調節脂肪生成的Vgll3活性調節劑的用途的制作方法

專利名稱：調節脂肪生成的Vgll3活性調節劑的用途的制作方法
調節脂肪生成的Vgl 13活性調節劑的用途本發明涉及參與脂肪生成調節的新靶標Vgll3。此外，本發明還涉及提高脂肪細胞和前脂肪細胞的Vgll3活性的方法。另外，還提供包含提高靶組織的Vgll3活性的分子的藥物組合物。這些方法、組合物和分子可用于調節脂肪生成，從而治療肥胖癥和相關病癥。肥胖癥是包括高血壓、冠狀動脈疾病、血脂異常(dyslipidemia)、胰島素抵抗和 2型糖尿病在內的多種病癥的主要風險因子。由于肥胖流行病的重要性，因此大量研究集中在脂肪細胞的生物學方面，包括產生新的脂肪細胞的發育途徑。脂肪生成是未分化的間充質前體細胞成為成熟脂肪細胞的過程。在整個過去十年間，在闡述脂肪細胞分化的分子機制方面取得了相當大的進展，所述分子機制涉及來自若干家族的轉錄因子(例如 CCAAT/增強子結合蛋白(C/ΕΒΡα、α和γ)以及核激素受體過氧化物酶體增殖物激活受體 Y (PPARy))的序貫活化(R0sen，E.D.等，2002)。PPAR γ被稱為脂肪生成的“主要調節劑”， 因為已知證實，PPARy在體外和體內二者都對脂肪生成既是充分的也是必需的。最近，描述了參與脂肪生成的新的轉錄因子，例如KLF家族(KLF2、5和KLF15) (Banerjee, S. S.等， 2003 ；Gray, S. Μ.等，2002)、Ebf 家族(Jimenez, Μ. Α.等，2007)和 Krox 20 (Chen, Ζ.等， 2005)，這就表明了發生在脂肪生成期間的轉錄級聯比之前設想復雜得多。此外，還描述了信號轉導分子和/或受體例如分泌蛋白的Wnt家族(Kang S.等，2007)、Shh蛋白、Notch受體參與導致脂肪細胞形成的分子事件。引人關注的是注意到，胞外和胞內事件以某種方式與調節脂肪生成相關聯。所有的這些信號轉導途徑會聚在受嚴格調節的轉錄級聯上，這就需要更全面地理解以潛在地控制脂肪細胞發育，并預防肥胖癥。脂肪組織中脂肪的貯存是有限的，超過這種容量將導致脂質在其它組織(特別是肌肉、肝和內分泌胰腺)中蓄積，并導致脂肪細胞分泌各種脂肪因子。脂肪組織由位于不同解剖部位的若干沉積物組成，所述解剖部位可起源于截然不同的前體，并且可具有不同的生理功能和病理生理作用。與皮下脂肪庫不同，內臟脂肪庫更可能引起與代謝綜合征相關的缺陷。已鑒定出大麻素1受體在所有器官(即脂肪組織、胃腸道、肝、骨骼肌和胰腺)中對葡萄糖代謝和2型糖尿病起關鍵作用。利莫納班，臨床使用的第一個選擇性大麻素受體 I(CBlR)拮抗劑，已被證實可減少食物攝取和體重，從而改進葡萄糖代謝調節。然而，仍需要用于治療肥胖癥的新的治療靶標。Vestigial樣3因子(Vgll3)屬于vestigial家族，該家族包括3個成員。首次在黃猩猩果蠅(Drosophila melanogaster)中將Vgll3描述為可能參與翅發育的轉錄輔因子 (Paumard-Rigal,S.等，1998)。Vgll3位于核內，可能與脂肪形成轉錄級聯相互作用。最近有研究將第二個成員Vgll2與哺乳動物的肌肉發育相聯系(Chen，H.H.，T.等，2004)。這個蛋白質家族在據推測將發育成脂肪細胞或肌肉細胞的前體細胞中表達。本發明人現已發現，Vgll3在脂肪細胞分化中起決定性作用。因此將Vgll3視為調節脂肪生成的新的相關靶標，從而用于治療肥胖癥和相關病癥。Vgll3的過量表達也可用于減少脂肪生成以降低內臟和/或皮下脂肪蓄積。
