專利名稱：用于預防或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的肽的制作方法
用于預防或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的肽
技術領域：
發(fā)明涉及預防或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤。更特別是，發(fā)明涉及TGF-β 1 抑制性肽用于預防或治療性處理(優(yōu)選利用局部應用)初始階段的皮膚腫瘤的用途。
背景技術：
皮膚癌是在皮膚上確定的細胞類型的惡性生長，其可具有許多原因，通過太陽輻射是最熟知的一個。皮膚癌通常在表皮(皮膚的最外層)發(fā)展，但也可位于真皮。最常見的一種皮膚癌是基底細胞癌(BCC)，鱗狀細胞癌(SCC)和黑色素瘤。基底細胞癌傾向于生長緩慢和罕見擴展。鱗狀細胞癌通常相比基底細胞癌是更攻擊性的，且更可能向身體其他部分擴展。最危險的一種皮膚癌是黑色素瘤，尤其惡性黑色素瘤，其如果不早期處理可致死。 皮膚癌是最快速生長的癌之一，且超過肺，乳腺，結(jié)直腸或前列腺癌的病例數(shù)。轉(zhuǎn)化生長因子β l(TGF-i3 1)是調(diào)控各種細胞過程，例如細胞增值，分化，凋亡，組織重塑和血管發(fā)生的多功能的細胞因子。各種用遺傳修飾的小鼠的實驗模型(W. Cui et al.，“ TGFbetalinhibits the formation of benign skin tumors, but enhances progression to invasive spindle carcinomas in transgenic mice " , 35Cell 1996, vol. 86, pp. 531-542),力口上培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞的體夕卜研究(G. Portella et al. , ‘‘ Transforming growth factor beta is essential for spindle cell conversion of mouse skin carcinoma in vivo implications for tumor invasion" ,Cell. Growth. Differ. 1998,vol. 9,pp. 393-404)提示，TGF-β 1在皮膚致癌作用中具有雙功能。其發(fā)揮腫瘤發(fā)展的初始階段的良性腫瘤的形成抑制劑的作用及發(fā)揮致癌作用的最后階段中惡性進展的引發(fā)劑的作用，促進侵入和轉(zhuǎn)移 (R.J. Akhurst et al. , “ Genetic events and the role of TGF beta in epithelial tumour progression"，J. Pathol. 1999，vol. 187，pp. 82-90)。因此，預期致癌作用的最后階段中此因子的抑制對惡性進展具有抑制效應，然而腫瘤發(fā)展的初始階段的其抑制應對良性腫瘤的形成和它們向惡性癌的進展具有刺激性效應。文獻WO 00/31135首次描述了 P144肽(其INN是地司特肽，SEQ ID NO :1)。其也描述此肽如何可用于治療肝臟疾病，更具體治療肝臟纖維化。文獻W007048857描述了地司特肽作為免疫應答的調(diào)節(jié)制劑及在治療癌中的用途。地司特肽用于治療癌的用途與以上-提及的研究一致，其提示所述因子對致癌作用的最后階段中惡性進展的刺激性效應。但是，目前仍有對可局部應用于預防或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤以避免向癌的進展，且有效和良好耐受的的替代性治療的需要。發(fā)明概述意外地發(fā)現(xiàn)，確定的TGF- β 1抑制性肽抑制初始階段的皮膚腫瘤的形成和也抑制它們的隨后向癌的進展。尤其是，發(fā)現(xiàn)，地司特肽抑制小鼠中乳頭瘤形成及延緩它們向癌的進展。
