在疾病治療方法中使用的b-淋巴細胞靶向劑的制作方法

專利名稱：在疾病治療方法中使用的b-淋巴細胞靶向劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及在心功能不全的治療或診斷方法中使用的B-淋巴細胞靶向劑。此外， 本發明涉及包含該B-淋巴細胞靶向劑的組合物，以及確定心功能不全患者是否適合使用 B-淋巴細胞靶向劑對該疾病進行治療的方法。
背景技術：
心功能不全或心力衰竭是以心輸出量不能滿足身體需要的生理狀態為特征的疾病。造成心力衰竭的常見原因包括心肌梗塞和其它形式的缺血性心臟病、高血壓、瓣膜性心臟病和心肌病。心肌病是心肌疾病，其通過中樞血液動力學和大體病理學進行定義， 并且已被劃分為5種主要形式擴張性心肌病(DCM)、肥大性心肌病(HCM)、限制性心肌病 (RCM)、右室心肌病(RVCM)和不可分類的心肌病(NCCM)。炎性心肌病(DCMi)是DCM中的特定心肌病，其通過以心肌內炎癥和/或心內膜心肌活檢(EMB)中的病毒感染為例證進行定義。心力衰竭可造成多種癥狀，如氣促(通常在平躺時更嚴重，其被稱為端坐呼吸)、 咳嗽、踝關節腫脹和運動能力降低。由于缺乏公認的定義以及在確定性診斷中存在的異議， 因此心力衰竭通常難以診斷。治療一般由生活方式措施(如減少鹽的攝入)和藥物療法組成，有時還包括設備或者甚至手術。心力衰竭是常見的、昂貴的、致殘和致死的病況。在發達國家，約2%的成年人患有心力衰竭，但是在65歲以上的人群中，這一比率提高至6-10%。它的醫療費用較高，這主要是由住院治療的花費所造成的；在英國，費用預計占國家健康中心總預算的2%，而在美國，該花費超過了 350億美元。心力衰竭與身心健康水平的顯著下降有關，從而導致生活質量明顯降低。除了可逆病況所引起的心力衰竭外，這種病況通常會隨時間加重。盡管一些患者存活了多年，但是進行性疾病造成了 10%的整體年死亡率。除了生活方式形式外，目前還存在用于治療心功能不全的藥理學藥征。在心功能不全的治療中存在著顯著的證據_實踐差距；具體地，已顯示能夠提供死亡率改善作用的ACE抑制劑和阻斷劑以及醛甾酮拮抗劑的使用不足。心功能不全的治療旨在通過延緩心力衰竭的進展和降低心血管風險來減輕癥狀、維持液量正常狀況(循環系統中正常的體液水平)和改善預后。所使用的藥物包括利尿劑、血管舒張劑、正性肌力藥、ACE抑制劑、β阻斷劑和醛留酮拮抗劑(例如，螺留內酯)。增強心臟功能的一些藥物(如正性肌力藥米立農)會導致死亡率提高并已禁用。

發明內容
因此，在第一方面，本發明申請的問題在于提供適于心功能不全治療的試劑。在第二方面，本發明的問題在于提供一種試劑，該試劑適于確定哪類患者適合以根據第一方面所提供的試劑為基礎的療法。
通過在心功能不全的治療方法中使用的B-淋巴細胞靶向劑，解決了本發明潛在的問題。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑靶向由B-淋巴細胞所表達的抗原或B-淋巴細胞可誘導表達的抗原。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑與由B-淋巴細胞所表達的抗原或B-淋巴細胞可誘導表達的抗原結合。在一個實施方式中，所述抗原選自⑶19、⑶20和⑶21。在一個實施方式中，所述抗原為⑶20。在一個實施方式中，所述方法包括向有需要的患者施用B-淋巴細胞靶向劑的步
馬聚ο在一個實施方式中，所述患者為心臟組織含有B-淋巴細胞的患者。在一個實施方式中，B-淋巴細胞存在于細胞間隙中，優選地，存在于心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙中。在一個實施方式中，所述心功能不全是選自由心肌或心內膜的炎癥所引起的心功能不全、由心肌或心內膜的變性所引起的心功能不全、由冠狀動脈功能不全所引起的心功能不全、由心肌梗塞所引起的心功能不全和創傷所引起的心功能不全中的一種。在一個實施方式中，所述心功能不全不同于由心肌梗塞所引起的心功能不全。在一個實施方式中，所述心功能不全由心肌或心內膜炎所引起。在本發明的一個實施方式中，所述心功能不全由心肌病所引起，優選地，由炎性心肌病(DCMi)所引起。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑能夠或可用于殺死B-淋巴細胞。在一個實施方式中，B-淋巴細胞具有至少一種抗原，該抗原選自⑶19、⑶20和 ⑶21，優選地，所述抗原為⑶20。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑為裸B-淋巴細胞靶向劑。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑包含可用于殺死B-淋巴細胞的其它部分。在一個實施方式中，所述其它部分選自放射性同位素、細胞毒性劑和免疫調節劑。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑是治療有效的，或者是以能夠提供治療效果的量施用的。