發明詳述本發明涉及用于調節脂肪細胞和前脂肪細胞的脂肪生成和代謝功能的方法。本發明在于提高Vgll3活性的分子，所述分子能夠提高前脂肪細胞或脂肪細胞的 Vgll3活性。這類分子可用來降低內臟和/或皮下脂肪。因此，它們可用于制備降低脂肪生成、特別是用于治療肥胖癥和相關病癥的藥物。本文使用的術語“提高Vgll3活性的分子”包括能夠提高Vgll3活性的化合物和表達Vgll3重組蛋白的載體。下面詳細描述了這兩種分子。本文使用的術語“肥胖癥和相關病癥”中的“相關病癥”包括高血壓、冠狀動脈疾病、血脂異常、胰島素抵抗和2型糖尿病。通過轉錄組學方法，本發明人鑒定出在喂食高脂肪飲食的C57B1/6小鼠同齡組中其表達與體重增加有關的基因。因此，他們進行了第二項分析，以評價用利莫納班治療高脂肪飲食飼喂的小鼠誘導的基因表達的改變。保留了這樣的基因，其以前在脂肪細胞生物學中從未描述過，但卻可能參與諸如信號轉導、胞外基質蛋白修飾和基因轉錄等重要的生物學過程。這些基因對于脂肪生成可為重要的，尤其因為它們可能參與利莫納班降低小鼠脂肪量的機制。出于這個原因，Vgll3被鑒定為參與脂肪細胞代謝、尤其是新的信號轉導途徑。 更概括地講，該基因似乎在脂肪生成和肥胖癥脂肪組織發育的控制中發揮作用。提高脂肪細胞和前脂肪細胞的Vgll3活性可在治療學方面用于調節脂肪生成，尤其是降低脂肪生成，特別是治療和預防肥胖癥相關病癥，其為2型糖尿病、血脂異常、高血壓、胰島素抵抗、心血管疾病，更概括地講是代謝綜合征。提高脂肪細胞和前脂肪細胞的Vgll3活性還可用于美容應用以便減少不雅的脂肪蓄積。在一個實施方案中，可利用增加Vgll3轉錄的小分子提高脂肪細胞和前脂肪細胞的Vgll3活性。可采用本領域技術人員熟知的方法鑒定能夠提高Vgll3活性的這類化合物。一種方法可為報道系統，其在于與報道基因符合讀框地連接、并且在合適的細胞系中表達的Vgll3的啟動子；可以定量測定報道基因產物的活性。因此，提高報道基因表達的化合物可視為潛在的候選化合物。有許多可用于這類報道系統中的報道基因，并且是本領域眾所周知的。例如，這類報道基因可以是允許表達綠色熒光蛋白(GFP)、螢光素酶、β-半乳糖苷酶等的基因。因此，本發明的一個方面提供篩選Vgll3活性增強劑的方法，所述方法包括以下步驟a)將細胞系用包含與報道基因連接的Vgll3啟動子的報道構建體(importer construction)轉染b)將所述細胞系在允許報道基因表達的條件下培養c)將候選化合物加入細胞培養物中d)將增強劑化合物鑒定為具有提高報道基因表達的能力的化合物。可用于上述PlacS轉錄調節劑的篩選試驗的預測的人Vgll3啟動子相當于SEQ ID NO. 17。在另一個實施方案中，可通過給予具有用于Vgll3表達的序列的重組載體，來提高有需要的患者中的Vgll3活性。
出于此目的，本發明提供包含用于表達Vgll3重組蛋白的多核苷酸的載體。這些載體可以是裸DNA或病毒載體，例如腺病毒載體、AAV載體或反轉錄病毒載體(如慢病毒載體)。這些載體可通過不同的合適途徑給予，包括靜脈內途徑或局部注射，包括肌內途徑、直接注射到皮下組織或按慣例選擇的其它靶定組織。在一個實施方案中，表達載體為質粒。這類質粒可以是為安全起見而無法在患者中復制的條件性復制質粒。這些質粒可以專利公開文本WO 97/10343中描述的質粒pCOR 為基礎。所述載體可包含能夠在其所給予的組織中指導Vgll3多肽表達的啟動子，例如巨細胞病毒即時早期啟動子。所述載體還可包含SV40的多腺苷酸化信號。可通過各種方式給予載體，包括通過肌內注射。可通過多次直接注射到待治療的缺血肌肉中來給予載體。因此，可通過體內、體外或離體將這類質粒載體遞送給細胞，并且允許從載體中進行轉錄，來提供Vgll3重組蛋白。優選本發明的多核苷酸與調控序列有效連接，所述調控系列能夠使宿主細胞表達編碼序列，即載體是表達載體。“有效連接”是指元件的排列，其中如此描述組分經配置以便進行其常規功能。因此，與核酸序列有效連接的既定調節序列(例如啟動子)，在合適的酶存在時能夠實現該序列的表達。啟動子不必與所述序列鄰接，只要其起指導該序列表達的作用即可。因此，例如在啟動子序列與核酸序列之間可存在間插的不翻譯但轉錄的序列，而該啟動子序列仍可視為與編碼序列“有效連接”。“啟動子”是啟動和調節編碼多肽的多核苷酸轉錄的核苷酸序列。啟動子可包括誘導型啟動子(其中與啟動子有效連接的多核苷酸序列的表達受分析物、輔因子、調節蛋白等誘導)、阻抑型啟動子(其中與啟動子有效連接的多核苷酸序列的表達受分析物、輔因子、調節蛋白等阻抑)和組成型啟動子。