治療谷蛋白不耐受的組合物及其應用的制作方法

專利名稱：治療谷蛋白不耐受的組合物及其應用的制作方法
治療谷蛋白不耐受的組合物及其應用本申請總體上涉及用于預防或治療谷蛋白過敏反應(不耐受)相關病癥的組合物及其應用。
背景技術：
谷蛋白過敏反應(不耐受)主要見于以小麥為主食的區域(如歐洲、北美和澳大利亞)。在這些區域，此病的發生率約為人口的(DA Van Heel等，Gut 2006 ；55 1037-1046)。此病的癥狀包括腹痛、胃氣脹和腹瀉。在嚴重病例或患病時間長的病例中(例如腹部疾病)，腸粘膜有炎性變化，導致營養素吸收不良、疲勞、慢性腹瀉、體重減輕、腹脹、 貧血、出血傾向增加，及胃腸道惡性腫瘤的危險增加，如淋巴瘤和癌。谷蛋白過敏反應(或腹部疾病，口炎性腹瀉)的發病機理似乎既有遺傳因素又有環境因素。雖然遺傳傾向性是一個主要的因素(約10%的一級親屬受到影響)，然而單卵雙生子的同病率僅約75 %，這一事實提示環境因素在此病的發生發展中也是起作用的。罹患谷蛋白過敏反應的患者特征性地在其腸粘膜中有T細胞存在，該T細胞可識別谷蛋白毒性肽中存在的某些序列。證據表明，這些T細胞通過識別含某些與毒性相關的特殊氨基酸序列的肽而在此病的免疫發病機制中起著關鍵性的作用。例如，在體外實驗中通過將部分消化形式的水溶性谷蛋白添加到攜帶HLA-DQ2的抗原遞呈細胞中，可引起從腹部疾病患者腸道得到的受麥醇溶蛋白特異性HLA-DQ2限制的T細胞克隆發生增殖。與嚴重的谷蛋白過敏反應相關的一種疾病是皰疹樣皮炎，它以慢性出疹的形式出現，特征為特別瘙癢的水泡、丘疹和蕁麻疹樣病變集群。研究證明，在幾乎所有外觀正常的和病灶周圍的皮膚上都出現IgA沉積物。無癥狀的谷蛋白敏感性腸病見于75%至95%患者及其一些親屬中。皰疹樣皮炎的發病通常是漸進型的，發展為受累表面嚴重瘙癢和燒灼。 此外，撓抓常常使有周圍皮膚濕疹的原發損害不清楚，從而導致濕疹的錯誤診斷。谷蛋白是一種蛋白成分，見于例如谷類生面團中，它可再區分為麥谷蛋白和醇溶谷蛋白。醇溶谷蛋白還可以再分類為分別從小麥、黑麥、大麥和燕麥得到的麥醇溶蛋白、黑麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白和燕麥谷蛋白。對谷蛋白過敏反應患者有潛在有害影響的谷蛋白是小麥的儲存蛋白，這些小麥的種類包括Triticum aestivum ；Triticum aethiopicum ； Triticum baeoticum ；Triticum militinae ；Triticum monococcum ；Triticum sinskajae ； Triticum timopheevii ；Triticum turgidum ；Triticum urartu, Triticum vavilovii ； Triticum zhukovskyi ；等等(例如見 Colot，Genet Eng(NY) 12 :225-41,1990) 麥醇溶蛋白是小麥谷蛋白中70%醇溶蛋白部分。按照其電泳遷移率，可將得自小麥面粉的麥醇溶蛋白分成幾類，包括α-型、β-型、Υ-型和ω-型。麥醇溶蛋白有特色地富含谷氨酰胺和脯氨酸，特別在其N-末端部分。例如，α-和Y-麥醇溶蛋白的前 100個氨基酸分別含有約35%谷氨酰胺殘基和20%脯氨酸殘基。不同的麥醇溶蛋白存在于小麥的每一次移種中，而在每一種類型中存在著氨基酸序列上的差異。麥醇溶蛋白的典型特征是其分子量約為30-50千道爾頓，以及它們在中性水溶液中不溶解。麥醇溶蛋白序列的例子包括但不限于小麥α-麥醇溶蛋白序列，例如，基因庫中提供的如下登錄號的序列:AJ133612 ；AJ133611 ；AJ133610 ；AJ133609 ；AJ133608 ；AJ133607 ；AJ133606 ；AJ133605 ；AJ133604 ；AJ133603 ；AJ133602 ；D84341. 1 ；U51307 ；U51306 ；U51304 ；U51303 ；U50984 ；和 U08287。小麥ω-麥醇溶蛋白的序列為基因庫登錄號為AM80605的序列。現已發現，谷蛋白不耐受患者中缺乏通常存在于小腸中的消化谷蛋白所必需的酶。谷類蛋白不完全消化所產生的肽片段對這樣的個體是有毒的；毒性最大的肽是來源于 α -醇溶蛋白的肽，或稱作A-醇溶蛋白的類似的蛋白質。含絲氨酸的肽(含PSQQ基序，可能還含QQQP基序，如見于A-醇溶蛋白的11_19 殘基上)似乎具有細胞毒效應。含酪氨酸的肽(含QQPY和/或QPYP基序，如見于A-醇溶蛋白的75-86殘基上)與通過T細胞介導的免疫活性有關，因此而與毒性有關。實驗證明，在罹患腹部疾病的患者，含絲氨酸的活性肽如11-19肽和含酪氨酸的活性肽如75-86肽，被粘膜上的酶不完全消化。殘留的肽序列，如11-18和77-84，仍然是有毒性的，這提示腹部疾病的病原學是與粘膜消化的缺陷相關連的，此病的發病機理起因于未消化的肽對粘膜的作用。這可能最終由于腹部疾病患者一種酶的缺乏所致，但至少有兩種不同類型的肽殘留物累積而引起粘膜組織的損傷。目前，除了對患者強制實行無谷蛋白膳食之外，對谷蛋白不耐受效應尚無有效的治療方法。然而，由于含谷蛋白的谷類食品或谷蛋白本身的數量眾多，這一處理方式對可供患者選擇的食物構成了嚴格的限制。此外，雖然取消谷蛋白攝入改善了谷蛋白不耐受患者的預后，但是一些人們仍然可能因淋巴網狀內皮細胞疾病(尤其是腸淋巴瘤)而死于此種疾病，特別是本說明書開頭提到的那些存在嚴重谷蛋白過敏反應的人們。無谷蛋白膳食看來是減少了淋巴網狀內皮細胞疾病進展的危險，然而表面上的臨床緩解通常伴有組織學復發，這僅僅可由活組織檢查或IgA類抗肌內膜抗體(EMA)滴度的提高而檢出。鑒于谷蛋白過敏反應的嚴重性和廣泛分布性，需要尋求更好的治療、預防或改善此病效應的方法。因此，本發明的一個方面是通過提供預防或治療谷蛋白不耐受所致病癥的改善的組合物及其使用方法，來克服或至少部分緩解本領域存在的上述一些問題。本說明書中包括的對文獻、正式記錄、材料、方法、物品等的討論僅僅用于提供對本發明背景的理解之用。這些材料中的任何一種或其全部都不提示或代表在本申請的每一個權利要求的優先權日之前所存在的與本發明相關的領域中的普通常識。發明概述本發明的一個方面，提供一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物， 該組合物包括至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體。在一個實施方案中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)從番木瓜(Carica papaya)中得到。在另一個實施方式中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)包含如圖1所示的氨基酸序列，或其生物活性片段、類似物或變異體。按照本發明的組合物，可一步包含如本說明書描述的一種動物腸道酶提取物。