支原體感染癥用疫苗的制作方法

專利名稱：支原體感染癥用疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用支原體等各細菌中的特異性脂質抗原的細菌樣粒子以及使用該粒子的高安全性的高性能支原體感染癥用疫苗，以及使用該疫苗的支原體感染癥的預防或治療方法。
背景技術：
已知支原體感染人類、家畜甚至寵物等動物，引起種種疾病。尤其對于人類，懷疑不僅肺炎與支原體有強烈的關聯性，也懷疑通過慢性化或反復感染，哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等呼吸系統疾病、風濕性關節炎等風濕性疾病(非專利文獻1)、多發性硬化癥等神經疾病等與支原體也有強烈的關聯性，因而支原體最有可能成為導致現今稱為疑難雜癥的慢性疾病的致病微生物(圖1，非專利文獻31、32)。已知支原體感染可從發燒、咳嗽、肺炎等感冒癥狀而發病，轉變成哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多發性硬化癥和風濕性疾病的病例，還已知此時因癥狀反復復發、加重， 會逐漸轉變為慢性疾病，所以，早期診斷、早期治療，尤其是預防、治療加重(癥狀逐漸惡化)或復發(癥狀減輕后再度惡化)特別重要。但是，由于以往的檢查方法不容易把握支原體感染的診斷或治療經過而不能詳細了解病情，因此，現狀為大量患者不能受到適當治療。作為支原體感染的診斷方法， 現在最廣泛使用的是血清診斷法，以往的診斷法為大量培養肺炎支原體(mycoplasma pneumonia)，使用來自該菌體的粗提取物進行抗體測定法，在特異性、檢測靈敏度、定量性方面存在問題，所以支原體感染的早期診斷仍具有困難。本發明人等從現狀出發，著眼于屬于支原體屬的各種細菌表面的脂質抗原，從而發現了多種細菌特異性脂質抗原。將上述特異性脂質抗原分離純化并確定結構，也成功地進行了其中幾個的化學合成(專利文獻1 8)。與以往的診斷藥相比，對于支原體感染癥使用上述特異性脂質抗原的診斷藥，可建立具有特異性和靈敏度高、定量測定抗體效價變化的方法，大致可解決迄今仍為問題點之一的支原體感染的早期診斷問題。然而，對于支原體感染癥的治療藥，作為現在最可預期治療效果的治療藥，實用化的有大環內酯類(macrolide)、新喹諾酮(new quinolone)類、四環素類等部分抗生素，但上述抗生素不僅副作用大，耐藥菌的出現也是個大問題，對支原體感染癥無法預期到充分的治療效果，進一步成為導致病情加重進而轉變成慢性疾病的原因。另一方面，對于人類，尚未開發支原體的疫苗療法。其理由是活疫苗、減毒疫苗等有安全性問題，很難實用化，死疫苗等存在因培養液混入馬血清等而引起過敏反應問題。此外，為了鑒定疫苗誘導的相關特異性抗原蛋白，進行肽或DNA解析，但尚不能列舉鑒定的有效特異性抗原蛋白。將豬或牛等家畜用的以往使用的活疫苗或減毒疫苗等再進一步改良 (專利文獻9 12)。還開發了使用蛋白抗原的疫苗(專利文獻13 15)，最近開發以與支原體感染癥引起的組織損傷相關的酶作為靶點的疫苗(專利文獻16)，但上述疫苗都只限于肺炎抑制效果或炎癥抑制效果，對于家畜用疫苗也還不能說是毒性少且有效的疫苗。綜上，由于尚未發現對于支原體感染癥有效的預防和治療方法，因此，開發支原體感染癥用的有效的預防/治療藥，尤其是支原體感染癥用的疫苗成為當務之急。在制造各種病原性病毒疫苗方面，已知有制成對象病原性病毒樣粒子，使用該病毒樣粒子進行免疫，獲得高免疫應答，使用該病毒樣粒子也可推進開發高活性且高安全性的疫苗制劑(非專利文獻幻。在病毒的抗原肽方面，也有加入脂質體等的疫苗使其實用化的動向(非專利文獻3)。病毒是利用細胞機理將結構蛋白或酶等自我復制，并用細胞膜包覆后向細胞外釋放進行增殖。因此，不存在細胞膜脂質抗原，疫苗幾乎全為病毒粒子或蛋白抗原。病毒不僅大小非常小，其表面的構成成分也少，因此提供仿真病毒粒子，即提供對于生物體的免疫系統引起病毒自身侵入錯覺的病毒樣粒子比較簡單。另一方面，對包含支原體的細菌類的情況，可通過DNA自我復制，基本上也獨立產生脂質膜構成成分，所以膜脂質成分對于各種細菌為特異性且復雜的。所以除了細胞膜構成成分或膜脂質的解析困難之外，若考慮到細胞成分或膜蛋白等，則橫跨多個領域，很難簡單地只用其中的1個成分模擬支原體本身，所謂支原體樣粒子、細菌樣粒子的概念并不成熟。通常，尚不明確上述多種的成分中何種成分必須留下且使用何種粒子化技術可提供支原體樣粒子，也不明確上述支原體樣粒子對于生物免疫系統是否會引起支原體感染錯覺的免疫應答。專利文獻20 國際公開 2002/098465 (W02002/098465)專利文獻21 日本特開2008-37831號公報專利文獻22 日本特開2001-69977號公報專利文獻23 日本特開2002-241313號公報專利文獻M 日本發明專利第觀觀391號專利文獻25 日本特開2004-010481號公報專利文獻沈日本發明專利申請2007-288728號公報專利文獻27 日本發明專利第觀觀391號非專利文獻非專利文獻ι 松田和洋特集ι ο m感染癥們基礎i臨床慢性関節1J , ι +乃関節破壊原因物質i Θ Mycoplasma fermentans特異二 1J >含有糖丨」>脂質微生物 i 臨床 30 75-79 (2003)非專利文獻 2 :Influenza virus-like particle vaccines. Haynes JR. Expert Rev.Vaccines. 2009 Apr ；8 (4) :435-45. Review非專禾丨J 文獻 3 Immunobiology of human papillomavirus infection and vaccination implications for second generation vaccines. Stanley M. Gissmann L.Nardelli-Haefliger D.Vaccine. 2008 Aug 19:26 Suppl 10 :K62-7, Review.非專利文獻4 :Mol. Immunol. 25 :10,1025-1031，1988非專利文獻 5 :Matsuda K, Saito Μ, Yamamoto N, Encyclopedia of Life Science. Vol. 1 p748_755, Nature publishing group, (2001)非專禾Ij文獻 6 :M. Kraft Q. &Hamid，J Allergy Clin Immunol 117， 1197-1198(2006).非專利文獻7 :M. Kraft, G. H. Cassell, J. E. Henson, H. Watson, J. Williamson, B. P. Marmion， C. A. Gaydos&R. J. Martin， Am J Respir Crit Care Med 158,998-1001. (1998)# 專禾Ij 文 ^ 8 :F. Meloni, Ε. Paschetto, P. Mangiarotti, Μ. Crepaldi, Μ. Morosini, Α.Bulgheroni&A. Fietta, J Chemother 16,70-76. (2004)# 專禾I」文■ 9 Haier， Μ· Nasrallii， A. R. Franco&G. L. Nicolson， Rheumatology(Oxford)38，504-509. (1999)非專利文10 :H. W. Clark, Μ. R. Coker-Vann, J. S. Bailey&T. M. Brown, Ann Allergy 60，394-398. (1988)非專利文獻11 :E. Maida, J. Neurol 229，103-111. (1983)非專利文獻12 :G. L. Nicolson, Μ. Y. Nasralla, J. Haier&J. Pomfret, J Clin Neurosci 9，525—529. (2002)# 專禾Ij 文 ^ 13 :F. Daxbock, K. Zedtwitz-Liebenstein, H. Burgmann&ff. Graninger, Ann Hematol 80，180—182. (2001)非專利文獻14 :C. Leen, S. &Ling, Arch Dis Child 75，266-267. (1996)非專利文獻 15 :J. Nijs，G. L. Nicolson，P. De Becker,D. Coomans&K. De Meirleir, FEMS Immunol Med Microbiol 34，209-214. (2002)
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發明內容