術語“啟動子”或“調控元件”欲包括全長啟動子區和這些區的功能性(例如控制轉錄或翻譯)區段。可選擇與設計用于表達的宿主細胞相容的啟動子和其它表達調節信號。具體地講，如果本發明的方法需要直接遞送到肌肉中，則啟動子和其它表達調節系統應能夠在肌肉組織起作用。例如，可使用哺乳動物啟動子，例如β-肌動蛋白啟動子。可用于實施本發明的啟動子的實例包括但不限于病毒啟動子，例如猿猴病毒 40 (SV40)的啟動子(例如SV40大T抗原啟動子或SV40早期啟動子)、小鼠乳腺腫瘤病毒 (MMTV)啟動子(例如MMTV LTR啟動子)、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動子(例如HIV長末端重復序列(LTR)啟動子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)啟動子(例如莫洛尼鼠白血病病毒LTR啟動子)、ALV啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子(例如CMV即時早期啟動子)、EB病毒(Epstein Barr Virus，EBV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus, RSV)啟動子 (例如RSV LTR啟動子)、腺病毒啟動子(例如腺病毒主要晚期啟動子Ad MLP)、HSV啟動子 (例如HSV IE啟動子)或HPV啟動子(例如HPV上游調節區URR)。合適的啟動子還可來源于人基因，例如人α肌動蛋白或β肌動蛋白啟動子、人肌球蛋白啟動子、人血紅蛋白啟動子、人肌肉肌酸啟動子和人金屬硫蛋白啟動子或任何合適的組織特異性啟動子。本領域容易獲得所有這些啟動子。可用于實施本發明的多腺苷酸化信號的實例包括但不限于SV40多腺苷酸化信號、牛或人生長激素多腺苷酸化信號和LTR多腺苷酸化信號。特別是可使用PCEP4質粒 (Invitrogen,San Diego Calif.)中的SV40多腺苷酸化信號，稱為SV40多腺苷酸化信號。
載體可含有一種或多種選擇標記基因，例如在細菌質粒情況下為氨芐西林抗性基因，或者用于真菌載體的抗性基因。載體可體外使用，例如用來產生DNA或RNA，或者用于轉染或轉化宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞。載體還可適于體內使用，例如以使多肽在體內表達。在一個實施方案中，Vgll3編碼質粒含有細菌中的條件性復制起點，例如國際申 it WO 97/10343 和 Soubrier 等(Gene Ther. 1999 ；6 :1482-1488)中描述的質粒 pCOR。WO 2004/033664中亦描述了基于pCOR骨架的質粒。與常用的骨架5Kbp)相比，pCOR骨架較小(IKbp)，因此注射入患者中的不需要的細菌DNA的量減少一半。因此，在一個實施方案中，pCOR質粒可包括編碼上述Vgll3重組蛋白的表達盒。載體可以是重組病毒載體。合適的重組病毒載體包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒(AAV)載體、皰疹病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、痘病毒載體或細小病毒載體。載體可以是靶定載體，即其感染或轉染或轉導細胞的能力或者在宿主和/或靶細胞中表達的能力限于宿主受試者內的某些細胞類型(通常為共同或相似表型的細胞)的載體。可直接作為“裸核酸構建體”給予本發明的載體和表達盒。本文使用的術語“裸 DNA”是指載體，例如包含本發明的多核苷酸連同控制其產生的短啟動子區的質粒。之所以稱為“裸” DNA,是因為載體不用任何運載工具運載，例如它們不含病毒組分，特別是可攜帶遺傳信息的任何病毒顆粒。