在另一個實施方式中，按照本發明的組合物包含菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、 類似物或變異體。按照本發明的組合物可制劑成腸溶包衣片劑或膠囊。在本發明的一些實施方案中，組合物包含至少15mg番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、變異體或類似物。本發明的另一個方面，提供一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物，該組合物包含編碼重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體的核酸分子。在一個實施方案中，該核酸分子包含如圖2所示的核酸序列或其功能等同物。在另一個實施方案中，該核酸分子編碼如圖1所示的氨基酸序列或其生物活性片段、類似物或變異體。按照本發明的組合物可進一步包含可表達重組菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的核酸分子。在本發明的另一個實施方案中，提供一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物，其中該組合物包含一種可表達重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體的宿主細胞。在本發明的另一個實施方案中，組合物包含一種可表達重組菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的宿主細胞。本發明的另一個方面，提供一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的方法， 該方法包括對需要施用該方法的患者施用一種組合物，該組合物包含本說明書描述的至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體。在本發明的一些實施方案中，該組合物包含至少15mg番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、變異體或類似物。在本發明的一些實施方案中，該組合物于飯前施用于需要服用該組合物的患者。在一個實施方式中，按照本發明的方法包括對需要施用該方法的患者施用一種包含腸道提取物的組合物。在另一個實施方式中，按照本發明的方法包括對需要施用該方法的患者施用菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體。本發明的另一個方面，提供一種用于預防或治療谷蛋白不耐受所致病癥的方法， 該方法包括對需要施用該方法的患者施用一種核酸分子，其中所述核酸分子可在患者體內表達如本說明書所描述的重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體。在一個實施方式中，按照本發明的方法包括對需要施用該方法的患者施用一種核酸分子，該核酸分子可在患者體內表達重組菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體。本發明的還有一個方面，提供一種從來自含谷蛋白材料制備食品的方法，該方法包括用番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體處理食品或含谷蛋白的材料，從而減少存在于食品中的源自谷蛋白的毒性寡肽的量。在一個實施方案中，按照本發明的方法可進一步包括用菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體對食品或含谷蛋白材料進行處理。


圖1顯示Carica papaya caricain的一級氨基酸序列(GenBank登錄號 No. X66060)。
圖2顯示Carica papaya caricain的一級氨基酸序列(GenBank登錄號 No. X69877)。圖 3 顯示 Carica papaya caricain 的 mRNA 序列(GenBank 登錄號 No. X66060)。圖 4 顯示 Carica papaya caricain 的 mRNA 序列(GenBank 登錄號 No. X69877)。發明詳述組合物在本發明的一個方面，提供一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物，該組合物包括至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、 類似物或變異體。現已發現，番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)可修飾谷蛋白消化產生無毒肽后產生的毒性寡肽，從而提供一種預防或至少部分減輕其對谷蛋白不耐受個體毒性作用的改進的方法。不受理論的束縛，可預期該效應是酶量和經消化的谷蛋白量的劑量依賴性效應。如本說明書中所使用的，術語“番木瓜半胱氨酸蛋白酶 (caricain) ”(EC3. 4. 22. 30)指代表性地在植物(如Carica papaya)乳膠中發現的一種半胱氨酸蛋白酶。本領域已知的關于caricain的其它名稱包括包括ω-番木瓜蛋白酶、番木瓜內肽酶III、番木瓜肽酶Α、番木瓜肽酶II和番木瓜蛋白酶III。番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)是番木瓜蛋白酶超家族的一個成員，它與其它植物和動物半胱氨酸蛋白酶是同型的。自然表達的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)是一種無活性酶原的形式，稱作番木瓜半胱氨酸蛋白酶酶原(pro-caricain)。蛋白酶的無活性形式包含一種由附加的106 個N-末端氨基酸組成的抑制性前區。研究證明，番木瓜半胱氨酸蛋白酶酶原在體外激活中的限速步驟是前結構域(prodomain)的解離，該步驟之后是前區延伸的多肽鏈的溶蛋白性裂解。前驅區域提供可促進番木瓜半胱氨酸蛋白酶酶原C-末端裂片折疊的穩定支架(見 Groves et al.，1996，Structure，4 (10) :1193-1203)。是本發明者，首次將番木瓜半胱氨酸蛋白酶鑒定為將例如小麥谷蛋白的毒性寡肽轉化為無毒片段的關鍵酶。在一個實施方案中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶得自番木瓜(Carica papaya)，由 Schack于1967年發現(Dubey K. at al. 2007，番木瓜半胱氨酸蛋白酶其抑制劑的應用； African Journal of Biotechnology 6(9)1077-1086)。在另一個實施方案中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶包括如圖1所示的氨基酸序列，或其生物活性片段、類似物或變異體。