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑選自抗體、適體、鏡像適體(spiegelmer)、 抗原結合多肽和抗促成素(anticaline)。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑為抗體。在一個實施方式中，所述抗體是多克隆抗體。在一個實施方式中，所述抗體是單克隆抗體。在一個實施方式中，所述抗體是抗體片段，優選地，是與各自抗體所結合的相同的抗原和/或表位結合的抗體片段。在一個實施方式中，所述抗體片段為選自F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、FV、ScFV 和sFv中的一個。在一個實施方式中，所述抗體為非人靈長類抗體、鼠單克隆抗體、嵌合抗體、人化抗體或人抗體。
在一個實施方式中，所述抗體介導了補體介導的細胞毒性和/或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。在一個實施方式中，所述抗體為抗CD20抗體。在一個實施方式中，所述抗體為利妥昔單抗(rituximab)。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑選自適體、鏡像適體、抗原結合多肽和抗促成素。在一個實施方式中，B-淋巴細胞靶向劑包含可用于殺死B-淋巴細胞的其它部分。在一個實施方式中，所述其它部分選自放射性同位素、細胞毒性劑和免疫調節劑。在一個實施方式中，所述其它部分為放射性同位素。在一個實施方式中，所述放射性同位素選自198Au、32P、125I、131I、9°Y、186Re、188Re、 67Cu、211At、213Bi 或 225Ac。本發明潛在的問題還通過包含如上定義的B-淋巴細胞靶向劑以及可藥用載體的藥物組合物解決。在一個實施方式中，所述藥物組合物用于在心功能不全(優選地，如上定義的心功能不全)的治療方法中使用。本發明潛在的問題還通過使用用于生產治療心功能不全(優選地，如上定義的心功能不全)的藥劑的如上定義的B淋巴細胞靶向劑解決。本發明潛在的問題還通過用于確定心功能不全患者對使用如上定義的B-淋巴細胞靶向劑的心功能不全的治療是否敏感的體外方法解決，該方法包括以下步驟a)提供患者的心臟組織樣品；b)將所述樣品與如上定義的B-淋巴細胞靶向劑接觸；和c)確定所述樣品中是否包含B-淋巴細胞。在一個實施方式中，如果樣品中含有B-淋巴細胞，則可以使用如上定義的B-淋巴細胞靶向劑治療患者。本發明潛在的問題還通過用于確定心功能不全患者對使用如上定義的B-淋巴細胞靶向劑的心功能不全的治療是否敏感的方法解決，該方法包括以下步驟a)向患者施用如上定義的B-淋巴細胞靶向劑；和b)使如上定義的B-淋巴細胞靶向劑所靶向的B-淋巴細胞顯像。在一個實施方式中，確定在心臟中是否存在B-淋巴細胞，更優選地，確定在細胞間隙(優選地，在心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙)中是否存在B-淋巴細胞。在一個實施方式中，在心臟中存在B-淋巴細胞，更優選地，在細胞間隙(優選地， 在心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙)中存在B-淋巴細胞的情況下，可以使用如上定義的B-淋巴細胞靶向劑治療患者。在一個實施方式中，如上定義的B-淋巴細胞靶向劑具有優選地允許檢測樣品、組織、器官或生物體中所述B-淋巴細胞靶向劑的標記物。在一個實施方式中，通過體內成像使B-細胞顯像。在一個實施方式中，體內成像是選自磁共振成象、正電子發射層析成象、單光子發射計算機斷層照相和光學成象中的一種方法。
本發明潛在的問題還通過在如上定義的(體外)方法中使用的如上定義的B-淋巴細胞靶向劑解決。本發明潛在的問題還通過在如上定義的心功能不全的診斷方法中使用的如上定義的B-淋巴細胞靶向劑解決。本發明潛在的問題還通過使用用于生產診斷試劑(優選地，用于診斷心功能不全)的如上定義的B-淋巴細胞靶向劑解決。在一個實施方式中，所述心功能不全是適合于使用如上定義的B-淋巴細胞靶向劑治療的一種疾病。在另一個方面，本發明涉及如上定義的心功能不全的治療方法，該方法包括向有需要的患者施用如上定義的B-淋巴細胞靶向劑的步驟。本發明人驚喜地發現，在患有心功能不全的患者的心臟中存在B-淋巴細胞。更具體而言，本發明人發現B-淋巴細胞存在于細胞間隙中，優選地，存在于心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙中。通過使用一種或幾種B-淋巴細胞靶向劑，可以將這類B-淋巴細胞用于治療和診斷的目的。還可以從使用B-淋巴細胞靶向劑(如抗CD20抗體)成功治療腎病中獲得這種診斷方法、特別是治療方法的可行性的實驗證據。與心臟病的情況一樣，這種腎病的特點在于存在B-淋巴細胞。如本文中優選使用的那樣，B-淋巴細胞靶向劑靶向B-淋巴細胞的抗原。