抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗體及其用途的制作方法

            文檔序號:1199982閱讀:419來源:國知局
            專利名稱:抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗體及其用途的制作方法
            技術領域
            本發明涉及特異性地并以高親和力識別硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖的新的單克隆抗體(MAb)。本發明還涉及包含本發明的單克隆抗體或衍生自這些抗體的片段的藥物組合物。另外,本發明涉及用于診斷心血管疾病的試劑盒,其包含本發明的抗體或其片段。
            背景技術
            在用于獲得鼠MAb 的雜交瘤技術(Koehler y Milstein Nature, 256 :495-497, 1975)發展了 30多年以后,已經證明其在疾病診斷和基礎研究中是非常有用的,但是僅注冊了 20 種用于人類治療的抗體(Pharma Vitae, Monoclonal Abs Update,6-363,2008)。 這很大程度是由于它們在血液中的半衰期短、人類免疫系統對鼠效應子功能的識別差,以及,當把這些抗體注射進入患者時,由于它們的鼠源性而引發的免疫應答(HAMA應答,“人抗-小鼠抗體”的英文首字母簡略詞)。數項研究已經證明在施用外來抗體之后,患者中產生的免疫應答可能相當之強,并且能夠實質上消除該抗體在最初治療之后的治療功用。此夕卜,牛艮據 Khazaeli,M. B. y col. Journal of Immunotherapy 15:42—52(1994)的 艮告,在給予患者鼠MAb之后,隨后以不相關的鼠抗體進行的治療可能是無效的,甚至是有危險的,這是由于交叉反應性的HAMA應答。從以上信息可以看出,有必要獲得在人體中免疫原性較低的形式的治療性抗體,其可以容易地且經濟地獲得,并且它們適合于制備治療性制劑和其它用途。Morrison S. L. y col. Adv Immunol.,44 :65-92 (1989)。已經開發了數種方法以從小鼠或大鼠人源化抗體,因此減小當注射入人體時針對這些外來蛋白的異種應答。最初的減小免疫原性的嘗試之一是產生“嵌合”抗體,其中鼠蛋白的可變域被連接至人類分子的恒定域,不僅實現了降低的免疫原性,而且實現了免疫效應子功能的激活。Morrison S. L. y col. PNAS USA, 81 :6851-6855 (1984)。這些嵌合分子保持了與抗原結合相關的原始抗體的特征,同時其恒定區是非免疫原性的。動脈粥樣硬化及其后果對于世界人民具有重大影響,從數年前開始,其為發達國家(Melian, A. y col. Am. J. Pathol.,155 :775,1999)和古巴(0MS,2004,Anuario Estadistico, MINSAP,2007)發病率和死亡率的主要誘因。動脈粥樣硬化是多因素性質的慢性炎性疾病,其大大促成心肌和腦梗塞的發病、壞疽和肢體功能喪失。Greaves, D. R. y col. Trends Immunol 22 :180-181(2001) ;Ross, R. y col. Am Heart J 138(5Pt2) S419-20(1999)。動脈粥樣硬化的主要誘因之一是高膽固醇血癥。通過與蛋白聚糖的相互作用,低分子量脂蛋白(LDL)穿過動脈壁的運輸被阻塞在動脈內膜的細胞外基質中,并發生氧化修飾。結合于動脈內膜的蛋白聚糖的脂蛋白更易于在脂和蛋白部分發生變化,例如氧化和酶促水解,這會增加它們的致動脈粥樣化的潛在性。ApoB-100含有數個區域,通過所述區域其能夠結合至蛋白聚糖的糖胺聚糖鏈,所述區域共同之處在于存在多個堿性氨基酸。Camejo, G. , E. y col. Atherosclerosis 139:205-22, (1998) ;Chang, Τ. Y. y col. Curr Opin Lipidoll2 :289-96(2001) ;Camejo, G. , U. y col.Atheroscler Suppl3 :3-9(2002) 糖胺聚糖上的負電荷的密度影響其與LDL的相互作用,硫酸化程度影響LDL與蛋白聚糖的相互作用° Sambandam T. y col. Arterioascler Thromb, 11 :561-568 (1991)。