按照本發明的組合物可進一步包括一種腸酶提取物，例如在國際專利申請PCT/ AU03/00633(公開號WO 2003/100051 ；其內容全文納入本說明書作為參考)中所描述的。 本發明者首次確定了番木瓜半胱氨酸蛋白酶和WO 2003/100051中描述的腸酶提取物合用時的協同效應。至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(Caricain)在本發明的一個實施方案中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶是按照熟練技術人員已知的常規方法從天然來源(如番木瓜乳膠)至少部分純化的。在本發明的某個實施方式中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶是用本領域已知的任何方法從番木瓜(Carica papaya)的乳膠中至少部分純化的，這些方法包括但不限于Azarkan M.等(“儲存于番木瓜乳膠中的酶的分離和純化”,JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003 790(1-2) :229-38)和 Buttle D.J.(番木瓜半胱氨酸蛋白酶，Handbook of Proteolytic Enzymes, 2edition, p. 1130-1132，Elsevier, London)中描述的方法。番木瓜屬番木瓜樹(the tree Carica papaya)的果實番木瓜(Papaya)，也稱作 mamao, tree melon, fruta bomba，Iechosa或pawpaw。用于從天然來源如番木瓜乳月交分離番木瓜半胱氨酸蛋白酶的方法包括(但不限于)固-液萃取、液-液萃取、固相萃取、膜過濾、超濾、滲析、電泳、溶劑濃縮、離心、超速離心、液相或氣相色譜法(包括分子大小排阻色譜法、親和色譜法等)，這些方法使用或不使用高壓、冷凍干燥、蒸發、與各種“載體”(如抗體)共沉淀、結晶，以及它們的任何組合。熟練的技術人員應當明白如何以順序的方式使用這些選項，以便在整個純化過程中按照番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)的各部分的活性富集其各相繼的部分。如本說明書所描述的，至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶的活性可用熟練技術人員已知的各種方法進行測定。固-液萃取包括(但不限于)使用各種溶劑、渦旋混合器、超聲波及其它方法以促進萃取，以及使用過濾、離心及本領域中所描述的相關方法進行回收(例如見Carmell RJP, Natural Products Isolation, Humana Press，1998)。可使用的溶劑的例子包括(但不限于)碳氫化合物溶劑、含氯溶劑、有機酯類、有機醚類、醇類、水，以及它們的組合。液-液萃取包括(但不限于)使用本領域已知的各種溶劑，例如碳氫化合物溶劑、 含氯溶劑、有機酯類、有機醚類、醇類、水、各種水溶液，以及它們的組合。液-液萃取可用人工促進，或可自動化操作(完全或部分)，溶劑可用本領域的標準技術加以去除和/或濃縮。膜過濾、反向滲透和超濾包括(但不限于)使用本領域已知的各種類型的膜，以及使用壓力、真空、離心力，和/或可在膜過濾和超濾過程中使用的其它方法。滲析典型地包括使用選擇性除去天然來源材料中各種組分的分子量截留膜，以便提高樣品中番木瓜半胱氨酸蛋白酶的相對純度。本發明還包括用本領域已知的各種方法 (包括但不限于冷凍干燥和結晶)從滲析液或滲余物中回收純化的和/或分離的提取物。色譜法包括(但不限于)使用常規柱色譜法、快速色譜法、高效液相色譜法 (HPLC)、中壓液相色譜法(MPLC)、超臨界溫度液相色譜法(SFC)、逆流色譜法(CCC)、移動床色譜法、模擬移動床色譜法、膨脹床色譜法，及平面色譜法。色譜法中可使用的吸附劑包括 (但不限于)硅膠、氧化鋁、硅酸鎂吸附劑(fiuorisil)、纖維素和改性纖維素、各種改性硅膠、離子交換樹脂、分子大小排阻凝膠、化學改性凝膠，及本領域技術人員已知的其它吸附劑。本發明還包括使用兩種或兩種以上鹽梯度以影響用色譜法分離和/或部分純化番木瓜半胱氨酸蛋白酶。當使用水或水相時，可包含各種量的無機鹽或有機鹽，并/或用酸或堿將 PH調節到不同的值，以加強分離和/或純化。從天然來源至少部分純化番木瓜半胱氨酸蛋白酶的方法還包括通過從有機提取物和/或分離的提取物和/或純化的提取物除去溶劑來濃縮純化的或部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶。除去溶劑的技術是本領域技術人員已知的，它們包括(但不限于)旋轉蒸發、蒸餾(常壓和減壓)、離心真空蒸發(speed-vac)、冷凍干燥以及它們的組合。當涉及本發明的肽、蛋白質和肽的類似物(如番木瓜半胱氨酸蛋白酶或菠蘿蛋白酶)時，術語“至少部分純化”代表性地指部分或完全沒有其它組分(如其它蛋白、核酸、脂類、碳水化合物)的組合物，而這些組分是伴隨非純化狀態(如天然狀態或環境中的)肽、 蛋白質或其類似物存在的。至少部分純化的肽和蛋白質一般可以均勻的或接近均勻的狀態
8存在，它們既可以干燥狀態存在也可在水溶液中存在。純度和均勻性典型地堅決采用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法等分析化學技術加以測定。在一個實施方案中，肽 (如caricain)可采用例如本說明書所描述的常規和已知的方法進一步純化。在本發明的某個實施方案中，至少部分純化的蛋白質(如caricain)可構成組合物總重量的至少約百分之一或百分之幾(重量％ )，例如組合物總重量的至少約5重量％。 另一個實施方案中，至少部分純化的caricain可構成組合物總重量的至少約10重量％。另一個實施方案中，至少部分純化的caricain可構成組合物總重量的至少約20重量％。另一個實施方案中，至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)可構成組合物總重量的至少約50重量％。在還有另一個實施方案中，至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶 (caricain)可構成組合物總重量的至少約80重量％。在其它實施方案中，至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)可構成組合物總重量的至少約90重量％或95重量％ 或更多。番木瓜半胱氨酸蛋白酶(Caricain)的活性檢測采用一種或幾種本說明書描述的方法可檢測部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶降低谷蛋白毒性肽毒性的能力。