如本文所使用的那樣，靶向抗原優選表示在抗原和根據本發明的B-淋巴細胞靶向劑之間建立相互作用。優選地，這種相互作用在生理條件(例如出現這種相互作用的樣品、組織、器官或生物體中存在的條件)下是穩定的。相互作用的特別優選的實施方式是抗原與B-淋巴細胞靶向劑的結合。如本文優選地使用的那樣，B-淋巴細胞為任何B-淋巴細胞或任何前體細胞，如漿細胞。在優選的實施方案中，B-淋巴細胞表達抗原，或者可以被誘導以表達該抗原。B-淋巴細胞還被稱為B細胞。無論是否通過B-淋巴細胞表達該抗原或者是否可以誘導B-淋巴細胞表達該抗原，該抗原均優選地選自⑶19、⑶20和⑶21。更優選地，在本發明的任何方面中，該抗原為 CD20。CD20分子(也稱為人B-淋巴細胞限制分化抗原或Bp35)是疏水性跨膜蛋白，其分子量為約35kD，位于前B-淋巴細胞和成熟B-淋巴細胞上(Valentine，M.A.等人，J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287 ；和 Einfield，D. Α.，等人，EMBO J. 7 (3) (1988)711-717)。 ⑶20存在于來自周圍血液或淋巴器官的超過90%的B細胞的表面上，并且在早期前B細胞發育期間表達并保持到漿細胞分化為止。⑶20存在于正常B細胞和惡性B細胞上。具體地，在超過90%的B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表達⑶20 (Anderson，K. C.等人，Blood 63(6) (1984) 1424-1433)，但是在造血干細胞、原B細胞、正常漿細胞或其它正常組織中不存在(Tedder，Τ. F.等人，J, Immunol. 135 (2) (1985) 973-979)。CD20蛋白的85個氨基酸的羧基末端區域位于細胞質內。該區域的長度與其它B 細胞特異性表面結構形成對比，如IgM、IgD和IgG重鏈或II類組織相容性抗原α或β 鏈，它們分別具有3、3、28、15和16個氨基酸的相對較短的胞漿內區域(Komaromy，Μ.等人，NAR 11 (1983)6775-6785)。在最后61個羧基末端氨基酸中，有21個為酸性殘基，而僅有2個為堿性殘基，這表明該區域具有強的凈負電荷。人CD20的GenBank登錄號為 NP_690605。據認為⑶20可能參與調節B細胞激活和分化過程的早期步驟(Tedder等人， Eur. J. Immunol. 25Vol. 16(1986)881-887)并且可以用作鈣離子通道(Tedder, Τ. F.等人， J. Cell. Biochem. 14D(1990) 195)。⑶19是在小結樹突細胞和B細胞上表達的。事實上，它存在于B細胞上，從發育期間的最早可識別的B系細胞到B細胞胚細胞，但是在成熟為漿細胞的過程中消失。它主要與⑶21和⑶81 —起用作B細胞輔助受體。一旦激活，⑶19的胞質尾磷變得酸化，其導致與Src家族激酶的結合和PI-3激酶的募集。⑶19還被稱為B4。人⑶19的序列可以從 uniprot數據庫中以P15391獲得，或者對于其mRNA序列以NM_001770獲得，并且對于其氨基酸序列以NP_001761獲得。⑶21還被稱為CR2或C3DR，它是補體系統中的蛋白。它結合iC3b(C3b的失活衍生物)、C3dg或C3d。B細胞在其自身表面上具有CD21受體，從而使補體系統在B-細胞激活和成熟中起作用。成熟B細胞上的⑶21與兩種其它膜蛋白⑶19和⑶81 ( = TAPA-1)形成復合物。⑶21-⑶19-⑶81復合物通常被稱為B細胞輔助受體復合物，這是因為當膜IgM與抗原結合時，⑶21通過所連接的C3d(或iC3b或C3dg)與抗原結合。這導致B細胞對抗原的應答顯著提高。可以從uniprot數據庫中以P20023獲得人CD21的序列，或以NM_001006658 獲得其mRNA序列，或以ΝΡ_001006659獲得其氨基酸序列。本領域技術人員都會明白，任何形式的心功能不全在原則上都是可以治療的。然而，在優選的實施方式中，包含B-淋巴細胞的那些形式的心功能不全是可以治療的。如本文中優選地理解和使用的那樣，“包含”表示B-淋巴細胞與常見形式或不常見形式的心功能不全有關，但仍導致與心功能不全有關的癥狀的發生或加劇。還將理解，在原則上，不管疾病的病原學如何，優選地只要滿足存在B-淋巴細胞的必要條件，則可以根據本發明治療這種心功能不全。可以理解，能夠產生多種類型的B細胞靶向劑，其適合于關注B-淋巴細胞直接或經誘導后表達的抗原。這些種類的B-淋巴細胞靶向劑包括抗體、適體、鏡像適體、抗原結合多肽和抗促成素。用于生產對B-淋巴細胞的抗原(并且更具體而言為⑶20、⑶19和⑶21)特異的抗體的方法是本領域技術人員已知的。對于單克隆抗體的情況也是一樣。一般地，參見 Kohler 和 Milstein，Nature 256:495(1975) ；Coligan 等人編輯，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John ffiley&Sons 1991)。