盡管已知地司特肽可在后期階段治療癌中有用，現(xiàn)有技術未給出涉及使用地司特肽來治療初始階段的皮膚腫瘤的任何公開或提示。由此，本發(fā)明一方面涉及用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的 TGF-β 1抑制性肽，其中所述肽是地司特肽或其衍生物。本發(fā)明另一方面涉及用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的藥物組合物，其包括治療有效量的以上所述肽，以及至少一種藥學可接受的載質(zhì)，賦形劑或稀釋劑。最后，本發(fā)明另一方面涉及以上所述的肽用于制備預防性或治療性處理哺乳動物 (包括人)中初始階段的皮膚腫瘤的藥物的用途。本發(fā)明最后一方面涉及阻止或治療哺乳動物(包括人)中初始階段的皮膚腫瘤 (尤其是乳頭瘤或光化性角化病)的方法，其中方法包括向哺乳動物的皮膚應用包括治療有效量的以上所述的肽，以及藥學可接受的載質(zhì)或稀釋劑的組合物。在優(yōu)選的實施方式中， 哺乳動物出現(xiàn)初始階段的皮膚腫瘤，且方法包括向哺乳動物的皮膚應用組合物，以便治療腫瘤和避免其向癌的進展。在另一優(yōu)選的實施方式中，哺乳動物不出現(xiàn)皮膚腫瘤，且方法包括將化合物施加到哺乳動物的皮膚，以便阻止腫瘤。發(fā)明詳述如以下例示，根據(jù)本發(fā)明的肽向用作動物模型的小鼠皮膚的局部應用抵御良性乳頭瘤及通過DMBA/TPA誘導的SCC的發(fā)展。因此，這些結(jié)果顯示，本發(fā)明的肽在預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤(例如乳頭瘤或光化性角化病)中有用。本發(fā)明的肽優(yōu)先施加到人的皮膚，如果所需，也可將它們普遍應用于哺乳動物的皮膚。本發(fā)明的TGF- β 1-抑制性肽之中包括序列SEQ ID NO 1 (地司特肽)或其衍生物。地司特肽(肽Ρ144的INN)首先被文獻WO 00/31135描述。如此文獻中所述，地司特肽包括TGF-β 1的III型受體的氨基酸730-743(登錄號Q03167, SwissProt)。術語"初始階段的腫瘤"指局限于它們的發(fā)展位置的腫瘤，其還未侵襲周圍的組織，以及指已侵襲其他組織，但侵襲區(qū)限于局部區(qū)的腫瘤。此定義可應用于絕大部分癌，包括皮膚癌。光化性或日光性角化病被認為是皮膚癌發(fā)展的最早的階段。更具體而言，光化性角化病被認為是初癌，且是SCC的主要前體。皮膚乳頭瘤被認為是初始階段的另一種腫瘤它們是良性非-癌性的腫瘤。術語〃衍生物或地司特肽〃包括序列SEQ ID NO :1的哺乳動物片段，類似物和同源物，只要它們維持它們抑制TGF-βΙ的生物學活性的能力。可評價本發(fā)明的肽抑制 TGF-β 1的生物學活性的能力，且如果所需，利用抑制Mv-I-Lu細胞系的生長的測定來定量。這是源于美洲野牛肺部上皮的細胞系，其增殖被TGF-β 1抑制，如WO 00/31135中所述。術語“片段“指相比原SEQ ID NO 1的序列短至少一個氨基酸且包括優(yōu)選來自原序列的至少6個殘基的連續(xù)氨基酸長度的任何氨基酸序列。術語"類似物"包括SEQ ID NO :1的一個或更多個氨基酸被不同的氨基酸取代的肽。優(yōu)選氨基酸的保守性取代。保守性取代是氨基酸殘基被另一生物學類似殘基取代的取代。保守性取代例包括疏水殘基(例如異亮氨酸，纈氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸)被另一疏水殘基取代或極性殘基被另一極性殘基取代，例如精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酸和天冬氨酸之間，或谷氨酰胺和天冬酰胺之間。保守性取代也包括使用取代的氨基酸代替非-取代的氨基酸，只要維持肽的抑制TGF-β 1的生物學活性的能力。也作為類似物包括在SEQ IDNO 1中插入或缺失一個或更多個氨基酸的肽。這些修飾(取代，缺失或插入)可由特定肽與SEQ ID NO :1的同源性程度表示。