本領域熟練技術人員會理解，從番木瓜乳膠或從其它任何合適的來源分離和純化番木瓜半胱氨酸蛋白酶的方法將是使分離的肽酶的至少一些酶活性保留，以提供對谷蛋白不耐受所致病癥的預防或治療。本領域技術人員會懂得，有許多體外或體內試驗的方法和技術可用于定性和/或定量測定至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶降低谷蛋白毒性肽毒性的能力，如本說明書所描述的那樣。本說明書所描述的番木瓜半胱氨酸蛋白酶，可用其改變底物以滅活谷蛋白毒性寡肽的能力來加以鑒定，其中底物可包括(但不限于)麥醇溶蛋白、大麥醇溶蛋白、黑麥醇溶蛋白或燕麥蛋白。如本說明書所述，谷蛋白毒性寡肽包括正常的人消化食用谷物(如小麥、 黑麥、大麥等)中的醇溶蛋白和相應的儲存蛋白時得到的肽類。據信，這樣的寡肽在罹患谷蛋白不耐受所致病癥(如口炎性腹瀉)的患者身上起著作為T細胞抗原的作用。為了結合于II類MHC蛋白，免疫原性肽的長度通常為約8-20個氨基酸，更通常為10-18個氨基酸。 這樣的肽可包括QQPY或相應的含酪氨酸基序。測定寡肽對特定患者是否具有免疫原性，可用標準的T細胞激活試驗和其它本領域技術人員已知的試驗進行測定。番木瓜半胱氨酸蛋白酶(Caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體滅活谷蛋白毒性肽的能力，如本說明書所述，可用本領域已知的任何方法進行測定，例如，采用大鼠肝臟溶酶體(RLL)試驗，如 WO 2003/100051 和 Cornell and Townley(1974 ；Gut, 15(11) :862-869)中所描述的，這兩篇文獻均列入本說明書作為參考。在某個實施方案中，按照本發明的caricain能使毒性肽改性，如含PSQQ、QQQP 和QQPY基序的肽、小麥A-麥醇溶蛋白肽QNPSQQQPQ(殘基11-19)、RPQQPYPQPQPQ(殘基 75-86)、LGQQQPFPPQQPY (殘基 31-4 、PQPQPFPSQQPY (殘基 44-5 和 LGQGSFRPSQQN (殘基 206-217)等。番木瓜半胱氨酸蛋白酶使底物改性的能力可用如下方法加以測定，例如通過將含lmg/ml底物和10mg/ml caricain的反應混合物于37°C培育1小時后測定酶增加游離 NH2-濃度的能力。按照本發明的番木瓜半胱氨酸蛋白酶，在這樣的條件下可增加游離氨基末端的濃度，通常至少約10%，更通常為至少約25%，更好為至少約50%。按照本發明的番木瓜半胱氨酸蛋白酶，還可降低大于約IOOODa的寡肽(在0. Iml的50mg/ml底物中， 與0. 2ml的10mg/ml肽酶一起培養2小時)的毒性至少約25%，通常至少約50%，較好的至少約10倍。這些寡肽的毒性可用本領域已知的方法進行測定，例如，采用大鼠肝臟溶酶體(RLL)試驗，如 WO 2003/100051 和 Cornell and Townley (1973) ；Clin. Chim. Acta 49: 181-188中所描述的，這兩篇文獻均列入本說明書作為參考。在本發明的一個實施方案中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶顯示去毒活性(如采用RLL 試驗測定的)為對溶酶體的保護達到至少約20%，較佳為至少約50%，或較佳為至少約 90%。在本發明的一些實施方案中，組合物包括至少15mg番木瓜半胱氨酸蛋白酶，或其生物活性片段，變異體和類似物。其它組合物在本發明的另一個實施方案中，受關注的組合物可包括番木瓜半胱氨酸蛋白酶與其它能滅活谷蛋白寡毒性肽的酶的組合，這些酶包括但不限于菠蘿蛋白酶和腸道提取物， 如國際專利申請PCT/AU03/00633(公開號WO 2003/100051，其內容納入本說明書作為參考)中所描述的。本發明者發現，番木瓜半胱氨酸蛋白酶與腸道酶提取物合用(如WO 2003/100051 所描述的)，對麥醇溶蛋白毒性寡肽的裂解產生驚人的協同效應，例如，用大鼠肝臟溶酶體保護試驗(Rat Liver Lysosome Protection Assay)所證實的男|3樣。菠蘿蛋白酶是一種植物蛋白酶，它典型地從菠蘿(Ananas comosus)中分離而得。 它的最適PH范圍是5-8(由底物而定)，對肽鍵具有寬的特異性。菠蘿蛋白酶可用本領域已知的標準技術從諸如菠蘿來源純化得到，這些技術包括但不限于Yamada F.等(“從菠蘿果實純化和鑒定，果實菠蘿蛋白酶FA2” J Biochem(Tokyo). 1976 ；79 (6) :1223-34)描述的方法。分離和純化的菠蘿蛋白酶也是商業上可購得的。番木瓜半胱氨酸蛋白酶是本發明者發現的從番木瓜乳膠洗脫的高分子量餾分 (在30_35KDa范圍內的餾分4，見實施例部分)，與其活性形式的序列一致(Groves et al.， 1996，Structure, vol4 :1193-1203) 用高效液相色譜儀在 Bios印 SEC S 2000 上進一步純化餾分4，證實餾分4的前期高分子量部分包含caricain、谷氨酰胺環化轉移酶和木瓜凝乳蛋白酶，而后兩種酶并不顯示它們對麥醇溶蛋白的去毒化有明顯的貢獻。本申請人證明苯甲基磺酰氟(PMSF)在6mM濃度時不明顯抑制餾分4對大鼠肝臟溶酶體的作用，證實了此餾分中存在的主要的酶不是絲氨酸蛋白酶。如本說明書所述的，腸道提取物可以從胃腸道的任何部分得到，包括但不限于十二指腸。腸道提取物可從任何種屬得到，只要它顯示對麥醇溶蛋白毒性肽的去毒能力，單獨使用或與番木瓜半胱氨酸蛋白酶產生協同作用的能力。在本發明的某個實施方案中，腸道提取物來自豬腸子。這些蛋白質的其它動物形式也可使用，或它們的改性形式可分離自其它商業允許的渠道。本發明的組合物也可包含其它酶，例如(但不限于)真菌蛋白酶，得自曲霉 (Aspergillus spp.),如米曲菌(Aspergillus oryzae)(例如，Byun et al. (2001) J. Agric. Food Chem. 49，2061-2063)和乳酸桿菌(Lactobacilli spp.)，如瑞士乳酸桿菌(如 Vesanto et al.，(1995)Microbiol. 141，3067-3075)和乳酸乳球菌(Mayo et al.， (1991)Appl. Environ. Microbiol. 57,38-44)。生物活性片段、變異體和類似物如本說明書關于番木瓜半胱氨酸蛋白酶所使用的，術語“生物活性片段”代表性地指在體外或體內試驗中保留其谷蛋白肽去毒化能力的片段。受關注的肽片段包括(但不限于)至少約20個連續氨基酸的片段，更通常為至少約50個連續氨基酸的片段，并可包含100個或更多個氨基酸，直至完全蛋白，還可進一步延伸至包括額外的序列。對于每一種情況，關鍵的標準是該片段是否保留使與谷蛋白不耐受所致病癥有關的毒性寡肽改性的能力。如本說明書中所使用的，術語“天然的”較好地是指具有存在于自然界的氨基酸序列(如天然蛋白質)的番木瓜半胱氨酸蛋白酶。