概括而言，通過用包含(例如)NCA-90的組合物注射小鼠，取出血清樣品驗證抗體產生的存在，取出脾以獲得B-淋巴細胞，將B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以產生雜交瘤，克隆這些雜交瘤，選擇產生所需抗體的陽性克隆，培養產生抗抗原的抗體的克隆并將雜交瘤培養基與抗體分離，從而可以獲得單克隆抗體。可以通過多種熟知的技術從雜交瘤培養基中分離和純化單克隆抗體。這些分離技術包括使用蛋白-A瓊脂糖的親和色譜法、排阻色譜法和離子交換色譜法。參見Coligan 等人編輯，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John ffiley&Sons 1991) ；Baines 等人，第 79-104 頁，METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (The Humana Press, Inc.1992)。在本領域中，產生非人靈長類抗體、嵌合抗體、人化抗體或人抗體的方法同樣是已知的。與之有關的，“嵌合抗體”優選地為包含來源于嚙齒動物抗體的可變域和互補決定區的重組蛋白質，而該抗體分子的其余部分來源于人抗體，而“人化抗體”優選為重組蛋白，其中將單克隆抗體的鼠互補決定區從鼠免疫球蛋白的可變重鏈和輕鏈轉移到人的可變域中。如本文中優選使用的那樣，“抗體片段”是抗體的一部分，如F(ab' )2、F(ab)2、 F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv和sFv等。如果不考慮其結構，抗體片段與由完整抗體所識別的相同抗原結合。例如，抗CD20單克隆抗體片段與CD20的表位結合。如本文中優選使用的那樣，術語“抗體片段”還包括像抗體一樣、通過與特異性抗原結合形成復合物而作用的任何合成或基因工程蛋白。例如，抗體片段包括由輕鏈可變區組成的分離片段、由重鏈和輕鏈的可變區組成的“Fv”片段、其中輕鏈和重鏈可變區通過肽接頭連接的重組單鏈多肽分子(“sFv蛋白”)、以及由類似高變區的氨基酸殘基組成的最小識別單元。“裸抗體”是不與治療劑或診斷劑結合的完整抗體或抗體片段。裸抗體包括多克隆和單克隆抗體，以及某些重組抗體，如嵌合和人化抗體。適體為單鏈或雙鏈的D-核酸，并且其特異地與靶標分子(如本發明所述的B-淋巴細胞的抗原)相互作用。在(例如)歐洲專利EP 0533838B1中說明了適體的生產或選擇。基本而言，采用了以下步驟。首先，提供核酸混合物(即，潛在的適體)，其中每個核酸通常包含幾個(優選為至少8個)連續隨機核苷酸的片段。隨后，將該混合物與靶標分子接觸，其中(例如)基于與候選混合物相比對靶標較高的親合力或對其較大的作用力，核酸與靶標分子結合。隨后，將結合的核酸與剩余的混合物分離。任選地，使用(例如)聚合酶鏈反應擴增如此獲得的核酸。這些步驟可以重復數次，從而獲得與靶標特異性結合的核酸比例增高的混合物，然后從中任選地選擇最終結合的核酸。這些特異性結合的核酸被稱為適體。顯然，在用于適體產生或鑒別的方法的任何階段，可以獲取各個核酸混合物的樣品以使用標準技術確定其序列。在本發明中，可以通過(例如)引入本領域技術人員已知的產生適體的所定義的化學基團來穩定適體。例如，這種改性可在于在核苷酸的糖部分的2'-位置引入氨基。目前，將適體用作治療劑。然而，另外，在本發明中，如此選擇或產生的適體可以用于診斷目的。使用如本發明所述的B淋巴細胞的抗原，根據本發明可使用或產生的鏡像適體的產生或生產是基于相似原理的。在國際專利申請WO 98/08856A2中說明了鏡像適體的生產。鏡像適體是L-核酸，這表示鏡像適體由L-核苷酸組成，而不是像適體一樣由D-核苷酸組成。鏡像適體的特點在于它們在生物系統中具有很高穩定性，并且與適體相比，它們對其所抗的靶標分子特異地相互作用。出于產生鏡像適體的目的，形成D-核酸的異型生殖群體，并且將該群體與靶標分子的旋光對映體接觸，在本發明的情況下，例如與如本發明所述的B-淋巴細胞的抗原的天然存在的L-對映異構體的D-對映異構體接觸。隨后，將不與靶標分子的旋光對映體相互作用的那些D-核酸分離。但是，與靶標分子的旋光對映體相互作用的D-核酸分離被分離、任選地進行測定和/或測序，并且隨后根據源自D-核酸的核酸序列信息合成相應的L-核酸。在序列上與與靶標分子的旋光對映體相互作用的上述D-核酸相同的這些L-核酸將與天然存在的靶標分子而不是與其旋光對映體特異地相互作用。與產生適體的方法類似，還可以將各個步驟重復數次，并因此富集與靶標分子的旋光對映體特異地相互作用的那些核酸。還將明白，適體和鏡像適體優選地通過它們所采用的立體結構與它們的靶標分子結合，而不是通過適體和鏡像適體分別與靶標分子之間的沃森-克里克堿基配對來與它們的靶標分子結合。使用如本發明所述的B-淋巴細胞的抗原可以產生的其它種類的藥劑和診斷試劑是與其結合的肽。通過使用根據現有技術的方法(如噬菌體展示)，可以產生這樣的肽。 