它們同樣不含促進轉染的任何物質，或者相對于促進轉染的任何物質是裸的，這類物質為例如脂質體制劑、帶電荷的脂質(例如Lipofectin )或沉淀劑 (例如CaPO4)。當這類載體進入宿主細胞(例如真核細胞)時，便在細胞內轉錄或翻譯其編碼的蛋白質。可將載體(例如質粒)與藥學上可接受的液體載體一起遞送給動物。在優選的應用中，液體載體是水性的或部分水性的，包括無菌無熱原水。適當調節并緩沖制劑的PH。下面進一步描述了用于給藥的合適組合物。或者，可使用脂質體制劑遞送本發明的載體。有用的脂質體制劑包括陽離子(帶正電荷的)、陰離子(帶負電荷的)和中性制劑，其中特別優選陽離子脂質體。陽離子脂質體可介導胞內遞送質粒DNA和mRNA。在病毒載體的情況下，通過病毒感染靶細胞而介導多核苷酸的給予。表達Vgll3的載體的全身給予可供轉導從外部不易進入的組織。對于全身遞送， Vgll3蛋白可與膽固醇綴合物、脂質體或聚合物型納米粒一起配制。按傳統使用脂質體，從而提供提高的藥代動力學性質和/或降低的毒性特征。它們在體內遞送中可取得重大且重復的成功。基因遞送的方法是本領域已知的。參見例如美國專利號5，399，346,5, 580，859和 5，589，466。例如，可通過標準肌內或真皮內注射；經皮顆粒遞送；靜脈內遞送；吸入；局部或通過口服、鼻內或粘膜給藥方式，將載體直接弓I入受體受試者中。還可在體外或離體將載體導入從受試者中收獲的細胞中。按照本發明，表達Vgll3重組蛋白的載體可具有序列SEQ ID N0. 15或其因遺傳密碼簡并性產生的衍生物或者其與該序列有至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%
6序列同一性的任何衍生物。在一個優選的實施方案中，載體表達Vgll3重組蛋白，所述Vgll3重組蛋白具有相當于SEQ ID NO. 2或SEQ IN NO. 4的序列或者與這些序列存在至少60%、70%、80%、90%、 95%、98%或99%序列同一性的這些序列的衍生物或片段或同源物。在另一個實施方案中，這些同源物、衍生物和片段保持與Vgll3相同的活性，或者這種活性的至少50%、80%或90%。本發明還在于用于調節脂肪生成的方法，所述方法包括將提高Vgll3活性的分子給予有需要的患者以調節脂肪生成。可采用這類方法治療肥胖癥或相關疾病。還可采用這類方法，以便在美容目的中降低脂肪蓄積。本發明的另一個目的是包含本發明的提高Vgll3活性的分子的組合物。這些組合物包含有效劑量的至少一種本發明的這類分子和至少一種藥學上可接受的賦形劑。這種組合物可用于制備抑制脂肪生成的藥物。在一個優選的實施方案中，它可用來治療肥胖癥和相關疾病。所述組合物還可用于減少內臟和/或皮下脂肪蓄積。任何合適的藥學上可接受的載體均可用于本發明的范圍內，而且這類載體是本領域眾所周知的。載體的選擇部分取決于待給予組合物的特定部位和用于給予組合物的具體方法。適于注射的劑型包括水性溶液劑和非水性溶液劑、等滲無菌注射溶液劑，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和賦予該劑型與預定接受者血液等滲的溶質；以及水性無菌混懸劑和非水性無菌混懸劑，其可包括助懸劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑和防腐劑。劑型可以單位劑量或多劑量密封容器(例如安瓿和小瓶)提供，并且可在冷凍干燥(凍干)條件下保存，臨用前只需要加入無菌液體載體(例如水)。臨用時配制的注射溶液劑和混懸劑可由上述各種無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備。優選藥學上可接受的載體是緩沖鹽溶液。最優選藥物組合物是等滲的，例如包含氯化鈉溶液(0. 9% )。本領域技術人員可調節劑量和濃度以適于特定的遞送途徑。在一個實施方案中， 單次給予單劑量。在一個備選實施方案中，同時給予受試者多劑量，但卻在例如不同的部位。在又一個實施方案中，多次給予多劑量。這類多劑量可分批給予，即同時在不同的部位多次給予，或者可以各別給予，其中多次給予(任選在多個部位)情況下每次給予一劑。可采用這類給藥方案的任何組合。現參照以下實施例對本發明進行描述，這些實施例只是說明性的，并不意在限制本發明。