這樣的片段一般可采用本領域技術人員熟知的鑒定肽酶活性的技術加以鑒定，例如，采用如上文所描述的技術。如本說明書中關于菠蘿蛋白酶所使用的，術語“生物活性片段”典型地指能保留其與番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體合用時使谷蛋白肽去毒化能力的菠蘿蛋白酶片段。如本說明書中關于番木瓜半胱氨酸蛋白酶所使用的，術語“類似物”典型地指其具有的氨基酸序列與天然存在的番木瓜半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列基本上相同的肽酶。如本說明書中關于菠蘿蛋白酶所使用的，術語“類似物”典型地指其具有的氨基酸序列與各自天然存在的酶的氨基酸序列基本上相同的肽酶。如關于類似物所使用的，術語“基本上相同的”典型地指取代或添加一個或更多的氨基酸，使所得類似物具有天然存在酶的至少一些生物活性。類似物可以是天然存在的，例如等位基因變異或mRNA拼接變異體，或可以用本領域技術人員可使用的合成或重組技術進行構建。如本說明書中關于番木瓜半胱氨酸蛋白酶和菠蘿蛋白酶所使用的，術語“變異體，， 典型地指顯示其氨基酸序列與天然酶至少有80%相同的酶。還有的預期的是在實施方案中，變異體包含與天然分子至少90%相同的氨基酸序列，較佳為至少95%相同，較佳為至少98%相同，較佳為至少99%相同，或較佳為至少99. 9%相同。百分率的鑒定可采用本領域技術人員已知的方法進行目視檢測和/或數學計算。變異體可以是天然存在的、合成的或重組的。在本發明的一個實施方案中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶或菠蘿蛋白酶的變異體包括一種與天然形式的酶基本相同的酶，但其氨基酸序列因一個或幾個缺失、插入或替代而不同于天然形式。某些實施方案包括含與天然形式相比有一個至十個氨基酸殘基缺失、插入或替代的氨基酸序列。一個特定的序列可被例如具有相似理化性質的殘基替代。這種一種脂肪族殘基對另一種脂肪族殘基的保守取代的例子為例如Ile、Val、Leu或Ala對另一種的取代；一種極性殘基對另一種的取代，例如Lys和Arg之間或Glu的Asp之間或Gln和Asn 之間；一種芳香族殘基對另一種的取代，例如Wie、Trp或Tyr對另一種的取代。其它的保守取代，例如，包括具有類似疏水性的整個區域的取代，是本領域熟知的。變異體也可由天然肽酶的氨基酸平截引起。本發明涵蓋的其它變異體包括(但不限于)去糖基化氨基酸或其片段，或當其與天然酶比較時顯示糖基化增加的那些氨基酸。
“保守的氨基酸取代”是其氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基取代的一種取代。具有類似側鏈的氨基酸殘基家族在本領域中已被限定。這些家族包括具有堿性側鏈 (如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側鏈(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側鏈(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(如蘇氨酸、 纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的氨基酸。因此，番木瓜半胱氨酸蛋白酶的一個氨基酸殘基較佳為被相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基取代。在一個優選實施方案中，可隨機地沿著全部或部分酶編碼序列引入突變，例如通過飽和誘變引入突變。可將所產生的突變體進行篩選，以鑒定可證實天然酶的至少某些生物活性的變異體。進行誘變后，可用本說明書描述的方法重組表達該編碼的蛋白質并測定酶的活性。還可展望的是，不改變天然形式番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或菠蘿蛋白酶基本序列的修飾，包括(但不限于)蛋白質的化學衍生作用(如乙酰化或羧化)、糖基化作用(如在其合成和加工過程中或在進一步加工步驟中改變蛋白質的糖基化模式)，及具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸)的序列。本發明實踐中，還可使用的是用分子生物學技術和/或化學方法加以修飾的番木瓜半胱氨酸蛋白酶或菠蘿蛋白酶，這樣的修飾可改善它們對蛋白降解和/或酸性條件(如見于胃的酸性環境)的耐受性，并使其溶解性能最適化，或使其更適合于作為治療劑使用。 這些蛋白質的類似物包括含有天然存在的L-氨基酸之外的殘基(如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的蛋白質。按照本發明的番木瓜半胱氨酸蛋白酶可用本領域已知的常規方法在體外合成。可購得各種市售合成裝置，例如自動合成儀(如CS936X肽合成儀，CSBio Company, Inc.)。使用這樣的合成儀，一個技術熟練的人員就可容易地將一個或多個非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸。特定的序列和制備方法可按方便、經濟、所需純度等加以確定。如果需要，合成時可在蛋白中引入各種基團，它們可使蛋白連接到其它分子或表面上。例如，可用半胱氨酸制得硫醚，可用組氨酸連接到金屬離子復合物上，可用羧基形成酰胺或酯，可用氨基形成酰胺，等等。核酸分子本發明的還有一個方面，提供一種預防或治療谷蛋白不耐受所致病癥的組合物， 該組合物包括編碼番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的核酸序列的核酸分子。該核酸分子應能驅使番木瓜半胱氨酸蛋白酶的重組類似物(包括其生物活性片段、類似物或變異體)的表達。例如，不受理論的限制，該核酸分子可將受試者胃腸道內層細胞轉染到被給予此核酸分子的人身上，在此摻入受試者的基因組。核酸分子的摻入隨后即引起重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的表達。如本說明書所用，術語“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)和RNA 分子(如mRNA)及例如通過使用核苷酸類似物所產生的DNA或RNA的類似物。該核酸分子可以是單鏈的，或雙鏈的，但優選雙鏈DNA。本發明所涵蓋的是天然存在和合成的核酸分子或其結合，它們的核酸序列編碼如上文所述的番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、 類似物或變異體。如本說明書所用的，術語“天然存在的”核酸分子典型地指具有存在于自然界的核苷酸序列的RNA或DNA分子(如在番木瓜植物中可獲得的)。如本說明書所用的，術語“基因”和“重組基因”較佳為指包括一個開放閱讀框架的編碼本說明書所述肽酶的核酸分子，并可進一步包括非編碼的調節序列和內含子。