專利名稱：用peg標記干擾素的方法
技術領域：
本申請涉及肽、蛋白等的位點特異性修飾方法。特別地，它涉及用PEG標記諸如干擾素的蛋白的方法。
背景技術：
重組蛋白治療劑已作為用于從癌癥到代謝病癥和自身免疫疾病范圍的多種狀況的有效治療而出現，但它們通常受其藥代動力學和免疫原性限制。因此，已開發大量策略來克服這些，所述策略包括糖基化、白蛋白附著、環化和PEG化。蛋白糖基化是一個或多個糖的連接，這可有助于蛋白穩定性和帶來對蛋白水解和免疫識別的某種保護(Doores等人， 2006)。人白蛋白是循環中最為普遍的血清蛋白且具有異乎尋常長的約19天半衰期。因此， 將白蛋白基因融合(genetic fusion)至蛋白N末端或C末端被良好耐受，并且所得融合蛋白具有顯著提高的半衰期(Subramanian等人，2007)。PEG化即聚乙二醇的共價連接(Veronese和Mero，2008)大概是用于改良蛋白藥代動力學的得到最廣泛使用和認可的方法。PEG是基于重復單元(-C2H3-O-)n的可有具有低多分散性的廣范圍分子量的聚合物，并且PEG可以是直鏈和支鏈兩者。其高柔性和水合作用表明，它具有大的水力半徑并顯著提高與之連接的蛋白的大小，轉而顯著降低其腎清除。 此外，潛在免疫原性表位和蛋白酶切割位點被掩蔽，從而分別降低免疫原性和蛋白水解。另外，PEG化可以實質上提高蛋白溶解性和穩定性。然而，用于PEG化的已知方法一般是非位點選擇性的，其使用與蛋白親核物質、例如賴氨酸側鏈上的氨基基團經歷酰化或烷化的親電PEG衍生物(Roberts等人，2002)。這通常生成異質的蛋白制備物，其中將1個PEG分子在大量不同位點連接至蛋白，以生成不同的位置異構體。在蛋白內的一些位置，PEG連接阻止或損害受體結合。此外，還可以存在多 PEG化物質，借此大量PEG分子在不同位點連接至相同蛋白。因此，PEG化蛋白制備物的總活性相比未修飾蛋白被降低。因此，存在對用于位點特異性蛋白PEG化方法的需要；通過在蛋白序列內的所定義位置并入單個PEG部分，可以克服與非選擇性PEG化(即含有多PEG 位置異構體的制備物)相關的有害作用。用于以位點特異性方式將標記引入蛋白的最常見方法是在修飾位置將獨特的游離半胱氨酸工程化進一級序列。隨后使該游離半胱氨酸的巰基側鏈與該標記的馬來酰亞胺衍生物反應，以提供位點特異性修飾。然而，這需要在一級序列內的所有其它天然存在的游離半胱氨酸通過氨基酸誘變被移除。此外，如果該蛋白天然含有二硫鍵，那么在該分子內添加額外的半胱氨酸可能干擾蛋白的正確折疊。因此，已研究用于蛋白位點特異性PEG化的其它途徑。Marsac等人，2006描述了借助PEG-硫酯與靶蛋白上的N末端半胱氨酸之間的天然化學連接而將PEG連接至蛋白N 末端。如果N末端半胱氨酸尚未存在的話，這需要將N末端半胱氨酸加在蛋白序列上，這可能干擾含半胱氨酸蛋白的蛋白折疊。Kinstler等人，2002描述了 PEG對N末端的連接，所述連接借助酸性條件下蛋白與PEG醛的還原性烷化，在酸性條件下，只有α -氨基N末端胺是反應性的，比較，Pka比賴氨酸殘基的ε -氨基低(Kinstler等人，200 。然而，仍然可能用該方法獲得一些ε -氨基PEG化。Brocchini等人，2008建議將PEG并入二硫橋。這涉及二硫化物的起始還原，以釋放2個半胱氨酸硫醇，隨后是雙烷化，以產生與PEG共價連接的3碳橋。然而，該途徑限于含溶劑暴露的二硫鍵的蛋白。另一方法是天然糖基化位點的 PEG化，其中在大腸桿菌(E. coli)中表達的重組蛋白被酶糖基化，并且PEG在天然糖基化位點經聚糖連接(DeFrees等人，2006)。該途徑限于天然糖基化的蛋白。^iang等人，2009描述了經硫代酸/疊氮化物酰胺化的蛋白C末端PEG化；在此該蛋白作為VMA內含肽CBD融合蛋白表達并由Na2S氫硫解(hydrothiolitically)切割以產生硫代酸，所述蛋白隨后可與PEG-磺疊氮化物(PEG-sulfonazide)反應。然而，該硫代酸蛋白在標記反應期間傾向水解，從而產生作為副產物的該蛋白的未標記C末端羧酸衍生物。Xie和khultz，2006描述了大腸桿菌蛋白表達期間并入具有反應性化學基團的非天然氨基酸，所述氨基酸能允許PEG官能團的隨后連接。這使用工程化進大腸桿菌的獨特密碼子(例如琥珀無義密碼子UAG)和相應的轉移RNA 氨基酰-tRNA-合成酶對來實現。WO 2005/110455和W02004/076474描述了 PEG化干擾素在治療病毒感染中的用途。同樣地，US2005/059U9描述了 PEG化干擾素。然而，這些文件描述的用于干擾素PEG 化的方法不是位點特異性的。當前存在9種批準用于治療性用途的PEG化蛋白治療劑(Veronese &Mero 2008 Biodrugs 22(5)p315)，包括腺苷脫氨酶、G-CSF、紅細胞生成素、IFNα i和IFNa 2b的PEG 化形式。