實施例附圖簡述fil:關鍵性脂肪組織調節基因的選擇。文氏圖(Venn diagram)表示根據下列標準選擇基因。1)通過高脂飼喂在皮下(SCAT或Sq)和內臟(VAT)中有類似的調節。選出 151種基因(SCAT為48種，VAT為88種)。2)在這151種基因中，選出受利莫納班治療調節的基因(SCAT為14種，VAT為M種)。這導致在兩種組織中選出受高脂飼喂和利莫納班調節的34種基因。在這些基因中，16種具有與L、M和H組的體重相關的表達水平(肥胖癥相關的)，在各分組中，18種被HFD調節至相同水平(非肥胖癥相關的)。
不同組織和細胞類型中的Vgll3表達。通過RT-PCR測定了在以下組織中 Vgll3的mRNA水平A)脾、肌肉(腓腸肌)、心臟、肺、腎、肝、褐色脂肪組織(BAT)、皮下 (SCAT)和內臟(VAT)脂肪組織。結果表示為相對于設為1的肝表達的相對水平。B)在野生型(白色條形柱)和0b/0b小鼠(黑色條形柱)的SCAT和VAT中(n = 5)，ρ < 0. 05， 數據表示為平均值士sd，并表示為相對于設為1的對照SCAT的倍數增加。C)在小鼠(n = 5)的SVF(黑色條形柱)和分離的脂肪細胞(白色條形柱)中。數據表示為與SCAT SVF 表達相比的倍數增加。D)在得自人完整組織、分離的脂肪細胞、分離的前脂肪細胞和體外分化的脂肪細胞的SCAT(黑色條形柱)和VAT(白色條形柱)中。數據表示為與任意設為 1的完整組織SCAT表達相比的水平。E)在DMI治療前第-2天和DMI治療后直到第7天的 3T3-L1細胞中。N = 2-3組的細胞。數據表示為與第0天的表達相比的水平。圖3 :3T3-L1細胞系中Vgll3 cDNA的過量表達。A) 3T3-L1細胞用表達人Vgll3 cDNA的反轉錄病毒轉導。第10天分化的3T3-L1的油紅0照片。B)第10天，在與A)相同的細胞中通過RT-PCR測定aP2(分化的標志)mRNA表達。結果表示為平均值士 sd P < 0. 005 η = 3。材料與方法動物治療易得肥胖癥的C57BL/6J小鼠(Collins等2004)用高脂肪飲食(HFD)飼喂6個月。 HFD 6個月后，小鼠的體重參差不齊，有不同程度的葡萄糖不耐受性(通過葡萄糖耐量試驗測定)。把HFD小鼠分成具有相同的葡萄糖不耐受水平但卻有低(L)、中(M)或高(H)體重的3個組，將這些小鼠以及正常食物(NC)飼喂的小鼠用溶媒或利莫納班(lOmg.kg—1.天-1) 治療1個月，使其體重恢復正常。cDNA微陣列上的RNA制備、標記和雜交。采用peqGOLD Trifast (peqlab)和氯仿-異戊醇04 1)提取法，從每組5只不同小鼠的內臟和皮下脂肪組織提取RNA。RNA用異丙醇沉淀后，經由RNeasy柱^liagen)純化。在用Bioanalyzer 2100 (Agilent)擴增之前和之后檢查RNA質量。用MessageAmp 試劑盒(Ambion)使RNA反轉錄，并使RNA擴增。同樣使小鼠通用參比(Mouse Universal Reference) (Clontech)擴增，按照已發表的方案(De Fourmestraux等，2004)，將脂肪組織RNA和參比RNA兩者用Cy5和Cy3通過間接技術標記。 將標記的RNA與含有洛桑大學DNA Array facility制備的17664 cDNA的微陣列雜交。按照前述已發表的方法(de Fourmestraux等，2004)，進行了掃描、成像和質量控制分析。數據表示為10 強度比(Cy5/Cy3)，用印刷尖(print tip)局域加權線性回歸(Lowess)方法歸一化，根據印跡點質量和不完全注釋過濾。全部分析均用在Comprehensive R Archive Network(cran. us. r-project. org/)上可獲得的用于統計計算的R軟件進行。