因此，本發(fā)明的TGF-β 1-抑制性肽中，也包括與地司特肽的氨基酸序列具有至少75 %同源性，優(yōu)選至少85 %同源性及，甚至更優(yōu)選，與此肽具有至少90%同源性的肽，只要維持它們的抑制TGF-β 1的生物學活性的能力。此外，本發(fā)明的肽可在它們的氨基酸中顯示化學修飾。作為類似物，也包括包含序列SEQ ID Ν0:1或它們的片段的雜交體或二聚體融合肽。術語"哺乳動物同源物"包括具有來自非人物種的相同的生物學功能的肽。由此，地司特肽的哺乳動物同源物肽是肽Ρ54，其具有序列SEQ ID NO :2，其包括大鼠TGF-β 1 的III型受體的氨基酸731-742(登錄號Ρ26342，SwissProt)。根據(jù)文獻WO 00/31135，地司特肽與PM肽相當。之前已顯示地司特肽及肽K4作為TGF-β 1抑制劑的能力，如文獻 WO 00/31135 中所述。在優(yōu)選的實施方式中，用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的肽是地司特肽(SEQ ID NO :1)。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽作為皮膚乳頭瘤的產(chǎn)生及它們向癌的進展的抑制劑有用。再更優(yōu)選地，本發(fā)明的肽在預防性或治療性處理光化性角化病中有用。本發(fā)明的肽可通過常規(guī)方法(例如通過固相化學合成技術)得到和通過高效液相色譜法(HPLC)純化，例如描述于WO 00/31135。如果需要，它們可利用常規(guī)技術，例如測序和質(zhì)量光譜法，氨基酸分析，核磁共振，等分析。或者，本發(fā)明的肽可通過重組DNA技術得到。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)有本發(fā)明的肽的藥學可接受的鹽。術語“藥學可接受的鹽”包括以金屬鹽或酸加成鹽形式慣常使用的鹽。鹽的性質(zhì)不是關鍵的，只要其是藥學可接受的即可。本發(fā)明的肽的藥學可接受的鹽可得到從有機或無機酸或堿。這些鹽可通過本領域技術人員熟知的常規(guī)方法得到。肽可由任何施用途徑施用。優(yōu)選，將本發(fā)明的肽局部施用。因此，另一方面，本發(fā)明涉及用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的包括治療有效量的本發(fā)明的肽以及至少一種藥學可接受的賦形劑，稀釋劑或載體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物可含一種或更多種本發(fā)明的肽，任選，以及一種或更多種替代性的 TGF-β 1抑制性化合物。此藥物組合物對于施用給哺乳動物身體(優(yōu)選人身體)有用。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為局部組合物，且可取例如，洗液，發(fā)膏劑，凝膠，乳油，罩或噴霧的形式。存在于本發(fā)明的藥物組合物的肽或肽的藥學可接受的鹽的量可在廣范圍內(nèi)變化。 用本發(fā)明的肽和/或藥物組合物預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的劑量將取決于多種因素，包括年齡，患者狀態(tài)，疾病或病理干擾的嚴重性，施用途徑和頻度，且也取決于待施用的本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽在產(chǎn)生此藥物組合物的用途是本發(fā)明的另一方面。 在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的肽用于制備抑制乳頭瘤產(chǎn)生及它們向癌的進展的藥物的用途。在另一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的肽用于制備預防性或治療性處理光化性角化病的藥物的用途。 貫穿說明書和權(quán)利要求書，詞匯“包括”和其變體不預定排除其他技術特征，添加物，成分或步驟。對于本領域技術人員而言，本發(fā)明的其他目的，益處和特征將部分遵從說明書及部分遵從本發(fā)明的實踐。