本發明的目的是提供對于支原體感染癥的治療效果好且安全的疫苗以及開發有效的支原體感染癥的預防和治療方法。而且，本發明的目的是提供支原體樣粒子以及進一步包含常見細菌的細菌樣粒子作為有效的該支原體感染癥用疫苗。本發明人等分離純化以往人類或豬等各種病原性支原體的各種特異性脂質抗原， 尤其對于作為人類病原性的肺炎支原體特異性脂質抗原的GGL Glc型、GGL Gal型及作為發酵支原體特異性脂質抗原的GGPL-I、GGPL- III，分別確定其結構后，還成功進行了化學合成(專利文獻1 8)(非專利文獻幻。本發明人等使用上述特異性脂質抗原，開發并建立了可以高靈敏度、特異性地檢測血清中抗體的支原體感染癥的診斷法，更進一步著眼于上述各脂質抗原對各支原體種的特異性，以使用上述脂質抗原制造有效的疫苗制劑為目標， 繼續進行研究。從以往盛行的研究開發穩定的疫苗制劑用載體，在開發將免疫原涂覆在粒子表面的疫苗組合物等(專利文獻17)的同時，也在開發利用脂質體作為載體，將抗原蛋白或各種過敏原等借助疏水性肽等結合在脂質體膜表面的脂質體制劑作為診斷用或疫苗用制劑使用的技術(專利文獻18 20)。此外，已知使用結合了抗原的磷脂制成的脂質體確認具有 T細胞活化劑作用的例子(專利文獻21)。相反，抗原為磷脂抗原時，雖用作為脂質體膜構成成分進行吸收，利用與抗體的反應和通過補體作用使脂質體被破壞的性質的抗體檢測法 (補體依賴性脂質體溶解檢測)，但只限用于磷脂抗原的抗體篩選或診斷(專利文獻22、非專利文獻4)。本發明人等著眼于支原體在細菌中為最小、幾乎無細胞壁、細胞膜結構簡單且細胞膜的主要成分為脂質膜這些方面，考慮對純化的特異性脂質抗原進行穩定且均一的脂質體粒子化。聯想到只要是上述脂質體粒子，作為支原體樣粒子在與活體免疫系統作用時，就有引起與支原體感染相同的免疫應答的可能性。本發明人等除了分別將肺炎支原體及發酵支原體2種的脂質抗原的化學合成品進行純化，并研究各種脂質體成形法的基礎上，在穩定的脂質體粒子化方面也取得成功。此外，成為豬支原體癥原因的豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)及豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae)的特異性脂質抗原分離、純化后，用同樣的方法可將脂質體粒子化。進一步地，以支原體細胞膜脂質構成成分的解析結果，與特異性脂質抗原一起，還模擬至構成模擬粒子的脂質成分的脂肪酸組成，制成最簡單的功能性粒子。使用由此制作的支原體樣粒子，對各種模型實驗動物進行免疫，可確認任何一種粒子都具有誘導強的免疫應答的疫苗效果。特別是，使脂質成分與支原體細胞膜構成成分一致且將粒徑進行均一調整的支原體樣粒子具有高的免疫誘導活性。從進行支原體樣粒子活性分析的結果表明，雖為非常簡單的構成成分，但可充分反映支原體免疫學的活性，并且穩定。包括脂質抗原以外的磷脂或膽固醇等脂肪酸部分，通過基于支原體成分分析的構成成分，更準確地反映活體內對于支原體的免疫應答。以往利用脂質體的疫苗是使構成脂質體的脂質與蛋白、肽、糖等結合并同時混入脂質體內，由于脂質抗原即為脂質體的構成成分，因此本發明的脂質抗原細菌樣粒子完全是非常簡單的粒子，具有穩定、毒性小、安全性也高的特點。
此外，可確認呈現作為佐劑的作用效果(非專利文獻33)。可確認以本發明的特異性脂質抗原為基礎的免疫誘導活性不只誘導IgG及IgM，還誘導粘膜性的IgA，強烈顯示作為粘膜性免疫用佐劑的可利用性。對于支原體以外的各種病原性細菌，本發明人等也適用支原體特異性脂質抗原的研究方法，確認存在各個特異性脂質抗原。使用上述特異性脂質抗原，可制成誘導對各細菌種具有特異性活性的細菌樣粒子。而且，上述細菌類各自的構成細胞膜的脂質成分的脂肪酸組成不同，根據對各細菌的脂質成分分析結果，應用支原體的最優化方法，設定最適當的脂質體的組成及粒徑，可制造各細菌的細菌樣粒子及使用上述粒子的疫苗。由以上觀點而完成本發明。S卩，具體而言，本發明為如下所述。[1] 一種細菌樣粒子，其特征在于，所述細菌樣粒子由脂質體粒子制成，所述脂質體粒子含有1種或多于1種的病原性細菌特異性脂質抗原作為構成脂質體的脂質成分 (liposome-consitituting lipid component)。[2] 一種支原體樣粒子，其特征在于，所述支原體樣粒子由脂質體粒子制成，所述脂質體粒子含有1種或多于1種的支原體特異性脂質抗原作為構成脂質體的脂質成分。[3]如上述[2]記載的支原體樣粒子，其中，前述支原體特異性脂質抗原的至少1 種是從支原體菌體配制物提取后，經分離純化的支原體特異性糖脂。[4]如上述[2]記載的支原體樣粒子，其中，前述支原體特異性脂質抗原的至少1 種是在化學合成或酶合成后，經分離純化的特異性糖脂。[5]如上述[2] [4]中任一項記載的支原體樣粒子，其中，前述支原體特異性脂質抗原的至少1種為肺炎支原體特異性脂質抗原或發酵支原體特異性脂質抗原。[6]如上述[2] [5]中任一項記載的支原體樣粒子，其特征在于，作為前述構成脂質體的脂質成分，進一步含有磷脂酰膽堿、磷酸甘油及/或膽固醇。[7]如上述[2] [6]中任一項記載的支原體樣粒子，其中，將含有前述支原體特異性脂質抗原的構成脂質體的脂質成分在溶劑中混合后，通過超聲波處理，以使粒徑在 30 300nm范圍內、且粒子的80%以上在40 200nm范圍內的條件下進行粒子化。[8]如上述[2] [7]中任一項記載的支原體樣粒子，其特征在于，所述支原體樣粒子為使其他抗原性物質存在于前述脂質體粒子表面的支原體樣粒子，通過前述支原體特異性脂質抗原的佐劑效果，提高所述其他抗原性物質的抗原性。[9]如上述[8]記載的支原體樣粒子，其中，前述其他抗原性物質為源自病毒的抗原肽。[10] 一種支原體感染癥的預防或治療用疫苗，其中，含有如上述[2] [7]中任一項記載的支原體樣粒子作為有效成分。[11]如上述[10]記載的支原體感染癥的預防或治療用疫苗，其中，前述支原體感染癥為肺炎、哮喘或風濕性疾病。[12] 一種支原體感染癥的預防或治療方法，其特征在于，包含對于罹患或疑似罹患支原體感染癥的人類或動物至少給予1次如上述[10]或[11]記載的支原體感染癥的預防或治療用疫苗的步驟。[13]如上述[12]記載的支原體感染癥的治療方法，其特征在于，在使用前述疫苗治療支原體感染癥的治療方法中，在給予前述疫苗之前及/或之后，設置測定支原體種特異性脂質抗原量或該脂質抗原特異性抗體量的步驟，并包含根據該測定值的大小決定下次疫苗給藥時機及給藥量的步驟。[14] 一種病毒感染癥的預防或治療用疫苗，其特征在于，將如上述[9]記載的、在粒子表面存在源自病毒的抗原肽的支原體樣粒子作為有效成分。[15]如上述[14]記載的疫苗，其中，前述病毒為流感病毒，前述病毒感染癥為流感。[16] 一種病毒感染癥的預防或治療方法，其特征在于，包含對于罹患或疑似罹患病毒感染癥的人類或動物給予如上述[14]或[15]記載的病毒感染癥的預防或治療用疫苗的步驟。[17]如上述[16]記載的預防或治療方法，其中，前述病毒為流感病毒，前述病毒感染癥為流感病毒感染癥。細菌樣粒子，其特征在于，該細菌樣粒子由脂質體粒子制成，所述脂質體粒子含有病原性細菌特異性脂質抗原作為構成脂質體的脂質成分。本發明的支原體樣粒子等細菌樣粒子可提供作為粒徑均一的穩定的脂質體制劑。 將上述細菌樣粒子給予人類或豬等哺乳動物，可高效率地誘導強的體液性免疫和細胞性免疫，且粘膜性免疫的IgA誘導活性也高，不僅可作為支原體感染癥用的疫苗制劑使用，還可作為病毒或其他病原微生物感染癥用疫苗的佐劑、IgA誘導性佐劑使用。上述疫苗制劑、佐劑制劑無毒性，可提供安全且穩定的制劑，因而非常有用。此外，尤其為IgA誘導性佐劑時， 由于作為現有的有效性高的佐劑，只有如金屬鋁這樣高毒性的佐劑，因而具有非常劃時代的意義。對于人類的支原體感染癥，根據本發明人等以前的研究，也建立對所有成為該感染癥原因的發酵支原體及肺炎支原體的診斷方法，根據本發明提供的疫苗制劑，可建立以支原體感染癥的病理分子機制為基礎的診斷系統、預防系統和治療系統。


圖1為支原體感染與疾病關聯的概念圖。圖2為支原體感染癥的急性癥狀及慢性化。圖3為細菌樣粒子(支原體樣粒子)的概念圖。圖4脂質體粒徑的質量管理(C)為根據粒度測定儀(zetasizer)的脂質體粒徑的測定值。圖5源自經純化的發酵支原體的抗原脂質GGPL-I及GGPL- III的定量分析。圖6為各種細菌脂質成分的比較在大腸桿菌、綠膿菌、肺炎球菌、肺炎桿菌、流感嗜血桿菌及軍團菌(Legionella)中，可確認特異性脂質的存在。圖7為使用肺炎支原體樣粒子誘導IgG和IgM抗體。圖8為通過使用發酵支原體樣粒子(合成GGPL-III)的SKG系統小鼠(自體免疫疾病模型)的腹腔內免疫，誘導IgG及IgM抗體。圖9為使用發酵支原體活菌制作動物模型。通過對經氣管模型及經膝關節模型的兔子給藥實驗，觀察血中IgG抗體效價的上升(疫苗活性)。