例如，編碼番木瓜半胱氨酸蛋白酶的核酸分子包含與編碼天然存在番木瓜半胱氨酸蛋白酶的核苷酸序列約65%至約99%或更多同源的核苷酸序列。編碼番木瓜半胱氨酸蛋白酶的核酸分子可從各種來源獲得，包括但不限于番木瓜，而如本發明的精神所設想的類似物可得自非植物種屬，包括但不限于人、豬、羊和牛。在本發明的某個實施方案中，核酸分子包括如圖2所示核酸序列或其功能等同物。如本說明書中所用的，術語“其功能等同物”是指與作為其功能等同物的序列具有類似的功能的序列。“類似的功能”是指若干序列在例如編碼番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體上享有共同的功能。在一些實施方案中，功能等同物序列可與作為其功能等同的序列顯示出序列的同一性。功能等同物序列與作為其功能等同的序列之間的序列同一性可以是沿功能等同物長度的至少50%，沿功能等同物長度的至少60%，或大于沿功能等同物長度的70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。在本發明的另一個實施方案中，核酸分子編碼如圖1所示的氨基酸序列或如本說明書中所述的其生物活性片段、類似物或變異體。本發明的核酸分子(如此處所述)可被插入載體，用作基因治療載體。在本發明的另一個實施方案中，提供一種組合物，如本說明書所述，進一步包含編碼如本說明書所述的重組菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體。宿主細胞在本發明的還有一個方面，提供用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物，該組合物包括一種宿主細胞，其中宿主細胞可表達重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶，或其生物活性片段、類似物或變異體，如本說明書所述。在本發明的某些實施方案中，宿主細胞是真核細胞或選自如下種屬中任何一種的細胞株胚胎干細胞、胚胎癌細胞、造血干細胞、肝細胞、成纖維細胞、肌原細胞、角質化細胞、內皮細胞、支氣管上皮細胞和免疫細胞。宿主細胞還可以是低等生物，如細菌。在一個實施方案中，宿主細胞可以是可定居于受者胃腸道的微生物，例如但不限于乳酸桿菌(LactcAacillus spp.)。在本發明的另一個實施方案中，宿主細胞是工程化表達如本說明書所述重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶和/或菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的植物。例如，宿主細胞可以是可食用植物，其中需要該植物的患者(如出現谷蛋白不耐受癥狀或有出現谷蛋白不耐受癥狀危險的患者)可消化該可食用植物，因而給以一劑重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶和/或菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述其生物活性片段、類似物或變異體)。本說明書所用術語“植物”包括整株植物、植物的部分或器官(如葉、莖、根等)，植物細胞、種子及其子代。本說明書所用術語“植物細胞”，進一步包括而不限于，從種子、懸浮培養物、胚胎、分生組織的局部、愈傷組織、葉子、根、嫩枝、配子體、孢子體、花粉和小孢子中得到或發現的細胞。植物細胞還可理解為包括工程化細胞，如得自前述組織的原生質體。按照本發明可使用的植物種類一般與可順應轉化技術的高等植物的種類一樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物。特別優選的植物包括玉米、大豆、向日葵、高粱、蕓苔、苜蓿、棉花、稻谷、大麥和小米。
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任何可用于將植物細胞工程化表達重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶和/或菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述其生物活性片段、類似物或變異體)的合適的方法包括(但不限于) 美國專利6，977，325 (其內容納入本說明書作為參考)中描述的方法。組合物還可進一步包括能表達重組菠蘿蛋白酶或如本說明書所述其生物活性片段、類似物或變異體的宿主細胞。例如，在本發明的某個實施方案中，組合物包括表達重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶(或如本說明書所述其生物活性片段、類似物或變異體)和重組菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述其生物活性片段、類似物或變異體)的宿主細胞。在另一個實施方案中，本發明的組合物包括表達重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶(或如本說明書所述其生物活性片段、類似物或變異體)的第一宿主細胞和表達重組菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述其生物活性片段、類似物或變異體)的第二宿主細胞。藥物組合物按照本發明的組合物，如上述說明書所述，可以是藥物組合物的形式，其中組合物進一步包括藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑和/或佐劑。本發明的藥物組合物可單獨使用或與其它化合物(如治療用化合物)聯合使用。如本說明書所用的，短語“藥學上可接受的載體”包括(但不限于)與藥物施用相容的溶劑、分散介質、包衣劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延緩劑，等等。還可在組合物中摻入補充的活性化合物。藥物組合物被配制成與其預期的給藥途徑相適應。代表性的給藥途徑為胃腸道給藥，包括口服(如攝入、吸入)或直腸給藥。用于胃腸道給藥的溶液或混懸液可包括一種或幾種如下組分無菌稀釋劑，如注射用水、溶于純水的氯化鈉溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑，如對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及調節張力的試劑，如氯化鈉或右旋糖。可用酸或堿(如鹽酸或氫氧化鈉)調節pH。一般來說，藥物組合物在制造和儲存條件下是穩定的，并且對微生物如細菌和真菌的污染作用具有防腐性。載體可以是一種包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇或液態聚乙烯乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質。