基本而言，例如以噬菌體的形式產生肽庫，并且將這類庫與靶標分子接觸，在本發明的情況下，例如與如本發明所述的B-淋巴細胞的抗原接觸。隨后，從相應反應中除去與靶標分子結合的那些肽，優選地，作為與靶標分子結合的復合物除去。本領域技術人員已知的是，結合特征至少在某種程度上取決于具體實施的實驗計劃，如鹽濃度等。在將與靶標分子以更高親和力或更大作用力結合的那些肽與庫中的非結合成員分離后，并且任選地還在從靶標分子和肽的復合物中除去靶標分子后，可以隨后對各個肽進行鑒定。任選地，在鑒定前，通過(例如)增殖肽編碼噬菌體來實施擴增步驟。優選地，鑒定包括靶標結合肽的測序。基本而言，這些肽在長度上不受限制，然而，優選地，在各種方法中優選地獲得長度約8至20 個氨基酸的肽。庫的大小可以為約IO2至1018，優選為IO8至IO15個不同的肽，然而，也不限于此。靶標結合多肽的特定形式是所謂的“抗促成素”，其尤其在德國專利申請DE 197 42 706 Al中有所說明。本領域技術人員應當理解，如果用作治療劑，則根據本發明的B-淋巴細胞靶向劑是治療有效的，或以能夠實現藥物相關效果的量施用。本領域技術人員還將理解，B-淋巴細胞靶向劑旨在殺死靶向的B-淋巴細胞，優選地，殺死如本文中更詳細說明的心臟組織中存在的那些B-淋巴細胞。如本文中優選使用的那樣，術語“殺死B-淋巴細胞”在本發明的多個實施方式中可以具有下列一種或幾種含義阻礙B-淋巴細胞的生長、通過如細胞凋亡或其它的生物過程誘導B-淋巴細胞自毀，或者直接或間接介導B-淋巴細胞的溶胞作用。應當理解，通過使用如本發明所述的任何B-淋巴細胞靶向劑，可以應對B-淋巴細胞并且B-淋巴細胞靶向劑可以用于將任何有效負荷輸送給所述B-淋巴細胞，其中這種有效負荷導致或介導了這種B-淋巴細胞的死亡。如本領域技術人員已知的那樣，這種有效負荷可以是放射性標記、細胞毒性劑或任何適合的免疫調節劑。將這種有效負荷直接或間接地連接到B-淋巴細胞靶向劑上的方法是本領域技術人員已知的。在B-淋巴細胞靶向劑是抗體并且更具體而言是單克隆抗體的情況下，可以通過補體介導的細胞毒性和/或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性可介導細胞殺死。對與本文所述的任何B-淋巴細胞抗原特異性結合的這類抗體的篩選是在本領域技術人員的技術之內的。優選的B-淋巴細胞靶向劑是抗CD20抗體，該抗體顯示出補體介導的細胞毒性和 /或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。在現有技術中，說明了這類B-淋巴細胞靶向劑的各個種類，其中特別優選的一種是商標名為Rituxan或MabThera的可商購的利妥昔單抗。“利妥昔單抗”抗體是抗人CD20抗原的含有基因工程嵌合人Yl鼠恒定域的單克隆抗體。這種嵌合抗體含有人Yl恒定域并且在1998年4月17日轉讓給IDEC Pharmaceuticals Corporation 的 US 5，736，137 (Andersen 等人)中被起名為"C2B8”。利妥昔單抗被批準用于治療患有復發或難治性、低度或濾泡、CD20-陽性的B細胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。體外作用機理研究表明利妥昔單抗表現出人補體依賴性細胞毒性(CDC) (Reiff, Μ. E.等人，Blood 83(2)435-445(1994))。另外，它在測量抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)的測定中表現出顯著的活力。至于根據本發明的B-淋巴細胞靶向劑的施用方案，本領域技術人員應當明白，這些試劑將在本領域中施用這類試劑常用的范圍內，并且可以通過常規實驗確定最佳劑量。應當明白，如本發明所述的B-淋巴細胞靶向劑還適合于各種形式的心功能不全的診斷，更具體而言，適合于如本發明所提到的包含B-淋巴細胞的那些形式。與它們的治療性應用類似，必須直接或間接標記B-淋巴細胞靶向劑，從而允許檢測B-淋巴細胞靶向劑所靶向的B-淋巴細胞。如本文中另外所公開的那樣，本發明所述的B-淋巴細胞靶向劑適合于對患有心力衰竭或具有患心力衰竭風險的一組患者進行分類，并且適合于確定是否可以根據本發明通過施用B淋巴細胞靶向劑治療該組患者成員，并且如果可以，則哪位成員可以。體內成像方法是本領域技術人員已知的，并且在(例如)歐洲專利申請EP 01114110. 8中有所說明。如本文中所使用的，術語“射血分數(EF) ”是每次心搏時從心室泵出的血液分數。 健康個體的射血分數通常在50%至65%之間，其中正常值還取決于用于計算射血分數的形式。心肌損傷，例如在心肌梗塞期間或在心肌病中所經受的損害了心臟的射血能力，因而降低了射血分數。術語“左室舒張末徑(LVEDD) ”是指左心室的橫截面直徑，其包括心臟舒張時的隔