圖1顯示不同的組的代表性的經(jīng)治療的小鼠的背部皮膚的圖像，如實施例中所述。
實施例以下以舉例方式提供實施例，且它們不旨在限制本發(fā)明的范圍。實施例1局部制劑的制備制備一種媒質(zhì)局部制劑及含地司特肽(300yg/g)的制劑。媒質(zhì)制劑通過混合以下成分制備10%聚二甲基硅氧烷，43. 5%液狀石蠟，0. 02%羥苯甲酯，0.01%羥苯丙酯， 0. 5%西曲溴銨和1. 5%鯨蠟基硬脂基醇。將此混合物加熱至50 60°C及用100%純化的水乳化(也加熱至50 60°C )。除了在溶解于0.2ml 二甲亞砜(0. 22% ρ/ρ)之前，將水用水加0. 03%地司特肽的混合劑取代之外，以相同的方式制備地司特肽制劑。實施例2地司特肽對乳頭瘤形成及對已建立的乳頭瘤的發(fā)展和進展的效應材料及方法動物使用從Harlan S. L. (Barcelona, Spain)獲取的雌性 Swiss albino 小鼠 0 6 周齡)。處理之前，使動物在常規(guī)溫度及濕度條件下經(jīng)歷1 2周時期的適應。給它們隨意提供無菌水和標準攝食。全部動物實驗獲得實驗動物的護理和使用學會指南的批準，并根據(jù)實驗動物的護理和使用學會指南進行。化學致癌作用以2個階段應用小鼠皮膚的化學致癌作用流程。小鼠皮膚是具有作為用于研究與腫瘤形成發(fā)展相關的變化的實驗模型的某些益處的上皮組織。此流程涉及用單劑量的致癌起始劑，具體是7，12-二甲基苯(α)蒽(DMBA)處理小鼠，然后是腫瘤促進劑，12_0_十四醇佛波醇-13-乙酸酯(TPA)的反復應用。此處理導致出現(xiàn)良性腫瘤(乳頭瘤)。最良性乳頭瘤消失或恢復，但小部分(5 10% )進展為惡性鱗狀細胞癌(SCC)，其穿過基底膜及穩(wěn)定侵襲其下的真皮，皮下組織和肌肉。在6 8周齡的小鼠的剃凈的背部皮膚上通過DMBAQ00 μ 1丙酮中的32 μ g)的單個局部應用，然后是用200 μ 1丙酮中的12. 5μ g的TPA(10-4M) —周處理兩次持續(xù)12周來誘導腫瘤。此外，將幾組小鼠如下用含或不含地司特肽的乳油形式的局部制劑處理。各周，在各小鼠中記錄直徑大于2mm的腫瘤數(shù)。在實驗末，將動物麻醉并處死(用DMBA起始后32周)，及將腫瘤在10%甲醛中固定，并嵌入石蠟用于組織研究。用地司特肽處理的實驗設計為了測試地司特肽的可能的腫瘤-促進效應，在化學致癌作用的促進期期間，將 TPA以用含地司特肽(組2，由5個動物構(gòu)成)或僅含媒質(zhì)(組1，由5個小鼠構(gòu)成)的局部制劑乳油處理取代。類似地，在5個小鼠的一組中通過每2天重復應用地司特肽持續(xù)23周來分析地司特肽的可能的致癌活性。由于乳頭瘤在起始后約7 8周出現(xiàn)，將用DMBA起始并用TPA促進的小鼠每2天用地司特肽進一步處理4和12周(分別是組5和6，各10個動物)，以便測試是否地司特肽可阻止皮膚致癌作用。用地司特肽處理在相同的周開始，其中小鼠用DMBA起始(周0)，及每隔一天進行用此和TPA的應用。作為對照，將一組小鼠(組 4，由5個動物構(gòu)成)用僅媒質(zhì)處理(對照乳油)12周。最后，從用DMBA起始后第12周到第周32周，將具有腫瘤的一組動物(組7，由10個動物構(gòu)成)每2天用地司特肽處理20周。 包括此組小鼠，以測試肽的可能的抗-腫瘤效應。以200μ 1局部制劑中60μ g的劑量作為乳油施加地司特肽，除了組7的小鼠之外，其中地司特肽的劑量增加至120 μ g(在400 μ 1 乳油中)。結(jié)果使幾組小鼠通過用單劑量的DMBA起始，然后是一周兩次用TPA促進12周來經(jīng)歷化學皮膚致癌作用。此處理給出導致從用DMBA起始后8周出現(xiàn)多個乳頭瘤。此外，將2組動物每2天用含地司特肽的皮膚乳油處理4和12周，開始于與DMBA開始的相同的天(分別組5和6)。在兩種情況中，相比未處理的小鼠(組3)或用僅媒質(zhì)處理的小鼠(組4)出現(xiàn)30 60%更少良性乳頭瘤，如見于起始后10和14周(表1，圖1)。