通過例如使用卵磷脂包衣， 對于分散液來說通過維持所需的顆粒大小，或通過使用表面活性劑，可保持適當的流動性。 通過摻入各種抗細菌劑和抗真菌劑可達到阻止微生物的作用，例如，摻入對羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。在很多情況下，組合物中以包括等滲劑為佳，例如包括糖、氯化鈉或多元醇如甘露醇或山梨醇。口服組合物一般包括一種惰性稀釋劑或一種可食用載體。為了口服治療給藥的目的，活性化合物可與賦形劑摻和，以片劑、含錠或膠囊(如明膠膠囊)的形式使用。口服組合物也可用液態載體制備成漱口劑。藥學上相容的粘合劑和/或輔助材料也可作為組合物的一部分包含在組合物中。片劑、丸劑、膠囊、含錠等可包含任何一種下面的成分或類似性質的化合物粘合劑，如微晶纖維素、西黃耆膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如海藻酸、羥甲淀粉鈉(Primogel)或改性玉米淀粉；潤滑劑，如硬脂酸鎂或其它硬脂酸鹽；助流劑，如膠態二氧化硅；甜味劑，如蔗糖或糖精；或調味劑，如薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑。在一個實施方案中，本發明的組合物可制備可采用載體，保護本發明組合物不會快速地從機體消失，比如控釋制劑包括例如埋植劑和微囊包埋的給藥系統。可使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些制劑的方法對于本領域技術人員來說是不言自明的。脂質體混懸液(包括靶向于帶有抗病毒抗原的單克隆抗體感染細胞的脂質體)也可用作藥學上可接受的載體。為了方便給藥而且使劑量均勻，有益的是將口服或胃腸外組合物配制計量單位形式。本說明書所用的“計量單位形式”，指與給予受治療者的單一劑量相匹配的完全分離的單位；每一單位包含經計算可產生所需治療效應的預定量的與所需的藥物載體相關的活性化合物。這些化合物的毒性和治療效應可采用標準藥學規程包括體外實驗、細胞培養或實驗動物進行測定，例如，根據所研究的化合物，測定LD5tl (使50%個體死亡的劑量)和 ED5tl(在50%個體上治療有效的劑量)。毒性和治療效應之間的劑量比是治療指數，可表示為LD5tZED5tl比值。顯示高治療指數的化合物是較適宜的。顯示毒性副作用的化合物可以使用，但應設計一種給藥系統，這種給藥系統將這樣的化合物靶向受累部位，以使其對非累細胞的損害最小化，從而降低副作用。從體外實驗、細胞培養試驗或動物實驗得到的數據可用于制定在人體上使用的劑量范圍。劑量較佳地為處于包含ED5tl而極少或沒有毒性的血濃度范圍內。根據所用劑型和給藥途徑可在此范圍內改變劑量。酶的治療有效劑量最初可從體外試驗結果估計。這樣的信息可用于更精確地確定對人有用的劑量。在本發明的一個實施方案中，番木瓜半胱氨酸蛋白酶的有效劑量為成人至少0. lmg/kg體重，每餐服用，兒童則典型地將該劑量減半。根據患者的情況、受治療的病情及給藥途徑，番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、變異體和類似物通常可以每天約0. lmg/kg體重至約500mg/kg體重的劑量給藥，例如對于一個普通人大約每天15mg。例如，番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物和變異體的典型劑量可以是每個成人至少約lmg，較通常為至少約15mg，較佳為至少約 50mg，較佳為不大于約500mg。對于兒科制劑來說，劑量可作適當調整。兒童有效劑量可較低，例如至少約0. Img或0. 5mg的番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、變異體和類似物。在涉及例如番木瓜半胱氨酸蛋白酶和腸內氨酰基脯氨酸二肽酶的聯合治療中，可給予相應劑量的組合物；但是，劑量比會受到組合物對胃滅活作用的相對穩定性的影響。番木瓜半胱氨酸蛋白酶在本發明組合物中可以至少部分純化的提取物的形式存在，或以合成的藥學上可接受蛋白的形式存在。本領域技術人員會容易地理解，劑量水平可根據特定酶、癥狀嚴重程度和患者對副作用易感性而變化。在一些實施方案中，特定酶的劑量可被本領域技術人員用各種方法容易地加以確定。一種可作例示的方法是測定克服癥狀所需的指定化合物的生物活性。在本發明的一些實施方案中，本發明的組合物包括至少15mg番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、變異體和類似物。熟練的技術人員會理解，某些因素可影響有效治療一個患者所需的劑量和有效治療患者所需的時間，例如包括所用特定化合物的活性、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄率、任何聯合用藥、擬調整的表達或活性的程度、對谷蛋白的易感性、先前的治療和其它存在的疾病。藥物組合物可與使用說明書一起包含在一個容器、包裝或分配器中。對于口服制劑，本發明的組合物可單獨使用，或與適當的添加劑一起制成片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑。這些添加劑為例如，常規的添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；粘合劑如微晶纖維素、纖維素變體、阿拉伯膠、玉米淀粉和明膠；崩解劑如玉米淀粉、 馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂；如果需要，還可有稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑和調味劑。在本發明的一個實施方案中，口服制劑包括腸溶包衣制劑，從而使活性劑到達腸道中。腸溶制劑通常用于保護活性成分不受胃中強酸內容物的破壞。用不溶于酸性環境而溶于堿性環境的聚合物薄膜將固體劑型包衣，可制成這樣的制劑。例示性的薄膜有醋酸鄰苯二甲酸纖維素、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素醋酸琥珀酸酯、甲基丙烯酸脂類共聚物類、醋酸鄰苯二甲酸纖維素，和丙烯酸包衣系統,如 Acryl-Ease (Colorcon.卡樂康公司)。其它腸溶制劑包括用生物學上易蝕化的聚合物制成的工程化聚合物微球，它與胃腸道粘膜和細胞內層形成強粘著相互作用，可穿越粘膜吸收性上皮和覆蓋派爾集合淋巴結 (Peyer' s patches)淋巴組織的連濾泡上皮。聚合物與腸上皮保持長時間接觸，實際上穿過細胞和從細胞之間穿透腸上皮。例如，見Mathiowitz et al. (1997)Nature 386(6623) 410-414。