膜和后壁厚度。紐約心臟學會(NYHA)心功能分級提供了對心力衰竭程度進行分類的簡單方法。 其根據患者身體活動的限制程度將患者分為四類(I-IV類)；限制/癥狀與正常呼吸和不同程度的氣促和/或絞痛有關(I類無癥狀并且對一般身體活動無限制，例如，行走、爬樓梯等時氣促/IV類嚴重限制；甚至在休息時出現癥狀；主要為臥床患者)。腦促尿鈉排泄肽(BNP)是對心肌細胞過度拉伸產生響應時由心室分泌的32個氨基酸的多肽。BNP與生物學上無活性的76個氨基酸的N-末端片段(NTproBNP) —起共分泌。BNP和NT proBNP均用于心力衰竭的診斷。它們的血漿濃度通常在左心室功能障礙患者中較高。


下面參考附圖，附圖中圖1顯示了 DCMi患者的心內膜心肌活檢樣本，其已經用⑶20抗體染色(放大 200x)；圖2顯示了與非DCMi患者(對照)相比，射血分數(EF) > 50%或< 50%的DCMi 患者的心內膜心肌活檢中每mm2的⑶20陽性細胞數。圖3顯示了由超聲波心動描記法所測量的、在73歲女性DCMi患者對兩劑量 Rituxan(利妥昔單抗)治療響應后左心室射血分數(LVEF，部分A)和左室舒張末徑 (LVEDD，部分B)的變化。圖4顯示了在73歲女性DCMi患者對兩劑量Rituxan (利妥昔單抗)治療響應后NT proBNP水平(部分A)和6分鐘行走測試中的表現(部分B)的變化；和圖5顯示了基線和用RituXan( “隨訪”)治療后心內膜心肌活檢中細胞因子 TNF-α、IL-4、IL-10和干擾素-β的mRNA表達譜，根據使用轉磷酸核糖基酶(HPRT)作為標準品/對照以定量RT-PCR所示。
具體實施例方式現在，將通過下列三個實施例對本發明進行進一步說明，從這三個實施例中，可以理解本發明的其它特征、實施方式和優勢。實施例1 心功能不全患者中B-淋巴細胞的檢測從RV隔膜取得心內膜心肌活檢，將其在液氮中冷凍并保存在-80°C下。將樣本包埋在Tissue Tec (SLEE，德國美因茲)中，并立即在液氮冷卻的甲基丁烷中快速冷凍。將包埋樣本連續切割成5 μ m厚的低溫切片并放置在10%聚L-賴氨酸預涂的載物片上。在冷丙酮中固定10分鐘并接著風干后，通過將低溫切片與0. 3%的H2A在磷酸鹽緩沖鹽水中的溶液一起培育20分鐘來抑制內源過氧化物酶活力。為了免疫組織染色，在加濕室中使用⑶20單克隆小鼠抗體克隆8J662 (Fa. Biomol，德國漢堡)45分鐘。在加濕室中，將EnVision 過氧化物酶結合的兔抗小鼠抗體 (DakoCytomation，德國漢堡)作為二抗使用30分鐘。使用3_氨基-9-乙基咔唑(Merck， 德國達姆施塔特)使免疫組織染色顯像。用Kaiser' s gelatin (Merck，德國達姆施塔特)固定載物片。通過對處理后切片進行目視分析，可以觀察到⑶20陽性細胞浸潤(參見圖1，用黑箭頭表示CD20陽性細胞)。這種細胞浸潤正在形成細胞巢，其位于心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙中。如圖2中所示，與對照樣本相比，射血分數高于或低于50%的炎性擴張性心肌病 (DCMi)患者中⑶20陽性細胞的數目顯著提高。實施例2 男性炎性擴張性心肌病(DCMi)患者的治療使用生產商推薦的給藥方案，用Rituxan治療有3年心功能不全(由DCMi所造成的)病史的76歲男性患者(末期DCM，嚴重DCMi ；輕微心臟炎癥、無心臟病毒出現、心臟活檢樣本中為CD20陽性、NYHA III,EF 20% ;LVEDD71mm)。在第一次施用單劑量Rituxan后， 24小時后，癥狀和LV功能(EF 29% )已得到改善并且按照規程第二次施用Rituxan后保持穩定。與應用Rituxan之前進行的檢查相比，壓力超聲波心動描記檢查顯示LV功能儲備也得到提高。實施例3 女性炎性擴張性心肌病(DCMi)患者的治療患者為有5年心力衰竭癥狀(由嚴重擴張性心肌病(EF 24% )所造成)病史的 73歲女性，盡管使用了心力衰竭藥物和雙心室ICD刺激(NYHAIII級)，但是心力衰竭癥狀仍然繼續出現。用心力衰竭藥物和375mg/m2體表面積的Rituxan (利妥昔單抗)以兩個階段治療這位女患者。超聲波心動描記法顯示左心室射血分數(LVEF)在施用第一劑量Rituxan后顯著提高，并且在施用第二劑量Rituxan后進一步提高(圖3A)。同時，左室舒張末徑(LVEDD)減小(圖3B)。在表1中列出了各個測量值。用Rituxan治療后，BNP水平顯著降低(圖4A)。Rituxan治療還改善了患者在6分鐘行走測試(其評價6分鐘內行走的距離)中的表現(圖4B)。隨后的心內膜心肌活檢顯示了由于Rituxan治療所造成的B-淋巴細胞部分缺失 (數據未顯示)，以及促炎細胞因子(如TNF-α、IL-4和IL-10)的mRNA表達的減少，這與具有抗病毒效力的細胞因子(如，干擾素的mRNA表達的提高有關(參見圖5)。
權利要求
1.一種在心功能不全的治療方法中使用的B-淋巴細胞靶向劑。
2.根據權利要求1所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑靶向由 B-淋巴細胞表達的抗原或B-淋巴細胞可誘導表達的抗原。