此外,氧化的LDL能夠通過巨噬細胞表面上的清道夫受體被巨噬細胞內化,這導致細胞內膽固醇的積累,隨后形成泡沫細胞。這些事件代表了啟動免疫應答的主要步驟,其中涉及單核細胞/巨噬細胞、肥大細胞、樹突細胞、T細胞和NKT。Camejo, G. y col. Atherosclerosisl39(2) :205-22(1998) ;Hurt-Camejo, Ε. y col.Invest Clin 42Suppll 43-73(2001) ;Skalen,K.,M. y col.Nature 417 :750-754(2002) 有實驗證據證明存在于巨噬細胞表面上的蛋白聚糖參與氧化的LDL與這些細胞的結合以及這些顆粒的內化或摻入,這最終引起泡沫細胞的形成。Halvorsen B. y col. Biochem J. 331 :743-752(1998)。毫無疑問,采取更健康的生活方式以及使用抗血栓和減脂劑已經對降低發生心血管事件的風險產生了影響,但這些策略仍不足以完全消除這些風險。如上所述,動脈粥樣硬化是多因素的炎性疾病,其中多種抗原對于其發展具有重要意義,所以正在開發不同的主動和被動免疫治療的策略,其旨在實現對該疾病的更大的治療效果。這些策略之一是增加HDL,因為HDL-膽固醇與心血管疾病之間具有相反的關系。 CETP是HDL代謝中的關鍵酶,其被認為是治療的潛在靶標,因為其活性的降低會增加HDL的水平。使用誘導能夠結合并抑制CETP功能的抗體的疫苗的策略已經描述于W01997/041227 和WO 2006/133196。然而,最近的研究表明,使用CETP抑制劑Torcetrapib進行的III期臨床試驗失敗了,這使得對于該策略產生了疑慮。Nicholls S. J.y col. Circulation. 9 ; 118 :2506-14(2008) ;Hermann Μ. y col. Curr Hypertens Rep,11 :76-80(2009) 一些作者已經描述了使用氧化的LDL作為免疫原的疫苗,旨在抑制動脈粥樣硬化斑的形成。Palinski W. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:821-25(1995) ;Ameli S y col.Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 16 1074-79(1996) ;Freigang S. y col. Arterioscl.Thromb.Vase.Biol. 18 1972-829 (1998) ;Zhou X. y col.Arterioscler. Thromb.Vase. Biol. 21 :108-14(2001) ;George J.y col.Atherosclerosis 138 147-52 (1998) ;Fredrikson G.N.y col. Arterioscler. Thromb. Vase.Biol.23 879-84(2003) ;US 2008/0070265A1。另一項策略是開發基于氧化的載脂蛋白C-III的特異性片段的預防性和治療性疫苗,其旨在誘導能夠預防或減少形成動脈粥樣硬化病變的免疫應答(W0 2001/064008, WO 2003/020765, WO 2004/080375 和 WO 2004/081045)。所描述的另一種疫苗方法是基于綴合于醛例如MDA或4-HNE的肽,以誘導與T細胞的α/β受體相互作用的抗體,從而預防形成動脈粥樣硬化病變(W02001/068119)。一些作者支持針對動脈粥樣硬化中的病原體的疫苗的重要性,以預防動脈粥樣硬化斑的形成(W01998/033510, US 006291437Β1, US6471965B1, US006808713B1)。所提出的另一項用于延緩或降低由于攝入膳食性膽固醇而引起的動脈粥樣硬化嚴重性的策略是使用針對固醇的疫苗(us 2002/0018808A1)。作為治療工具的被動免疫治療也可以在動脈粥樣硬化中發揮重要作用。已經描述了通過使用針對Apo B100的氧化的或修飾的片段的人類抗體來治療或預防動脈粥樣硬化的被動免疫(US 005196324a, US2007/0098725A1, US 2008/0075716A1)。另外,已經提出使用針對磷酰膽堿的特異性抗體的被動免疫作為治療組合來治療或預防動脈粥樣硬化(US 2007/0286868A1, US2007/0122419A1) 所描述的另一項策略是使用特異性結合人M-CSF的抗體或抗原結合片段(US 2007326414B2)。針對該疾病的另一項治療方法是使用防止單核細胞粘附至血管內皮并因此防止侵入內皮和周圍組織的MAb (US 005541296A)。