圖10為對使用發酵支原體樣粒子的動物模型的合成脂質抗原免疫功能引發效應 (priming effect) 0對于發酵支原體感染風濕性關節炎模型的兔子，在腹腔內以發酵支原體樣粒子進行多次免疫，可抑制關節病變。圖11為源自風濕性關節炎患者的滑膜細胞內的發酵支原體脂質抗原(GGPL-III) 的分布。圖12為幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的脂質抗原及干擾素-Y誘導活性。圖13為源自動物的支原體(豬鼻支原體及豬肺炎支原體)特異性脂質抗原的檢測。圖14為發酵支原體特異性脂質抗原(GGPL-III)的佐劑效果。左圖為先在小鼠耳朵同時給予金屬鎳(抗原)及發酵支原體樣粒子(GGPL-III)，確認是用量依賴性(給予 0. 2mg/mL及lmg/mL)的提高抗體產量的效果。圖15表示含有支原體肺炎的呼吸系統疾病的患者血清中的血清抗體效價根據使用肺炎支原體特異性抗原GGL Glc-型的ELISA法測定IgA的結果。確認在人類血清中可誘導IgA抗體，確認作為粘膜免疫佐劑。圖16支原體樣粒子的細胞免疫活性。使用人類的末梢血單核細胞，比起單獨給予白介素-2時，在加入支原體樣粒子(GGPL-I、GGPL-III)時，確認干擾素的產量增加 2倍以上。從健康人的末梢血分離單核細胞，培養在其中加入白介素-2及脂質抗原的樣品及未加入上述物質的樣品，回收上清液，用酶抗體免疫法(ELISA法)測定該上清液中干擾素-Y的量。圖17為年輕風濕性關節炎患者的肺炎支原體及發酵支原體抗體效價的測定結果 (ELISA 法)。圖18為結節病(sarcoidosis)患者的肺炎支原體及發酵支原體抗體效價的測定結果(ELISA法)。圖19為多發性硬化癥患者血清抗體的變化。圖20為小兒肺炎支原體的診斷-預防-治療方案。圖21為成人肺炎支原體的診斷-預防-治療方案。圖22為自體免疫疾病等慢性支原體感染癥的診斷-預防-治療方案。圖23為支原體樣脂質體粒子組成的研究。圖M為支原體樣脂質體粒子給藥法的最優化。圖25為支原體特異性脂質抗原(GGL)的定量(質譜分析法)。圖沈為沉淀于風濕性關節炎患者關節組織的發酵支原體特異性脂質抗原 GGPL- III的檢測(通過質譜分析裝置)。圖27為從被檢患者的咽拭子鑒定肺炎支原體特異性脂質抗原峰。
具體實施例方式1.關于支原體感染癥已知支原體會感染人類、家畜甚至寵物等動物，引起種種疾病。尤其對于人類，支原體不僅為肺炎的原因，也是以下疾病的原因哮喘(非專利文獻6、7)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)(非專利文獻8)等呼吸系統疾病、風濕性關節炎等風濕性疾病(非專利文獻9、10)、 多發性硬化癥(非專利文獻11)或肌萎縮側索硬化癥(ALS)(非專利文獻12)/格林-巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome)等神經疾病、溶血性貧血(非專利文獻1 等血液疾病、異位性皮膚炎等過敏性疾病、動脈炎/動脈硬化/川崎病(非專利文獻14)等心血管疾病或慢性疲勞綜合征(CM)(非專利文獻15)/纖維肌痛癥(FMQ (非專利文獻16)等精神疾病、海灣戰爭綜合征等。支原體感染被認為造成哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多發性硬化癥、風濕性疾病等慢性頑固性疾病最有力的候選原因。但是，尚未確立追蹤慢性疾病發展經過的特異性定量性診斷法及治療法，所以不能充分表明與病情的關聯，不能進行適當的治療。(圖1)支原體感染有從發熱、咳嗽、肺炎等感冒癥狀開始發病，轉變為哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、多發性硬化癥、風濕性疾病的病例(非專利文獻17、18)。已知此時癥狀反復復發、惡化，進而轉變為慢性疾病。由于以往的檢查方法不容易把握支原體感染的診斷或治療經過而不能詳細了解病情，因此，現狀為大量患者不能受到適當治療。(非專利文獻19) (圖2)已知豬、牛等家畜的支原體感染癥也會引起嚴重的疾病。例如，豬鼻支原體或豬肺炎支原體為豬呼吸系統感染癥的致病菌之一，牛支原體(Mycoplasma bovis)為牛呼吸系統感染癥的致病菌之一。2.關于支原體特異性抗原脂質(2-1)病原性支原體特異性脂質抗原的種類作為人類病原性支原體，現在已知有肺炎支原體及發酵支原體，本發明人等將各個支原體特異性脂質抗原中的2種分別分離純化，確定結構后進行化學合成(專利文獻 1 8、非專利文獻20 27)。具體而言，肺炎支原體有GGL Glc-型及GGL fell-型2種，發酵支原體有GGPL-I及GGPL- III 2種。已知豬、牛等家畜的支原體感染癥也會引起嚴重的疾病。例如，在豬中，豬鼻支原體或豬肺炎支原體引起豬支原體肺炎等呼吸系統感染癥；在牛中，牛支原體引起牛支原體肺炎等呼吸系統感染癥或支原體乳腺炎等疾病。這次，也將豬鼻支原體或豬肺炎支原體各自的特異性脂質抗原分離純化，進行脂質體粒子化(圖4)，對所獲得的支原體樣粒子進行免疫活性評估實驗，確認其免疫活性效果(圖13)。(2-2)支原體特異性脂質抗原的制造方法本發明中所謂“支原體特異性脂質抗原”，可為從對象支原體的膜分離純化的該支原體特異性脂質抗原，優選使用在該脂質的化學結構式為已知的情況(GGPL-I、GGPL-III、 GGL Glc-型或GGL (ial-型等)或使用根據下述的方法確定結構后進行化學合成、 純化的脂質化合物(專利文獻1 8)。例如，另外，可確定對象支原體的特異性脂質合成酶，使用該酶本身或將該酶基因進行克隆，使用轉化細胞，可大量獲得作為其酶合成品的特異性脂質抗原(非專利文獻28)。以下，對于典型的發酵支原體特異性脂質抗原GGPL-III的提取、分離純化、確定結構等制造方法進行詳細敘述。這些方法不僅適用于其他支原體特異性脂質抗原，也在微生物上適用于衣原體、立克次氏體、結核桿菌、肺炎球菌等其他病原性細菌的特異性脂質抗原的提取、分離純化、結構確定。
(2-3)支原體特異性脂質抗原的分離、純化、結構確定以下，將源自發酵支原體特異性脂質抗原(GGPL-III)的例子作為典型例進行說明 (根據專利文獻3等的方法)。(1)糖脂的分離、純化用PPLO培養基按照以下的方法培養支原體。加入10%牛血清、10%青霉素、 0.0002%酚紅及葡萄糖的PPLO液體培養基(Difco社制造)中，37°C進行培養。根據培養基PH值的變化確認微生物的增殖后，以16，OOOXg離心分離1小時。重復該操作一次， 作為脂質提取用的樣品。對200L (濕潤狀態的容量)的微生物樣品用氯仿與甲醇的混合溶劑提取脂質成分。(2)脂質的提取(GGPL-III)將樣品懸浮在甲醇中溶解4小時，加入兩倍量的氯仿，用超聲波將菌體粉碎，再放置4小時。以3000rpm離心，回收上清液，濃縮，作為脂質成分樣品。將該脂質樣品通過填充硅膠的柱層析色譜法，使用氯仿及甲醇進行分離、純化。通過薄層層析色譜法(TLC)將脂質樣品展開，用苔黑酚試劑染色、純化，獲得目標糖脂成分。(3)匪R 分析將獲得的脂質成分溶解于DMS0-d6 D2O = 98 2溶液，于SOt^lJSlH-NMIL獲得在100% DMS0-d6中測定的DQF-COSY光譜歸屬的數據。(4)質譜分析對獲得的脂質成分通過ESI-MS測定進行分析。(5)結構確定及化學合成將上述(3)、(4)的數據一起進行糖脂大致的結構確定，為了確定結構，通過化學合成，以立體選擇性及位置選擇性合成各個骨架。(6)通過與化學合成品的數據比較，確定結構將獲得的化學合成品與天然物在相同的DMS0-d6 D2O = 98 2、60°C的條件下進行1H-NMR測定、分析、比較該光譜。從合成品的光譜與天然物的光譜一致的結果，確定絕對結構。(2-4)酶合成法(根據非專利文獻觀的方法)檢索對象支原體的數據庫，使用作為候選的脂質合成酶基因，通過轉化大腸桿菌大量合成，確定對象的特異性脂質合成酶。也可使用該合成酶本身獲得酶合成品；或可使用該合成酶基因，在經轉化的轉化細胞內進行酶合成，在培養基內獲得大量的特異性脂質抗原。3.關于本發明中的細菌樣粒子作為對象的細菌在本說明書中，所謂“支原體樣粒子”是指將支原體各菌種的特異性脂質抗原加以純化，將純化的脂質抗原單獨作為脂質體粒子或與其他磷脂或膽固醇等脂質混合的脂質作為脂質體粒子，且在感染該支原體的生物體內的免疫系統中，可引起免疫應答的脂質體粒子。同樣地，所謂“細菌樣粒子”是指將病原性細菌各菌種的特異性脂質抗原加以純化，將純化的脂質抗原單獨作為脂質體粒子或與其他磷脂或膽固醇等脂質混合的脂質作為脂質體粒子，且在感染該病原性細菌種的生物體內的免疫系統中，可引起免疫應答的脂質體粒子。本發明的細菌樣粒子中使用的細菌，典型的是實施方式所使用的支原體，但是，不僅限于支原體，同樣地，只要是在細胞表面具有特異性抗原脂質的細菌類，即可將該特異性抗原脂質分離純化，在脂質體表面呈遞而制造細菌樣粒子。上述細菌類中，特別適用于大小或細胞表面結構與支原體類似的軍團菌等立克次氏體或衣原體等。此外，只要該特異性抗原脂質可分離純化并確定結構，就可進行化學合成，或可將該抗原脂質合成酶的基因進行克隆而進行酶合成。該方法適用于其他的幽門螺旋桿菌、衣原體、立克次氏體、結核桿菌、肺炎球菌等病原性細菌，同樣地，可制成脂質抗原粒子加以利用。圖6為各種細菌的脂質成分的比較， 確認了大腸桿菌、綠膿菌、肺炎球菌、肺炎桿菌、流感嗜血桿菌和軍團菌等各種菌的特異性脂質。