3.根據權利要求1至2中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑與由B-淋巴細胞表達的抗原或與B-淋巴細胞可誘導表達的抗原結合。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗原選自CD19、 CD20 和 CD21。
5.根據權利要求4所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗原為CD20。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述方法包括向有需要的患者施用所述B-淋巴細胞靶向劑的步驟。
7.根據權利要求6所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述患者為心臟組織含有B-淋巴細胞的患者。
8.根據權利要求7所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞存在于細胞間隙中，優選地存在于心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙中。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，心功能不全是選自由心肌或心內膜炎所引起的心功能不全、由心肌或心內膜變性所引起的心功能不全、由冠狀動脈功能不全所引起的心功能不全、由心肌梗塞所引起的心功能不全和由創傷所引起的心功能不全中的一種。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述心功能不全不同于由心肌梗塞所引起的心功能不全。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑能夠或可用于殺死B-淋巴細胞。
12.根據權利要求11所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞具有至少一種抗原，該抗原選自⑶19、⑶20和⑶21，優選地，所述抗原為⑶20。
13.根據權利要求11至12中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑為裸B-淋巴細胞靶向劑。
14.根據權利要求11至12中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑包含用于殺死所述B-淋巴細胞的其它部分。
15.根據權利要求14所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述其它部分選自放射性同位素、細胞毒性劑和免疫調節劑。
16.根據權利要求1至15中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑是治療有效的或者以能夠提供治療效果的量施用。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑選自抗體、適體、鏡像適體、抗原結合多肽和抗促成素。
18.根據權利要求1至17中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑為抗體。
19.根據權利要求18所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體為多克隆抗體。
20.根據權利要求18所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體為單克隆抗體。
21.根據權利要求18至20中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體為抗體片段，優選地為與各自抗體所結合的相同的抗原和/或表位結合的抗體片段。
22.根據權利要求21所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體片段是選自 F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv 和 sFv 中的一個。
23.根據權利要求18至22中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體為非人靈長類抗體、鼠單克隆抗體、嵌合抗體、人化抗體或人抗體。
24.根據權利要求18至23中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體介導補體介導的細胞毒性和/或抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。
25.根據權利要求18至24中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體為抗 ⑶20抗體。