RNA提取和實時PCR按照生產商的說明書(Axonlab)，用peqGOLD TriFast試劑，從培養細胞中分離總 RNA。使用隨機引物和 Superscript II (Invitrogen)，由 0. 5 μ g 總 RNA 合成第一 cDNA 鏈。 采用Power SYBR Green Mix (Applied Biosystem)進行了實時PCR。下列引物用于小鼠基因SEQ ID NO. 5(Vgll3-正向引物)、SEQ ID NO. 6 (Vgll3-反向引物)、SEQ ID NO. 9 (親環蛋白-正向引物)、SEQ ID NO. 10 (親環蛋白-反向引物)、SEQ ID N0. 13 (aP2_正向引物)、SEQ ID NO. 14(aP2-反向引物)。下列引物用于人基因SEQ ID NO. 7 (hVgll3_正向引物)、SEQ ID NO. 8(hVgll3-反向引物)、SEQ ID NO. 11 (親環蛋白-正向引物)、SEQ ID NO. 12(親環蛋白-反向引物)。從脂肪組織中分離脂肪細胞和基質血管成分(stromal vascular fraction, SVF)通過0)2吸入，將8周齡雄性C57BL/6J小鼠(n = 6-8)處以安樂死，收集附睪(內臟)和皮下脂肪組織，放入含有lOmg/mL低脂肪酸的BSA的DMEM培養基(Sigma-Aldrich， St. Louis,MI)中。將組織切成細碎片，然后在水浴搖床(80Hz)中于37°C用0. 12單位/mL I型膠原酶(Sigma)消化1小時。然后使樣品通過無菌250 μ m尼龍網(Scrynel NY250HC, Milian)過濾以除去未消化的片段。將所得懸液以1100RPM離心10分鐘，從脂肪細胞中分離出SVF。除去脂肪細胞后，用DMEM緩沖液洗滌。然后將其懸浮于peqGOLD Trii^ast試劑 (Axonlab)中，按照生產商的說明書分離RNA。使SVF部分在紅細胞裂解緩沖液(0. 154mM NH4ClUOmM KHCO3>0. ImM EDTA)中溫育2分鐘。然后將細胞在1100RPM下離心10分鐘，并重新懸浮于500 μ 1 peqGOLD iTriFast試劑(Axonlab)中用于RNA分離。細胞培養在5% CO2 下，將 3T3-L1 細胞在具有 10% FBS(Gibco)的 DMEM(Gibco)中培養。 在反轉錄病毒感染后(見下文)，在100-mm或60-mm培養皿內，使細胞在具有10 % FBS的 DMEM中生長至匯合。一旦達到匯合，便把細胞暴露于含有地塞米松(ΙμΜ)、胰島素(5yg/ ml)和異丁基甲基黃嘌呤(0.5μΜ) (DMI)的分化培養基中。2天后，將細胞保持在含有胰島素(5yg/ml)的培養基中，直到在7天時準備好收獲。油紅0染色在分化7-10天，將細胞在PBS中洗滌一次后，用甲醛(Formalde-fresh ；Fisher) 固定15分鐘。通過將0. 5g油紅0溶于100ml異丙醇中來制備染色溶液；將60ml該溶液與 40ml蒸餾水混合。在室溫下1小時后，過濾染色溶液，并加入培養皿中4小時。然后除去染色溶液，將細胞用蒸餾水洗滌兩次。反轉錄病毒構建體的產生和反轉錄病毒感染在RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen (pSIREN Clontech)或 pMSCV 嘌羅霉素質粒(pMSCV，Clontech)中構建反轉錄病毒。采用Jordan，Μ.等Q004)所描述的磷酸鈣方法，將病毒構建體與編碼gag-pol和VSV-G蛋白的構建體一起轉染至^3HEK包裝細胞中。 在3 μ m曲古抑菌素A (Sigma)存在下48小時后收獲上清液，即用或速凍并儲存于_80°C備用。在1，5_ 二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物Gyg/ml)存在下，將病毒上清液加入細胞中達6小時，并在接下來的15小時用新鮮培養基稀釋兩次。