具體而言，將各種菌大量培養，用氯仿-甲醇分離，用薄層層析色譜法展開。展開后用苔黑酚硫酸染色，檢測。此外，還已知在幽門螺旋桿菌中存在有特異性脂質抗原，可使用支原體的上述分離純化方法，取得純化的特異性脂質抗原，以與支原體樣粒子制作方法相同的方法制作幽門螺旋桿菌樣粒子。可確認該粒子在C57BL/6小鼠的骨髓細胞的干擾素-γ的誘導活性 (實施例13，圖12)。此情況證實，關于本發明支原體樣粒子的觀點也適用于幽門螺旋桿菌等其他細菌。4.細菌樣脂質體粒子的制作方法(4-1)關于脂質體“脂質體”為在內部含有水相的磷脂雙層的微泡，將脂質在相轉移溫度以上用足量的水進行水合而形成，以該脂質雙層的數目為基礎進行分類時，分為由多個脂質雙層形成的多層脂質體(MLV)及由單一脂質雙層形成的單膜脂質體，后者進一步以大小為基礎，分為小單層脂質體(SUV)、大單層脂質體(LUV、REV)及巨脂質體(GUV)。在本說明書中，稱為脂質體或脂質體粒子時，是指由單一脂質雙層形成的小單層脂質體(SUV)，直徑在數百納米以下。在本說明書中，最適當的脂質體粒徑依對象細菌而異，優選在數十至數百納米范圍內，盡可能為均一的粒徑。例如對于支原體，最好集中在約40 200nm的范圍。由于構成脂質體的磷脂是生物膜的主要構成成分，具有以下優點毒性低；可根據給藥目的、方法而控制粒子大小；以及通過在脂質體粒子表面導入官能基，可在脂質體中導入抗原、抗體、糖鏈等；可對目標部位進行靶向(目標指向化)。因此，廣泛進行了利用這些優點的制劑學研究(專利文獻23至沈)。在本發明中以脂質體粒子化的細菌樣粒子作為佐劑使用時，上述方法為可利用的技術。(4-2)含有脂質抗原的脂質體粒子的分析法(圖5)為了以本發明的支原體樣粒子等細菌樣粒子作為疫苗給藥，在粒徑及組成方面， 有必要總是以一定的穩定質量來提供細菌樣粒子。因此，脂質體粒子的粒徑測定及組成分析法的建立是重要的。在本說明書中，利用HPLC進行脂質體粒子的組成分析。通過該HPLC分析時，使用的檢測器并無特別限制，可使用紫外線吸收檢測器或蒸發光散射檢測器(WTjISELSD) 等。其中，從可將如脂質等非揮發性成分以高靈敏度檢測、可高精密度定量的觀點而言，以使用蒸發光散射檢測器(ELSD)較佳。
若使用HPLC進行脂質體的組成分析，則依據所使用色譜柱種類、使用的溶劑種類及流速，脂質體中的成分顯示特有的保留時間(樣品在色譜柱內滯留的時間)。由此可研究各成分的組成。可將以HPLC溶出的各成分定量。使用具有檢測器為ELSD或質譜分析儀的 HPLC，可將脂質體成分以高靈敏度、高精確度且簡便地進行組成分析，也可同時進一步進行正確的定量(圖幻。在實際的生產步驟中，質量管理通過HPLC進行分析，可確保穩定的質量。(4-3)本發明特異性脂質抗原的脂質體化方法已知脂質體的制作本身有許多方法[D. W. Deeamer，P. S. Uster，“Liposome”M. J. Ostro編著，Marcel Dekker Inc. N. Y.巴塞爾，1983，第27頁]。通常為渦旋法及超聲波法，除此之外，可適用乙醇注入法、醚法及逆相蒸發法等，也可將上述方法組合使用。例如，在渦旋法及超聲波法中，將預定的脂質溶解于有機溶劑，例如甲醇、乙醇、氯仿或上述的混合物(例如甲醇與氯仿的混合物)之后，將該有機溶劑蒸發除去，獲得脂質的薄層。接著，在該脂質薄層中加入水性介質，進行渦旋處理或超聲波處理，形成脂質體。此時，在上述水性介質中混入作為疫苗等活性成分的所期望的抗原或免疫原，通過例如溶解或懸濁，可將該抗原或免疫原封入脂質體中。脂質抗原溶解于有機溶劑時，可將合成的脂質抗原與構成脂質體用的脂質一起， 在脂質體制造過程溶解于如上述的有機溶劑后，根據常規方法形成脂質體。相對于脂質體的量，脂質抗原的量根據脂質抗原的種類、欲封入的脂質抗原以外的抗原種類、脂質體的組合結構等而不同，通常，相對于Img構成脂質體的其他脂質，脂質抗原的量為5yg 500 μ g。用于制作本發明的支原體樣粒子等細菌樣粒子的脂質體制作法，在上述脂質體制作法中優選為超聲波法。此外，本發明人等發現在先使用乙醇注入法基礎上，配合超聲波法更可制造均一性高且穩定的脂質體粒子。此外，用所期望的孔徑的過濾器過濾，可調整粒徑，可提供一定粒徑的穩定、高質量的脂質體粒子。(4-4)本發明含有脂質抗原的脂質體粒子的最優化由于支原體特異性脂質抗原可單獨形成脂質體粒子，作為脂質體粒子的脂質成分，只要是僅用支原體特異性脂質抗原形成的支原體樣粒子在粒子化后馬上給予活體內即引起強的免疫應答，可充分預期疫苗的活性，但是，由于粒徑不均一、不穩定，所以不適合作為疫苗、佐劑、免疫調節劑或診斷用制劑。作為疫苗制劑等使用時，有必要通過改變構成脂質體的脂質構成比例或脂質體的大小，進行最優化，使合成脂質抗原的穩定化而更接近天然的效果、安全性高。脂質體的最適形態依該脂質體預期的效果而異，其效果是指作為藥物傳遞系統(Drug Delivery System(DDS))的效果、抗原呈遞、抗體誘導、佐劑效果等。基于支原體特異性脂質抗原的物理化學分析的基礎數據，研究最適當的處理條件時，發現粒徑以IOOnm左右的粒徑最穩定，可長期保存，適合作為制劑效果穩定的制劑。艮口， 在支原體樣粒子中，進行被稱為最適合的脂質體制劑粒子的最優化時，粒徑可以在30 300nm的范圍內，同時優選全部粒子的80%在40 200nm范圍內的條件。另外，脂質體組成是使用支原體增殖中必需的膽固醇和作為基本構成成分的磷脂酰膽堿等磷脂(圖23)。天然支原體的脂肪酸長度以碳原子數16的飽和型最多，其次為碳原子數18及碳原子數14，顯示使用其中調配了碳原子數16合成抗原的結果。若僅用合成脂質抗原制作粒子，則大小或分布不均一，此外，改變膽固醇與碳原子數16的飽和型磷脂酰膽堿的比例，測定粒子體系及分布。從上述結果發現，作為摩爾比，優選脂質抗原為10 50%、磷脂酰膽堿為20 50%、膽固醇為10 50%。這些接近于支原體脂質分析數據的結果(非專利文獻29)。在談及支原體樣粒子的最優化時，是指使它的脂質體組成，以摩爾比計，脂質抗原磷脂酰膽堿膽固醇的配合比例在10 50 20 50 10 50的范圍內。同時使用的磷脂酰膽堿的碳原子數為14 18，優選為16，以飽和型的磷脂酰膽堿最適合。在支原體脂質抗原的鑒定、純化過程中，膜脂質構成成分不復雜，是以磷脂酰膽堿、膽固醇及脂質抗原為中心的構成，此外，發現脂肪酸部分的組成也非常簡單，考慮上述結果，制作穩定且有效果的支原體樣粒子。5.本發明細菌樣粒子的特征實際的支原體感染為溶菌、吸收進細胞、呈遞(脂質)抗原、產生抗體、引起T細胞或NKT細胞等的細胞免疫應答，而含有支原體特異性脂質抗原的支原體樣合成脂質體粒子可誘導相同的反應。另外，有關該細菌樣脂質體粒子，可根據各種目的功能，而變為最適的構成成分或大小。特別是，通過使用純化合成脂質抗原，完全不受支原體以外的成分的影響，而成為非常特異性的免疫活化制劑。進一步優選脂肪酸的長度等最優化后的物質。由于構成成分簡單，在抗體誘導、疫苗、佐劑、細胞免疫療法等的各種用途中可成為最適合的制劑。為了觀察合成脂質抗原的特異性疫苗效果，可使用純化及合成脂質抗原、使用多個支原體種類或多個脂質抗原合成品來研究活性。脂質體的制成法是以合成的脂質抗原及支原體脂質解析為基礎的、構成成分接近者為中心進行研究。以各個細菌的特異性脂質抗原為中心的構成成分制成脂質體，以該脂質體可制作具有各個細菌特征的免疫粒子。通過正確評估提升合成脂質抗原及抗體等制劑效果的方法，則有可能進行制劑的研究和實用化。非常接近支原體的免疫活性，且沒有活疫苗這樣的病原性復發、或滅活疫苗這樣的不純物或批次(lot)差異，毒性低。6.合成脂質抗原粒子的免疫活性的評估法(6-1)通過從腹腔內給予脂質抗原粒子，對抗體誘導活性進行定量在C57BL/6J小鼠(8周齡，雌性)的腹腔內、皮下或皮內4次腹腔內給予支原體脂質抗原粒子。從第1次給藥至第3次給予抗原，在每次給藥前進行部分采血。從第4次給予抗原經過4天后進行部分采血(血清)。通過涂覆有特異性脂質抗原的ELISA進行抗體的測定。使用二抗可測定IgM、IgG。此外，使用針對IgA的二抗，可測定IgA的產生，即可測定粘膜免疫誘導活性。標識測定結果，即可進行脂質抗原的量、組成、形狀、溶劑等的最優化。(6-2)通過從鼻腔內給予脂質抗原粒子，對抗體誘導活性進行定量在C57BL/6J小鼠(8周齡，雌性)鼻腔內4次腹腔內給予支原體脂質抗原粒子。從第1次給藥至第3次給予抗原，在每次給藥前進行部分采血。從第4次給予抗原經過4天后進行部分采血(血清)。通過涂覆有特異性脂質抗原的ELISA進行抗體的測定。使用二抗可測定IgM、IgG。此外，使用針對IgA的二抗，可測定IgA的產生，即可測定粘膜免疫誘導活性。標識測定結果，可進行脂質抗原的量、組成、形狀、溶劑等的最優化。(6-3)對人類通過脂質抗原粒子的誘導抗體的評估法發現根據支原體感染患者的血清中的抗體測定或抗體的變化可進行跟蹤觀察 (圖17、圖18)，該方法可直接適用。此外，用采取的血液可測定支原體增殖抑制活性。(6-4)根據質譜的脂質抗原的檢測、定量利用本發明人等開發的、使用質譜儀(質譜分析儀)的脂質抗原檢測法(專利文獻6)，可檢測支原體的種特異性糖脂抗原本身并進行定量。