26.根據權利要求25所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述抗體為利妥昔單抗。
27.根據權利要求1至17中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑選自適體、鏡像適體、抗原結合多肽和抗促成素。
28.根據權利要求27所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述B-淋巴細胞靶向劑包含用于殺死所述B-淋巴細胞的其它部分。
29.根據權利要求28所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述其它部分選自放射性同位素、細胞毒性劑和免疫調節劑。
30.根據權利要求29所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述其它部分為放射性同位素。
31.根據權利要求30所述的B-淋巴細胞靶向劑，其中，所述放射性同位素選自198Aiu 32P、125I、131I、9°Y、186Re、188Re、67CU、211At、213Bi 或 225Ac0
32.—種藥物組合物，包含根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑和可藥用載體。
33.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物用于心功能不全的治療方法中，該心功能不全優選是在以上任一權利要求中所定義的心功能不全。
34.一種用于確定心功能不全患者對使用根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑的心功能不全治療是否敏感的體外方法，該方法包括步驟a)提供所述患者的心臟組織樣品；b)將所述樣品與根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑接觸；和c)確定所述樣品中是否包含B-淋巴細胞。
35.根據權利要求34所述的方法，其中，如果所述樣品中包含B-淋巴細胞，則可以使用根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑治療所述患者。
36.一種用于確定心功能不全患者對使用根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑的心功能不全治療是否敏感的方法，包括步驟a)向所述患者施用根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑；和b)使根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑所靶向的B-淋巴細胞顯像。
37.根據權利要求36所述的方法，其中，確定心臟中是否存在B-淋巴細胞，更優選地， 確定細胞間隙中是否存在B-淋巴細胞，該細胞間隙優選為心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙。
38.根據權利要求37所述的方法，其中，在心臟中存在B-淋巴細胞的情況下，更優選地，在細胞間隙中存在B-淋巴細胞的情況下，使用根據權利要求1至31中任一項所述的 B-淋巴細胞靶向劑治療所述患者，其中細胞間隙優選為心肌細胞和心臟脈管系統細胞之間的細胞間隙。
39.根據權利要求34至38中任一項所述的方法，其中，根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑具有標記物，該標記物優選地允許檢測在樣品、組織、器官或生物體中的所述B-淋巴細胞靶向劑。
40.根據權利要求36至38中任一項所述的方法，其中，通過體內成像使所述B-細胞顯像。
41.根據權利要求40所述的方法，其中，所述體內成像是選自磁共振成象、正電子發射層析成象、單光子發射計算機斷層照相和光學成象的方法。
42.根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑在根據權利要求34至 41中任一項所述的方法中的用途。
43.根據權利要求1至31中任一項所述的B-淋巴細胞靶向劑在心功能不全的診斷方法中的用途。
全文摘要
本發明涉及在心功能不全的治療或診斷方法中使用的B-淋巴細胞靶向劑。此外，它涉及包含該B-淋巴細胞靶向劑的組合物和確定心功能不全患者是否適合于使用B-淋巴細胞靶向劑對其進行治療的方法。
文檔編號A61K39/395GK102395602SQ201080017150
公開日2012年3月28日 申請日期2010年4月16日 優先權日2009年4月16日
發明者H-P·舒爾特海斯, 佩特拉·賴因克, 卡斯滕·喬普, 漢斯-迪特爾·沃爾克, 菲利斯塔斯·艾雪 申請人:夏里特柏林大學醫學院