已經描述了單克隆抗體作為糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑并因此作為血小板聚集的抑制劑的用途(W0 1999/052551,US 005976532A)。另外,獲得了針對載脂蛋白CIII的保護性肽表位的人單克隆抗體,以用于被動免疫治療(W0 2004/081046)。另外,使用靜脈內免疫球蛋白(IVIG)可以具有防止動脈硬化效應Udi Nyy col. Autoimmunity reviews 7:445—452(2008)。尚未描述與硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖反應、或識別巨噬細胞和動脈粥樣硬化病變、當以低劑量施用時具有抑制形成動脈粥樣硬化病變的能力、并且誘導針對這些硫酸化分子的抗體應答的嵌合的MAb。

            發明內容
            本發明涉及單克隆抗體,其特征在于識別硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖或衍生自它們的片段。本發明的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗體優選為單克隆的。在本發明的范圍內還包括抗體片段,例如本說明書中提供的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗體的Fab片段、 Fab' ,Fab' -SH和F(ab' ) 2。可以通過傳統方式、例如酶促消化來產生這些抗體片段,或者可以通過重組技術來產生。這些抗體片段可以是嵌合的或人源化的。這些片段用于本說明書中記載的診斷和治療目的。本發明還包括實質上純的抗體及片段的實施方式。在具體的實施方式中,本發明的抗體的特征在于下列的重鏈和輕鏈可變區序列。重鏈HCDRl RYSVHHCDR2 MIffGGGSTDYNSALKSHCDR3 SGVRRGRAQAffFAYHFRl QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSHFR2 WVRQPPGKGLEffLGHFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHFR4 WGQGTLVTVSA輕鏈LCDRl KASQDVSTAVALCDR2 SASYRYTLCDR3 QQHYSTPffTLFRl DIVMTQSHKFMSTSV⑶RVSITCLFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCLFR4 FGGGTKLELK
            另外,本發明的抗體包括對于重鏈是人IgGl恒定區;對于輕鏈是人Ck。本發明包括組合物,包括藥物組合物,其包含本發明的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗體或衍生自它們的片段。如本說明書中使用的組合物包括與硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖結合的一種或多種抗體。這些組合物還可以包含合適的載體,例如藥學上可接受的賦形劑,包括緩沖液或佐劑,其為本領域熟知的。在另一個實施方式中,本發明涉及包含MAb的藥物組合物,所述MAb的重鏈和輕鏈可變區序列如下所示。重鏈HCDRl RYSVHHCDR2 MIffGGGSTDYNSALKSHCDR3 SGVRRGRAQAffFAYHFRl QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSHFR2 WVRQPPGKGLEffLGHFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHFR4 WGQGTLVTVSA輕鏈LCDRl KASQDVSTAVALCDR2 SASYRYTLCDR3 QQHYSTPffTLFRl DIVMTQSHKFMSTSV⑶RVSITCLFR2 WYQQKPGQSPKLLIYLFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCLFR4 FGGGTKLELK在第三個方面,本發明涉及用于診斷動脈粥樣硬化病變的試劑盒,其包含本發明的抗體中的一種或衍生自它的片段。更具體地,試劑組包含具有如上所述的重鏈和輕鏈可變區序列的MAb。