具體而言，使用任意的離子化方法(EI法、ESI法、LSI法、FAB法、MALDI法等)離子化，依照通常質譜分析法的步驟獲得質譜，可檢測支原體的種特異性糖脂抗原，使用定量標準品也可進行定量。例如，在發酵支原體的特異性糖脂抗原GGPL-I的情況下，在正離子模式下，測出在質荷比為924、896、658、640、420、402、328、310、184或104111/2的特有的離子峰，在負離子模式下，測出在質荷比為908、880、809、642、6M、404、386、312、294及168m/z特有的離子峰。該峰中，896m/z的峰為GGPL-I的特征峰，因而確認896m/z的峰存在即可確認GGPL-I 的存在。在想進行更正確地鑒定時，可確認上述多個峰存在。在發酵支原體的特異性糖脂抗原66 1^-111的情況下，以正離子模式測出在質荷比184、239、1049或1077111/2，或以負離子模式測出在質荷比809、823、864、988、1047或1075m/z特有的離子峰。該峰中，1049m/z的峰為GGPL-III的特征峰，確認1049m/z的峰存在即可確認GGPL-III存在。另一方面，肺炎支原體的特異性糖脂抗原GGL的正離子模式加鈉即可清楚地觀察，其特有的峰在質荷比185、 202、347、363、405、497、525、659、687、915或943m/z的位置出現，負離子模式是在質荷比 379、635、663、891或919m/z的位置出現。該峰中915m/z的峰為GGL的特征峰，確認915m/ ζ的峰存在即可確認GGL存在。(注，此處的正離子模式為在質譜分析器用正離子將被檢對象分子離子化的情況，負離子模式為用負離子進行離子化的情況)。欲將上述特異性糖脂抗原量進行定量時，合成上述GGPL-I、GGPL- III及GGL Glc-型、GGL gal-型等特異性糖脂抗原的至少一種所對應的含重氫的糖脂，并配制濃度逐級變化的糖脂標準品。對于被檢樣品，加入各濃度的脂質標準品，測定質譜，將被檢樣品特征峰的峰高度與糖脂標準品特有峰的峰高度相比較，采用兩者具有同等程度高的峰高度時的糖脂標準品濃度作為樣品中的特異性糖脂抗原量。例如，在實施例15，從IO7Cfu的培養肺炎支原體菌提取的特異性脂質抗原GGL量為將該特征峰的峰高度與定量標準品的濃度相比較，確定為小于50pmol、大于5pmol。由于實際上源自被檢血液等的樣品除脂質成分外，不僅含有極大量的蛋白質，還含有血細胞或其他細菌類等，所以必需進行前處理。具體而言，使用在甲醇、氯仿等有機溶劑中加入水的溶劑體系，以離心分離除去樣品中大量含有的蛋白質，以含有脂質抗原的脂質成分作為下層進行提取。此外，可用使用硅膠等吸附載體的層析色譜法或使用對于作為目標特異性脂質抗原的抗體的親和性色譜柱等進行分離純化。利用具有液相色譜(LC)功能的質譜儀LC-MS，則可同時進行脂質抗原的分離及質譜測定。(6-5)通過質譜，跟蹤觀察脂質抗原量變化及給藥量的最優化。將本發明的脂質抗原粒子作為疫苗給予支原體感染患者或感染動物后，經過一定時間后或是經時的用上述(6-4)的方法測定源自患者或動物的樣品中的特異性脂質抗原量。注，在本發明中，“樣品”為含有從被檢驗者或動物采取的體液，例如全血、血漿、血清、關節液、髓液、唾液、羊水、腹水、胸腔積液、尿、汗、胰液、滑液等及組織、細胞等。由于用上述簡單的測定法可將在血清等樣品中殘存的支原體脂質抗原直接檢測及定量，具有可迅速了解疫苗對于患者的效果的優點。因此，跟蹤觀察脂質抗原量的經時變化，可正確評估對應于給藥量、給藥時機的支原體增殖抑制活性，而可決定之后最適當的治療計劃。S卩，給予含有本發明脂質抗原粒子的疫苗制劑，在通過質譜等跟蹤觀察脂質抗原量變化的同時進行治療的方法，作為對于各個支原體感染患者的個別治療方法而發揮作用。7.關于含有細菌樣粒子的疫苗活性或佐劑活性(7-1)關于疫苗在本說明書中，“疫苗”的用語為可產生免疫應答的物質，包含因支原體感染的支原體感染癥的預防疫苗及支原體感染癥的治療疫苗的寬泛含義。疫苗為經制劑化而給予人類、家畜、寵物類等動物的物質，制劑化或在給藥時與以往的疫苗制劑相同，可適當使用藥理學容許的各種賦形劑。(7-2)支原體樣粒子的疫苗功能以往，支原體類等的病原性細菌用疫苗主要使用菌體提取成分或滅活疫苗等，最近也使用DNA疫苗或合成肽疫苗等。本發明使用的支原體樣粒子制成的疫苗為將各支原體種特異性脂質抗原分離、純化使用。尤其在使用以化學方法等合成與天然相同的物質時，因控制不純物或安全性高而優選。向模型動物給予該支原體樣粒子的結果確認疫苗具有可引起極高免疫應答的功能。尤其在實施例5中，對于風濕性關節炎模型兔子，預防性的預先給藥時，獲得抑制關節病變的突破性結果(圖10)。此外，該特異性脂質抗原由于具有如下述(7-3)敘述的佐劑活性，因此具有無需使用副作用等問題多的佐劑的優點。(7-3)支原體樣粒子的佐劑功能“佐劑”功能有提高樹狀細胞的抗原吸收及將樹狀細胞活化2種功能。成分疫苗(component vaccine)用佐劑已知有以下幾種，例如將結核桿菌的死菌菌體與礦物油混合的弗氏完全佐劑(Freund' s complete adjuvant)或弗氏不完全佐劑等使用礦物油的佐劑、磷酸化鋁佐劑或將氫氧化鋁作為主成分的鋁佐劑(alum adjuvant)類無機佐劑等。現在佐劑功能效果好，且在多數疫苗中被認可的有效佐劑只有名為Alum的氫氧化鋁凝膠，但副作用方面的問題多。因此正在尋求新的有效性高、副作用少的佐劑。本發明的支原體樣粒子確認具有上述2種佐劑功能(圖14、圖16)，而有希望作為有效性高、副作用少的佐劑。預期對于接種的人或動物毒性更低，作為新的、無毒性的成分疫苗用的佐劑，可使用支原體合成抗原脂質。本發明含有脂質抗原的微生物樣脂質體由于具有誘導免疫的佐劑活性、且毒性及自身的抗原性低，因此對于人類可作為疫苗等的抗原的佐劑使用。尤其是在該脂質體中，將作為目標的抗原或免疫原封入時，可獲得強力的疫苗。理解到合成脂質抗原可有效地誘導免疫，因此脂質體制劑的佐劑活性可作為佐劑使用。
此外，關于細胞性免疫佐劑，可采用小鼠的遲發型超敏(DTH)反應(THl細胞負責) 作為細胞性免疫的指標。目標佐劑可誘導DTH反應，所以，可作為如THl細胞參與的病原體感染防御疫苗、該免疫療法制劑或癌免疫療法制劑的佐劑使用。本發明確認在支原體感染癥患者的血清中誘導IgA，表明該抗原對于粘膜免疫起作用(圖15)，尤其是成為使流感等粘膜免疫特異性活化的佐劑。除了體液免疫及細胞性免疫以外，免疫還有位于其中間位置的、以自然殺傷T細胞為代表的脂質抗原免疫。Alum誘導體液免疫較佳，但對于細胞性免疫則幾乎無效(專利文獻27)。在持續性的病毒或感染癥中，細胞性免疫或自然免疫變得重要，但尚無對于上述免疫有效的佐劑。而本發明的支原體合成脂質抗原粒子具有該佐劑活性。8.支原體感染癥用的預防或治療用疫苗制劑及治療用的方案(8-1)支原體感染癥用的預防或治療用疫苗借助模擬存在于支原體(微生物)的膜表面作用于免疫系統的形態而制成的含有脂質抗原的支原體樣粒子，獲得特異抗體的誘導或疫苗活性。使用對于2種肺炎支原體特異性脂質抗原及2種發酵支原體特異性脂質抗原的抗體測定法，對于慢性頑固性疾病(哮喘、C0PD、多發性硬化癥、風濕性疾病等)研究支原體感染與病情發展的關聯性，選擇以支原體感染為病因的患者。對于所選擇的患者進行包括抗支原體藥效果的支原體感染治療。治療法為脂質抗原疫苗、脂質抗原抗體療法、脂質抗原關聯的免疫療法、脂質抗原減量的抗菌劑或中藥、減輕脂質抗原作用的抗過敏劑或類固醇劑等，或上述組合的總稱。此處提供使用ELISA法的診斷-治療系統。(8-2)給藥形態、給藥方法關于給藥方法，可對應支原體感染癥的病情，使用ELISA法或以支原體脂質抗原作為基礎的跟蹤觀察標識或診斷法把握病情而可進行選擇。支原體樣粒子疫苗的給藥途徑可為鼻腔內、皮內、皮下、肌肉內、腹腔內、靜脈內或口服的任何一種。此時，可并用以往疫苗制劑使用的藥理學上容許的穩定劑、抗氧化劑、防腐齊 、穩定劑、濕潤劑、潤滑劑、乳化劑、影響浸透壓的鹽、著色劑、醇、緩沖劑等賦形劑。本發明的疫苗可與其他的抗原成分混合使用，可并用公知的支原體用抗生素等的抗菌劑、抗炎癥劑等藥劑。另外，本發明的疫苗不僅可預期治療效果，也可預期預防效果，在有被支原體感染危險時，預先給藥，作為預防用疫苗也有效。(8-3)給藥量本發明含有脂質抗原的細菌樣粒子為可防御支原體感染的有效量(即，對于該感染誘導人類及動物免疫的量)，進行單次給藥或反復給藥。用于支原體感染癥的預防及/或治療用時，根據對象動物不同，給藥量不同，每次特異性脂質抗原量在ι μ g IOOOmg的范圍內。對如小鼠這樣的小型動物，1 μ g 200 μ g/ 次就十分有效，但給予人類時，則優選以IOOyg IOOmg/次給藥。此外，給藥量、給藥時機、給藥次數、給藥位置等給藥方法等，根據各種用途，使用上述評估法等可使最優化。(例如圖24)(8-4)評估方法如圖17、圖18所示，通過使用與支原體感染癥有關聯的患者所使用的相同ELISA法，將合成脂質抗原粒子作為疫苗給予后，測定血清中支原體特異性抗體效價，根據該效價的上升可判斷有疫苗效果。