有趣的是，用地司特肽處理越短時間G周)，抑制乳頭瘤數(shù)和尺寸中有越深刻的效應。我們也測試是否地司特肽可取代TPA作為致癌作用的促進劑。為此，將用DMBA起始的小鼠用含地司特肽或僅含媒質(zhì)的乳油促進12周(分別組2和1)。如所期望，這些組中無腫瘤誘導，除了組1中的2個小鼠被僅媒質(zhì)促進之外，它們均在起始后30周自發(fā)發(fā)展了小的腫瘤(直徑< 5mm)(表1)。每2天重復應用持續(xù)多于20周后，地司特肽未顯示對正常皮膚有有害的效應(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，地司特肽以局部乳油制劑向皮膚的應用不可起始或促進致癌作用。相反，地司特肽的局部應用具有抵御化學皮膚致癌作用的保護齊U效應。為了分析地司特肽對已建立的乳頭瘤的發(fā)展和進展的效應，我們包括了一組小鼠 (組7)，其中P144應用開始于用DMBA起始后第12周，當各小鼠平均具有約7 8個乳頭瘤時(表1)，及持續(xù)20周。此組未觀察到乳頭瘤數(shù)或尺寸的顯著降低。實際上，起始后14 周，直徑> 2mm的腫瘤平均數(shù)/小鼠趨向于全部組外的水平(表1)。在直徑> 5mm的腫瘤的平均數(shù)上出現(xiàn)相同的事件(表2)。但是，起始后32周，2種直徑> 2mm的腫瘤和直徑> 5mm的腫瘤數(shù)一般在用地司特肽處理的組中更低。再次，在起始后處理4周的組中觀察到最顯著的降低(表1和2)。早期乳頭瘤通常小(見圖1)，但由于它們會變大，它們采用具有窄或廣基部的花椰菜-樣結(jié)構(gòu)。另一方面，SCC通常是呈現(xiàn)為具有潰瘍表面的平面的內(nèi)生性腫瘤?；谶@些特征，我們每周檢查了各小鼠中癌的存在情況。如表3中所示，在起始后第17 18周， 在對照小鼠(組3和4)及用地司特肽處理4周的小鼠(組5)中出現(xiàn)第1個可觀察的癌。 顯然，在第12 32周期間用地司特肽處理的小鼠(組7)，其在處理開始時具有乳頭瘤，在第1個癌出現(xiàn)上顯示約14周的延緩。起始后用地司特肽處理12周的小鼠(組6)具有約 6周的更短延緩。這些結(jié)果顯示，地司特肽向皮膚的局部應用不僅阻止腫瘤形成，而且延緩惡性轉(zhuǎn)變。表1.地司特肽對以2個階段致癌作用后小鼠中皮膚腫瘤的發(fā)展的效應
權(quán)利要求
1.用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的TGF-β1抑制性肽，其中所述肽是地司特肽或其衍生物。
2.地司特肽，其用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤。
3.權(quán)利要求1或2中定義的肽，其用作皮膚乳頭瘤的產(chǎn)生及它們向癌的進展的抑制劑。
4.權(quán)利要求1或2中定義的肽，其用于預防性或治療性處理光化性角化病。
5.用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的藥物組合物，其包括治療有效量的權(quán)利要求1或2中定義的肽，以及至少一種藥學可接受的賦形劑，稀釋劑或載體。
6.權(quán)利要求1或2中定義的肽用于制備預防性或治療性處理哺乳動物中初始階段的皮膚腫瘤的藥物的用途，所述哺乳動物包括人。
7.權(quán)利要求1或2中定義的肽用于制備抑制皮膚乳頭瘤的產(chǎn)生及它們向癌的進展的藥物的用途。
8.權(quán)利要求1或2中定義的肽用于制備預防性或治療性處理光化性角化病的藥物的用途
全文摘要
本發(fā)明包括用于預防性或治療性處理初始階段的皮膚腫瘤的TGF-β1抑制性肽，其中所述肽是地司特肽或其衍生物，及包括治療有效量的所述肽的藥物組合物。
文檔編號A61P17/00GK102341115SQ201080010551
公開日2012年2月1日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者J·多托爾德拉斯埃雷里亞斯, M·昆塔尼拉阿維拉, R·因薩博羅納特 申請人:醫(yī)姿挺有限公司