在另一個方面,本發明涉及本發明的抗體用于治療心血管疾病、尤其是那些顯示出動脈粥樣硬化病變跡象的心血管疾病的用途。術語抗體一般是指MAb,更具體是指鼠MAb或嵌合抗體。抗體的獲得一般地,可以通過雜交瘤方法從經過以獲自天然或合成來源的糖脂提取物免疫的小鼠獲得本發明的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖MAb,該方法首先描述于Kohler et al., Nature, 256 :495 (1975)。將來自經免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞P3. X63Ag86. 5. 3融合,在如所描述的選擇性培養基上培養,通過以ELISA檢測培養物上清液中的免疫球蛋白來選擇生產性克隆。在鑒定了以所需的特異性、親和力和/或活性產生抗體的雜交瘤細胞之后,可以通過有限稀釋程序對產生抗體的克隆進行亞克隆,可以通過細胞培養物生長的標準方法使其生長(Goding,Monoclonal Abs Principles and Practice,pags. 59-103 (AcademicPress, 1986))。適合于此目的的培養基包括,例如,培養基D-MEM或RPMI-1640。此外,可以在動物體內以腹水腫瘤的形式使雜交瘤細胞生長。適宜地通過常規程序從培養基、腹水或血清中分離由亞克隆分泌的MAb,以純化免疫球蛋白,例如,通過A-瓊脂糖、羥磷灰石色譜、凝膠電泳、透析或親和色譜。也可以通過遺傳工程技術通過正確操作鼠免疫球蛋白基因來獲得本發明的抗體。 例如,可以通過常規的基因操作技術,例如本領域所描述的,特別是例如,擴增、克隆、基因測序禾口消化,例如描述于 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual 3rd. edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. Current Protocols in molecular biology(F. M. Ausubel, et al. eds. , (2003)) ;la serie Methods in Enzimology(Academic Press,Inc. ) :PCR 2 :A practical approach(M. J. MacPherson,B. D. Hames y G.R.Taylor eds. (1995)), Harlow y Lane, eds. (1988) ABS,A laboratory manual, y Animal cell culture (R. I. Freshney, ed. (1987))中的那些,從純化自產生鼠單克隆抗體的細胞的RNA來獲得本發明的嵌合抗體。可以從編碼鼠抗體的RNA進行抗體可變區的cDNA合成和PCR (聚合酶鏈式反應的英文首字母縮略詞)擴增,合成cDNA,通過PCR擴增VK和VH可變區,這可以通過本領域中為此目的所描述的常規技術來進行。將重鏈和輕鏈各自的PCR產物分別克隆進入用于基因測序的載體。使用為此目的所描述的任意方法對得到的克隆進行測序,例如,根據生產商的說明書,使用T7DNA聚合酶,使用雙脫氧核苷酸方法。根據用于構建嵌合基因的常規技術,通過中間體構建體的酶限制性消化獲得重鏈 VH和輕鏈VK的可變區基因,并克隆進入各自的表達載體。為此目的可使用所描述的任意載體以有效表達重組蛋白、尤其是MAb。為了表達嵌合抗體,可以使用NSO細胞,以含有抗體基因的各表達載體中的DNA構建體電穿孔所述細胞。這些細胞生長于選擇性培養基。通過使用ELISA(酶聯免疫吸附測定)測定培養物上清液來檢測產生免疫球蛋白的克隆。具有所需的特異性和功能的抗體的選擇在一些實施方式中,可以通過本領域中為此目的描述的多種技術、例如ELISA來檢測本發明的抗體。在本發明的一些實施方式中,分析所產生的抗體的生物學活性。在一些實施方式中,就它們與抗原結合的活性來測試本發明的抗體。本領域已知并可用于本說明書中的抗原結合測驗尤其包括直接或競爭性結合測驗,其使用諸如^festern印跡、放射免疫測驗、ELISA、雙抗免疫測驗(夾心式)、免疫沉淀檢驗、熒光免疫測驗和蛋白A免疫測驗的技術。在后面的實施例部分包括了用于抗原結合的示例性測驗法。另外,在本發明中,可以鑒定那些產生能夠識別人主動脈組織切片中的動脈粥樣硬化斑的抗體的克隆,這可以通過使用本領域中描述的常規的免疫組織化學技術來進行。在另一個方面,可以測定本發明抗體在小鼠中誘導抗肝素應答的能力。為此,以本發明的抗體免疫不同組的動物,并就抗肝素抗體的存在來測試這些動物的血清樣品。