此外，通過給予疫苗的治療效果可用質譜直接定量測定支原體種特異性糖脂抗原量來進行評估。特別是對支原體感染患者或動物給予疫苗及/或其他支原體用藥劑后經過一定時間，或在反復多次給藥的同時，經時地用上述(6-4)的質譜分析法對源自患者或動物的樣品(血清等)中的特異性脂質抗原進行檢測及/或定量從而經時地跟蹤觀察脂質抗原量的變化方法，對于作為治療對象的支原體感染患者或動物，可簡單、迅速且正確地評估給予疫苗及/或治療藥劑的給藥量、給藥時機等治療方法本身的效果，所以，可一邊修改治療計劃，一邊決定適合各個患者、動物的最適當的治療計劃。對于支原體感染癥，慢性化且重癥化的患者多，且并發合并癥而不知是否起因于支原體感染的情況多，所以實際上是一邊評估給予疫苗的效果、一邊提出接下來的給藥計劃。以下列舉具體的診斷、預防、治療方案的例子。(8-5)小兒肺炎支原體的診斷-預防-治療方案(圖20)在小兒科支原體肺炎領域，預期借助早期特異性定量的診斷，在必需選擇早期抗菌劑的情況下建立明確的治療方針，且根據診斷法可適當的更換抗菌劑。通過將以支原體樣粒子形式的脂質體作為預防疫苗給予，阻止支原體感染，可預防以支原體為原因的小兒髓膜炎等嚴重疾病。此外，考慮川崎病(非專利文獻30)等急劇發展的疾病的原因，上述情況可考慮抗體醫藥有效。(8-6)成人肺炎支原體的診斷-預防-治療方案(圖21)已明了支原體肺炎的原因有多種支原體參與，根據使用肺炎支原體及發酵支原體的種特異性脂質抗原的抗體測定法，研究慢性頑固性性疾病(哮喘、C0PD、多發性硬化癥、 風濕性疾病、癌等)與支原體感染及病情發展的關聯性，選擇以支原體感染為原因的患者 (圖17、圖18)。對于選擇的患者進行包括抗支原體藥效果的支原體感染治療。使用ELISA 法測定支原體的種特異性抗體效價或通過質譜儀等測定支原體的種特異性糖脂抗原量，根據該效價提出診斷-治療系統，進一步提供以糖脂抗原作為抗體醫藥或疫苗應用的制劑。(8-7)自體免疫疾病等慢性支原體感染癥的診斷-預防-治療方案(圖22)根據使用肺炎支原體及發酵支原體的脂質抗原的抗脂質抗原抗體測定法(ELISA 法)或支原體種特異性脂質抗原量測定法(質譜分析法等)，一邊進行慢性疾病的跟蹤觀察 (診斷)，一邊給予由本發明的支原體樣粒子制成的疫苗制劑。(8-8)豬等家畜支原體感染癥的診斷-預防-治療(圖13)能預防肺炎，同時提升收益效率。具有佐劑效果，有減輕礦物油等佐劑的使用量或不需使用礦物油等佐劑的可能性。對象為豬、雞、牛、植物等，對種無限制。微生物為支原體、 結核桿菌、衣原體等具有作為脂質抗原綜合征的病原性等也考慮為同樣的方法。現在市售的針對豬支原體肺炎的豬肺炎支原體疫苗有過敏樣反應的休克或發燒引起精神不振的副作用的報告。上述疫苗由于使用含有多種成分的菌體，要鑒定原因物質很困難。此外，培養豬肺炎支原體菌體時使用的培養液大都為價格高的馬血清或豬血清以及含有高蛋白成分多，除了制造成本高之外，數次接種上述蛋白含量高的疫苗，會使過敏等副作用的發生率變高。所以預期提供確定在豬肺炎支原體菌體構成成分中僅與形成肺病變有關的成分，僅由該成分所制成的疫苗(成分疫苗)。對豬肺炎支原體的特異性細菌樣粒子，只要是人工合成抗原，由于不含蛋白，就可開發便宜且安全的疫苗。9.細菌樣粒子的其他用途本發明的支原體樣粒子的免疫學功能為疫苗活性、抗體誘導活性、細胞性免疫誘導活性、佐劑活性、對巨噬細胞的吞噬活性、抗原呈遞細胞的吸收或抗原呈遞粒子的功能， 可作用于與NKT細胞、T細胞、B細胞活化等免疫功能控制相關的作用機制，由于安全、穩定、 有效，因此本制劑的用途很廣。特別是引起肺炎或腹瀉等的病毒(流感或輪狀病毒等)或細菌大多從呼吸系統或消化系統等的粘膜進入活體內。只要可提高該進入通道粘膜的免疫應答，即可有效的擊退上述微生物。可預期粘膜免疫即可誘導IgA的佐劑效果的本發明支原體樣粒子，通過導入上述微生物的抗原進行免疫，可有效提高對于上述微生物抗原的免疫。同時，可預期對于支原體感染的疫苗效果。已知流感感染或肺炎球菌等與支原體同時感染，病情會惡化，而可利用作為安全性高的混合疫苗。此外，也可作為用于將抗菌劑、抗病毒劑等給予活體內的“DDS”用脂質體制劑使用。10.其他本發明中的其他用語或概念在發明實施方式的說明或實施例中有詳細的規定。 用語基本根據 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature 或以在該領域慣用的用語的意義為基礎。為了實施發明所使用的種種技術，除了明示該出處的技術外，以公知的文獻等為基礎，只要是本領域的技術人員，就可容易且毫無困難地實施。例如基因工學及分子生物學的技術可根據J. Sambrook，Ε. F. Fritsch&T. Maniatis, "Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版)，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，紐約(1989) ；D. Μ· Glover 等編著，“DNA Cloning”，第二版，Vol. 1-4， (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press(1995)； Ausubel, F. Μ.等，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons,紐約，N. Y. 1995 ；日本生化學會編，「続生化學実験講座1、遺伝子研究法II」、東京化學同人 (1986)；日本生化學會，「新生化學実験講座2、核酸111(組換λ DNA技術)」、東京化學 ^JA (1992) ；R. Wu Helr =Method in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press，紐約(1980) ；R. Wu 等編著，“Methods in Enzymology”，Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B)&101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, (1983) ；R. Wu ^llelr, "Methods in Enzymology", Vol. 153(Recombinant DNA, Part D),154(Recombinant DNA, Part E)&155 (Recombinant DNA, Part F)，Academic Press，紐約(1987)等記載的方法、引用上述方法的文獻記載方法或實質與上述同樣的方法或改變法進行。此外，對于本發明使用的各種蛋白質或肽或編碼上述蛋白質或肽的DNA可從已有的數據庫(URL :http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ 等)得至丨J。實施例以下，通過所示實施例對本發明作更詳細且具體的說明，但本發明不只限于以下例子。本說明書中引用的技術文獻、專利文獻及專利申請說明書中記載的內容作為本發明記載內容的參考。
(實施例1)用于制作病原性支原體樣粒子的預備實驗(1-1)脂質體粒子粒徑的最優化將從大量培養的豬肺炎支原體提取純化的脂質15. 46mg及市售品的高純度膽固醇3. 31mg(日油株式會社制造)用乙醇600 μ L溶解，將該溶液在60°C的恒溫槽中加入 8. 5 %蔗糖溶液3mL中，進行超聲波處理3分鐘(株式會社- 7 - 3 Π社制造的超聲波洗凈器US-104)，制作脂質體粒子。粒徑以δ電位/粒徑/分子量測定裝置(MALVERN社制造 ZETASUER納米系列(nano series))測定，集中在約IOOnm(圖4)。(1-2)支原體樣脂質體粒子組成的研究在一定量的合成GGPL-III中，加入改變比例的二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)(日油株式會社制造)及膽固醇(日油株式會社制造)，并以氯仿-甲醇溶液溶解，濃縮干燥。在干燥的樣品中，加入細胞培養用培養基RPMI-1640 (SIGMA制造)，于25°C用超聲波處理40 分鐘。該樣品的粒徑用S電位/粒徑/分子量測定裝置(MALVERN社制造^TASIZER納米系列)測定(圖23)。所用的磷脂酰膽堿的脂肪酸為使用天然支原體最典型的脂肪酸碳原子數16的飽和型脂肪酸，改變與膽固醇的比例，與支原體脂質抗原一起制成脂質體粒子，測定粒徑及其分布。從上述結果導出，以摩爾比計，優選脂質抗原為10 50%、磷脂酰膽堿為20 50%、 膽固醇為10 50%。這些接近于支原體脂質分析數據的結果(非專利文獻29)。(1-3)脂質抗原的質量管理HPLC的測定是以色譜柱Waters C4 1. OX 150mm，流動相100 %甲醇，進樣量 5口1^，流速0.0511117分鐘，溫度401(內部、外部)、檢測器蒸發光散射檢測器(ELSD)， UV(215nm)的條件進行(全部為Waters社制造)。將各GGPL- III濃度與其峰面積的關系制成曲線圖的結果是，峰面積隨GGPL- III濃度依賴性地增大。