存在2種批準的用于治療丙型肝炎病毒并處于用于某些癌癥的臨床評估下的PEG 化形式的 IFN a 2 (Ferrantini 等人，2007)。Pegasys (Hoffmann La Roche)是連接至支鏈 40kDa PEG-NHS的重組IFN α 2a。它包括9個位置PEG異構體。然而，在體外測定法中，它保留未PEG化 IFNa 加的僅 7% 的活性(Dhalluin 等人，2005 ；Foser 等人，2003)。Peglntron (Schering Plough)是連接至單鏈12kDa琥珀酰亞胺碳酸酯PEG的重組IFNa 2b，產生95% 的包括14個位置異構體的單PEG化蛋白，在所述位置異構體中，組氨酸34占47.8%。在體外測定法中，與未PEG化IFNa 2b相比，Peglntron 保留的抗病毒活性(Wang等人， 2002)。Betaseron (EU 的 Betaferon) (Bayer Shering Pharma)禾口最近的 Extavia(Novartis)是用于治療多發性硬化的重組IFN^ Ib蛋白，并處于用于治療包括肝炎和某些癌癥在內的其它疾病的臨床評估下(Fine等人，1997 ；Fukutomi等人，2001)。然而，IFNi3 Ib的特定問題是它從血液中快速清除，從而必需可導致注射部位壞死和降低的患者依從的頻繁施用方案。中和抗體也是問題，在一個2年研究中，45%的患者出現這些。當前沒有已批準的PEG化IFNi3 Ib形式。然而，至今在本領域的工作包括，產生具有未修飾 IFN^ Ib 24-31%活性的5種位置異構體的混合物的伯胺的隨機PEG化，并包括(主要是) N末端胺的PEG化(35%活性)。利用在位置79 (天然糖基化位點)或者N末端或C末端的工程化游離Cys殘基的位點特異性PEG化嘗試是不成功的，這歸因于不足的位點特異性連接(Basu等人，2006)。另一策略使用bicin (雙-N-2-羥乙基甘氨酰胺)接頭，以隨機連接 2-3個PEG分子。在生理條件下，bicin的快速水解釋放PEG，以離開活性IFNi3 lb。然而， 這些可釋放PEG化形式的活性僅為未修飾IFNi3 Ib活性的7% -27% (Zhao等人，2006)。為了改善蛋白治療劑的效力和穩定性，明顯需要延長干擾素治療劑有效性的方式，例如通過延遲腎清除、降低免疫原性和/或減少蛋白水解。然而，盡管存在大量的本領域已知方法，每一種方法在例如需要引入另外的化學部分、修飾位點的模仿、對蛋白折疊的影響和對活性的影響方面仍存在其缺點。發明概述本發明人已研究穩定治療用干擾素的可選擇方法。他們已開發PEG化干擾素的新方法，所述新方法是位點特異性的并且對于被測試干擾素，如實施例中所述，產生具有比用常規技術PEG化的相應的干擾素大很多且事實上接近非PEG化干擾素的抗病毒活性的PEG 化干擾素。這通過生成新的PEG官能團的氧代羧酸衍生物、例如丙酮酰衍生物而促進。使C 末端酰胼重組蛋白與丙酮酰PEG反應，從而以良好產率生成位點特異性C末端PEG化蛋白， 其PEG官能團通過腙鍵直接連接至蛋白C末端。可以通過還原進一步穩定該腙鍵，所述還原例如在溫和條件下利用氰基硼氫化鈉進行。因此，在本發明的第一方面，提供了干擾素分子的位點特異性標記方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供標記分子，所述標記分子包括具有醛或酮部分的PEG部分；b)提供干擾素分子，所述干擾素分子具有C末端酰胼部分；c)使所述PEG部分的醛或酮部分與所述干擾素分子的C末端酰胼反應，以形成標記的干擾素分子，所述標記的干擾素分子包括經腙鍵連接至干擾素分子C末端的PEG部分。在本發明一實施方式中，所述腙鍵具有式I
權利要求
1.一種干擾素分子的位點特異性標記方法，其中所述方法包括以下步驟a)提供標記分子，所述標記分子包含具有醛或酮部分的PEG部分；b)提供干擾素分子，所述干擾素分子具有C末端酰胼部分；c)使所述PEG部分的醛或酮部分與所述干擾素分子的C末端酰胼反應，以形成標記的干擾素分子，所述標記的干擾素分子包含經腙鍵連接至所述干擾素分子的C末端的PEG部分。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述具有醛或酮部分的PEG部分是具有α-二酮或 α-酮-醛基團的PEG部分。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述具有醛或酮部分的PEG部分是具有氧代羧酸酯殘基的PEG部分。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述醛或酮部分是芳香酮或芳香醛部分。
5.如權利要求3所述的方法，其中所述氧代羧酸酯殘基是丙酮酰基團。