在另外的方面,可以測定本發明抗體的抗動脈粥樣硬化效應,為此,可以使用通過力保肪寧(Lipofimdin)誘導而在兔子中產生動脈粥樣硬化病變的模型(Takers E, Harsing J,Fiizesi S,Jellinek H. 1986Arteriosclerosis developing in rabbits after lipofundin administration. Morphol Igazsagugyi Orv Sz. 26 :99-105 ;Noa M & M0s R(1992). Ateromixol y lesion aterosclerotica en conejos inducida por lipofundin. Progresos en Ciencias Medicas,6 :14-19)。藥物組合物在一個實施方式中,本發明提供了包含一種或多種本發明的抗體的藥物組合物。 在一個實施方式中,包含抗體的組合物還包含藥學上可接受的賦形劑。在一個方面,本發明提供了試劑盒,其包含一種或多種本發明的抗體,還可以包含緩沖溶液。在一個實施方式中,緩沖溶液是藥學上可接受的。在一個實施方式中,包含抗體的組合物還包含載體分子,在一些實施方式中,所述載體分子是藥學上可接受的。在一個實施方式中,試劑盒還包含用于向受試者施用或使用組合物、例如抗體的說明書。通過將具有所需純度的抗體與生理上可接受的載體分子、任選賦形劑或穩定劑混合來制備包含本發明抗體的藥物組合物以保存它們(Remington :The Science and Practice of Pharmacy 20th editionQ000)),其形式為水溶液、凍干的或其它凍干的制劑。可接受的介質、賦形劑或穩定劑在所使用的所有劑量和濃度對于接受者都是無毒的。本發明的MAb以對于期望目的有效的量組合存在于藥物組合物中。用于體內施用的制劑必須是無菌的。通過經由無菌過濾膜的過濾來實現這一點。在一個方面,本發明顯示了如何使用本發明的抗體制備用于治療性和/或預防性處理病癥、例如心血管疾病的藥物。本發明的抗體可用于治療、抑制動脈粥樣硬化病變、延緩其進展、預防/延緩其發作、緩解或預防與一種或多種抗原性分子的表達和/或活性相關的疾病、病癥或過程。根據本發明,這些抗體的治療劑量將是10 μ g至IOmg/劑,優選100 μ g至lmg/劑。本發明的MAb通過任意合適的方式施用,包括胃腸外、皮下、腹膜內、肺內和鼻內途徑,如果需要局部處理,則可以通過損傷內(intralesional)途徑施用。在另一方面,本發明提供了用于診斷病癥、例如心血管疾病的試劑盒。實施例以下實施例意在例示本發明而不限制其范圍。在下列實施例中,除非另有指明,否則所使用的所有限制性或修飾性酶以及試劑和材料均獲自商業途徑。實施例1.嵌合MAb抗-S03對于牛腦硫苷脂的識別使用ELISA,以甲醇中的濃度為4 μ g/mL的牛腦硫苷脂溶液以50 μ L/孔包被 PolySorp平板,Nunc,通過在37°C溫育90分鐘蒸發掉溶劑。然后,以含有牛血清白蛋白(SAB)的磷酸鹽緩沖液(PBS)以200 μ L/孔在室溫封閉平板1小時。然后,加入50 μ L/ 孔的PBS中的不同濃度的嵌合抗體抗-S03,并在37°C溫育1小時。然后以PBS洗滌平板并加入50 μ L/孔的綴合于堿性磷酸酶(Sigma)的山羊抗血清抗-人Y鏈。將平板在37°C溫育1小時,然后再次洗滌平板,并加入100 μ L/孔的底物溶液,其由ρΗ9. 8的二乙醇胺緩沖液中的lmg/mL磷酸對硝基苯酯組成。在室溫溫育30分鐘之后,在ELISA讀數器中在405nm 測定反應產物的吸收值。
            作為陰性對照,使用通過將嵌合單克隆抗-S03的位置98處的重鏈可變區中的R 替換為S而修飾的嵌合MAb。圖1顯示了不同的嵌合MAb針對硫苷脂的反應性。該圖顯示了嵌合單克隆抗-S03即使在低至0. 01mg/ml的濃度也識別硫苷脂。相反,在位置98處修飾的嵌合MAb不顯示任何反應性。實施例2.肝素識別測試隨后測定了嵌合單克隆抗-S03是否識別比硫苷脂更復雜的硫酸化分子。選擇了肝素進行此研究,肝素是高度硫酸化的分子,其用作硫酸化糖胺聚糖的模型。基于Skalen,K. M. y cols (Nature 417 :750_754,2002)開發的用于 biglican 的 ELISA技術并稍加修改來進行抗肝素反應性的測試。以!fepes緩沖的鹽溶液(HBSS) (20mM Hepes, 150mM NaCl, pH 7.4)中的 10 μ g/mL(100 μ L/孑L )的肝素(Sigma)包被 Maxisorp 微量滴定板(Nunc)并在4°C過夜溫育。