將各標準曲線表示于圖表。根據以上的結果，由于在ELSD中，其峰面積的動態范圍廣，在用HPLC分析檢測GGPL-III時，認為蒸發光散射檢測器(ELSD)是適當的(圖 5)。質譜分析為將各樣品溶解于氯仿甲醇O 1)溶液500yL中，將IyL用甲醇稀釋10000倍。經稀釋的樣品IyL涂在靶上。進一步將基質溶液0，5_羥基苯甲酸及三氟乙酸鈉)1 μ L在靶上涂1 μ L，用質譜分析裝置(BRUKER社制造autof lex II T0F/T0F)測定。根據質譜分析的結果說明脂質抗原的純度很高(圖5)。(實施例2)誘導肺炎支原體合成脂質抗原的抗體使用合成的肺炎支原體脂質抗原(GGL Glc-型)，用與實施例1 (1_2)相同的方法配制肺炎支原體樣粒子。此外，合成GGL Glc-型可用專利文獻8等中記載的方法合成。使用該粒子免疫2只C57BL/6小鼠。具體而言，將含有該粒子的溶液100 μ L在小鼠腹腔內接種3次(第0天、第14天、第35天)，從該小鼠采血，用酶抗體免疫法(ELISA 法)測定各個樣品的IgG及IgM抗體效價。該結果如圖7所示，在2只小鼠誘導出IgG及 IgM抗體。該結果表示GGL Glc-型脂質體粒子作為支原體樣粒子發揮作用，在體內誘導特異性抗體。(實施例幻通過發酵支原體樣粒子(合成GGPL-III)誘導特異性抗體
在發酵支原體的合成GGPL- III 500 μ g中，加入ImL的生理鹽水，進行超聲波處理 30分鐘，形成脂質體粒子，將該粒子接種于慢性風濕性關節炎自然發病的小鼠模型SKG小鼠的腹腔內。在接種后第4天采血，用代謝抑制試驗測定該血液的發酵支原體的發育抑制活性。該結果為，在小鼠血清中可特異性誘導對于支原體脂質抗原的抗體，尤其是IgG 時，顯示對應于稀釋度的抗體效價。此外，確認抑制支原體的增殖(圖8)。該結果表示GGPL-III脂質體粒子作為支原體樣粒子而發揮作用，在體內可誘導特異性抗體。(實施例4)制作發酵支原體感染癥動物模型將發酵支原體活菌經氣管接種于兔子(新西蘭白兔，雌性，約2公斤)，制作肺炎模型兔子，又同樣地經膝關節接種，制作風濕性關節炎模型兔子。實驗1為在第0天單次接種 IO9CFU/兔子的量，制作2只肺炎模型兔子、3只關節炎兔子。實驗2為在第0天、第7天、 第21天分別每次以IO9CFU/兔子的量接種3次，制作3只肺炎模型兔子、3只關節炎兔子。 在上述模型兔子中，可觀察到，6例中有4例血中的GGPL- III的IgG抗體效價急速上升(圖 9)。該結果證明支原體不僅會引起肺炎，也會引起關節炎等多種慢性炎癥性疾病(圖 1)。此外，實施例5中，將同樣制造的模型兔子用于疫苗活性的評價。(實施例幻對發酵支原體感染癥動物模型的疫苗效果使用與上述實施例1(1-2)相同的方法，使用合成的發酵支原體脂質抗原 (GGPL- III)，配制發酵支原體樣粒子。與上述實施例4相同，制作發酵支原體感染風濕性關節炎模型，對上述兔子預先在腹腔內通過4次的發酵支原體樣粒子進行免疫的情況下，抑制發酵支原體感染風濕性關節炎模型的關節病變。由此證明，合成的GGPL-III發酵支原體脂質抗原粒子可成為疫苗等的免疫治療藥。上述效果相當于合成脂質抗原免疫功能引發效應(圖10)。該結果顯示，本申請的支原體樣粒子(GGPL-III)可成為因支原體感染引起的風濕性關節疾病的預防疫苗。(實施例6)源自風濕性關節炎患者的滑膜細胞內發酵支原體的脂質抗原 (GGPL-III)的分布(圖 11)方法1 免疫染色從風濕性關節患者分離滑膜細胞，抗GGPL-III抗體及陰性對照以小鼠IgM進行染色。方法2 免疫電子顯微鏡從風濕性關節患者分離滑膜細胞，以抗GGPL-III抗體作為一抗，以附有金膠體的IgG及IgM作為二抗，進行GGPL- III的檢測。(根據非專利文獻31的方法)用免疫染色法的結果(A D)、用免疫電子顯微鏡的結果(E)，在風濕性關節炎患者的滑膜細胞內，均觀察到發酵支原體特異性脂質抗原(GGPL-III)顯著量地增加。該結果表示，在支原體感染癥中，脂質抗原被吸收進免疫細胞中，轉運到粗面內質網后參與抗原呈遞(非專利文獻31)途徑。從抗原呈遞細胞進一步產生誘導特異性B細胞的抗體。在T細胞或脂質抗原誘導特異性反應的NKT細胞。(實施例7)使用支原體呼吸系統疾病患者血清中肺炎支原體特異抗原GGLGlc型測定IgA使用以合成的肺炎支原體GGL Glc-型作為抗原的ELISA，測定支原體呼吸系統疾病患者血清中的IgA。在支原體呼吸系統疾病患者的血清中，確認針對肺炎支原體GGL Glc-型的IgA抗體。由此暗示肺炎支原體GGL Glc-型可成為粘膜免疫佐劑。在免疫應答中，IgA為從粘膜免疫系統產生的抗體的亞型。所以，誘導針對其抗原的IgA顯示對于粘膜免疫系統起其抗原的作用。在人類，顯示誘導針對支原體特異性脂質抗原的IgA抗體的結果為本發明的支原體樣粒子在粘膜免疫方面顯示強的作用。若認為具有作為支原體樣粒子免疫功能的佐劑作用(實施例10)，則將成為對流感感染等特異性活化有效的粘膜免疫的佐劑。(實施例8)支原體樣粒子的細胞免疫活性從健康人的末梢血中分離單核細胞，培養加入白介素-2及支原體樣粒子(GGPL-1 或GGPL-III)的樣品和未加入上述物質的樣品，回收其上清液，用酶抗體免疫法(ELISA法) 測定該上清液中干擾素-Y的量。該結果確認，加入支原體樣粒子(GGPL-1、GGPL-III)時，較白介素_2單獨給藥時， 干擾素-、的產量增加2倍以上(圖16)。該結果顯示，本發明的支原體樣粒子(GGPL-1和/或GGPL-III)具有細胞免疫誘導活性。(實施例9)研究支原體樣粒子疫苗有效的疾病(9-1)根據ELISA法測定年輕性風濕性關節炎患者的肺炎支原體及發酵支原體的抗體效價(圖17)該患者有感冒癥狀。1至2個月后出現手指關節疼痛及變形，3個月后到醫院門診， 診斷為年輕性風濕性關節炎。接受口服藥治療，手指關節的疼痛逐漸減輕。根據ELISA法測定該年輕性風濕性關節炎的初期患者約半年之間的肺炎支原體及發酵支原體的抗體效價。其結果為，發酵支原體特異性GGPL-III的IgM抗體明顯上升，證明與發酵支原體的感染有關。此外，根據其他的檢查結果，用以往的支原體CF法檢測的結果為8倍，否定為支原體感染，但從血液中在PCR檢測發酵支原體，確認血液中存在發酵支原體感染。從以上的結果證明，在年輕性風濕性關節炎患者的發病初期，實際上存在以發酵支原體感染是其原因的患者。對于上述患者，測定GGPL-III抗體效價，確認感染，盡可能在早期給予本申請的支原體樣粒子(GGPL-III)疫苗是有效的。即，對原因不明的年輕性風濕性關節炎患者一部分有可能進行原因特異性的治療，成為可突破性根治的治療法。(9-2)根據ELISA法測定結節病患者肺炎支原體及發酵支原體的抗體效價結果以同樣的方法測定肺炎支原體及發酵支原體的抗體效價(圖18)。該患者因膝蓋疼痛到醫院就診。確認兩側性肺門淋巴節腫脹，診斷為結節病。此時，用以往的檢查法支原體PA法為160倍，認為與支原體感染有關聯的可能性。通過使用含有對支原體感染有效的抗生素治療，雖然持續膝關節不疼痛的狀態，但是從平成18年 (2006年)5月起膝關節疼痛復發。用支原體PA法為80倍，雖然抗體效價比前次的降低，但與前次相同，通過含有對支原體感染有效的抗生素治療，膝關節的疼痛減輕。癥狀復發時， 對發酵支原體特異性GGPL- III的IgG抗體明顯上升，在通過治療癥狀減輕的同時其抗體效價也降低，證明與發酵支原體的感染癥有關。
同樣地，從上述結果看到，該復發的結節病患者中可證明發酵支原體感染是其原因。對于該患者，給予本申請的支原體樣粒子(GGPL-III)疫苗可預期有效。(9-3)多位多發性硬化癥患者血清中肺炎支原體(GGL Gla-型)的IgG及IgM抗體效價的變化(圖19)測定多發性硬化癥患者血清中GGL foil-型抗體(IgG及IgM)的抗體效價。從該結果看到，在多發性硬化癥患者中，可證明實際上肺炎支原體感染為其原因。由于可誘導對于肺炎支原體特異性脂質抗原的抗體，證明對該脂質抗原有疫苗活性。對于多發性硬化癥，其癥狀的惡化及減輕在一年中反復數次，以年為單位漸漸惡化，為頑固性病，但對于該患者， 可預期通過給予由本申請的脂質抗原細菌樣粒子制成的支原體樣粒子(GGL (ial-型)疫苗等的治療效果為有效。(實施例10)通過合成的支原體脂質抗原產生干擾素-Y從健康人的末梢血分離單核細胞，培養向其中加入白介素-2及合成的發酵支原體脂質抗原GGPL- III的樣品和未加入上述物質的樣品，回收其上清液，用酶抗體免疫法 (ELISA法)測定該上清液中干擾素-Y的量并比較。在人類末梢血單核細胞中，相比未加入脂抗原的樣品，加入白介素-2與脂質抗原的樣品干擾素-Y的產量顯著增加(圖16)。 該結果表示，本申請的支原體樣粒子(GGPL-III)具有細胞免疫誘導活性。(實施例11)發酵支原體特異性脂質抗原(GGPL-III)的佐劑效果(圖14)如圖14㈧所示，將金屬鎳(抗原)同時與發酵支原體樣粒子(GGPL-III)給予小鼠的耳朵，確認是用量依賴性(給予0. ang/mL及lmg/mL)的、具有提高抗體產量的效果。