過量表達構建體使用表達GFP標記的修飾的pMSCV嘌羅霉素反轉錄病毒質粒(得自Clontech)，以過量表達Vgll3的cDNA進入細胞。將cDNA(SEQ ID NO. 15)以平端插入pMSCV多克隆位點 WhpaI限制位點上。測定所得集落的正確方向，并通過酶消化進行選擇。選出并擴增正確的克隆，并用于3T3-L1細胞的反轉錄病毒感染。MM實施例1 微陣列結果對微陣列數據的生物信息進行了分析，以鑒定符合下列3個標準的基因(i)受高脂飼喂調節，(ii)通過高脂飼喂在內臟和皮下脂肪中有類似的經調節的表達，和(iii)通過利莫納班治療其表達類似地趨于正常(

圖1)。在所使用的cDNA微陣列上存在的約 17’ 000種基因靶標中，34種基因(列于表1中)符合這些標準。引人注目的是，這些基因中的 10 種-Cavl、Fgfl、Fndc3b、Kif5b、Mest、Npr3、Pik3ca、Sparc、Vldlr 和 Wwtrl-是之前已知的脂肪組織發育和功能的重要調節劑。這些基因中的一些具有與體重增加相關的表達水平(見表1，灰色)，這就表明了在肥胖期間在脂肪組織增生和/或肥大中的潛在作用。 這些結果驗證了用于鑒定治療性治療肥胖癥可能的新靶標的方法。最重要的是，表1引用的許多基因從未在脂肪組織發育方面或生物學中進行過研究。這些基因屬于下列功能類型胞外基質/細胞相互作用、細胞骨架、胞內信號轉導、酶和轉錄因子/輔因子。它們很可能參與組織重塑，特別是脂肪細胞發育。本文提供了這些基因之一即Vgll3基因及其在脂肪細胞生物學中的作用，該基因構成本發明的一個方面。用于本發明的小鼠和人的Vgl 13序列分別對應于SEQ ID NO. 1和NO. 2和SEQ ID NO. 3 和 NO. 4。
權利要求
1.一種用作藥物的提高Vgll3活性的分子。
2.一種用于降低脂肪生成的提高Vgll3活性的分子。
3.一種用于治療肥胖癥和相關病癥的提高Vgll3活性的分子。
4.一種用于降低內臟和/或皮下脂肪蓄積的提高Vgll3活性的分子。
5.提高Vgll3活性的分子在制備用于降低脂肪生成的藥物中的用途。
6.任一項前述權利要求的用途，其中提高Vgll3活性的分子是小分子。
7.任一項前述權利要求的用途，其中提高Vgll3活性的分子是表達Vgll3重組蛋白的載體。
8.權利要求7的用途，其中所述載體含有SEQID NO. 15或其衍生物。
9.權利要求7的用途，其中所述Vgll3重組蛋白序列對應于SEQID NO. 2或SEQ IN NO. 4或者其衍生物或片段或同源物。
10.包含提高Vgll3活性的分子和至少一種藥學上可接受的賦形劑的組合物。
11.用于制備降低脂肪生成的藥物的權利要求10的組合物。
12.用于制備治療肥胖癥和相關疾病的藥物的權利要求10的組合物。
13.用于制備減少內臟和/或皮下脂肪蓄積的藥物的權利要求10的組合物。
14.調節脂肪生成的方法，所述方法在于將提高Vgll3活性的分子給予有需要的患者以調節脂肪生成。
15.篩選Vgll3活性增強劑的方法，所述方法包括以下步驟a)將細胞系用包含與報道基因連接的Vgll3啟動子的報道構建體轉染b)將所述細胞系在允許表達報道基因的條件下培養c)將候選化合物加入細胞培養物中d)將增強劑化合物鑒定為具有提高報道基因表達的能力的化合物。
全文摘要
本發明涉及參與脂肪生成調節的新的靶標Vgll3。此外，本發明涉及提高脂肪細胞和前脂肪細胞的Vgll3活性的方法。另外，還提供包含提高Vgll3活性的分子的藥物組合物以提高靶組織中的Vgll3活性。這些方法、組合物和分子可用于調節脂肪生成，從而治療肥胖癥和相關病癥。
文檔編號A61K48/00GK102355911SQ201080012720
公開日2012年2月15日 申請日期2010年2月16日 優先權日2009年2月18日
發明者B·托倫斯, C·普桑, D·賀爾, M·日默內 申請人:賽諾菲