以HBSS洗滌平板3次,然后以含有SAB的 HBSS (HBSS-BSA)在室溫封閉 1 小時。以 0. 02% 的 HBSS-Tween20 (HBSS-T)洗滌平板 3 次, 并在室溫在1小時內加入嵌合單克隆抗-S03的連續稀釋物從結合緩沖液(IOmM Hepes, 20mM NaCl, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2,pH7. 4)中的40 μ g/mL的最初濃度開始。作為陰性對照, 使用通過將嵌合單克隆抗-S03的位置98處的重鏈可變區中的R替換為S而修飾的嵌合抗體。以HBSS-T洗滌平板2次,然后與HBSS-T (含有0. SAB)中的綴合于堿性磷酸酶 (Sigma-Aldrich, USA)的山羊抗血清抗-人、鏈一起在室溫溫育1小時。進行所需的洗滌,使用溶解于PH9.8的二乙醇胺緩沖液中的底物磷酸對硝基苯酯使反應顯色。在ELISA 讀數器(Organon Teknica, Austria)中在405nm定量產物的吸收值。如圖2所示,嵌合單克隆抗-S03具有針對肝素的高反應性。相反,用作同種型對照的修飾的嵌合抗體在所研究的任何濃度都不顯示反應性。實施例3 通過流式細胞術測定J774細胞系的識別 單核細胞和巨噬細胞在炎性過程、例如動脈粥樣硬化中具有重要意義(0sterud BBjorklid Ε. Physiol Rev 83 :1069_1112,200 。這些細胞合成蛋白聚糖,已經證明在形成泡沫細胞時,巨噬細胞中摻入氧化的LDL的某些途徑涉及細胞膜蛋白聚糖(Halvorsen B, et al. Biochem J. 331 :743-752,1998)。為了測定抗-S03-嵌合抗體是否能夠識別巨噬細胞,我們使用鼠巨噬細胞系J774 進行了流式細胞術實驗,其培養于補充了 8%滅活胎牛血清(SFT;Gibc0)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL 青霉素、100 μ g/mL 鏈霉素的 DMEM-F12 (Gibco BRL, Paisley, Scotland)。將細胞(0. 5xl06/管)與20 μ L/管的滅活兔血清在37°C —起溫育10分鐘以封閉 Fc-Y受體。然后,加入同為生物素化的、濃度為 ομ g/mL的、處于含有牛血清白蛋白 (Sigma, St. Louis,MO)和0. 01%疊氮鈉的pH7. 4的PBS中的抗-S03-嵌合MAb和同種型對照修飾的嵌合抗體,置于冰浴中30分鐘。洗滌細胞之后,按照1/200稀釋將它們與鏈霉親禾口素-焚光素異硫氰酸酉旨復合物(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)在冰浴中溫育30分鐘。洗滌細胞,重懸于含有疊氮鈉的PBS中并在流式細胞儀 (Becton-Dickinson, San Jose, CA)上分析。如圖3所示,用作同種型對照的嵌合抗體不識別細胞系J774。相反,抗-S03-嵌合抗體識別93. 7%的細胞。實施例4 人主動脈中的動脈粥樣硬化斑的識別
            在固定于福爾馬林并包埋于石蠟中的人主動脈片段上進行嵌合抗體抗-S03的識別的免疫組織化學測定。使用4 μ m的組織切片,其封片于硅烷化的載玻片中,并在68°C溫育12小時。在二甲苯中使組織切片脫石蠟,在濃度漸減的乙醇中水化。然后將它們在蒸餾中洗滌5分鐘,在PBS中洗滌。使用設定在100°C的溫度的恒溫水浴進行抗原暴露。將平板浸于PH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中,保持在水浴中30分鐘,然后使用微波爐在pH6. 8的檸檬酸鹽緩沖液中煮沸10分鐘。將切片冷卻20分鐘,然后以蒸餾水和PBS洗滌。以3%的H2A 溶液在室溫抑制內源性過氧化物酶10分鐘,以PBS洗滌,加入濃度為50 μ g/mL的生物素化的嵌合抗體抗-S03和同種型對照抗體,在室溫放置30分鐘。然后,以PBS洗滌切片并在相同的溫度加入鏈霉親和素-過氧化物酶復合物(Anacrom Diagnostics),放置相同的時間。 最后,將組織切片與ImL底物緩沖液中的3,3' -二氨基聯苯胺(DAB)的新鮮混合物溶液一起溫育3-5分鐘。使用Mayer' s蘇木素進行反襯,將樣品在濃度漸增的醇中脫水,在二甲苯中澄清,最后在永久培養基平板Eukitt (Kinder GmbH & Co.)中封片。使用白光顯微鏡 (Leica)進行測評。圖4顯示了抗-S03嵌合抗體如何與存在于主動脈中的動脈粥樣硬化病變樣品強烈地反應。