圖 14(B)表示發酵支原體樣粒子(GGPL-III)具有與LPS同等的細胞免疫活性。此外，具有增強抗原活性的佐劑活性。由LPS開發的LipidA雖開始作為佐劑使用，預期支原體脂質抗原也作為佐劑。(實施例12)使用豬肺炎支原體的特異性純化脂質抗原的支原體樣粒子的疫苗效果大量培養豬鼻支原體及豬肺炎支原體，用氯仿-甲醇加以分離，將上述用薄層層析色譜法(氯仿甲醇0. 2%氯化鈣=55 45 10)展開。展開后，用苔黑酚硫酸以免疫染色法進行染色后檢測(圖13)。如圖4所示，制作使用純化脂質抗原的豬肺炎支原體樣粒子，在小鼠的腹腔內進行3次免疫。在最后接種后的第4天采血，用代謝抑制試驗測定該血液的支原體發育抑制活性。其結果確認抑制支原體的增殖。(實施例13)幽門螺旋桿菌的特異性脂質抗原及其檢測(圖12)大量培養幽門螺旋桿菌，用氯仿-甲醇加以分離，將其用薄層層析色譜法展開(氯仿甲醇0.2%氯化鈣=60 28 3)。展開后，用磷酸鉬染色并以使用苔黑酚硫酸的免疫染色檢測特異性脂質抗原，確認為幽門螺旋桿菌的特異性脂質抗原。使用幽門螺旋桿菌的純化特異性脂質抗原，以與實施例1(1-2)相同的方法制作幽門螺旋桿菌樣粒子。使用該幽門螺旋桿菌樣粒子，從C57BL/6小鼠的骨髓細胞產生干擾素-Y，用酶抗體免疫法(ELISA法)測定上清液中干擾素-Y的量。該結果表明，本申請的幽門螺旋桿菌樣粒子具有干擾素-Y的誘導活性。
(實施例14)支原體樣脂質體粒子給藥法的最優化將用與實施例1 (1-2)相同的方法配制的肺炎支原體樣粒子(GGLGlc-型)在分為 4組的、月齡為2個月的小鼠(體重約30g)腹腔內分別注入20(^8、5(^8、2(^8，進行4 次免疫。對照組未給予抗原。如圖M下方所示，分4次采血，根據ELISA測定各自的IgM 抗體效價(值為每組的平均值)。在50 μ g、20 μ g給藥組雖然顯示超過臨界值的高抗體效價，但在200μ g的高濃度給藥時，抗體效價未上升。確認該實施例使用的肺炎支原體樣粒子(GGL Glc-型)情況下，最適當的給藥量以約10 100 μ g/次就十分有效。假定為給予人類時，則為約IOOyg IOmg/次。最初假定的范圍內(在小鼠等小型動物為約1 μ g 200 μ g/次)，在實際的疫苗接種時，通過上述這樣的方法，可預期更方便地最優化給藥量。(實施例15)支原體種特異性糖脂抗原的檢測及定量該實驗為對于支原體種特異性糖脂抗原中典型肺炎支原體特異性糖脂抗原GGL 進行研究，是否可將患者血清等樣品中含有的GGL量進行定量的模型試驗。此外，基本的步驟是根據專利文獻6的方法。S卩，首先，預先合成GGL作為對應GGL的合成標準品，導入6個重氫[H3]，合成 [H3] -GGL (d6-GGL)作為定量標準品。另一方面，用培養液培養肺炎支原體，菌體量用以往方法的菌落數進行定量，將脂質抗原GGL從IO7Cfu的菌體提取、分離純化。將該含IO7Cfu培養肺炎支原體的樣品與甲醇氯仿=1 1等有機溶劑(0. 8mL)充分混合，添加水(0. 2mL)，經約2500 3000g離心操作，使分層，將下層含目標GGL(C16:0)的脂質成分的氯仿層與蛋白質或血細胞分離而獲得GGL。另用DIAION ((三菱化學)社制造)的硅凝膠(IATR0BEADS)(來自二氧化硅的羥基被保護的物質)純化。為了測定該脂質抗原的量，在上述脂質成分中以[H3]-GGL(C16:0)濃度逐級變化的方式添加，通過質譜分析儀(O力一夕卜二 ” 7社制造)添加鈉使離子化，并以正離子模式測定各自的質譜圖。(圖25)該結果是，若同時比較目標GGL(C16:0)特征峰(915m/z)的峰和[H3]-GGL(C160) 特征峰(921m/z)的峰的峰高度，則可確認是添加[H3]-GGL(C16:0)為50pmol時及5pmol 時的中間高度，可確定GGL(C16:0)的存在量是在50pmol至5pmol之間。即，表明在模型樣品中的培養支原體菌體IO7Cfu中，存在有50pmol至5pmol的支原體特異性脂質抗原 GGL(C16:0)。此外，該結果顯示，只要有約IO5Cfu的菌體量存在，即可充分檢測。所以，使用源自實際的支原體感染患者的組織或血液進行測定時，不僅可馬上確定感染支原體種，且可準確地判定其感染程度，也證明在用于判定進行疫苗治療或化學療法劑治療后，或中途發展過程的治療效果方面可為非常有效利用的技術。(實施例16)風濕性關節炎患者的關節組織中發酵支原體特異性脂質抗原 GGPL- III的檢測圖11為表示將風濕性關節炎患者的關節組織中發酵支原體特異性脂質抗原 GGPL-III用特異抗體染色的圖，此次是顯示以實施例15記載的使用質譜分析儀的方法檢測風濕性關節炎患者的關節組織中GGPL- III的存在。從風濕性關節炎患者的關節組織獲得經使用硅凝膠(DIAI0N，(三菱化學)社制造)分離純化的脂質成分。
用質譜分析儀(O力一夕· >卜二々7社制造)解析時，可確認該成分表示 GGPL- III存在于1049m/z位置的峰(圖26)。(實施例17)疑似支原體感染患者的臨床樣品的解析從多位疑似支原體感染的肺炎患者采集咽拭子，用與實施例16相同的方法，將獲得的溶出成分離子化，用質譜分析儀(O力一夕 卜二 ” 7社制造)解析時，如圖27所示，可在多個樣品檢測到肺炎支原體特異性糖脂抗原GGL的特異性峰。
權利要求
1.一種細菌樣粒子，其特征在于，所述細菌樣粒子由脂質體粒子制成，所述脂質體粒子含有1種或多于1種的病原性細菌特異性脂質抗原作為構成脂質體的脂質成分。
2.一種支原體樣粒子，其特征在于，所述支原體樣粒子由脂質體粒子制成，所述脂質體粒子含有1種或多于1種的支原體特異性脂質抗原作為構成脂質體的脂質成分。
3.如權利要求2所述的支原體樣粒子，其中，前述支原體特異性脂質抗原的至少1種是從支原體菌體配制物提取后，經分離純化的支原體特異性糖脂。
4.如權利要求2所述的支原體樣粒子，其中，前述支原體特異性脂質抗原的至少1種是在化學合成或酶合成后，經分離純化的特異性糖脂。
5.如權利要求2 4中任一項所述的支原體樣粒子，其中，前述支原體特異性脂質抗原的至少1種為肺炎支原體特異性脂質抗原或發酵支原體特異性脂質抗原。
6.如權利要求2 5中任一項所述的支原體樣粒子，其特征在于，作為前述構成脂質體的脂質成分，進一步含有磷脂酰膽堿、磷酸甘油及/或膽固醇。
7.如權利要求2 6中任一項所述的支原體樣粒子，其中，將含有前述支原體特異性脂質抗原的構成脂質體的脂質成分在溶劑中混合后，通過超聲波處理，以使粒徑在30 300nm范圍內、且粒子的80%以上在40 200nm范圍內的條件下進行粒子化。
8.如權利要求2 7中任一項所述的支原體樣粒子，其特征在于，所述支原體樣粒子為使其他抗原性物質存在于前述脂質體粒子表面的支原體樣粒子，通過前述支原體特異性脂質抗原的佐劑效果，提高所述其他抗原性物質的抗原性。
9.如權利要求8所述的支原體樣粒子，其中，前述其他抗原性物質為源自病毒的抗原肽。
10.一種支原體感染癥的預防或治療用疫苗，其中，含有如權利要求2 7中任一項所述的支原體樣粒子作為有效成分。
11.如權利要求10所述的支原體感染癥的預防或治療用疫苗，其中，前述支原體感染癥為肺炎、哮喘或風濕性疾病。
12.—種支原體感染癥的預防或治療方法，其特征在于，包含對于罹患或疑似罹患支原體感染癥的人類或動物至少給予1次如權利要求10或11所述的支原體感染癥的預防或治療用疫苗的步驟。
13.如權利要求12所述的支原體感染癥的治療方法，其特征在于，在使用前述疫苗治療支原體感染癥的治療方法中，在給予前述疫苗之前及/或之后，設置測定支原體種特異性脂質抗原量或該脂質抗原特異性抗體量的步驟，并包含根據該測定值的大小決定下次疫苗給藥時機及給藥量的步驟。
14.一種病毒感染癥的預防或治療用疫苗，其特征在于，將如權利要求9所述的、在粒子表面存在源自病毒的抗原肽的支原體樣粒子作為有效成分。
15.如權利要求14所述的疫苗，其中，前述病毒為流感病毒，前述病毒感染癥為流感。
16.一種病毒感染癥的預防或治療方法，其特征在于，包含對于罹患或疑似罹患病毒感染癥的人類或動物給予如權利要求14或15所述的病毒感染癥的預防或治療用疫苗的步馬聚ο
17.如權利要求16所述的預防或治療方法，其中，前述病毒為流感病毒，前述病毒感染癥為流感病毒感染癥。
全文摘要
本發明的目的是提供對于支原體感染治療效果好且安全的疫苗以及開發支原體感染的有效治療方法，并且，本發明的目的是提供支原體樣粒子以及包含常見細菌的細菌樣粒子作為有效的支原體感染癥用疫苗。本發明中，通過含有支原體等病原性細菌特異性脂質抗原作為構成脂質體脂質成分的脂質體粒子，可提供支原體樣粒子等的細菌樣粒子。通過給予所述支原體樣粒子，在活體內能誘導強的免疫活性，可提供支原體感染預防用或治療用的優異疫苗。
文檔編號A61K47/28GK102448488SQ201080023429
公開日2012年5月9日 申請日期2010年6月4日 優先權日2009年6月4日
發明者佐佐木裕子, 原澤亮, 市山浩二, 松田和洋, 松田幸枝, 片山宜郎, 荒川宜親, 西田芳弘, 遠藤康男, 野村信夫 申請人:醫學生物技術株式會社, 國立感染癥研究所, 獨立行政法人產業技術綜合研究所