞，在體外處理所述細胞，并使所述細胞返回患者，然后施用構建體。
80.如在權利要求76-78中的任一項中要求保護的治療心臟病的方法，所述方法另外包括施用化合物，以增強干細胞存活、分化或增殖。
81.如在權利要求80中要求保護的方法，其中所述化合物選自VEGF、FGF、他汀類藥物、 SDF-I、CXCR4 或 SDF-I β P2G。
全文摘要
本發明描述了一種抗原-結合構建體，其包含結合干細胞特異性的標志物分子的第一種藥劑，和結合組織特異性的標志物分子的第二種藥劑。具體地，本發明描述了一種構建體，其中所述組織特異性的標志物是肌肉特異性的標志物分子。這樣的構建體可以用于藥物組合物中，所述藥物組合物用于肌肉再生或心臟病。
文檔編號A61K38/19GK102481340SQ201080025008
公開日2012年5月30日 申請日期2010年5月26日 優先權日2009年5月28日
發明者C·埃內弗, E·庫爾斯托克, E·德安格利斯, J·埃德爾伯格, S·霍爾姆斯, T·D·巴圖萬加拉, V·巴拉德, Z·賈瓦德-阿拉米 申請人:葛蘭素集團有限公司