觀察到與充滿脂的巨噬細胞或泡沫細胞以及與病變脂核的反應性(反應性以深灰色顯示)。該圖顯示了用作同種型對照的抗體不識別人主動脈切片。實施例5.抗-S03嵌合抗體在小鼠中誘導抗-肝素應答的能力使用BALB/c雌性小鼠;它們皮下接受50 μ g抗-S03-嵌合抗體(在200 μ L中)。 每14天進行免疫,以完成總共4劑。施用抗-S03-嵌合抗體而不加佐劑或載體蛋白。在第 0天和第49天(第4劑之后7天)獲取血清樣品。使用實施例2中描述的ELISA技術測定經免疫的動物的血清中抗-肝素抗體的存在使用肝素(10 μ g/mL, 100 μ L/孔)包被的Maxisorp平板。按照1/100的稀釋度測試結合緩沖液中的小鼠血清,100 μ L/孔。作為二抗,使用綴合于堿性磷酸酶(Jackson)的山羊抗-小鼠IgG和IgM抗血清。圖5顯示了使用在第0天和第49天獲取的小鼠血清進行的測驗的結果。在任何動物的免疫前血清(第0天)中都沒有檢測到抗-肝素抗體的存在。相反,在以抗-S03-嵌合抗體免疫小鼠之后,檢測到這些血清抗體的存在。該結果說明抗-S03-嵌合抗體不僅強烈識別肝素,而且具有令人驚奇的誘導針對該分子的應答的能力(疫苗效應)。實施例6.抗-S03-嵌合抗體的抗動脈粥樣硬化效應為了測定抗-S03-嵌合抗體是否能夠在體內產生生物學效應,我們使用了之前描述的模型使用力保肪寧在兔子中誘導動脈粥樣硬化病變(Takcics E and cols. Morphol Igazsagiigyi Orv Sz. 26 :99-105,1998, Noa M & R. More Progress in Medical Sciences, 6 :14-19,1992)。使用15只新西蘭兔,將它們分成3組,每組5只。組1不接受處理(陰性對照)。 組2每日靜脈內接受2mL/kg 20%的力保肪寧(Braim),持續8天。組3以7天的間隔皮下接受3劑處于PBS中的100 μ g抗-S03-嵌合抗體,在最后一次免疫那天開始每日施用力保肪寧,按照與組2的動物中所使用的相同的方案進行。在接受最后一劑力保肪寧1天之后, 在麻醉下殺死所有的兔子,在同一天殺死組1的陰性對照動物。從動物獲取主動脈,進行生理學研究以確定是否存在肉眼可見和顯微鏡下可見的動脈粥樣硬化病變。
            來自組1的未接受處理的兔子的主動脈未顯示出肉眼能看到的病變。在來自組2 的接受2mL力保肪寧/kg持續8天的兔子的所有主動脈中,觀察到肉眼可見的病變。在那些先接受3劑抗-S03-嵌合抗體再施用力保肪寧的兔子的主動脈中,沒有肉眼可見的病變。為了進行顯微鏡下病變研究,將主動脈的片段固定于福爾馬林并包埋于石蠟中。 使用4 μ m的組織切片,封片于硅烷化的載玻片中,并以蘇木精-曙紅染色。使用白光顯微鏡(Leica)進行測評。當測評未接受處理的兔子的主動脈的組織切片時,均顯示出無改變的動脈的正常結構,如圖6所示。在來自接受力保肪寧的組的所有兔子的主動脈切片中,觀察到特征性的病變出現內膜變厚,在肌肉、彈性和膠原纖維之間的細胞外物質的沉積,以及組織架構畸變。相反,在來自接受3劑抗-S03-嵌合抗體、然后再施用力保肪寧的3只兔子的樣品中沒有觀察到顯微鏡下的病變。在來自其余2只兔子的樣品中,觀察到組織變化在動脈壁的一些區域中有一些不連續的增厚,在纖維之間有細胞外物質的沉積。沒有內膜的增厚。


            圖1.抗-S03-嵌合MAb對硫苷脂的識別將多個濃度的抗-S03-嵌合MAb和同種型對照嵌合MAb加入到以甲醇中的濃度為 4 μ g/mL的硫苷脂包被的ELISA平板中。以綴合于堿性磷酸酶的山羊抗-人、鏈抗血清檢測反應性。在ELISA讀數器中在405nm定量產物的吸收值Γη < 0. 05,Mann-Whitney U 檢驗)。圖2.抗-S03-嵌合MAb對肝素的識別將多個濃度的抗-S03嵌合-MAb和同種型對照嵌合MAb加入到以HBSS中的濃度為10 μ g/mL的肝素包被的ELISA平板中。以綴合于堿性磷酸酶的山羊抗-人、鏈抗血清檢測反應性。在ELISA讀數器中在405nm定量產物的吸收值Γη < 0. 05,Mann-Whitney U 檢驗)。圖3.抗-S03-嵌合MAb對J774細胞系的識別將細胞與10 μ g/mL的生物素化抗體一起溫育。使用綴合于FITC的山羊抗-人 IgG抗血清顯示反應,并通過流式細胞術分析。圖4.通過抗-S03嵌合MAb識別人動脈粥樣硬化斑將固定于福爾馬林并包埋于石蠟中的人主動脈的片段Gym)與生物素化的抗-S03-嵌合抗體及同種型對照抗體溫育。使用鏈霉親和素-過氧化物酶復合物顯示反應。