6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中步驟(b)的具有C末端酰胼部分的干擾素分子通過胼與前體分子的反應而產生，所述前體分子包括經硫酯部分而N末端融合至內含肽結構域的前體干擾素分子。
7.如權利要求6所述的方法，其中通過胼與前體分子反應而產生的步驟(b)的具有C 末端酰胼部分的干擾素分子直接作為折疊蛋白產生，而無再折疊步驟或再折疊劑。
8.如權利要求6或權利要求7所述的方法，其中所述前體分子與胼在至少0.ImM螯合劑、例如EDTA存在下反應。
9.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述干擾素分子是具有如序列IDNo=I 所示氨基酸序列的IFN α 2b分子，或其片段，或其與序列ID No 1具有至少60%序列同源性的衍生物。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述干擾素分子是IFNα 2b。
11.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述干擾素分子是具有如序列IDNo 2所示氨基酸序列的IFNi3 Ib分子，或其片段，或其與序列ID No :2具有至少60%序列同源性的衍生物。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述干擾素分子是IFNi3lb。
13.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述標記的干擾素分子具有大于相應的非PEG化干擾素分子抗病毒活性的40%的抗病毒活性。
14.一種C末端PEG化干擾素分子，其中所述PEG部分經腙鍵或還原腙鍵連接至所述干擾素分子的C末端。
15.如權利要求14所述的C末端PEG化干擾素分子，其中所述干擾素分子是具有如序列ID No:l所示氨基酸序列的IFNa2b分子，或其片段，或其與序列ID No:l具有至少60% 序列同源性的衍生物。
16.如權利要求15所述的C末端PEG化干擾素分子，其中所述干擾素分子是IFNα 2b。
17.如權利要求14所述的C末端PEG化干擾素分子，其中所述干擾素分子是具有如序列ID No :2所示氨基酸序列的IFNi3 Ib分子，或其片段，或其與序列ID No :2具有至少60% 序列同源性的衍生物。
18.如權利要求17所述的C末端PEG化干擾素分子，其中所述干擾素分子是IFNβ lb。
19.如權利要求14-18中任一項所述的C末端PEG化干擾素分子，其中所述PEG分子是質量在9kDa至12kDa范圍、諸如約IOkDa質量的直鏈PEG分子。
20.一種治療有相應需要的患者中的干擾素治療可以是有用的醫學病癥的方法，所述方法包括施用根據權利要求14-19中任一項的PEG化干擾素或根據權利要求1-13中任一項所述的方法產生的PEG化干擾素。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述醫學病癥選自由癌癥、IDDM、丙型肝炎、多發性硬化、自身免疫病癥和病毒性病癥組成的組。
22.用于醫藥的根據權利要求14-19中任一項的PEG化干擾素或根據權利要求1_13中任一項所述的方法產生的PEG化干擾素。
23.用于治療癌癥、IDDM、丙型肝炎、多發性硬化、自身免疫病癥或病毒性病癥的根據權利要求14-19中任一項的PEG化干擾素或根據權利要求1-13中任一項所述的方法產生的 PEG化干擾素。
24.根據權利要求14-19中任一項的PEG化干擾素或根據權利要求1_13中任一項所述的方法產生的PEG化干擾素在制備用于治療癌癥、IDDM、丙型肝炎、多發性硬化、自身免疫病癥或病毒性病癥的藥物中的用途。
25.一種藥物組合物，所述藥物組合物包括根據權利要求14-19中任一項的PEG化干擾素或根據權利要求1-13中任一項所述的方法產生的PEG化干擾素。
26.—種基本上如本文參照
圖1至圖11中的一個或多個描述的產生標記的干擾素分子的方法。
27.—種基本上如本文參照圖1至圖11中的一個或多個描述的C末端PEG化干擾素分子。
全文摘要
提供了干擾素分子的位點特異性標記的方法。所述方法包括以下步驟a)提供標記分子，所述標記分子包含具有醛或酮部分的PEG部分；b)提供干擾素分子，所述干擾素分子具有C末端酰肼部分；和c)使所述PEG部分的醛或酮部分與所述干擾素分子的C末端酰肼反應，以形成標記的干擾素分子，所述標記的干擾素分子包含經腙鍵連接至所述干擾素分子C末端的PEG部分。還描述了使用此種方法標記的干擾素分子。
文檔編號A61K38/21GK102421447SQ201080020756
公開日2012年4月18日 申請日期2010年5月17日 優先權日2009年5月15日
發明者格雷厄姆·科頓, 詹妮弗·羅伯茨 申請人:阿爾麥克科學(蘇格蘭)有限公司