抗-S03-MAb對表位的識別通過深灰色顏色指示,以蘇木精對比染色細胞的細胞核GOO 倍)。圖5 通過以抗-S03-嵌合MAb免疫而誘導的針對肝素的抗體應答通過ELISA測定獲自以抗-S03-嵌合MAb在第0天和第49天免疫的BALB/c小鼠的血清樣品。每種符號是以小鼠血清獲得的數值。Pi和hi分別是預免疫和超免疫ΓP < 0. 05, Mann-Whitney U 檢驗)。圖6.以抗-S03-嵌合MAb進行的處理對于兔子力保肪寧模型中產生動脈粥樣硬化病變的效應代表不同的研究組的兔子胸主動脈的組織學切片。A 組1,未處理的動物,其顯示出動脈的正常結構,無改變。B:組2,以力保肪寧處理的動物,其中觀察到動脈內膜增厚, 在肌肉、彈性和膠原纖維之間出現細胞外物質的沉積,和組織架構的畸變。C和D 組3,以抗-S03-嵌合MAb免疫、后又接受力保肪寧的動物;未觀察到明顯的組織損傷或內膜增厚。 蘇木精-曙紅染色,180倍。
            權利要求
            1.用于診斷和治療心血管疾病的單克隆抗體,其中所述抗體特異性結合硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖。
            2.根據權利要求1的單克隆抗體,其中重鏈和輕鏈的可變區的互補決定區(CDR)的序列如下所示重鏈HCDRl RYSVH HCDR2 MIffGGGSTDYNSALKS HCDR3 SGVRRGRAQAffFAY 輕鏈LCDRl KASQDVSTAVA LCDR2 SASYRYT LCDR3 QQHYSTPffT0
            3.根據權利要求2的單克隆抗體,其中重鏈和輕鏈的可變區內的框架區的序列如下所示重鏈HFRl QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSHFR2 WVRQPPGKGLEffLGHFR3 RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARHFR4 WGQGTLVTVSA輕鏈LFRl DIVMTQSHKFMSTSV⑶RVSITC LFR2 WYQQKPGQSPKLLIY LFR3 GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC LFR4 FGGGTKLELK。
            4.根據權利要求3的單克隆抗體,其中恒定區的序列是對于重鏈而言是人IgGl;對于輕鏈而言是Ck。
            5.包含權利要求1至4的任意單克隆抗體或其片段的藥物組合物。
            6.權利要求5的藥物組合物,其還包含藥學上可接受的賦形劑。
            7.權利要求6的藥物組合物,其還包含佐劑。
            8.用于診斷動脈粥樣硬化病變的試劑盒,其包含權利要求1至4的任意單克隆抗體或其片段。
            9.特異性結合硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖的單克隆抗體在制備用于診斷和治療心血管疾病的藥物中的用途。
            10.權利要求1至4的單克隆抗體在制備用于治療心血管疾病的藥物中的用途。
            全文摘要
            本發明涉及生物技術領域,尤其是用于人類健康的新產品。本發明提供了新的特異性單克隆抗體,其特異性地并以高親和力識別硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖。在本說明書中描述的抗硫苷脂和抗硫酸化蛋白聚糖抗體構成了重要的診斷和治療試劑,其作用于與動脈粥樣硬化斑的出現相關的病理學過程。與此相應,本發明提供了包含本發明的單克隆抗體或衍生自這些抗體的片段的藥物組合物,其用于與心血管疾病相關的治療和診斷用途。另外,本發明涉及識別硫苷脂和硫酸化蛋白聚糖的單克隆抗體的片段,所述片段可用于這種病況的治療或診斷。
            文檔編號A61P9/10GK102414222SQ201080019730
            公開日2012年4月11日 申請日期2010年5月3日 優先權日2009年5月4日
            發明者A·M·維茲克茲洛普茲, A·洛普茲瑞克納, C·馬蒂奧德阿卡斯塔德爾瑞奧, V·布瑞托納維羅, Y·索托洛普茲, Y·費爾南德茲瑪瑞奧 申請人:分子免疫中心
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