給藥系統還可使用一個多孔水凝膠(SPH)和SPH復合材料(SPHC)的核心，如 Dorkoosh et al. (2001) J Control Release 71 (3) :307-18)所描述的。預防或治療的方法本發明的另一個方面，提供一種預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的方法，該方法包括給予有需要的患者如本說明書所描述的本發明的組合物。本發明的一些實施方案中，該方法包括給予有需要的患者至少15mg番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、變異體和類似物。本發明的一些實施方案中，該方法包括飯前、飯后或飯中給予有需要的患者至少15mg番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、變異體和類似物。本發明的方法除了可用作治療目的外，還可用于預防或防護。因此，如本說明書所用的，術語“治療”等指現有的谷蛋白不耐受疾病、病癥或癥狀嚴重程度的任何減輕，特別是按如下癥狀嚴重程度進行測量，這些癥狀包括(但不限于)疲勞、慢性腹瀉、營養素吸收不良、體重減輕、腹脹和貧血。如本說明書所用的，術語“預防”等指防止谷蛋白不耐受性疾病、病癥或癥狀的發生。谷蛋白不耐受的其它指數包括(但不限于)谷蛋白特異性抗體的存在、組織轉谷氨酰胺酶特異性抗體的存在、促炎癥反應T細胞和細胞因子的存在、組織學或其它檢查證明的小腸絨毛結構的損傷、小腸滲透性的增加，等等。可受益于本發明方法的患者可以是任何年齡的患者，包括成人和兒童。兒童特別受益于預防療法，如預防早期暴露于谷蛋白毒性肽，可防止此病的初期發展。適合于預防處理的兒童，可用遺傳缺陷基因測試加以鑒定，例如，用組織相容性抗原分型、家族史、T細胞測定，或本領域技術人員已知的其它方法。在本發明的一個實施方案中，預防或治療的方法還包括對需要該處理的患者施用有效劑量的如本說明書所述的至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、 類似物或變異體。在另一個本發明實施方案中，預防或治療的方法還包括對需要該處理的患者施用有效劑量的菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述的其生物活性片段、類似物或變異體)、腸道提取物(如前文所述)或他們的組合。根據需要，可將番木瓜半胱氨酸蛋白酶與菠蘿蛋白酶
16和/或腸道提取物一起給藥，或以分開的劑量給藥。本發明的另一個方面，預防或治療的方法包括對需要該處理的患者施用包含編碼如本說明書所述重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的核酸序列的核酸分子。本發明的方法還可進一步包括對患者施用包含編碼重組菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述的其生物活性片段、類似物或變異體)的核酸序列的核酸分子。在本發明的還有一個方面，預防或治療的方法包括對需要該處理的患者施用可在患者身上表達如本說明書所述重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的宿主細胞。本發明的方法也可進一步包括對患者施用可表達重組菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述的其生物活性片段、類似物或變異體)的宿主細胞。按照本發明的方法也可與其它治療形式合用，包括(但不限于)對需要該處理的患者施用組織轉谷氨酰胺酶抑制劑、抗炎劑、抗潰瘍劑、肥大細胞穩定劑，和/或抗變態反應劑。這些藥劑的例子包括具有抗炎性的HMG-CoA還原酶抑制劑，如康帕丁、洛伐他丁、辛伐他丁、普伐他丁和阿托伐他丁 ；抗變應性的組胺Hl受體拮抗劑，如阿伐斯丁、西替利嗪、 地氯雷他定、依巴斯汀、非索非那定、左西替利嗪、氯雷他定和咪唑斯汀；白三烯受體拮抗劑，如孟魯司特和扎魯司特；環氧化酶2抑制劑，如塞來考昔和羅非考昔；p38MAP激酶抑制齊IJ，如BIRB-796 ；及肥大細胞穩定劑，如色甘酸鈉(chromolyn)、吡嘧司特、普昔羅米、瑞吡司特、四唑硫蒽酮、氨氯地平、奈多羅米和普克羅米。各種給藥方法都可以采用，較佳為采用口服給藥，例如與膳食合用。根據疾病的性質、給藥頻率、給藥方式、藥劑從宿主體內清除等各種因素，治療制劑的劑量可在很寬的范圍內變動。初始劑量可以較大，隨后用較小的維持劑量。劑量可按每周一次或兩周一次的低頻率給藥，或更經常地，分成較小的劑量每天隨膳食給藥，半周一次給藥，或按維持有效劑量水平所需的其它方式給藥。治療效應可按臨床結果或可用免疫學或生物化學試驗進行測定。通過測定損傷部位細胞因子的釋放的測量，或采用本領域已知的檢測自身免疫T細胞存在的其它試驗，對活性Thl細胞進行計數，可測定有害T細胞活性的抑制。另外，可根據疾病癥狀的嚴重程度的降低。食品的制備本發明的另一個方面，提供從含谷蛋白材料得到食品的制備方法，該方法包括用番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體處理食品或含谷蛋白材料，從而減少存在于食品中的來自谷蛋白的毒性寡肽的量。本發明的另一個方面，該方法進一步包括用菠蘿蛋白酶(或如本說明書所述的其生物活性片段、類似物或變異體)處理食品或含谷蛋白材料。對文獻、記錄、材料、裝置、物品等的討論包括在本說明書中，僅僅為了提供本發明背景材料的目的。它并不提示或代表這些內容的任何部分或全部形成現有技術基礎的一部分，或成為本申請每一權利要求優先權日前與本發明相關的領域中的普通常識。最后，應理解的是，可進行各種其它的變更和/或改變而不背離如此處概述的本發明的精神。按照本發明的某些實施方案，組合物及其在谷蛋白不耐受所致病癥的預防或治療上的應用在下面的實施例中加以描述。但是，應當理解，下面的描述只是用以說明本發明，而不應以任何方式作為對上面描述的本發明通用性的限制。
實施例MM番木瓜半胱氨酸蛋白酶粗品是從干燥的番木瓜乳膠(酶溶液)中提取(見實施例 2)。番木瓜乳膠是從番木瓜果實中分離得到的蛋白水解酶的食品級混合物。在兩個大鼠肝臟溶酶體(RLL)試驗中，采用通常量的麥醇溶蛋白消化物(本試驗中為5mg)，番木瓜半胱氨酸蛋白酶粗品提供了良好的保護作用，在濃度約10mg/ml時提供約92% -94%的保護作用。按例如Cornell&Townley(1973 ；Clinica Chimica Acta 49:181-188)和 Cornell&Townley(1974 ；Gut, 15(11) :862-869)中所描述的，大鼠肝臟溶酶體(RLL)試驗基于這樣的事實小麥醇溶蛋白的胃蛋白酶-胰蛋白酶-胰酶消化液破壞大鼠肝臟溶酶體，引起這些細胞器混懸液的光密度(于400nm)降低。這是存在于消化液中的肽的細胞毒反應的跡象。但是，如果將酶提取物與醇溶蛋白的毒性消化液預培育2個小時，則與溶酶體一起培育后光密度的變化就非常小。通過比較對照組(無毒性消化液)、毒性樣品(與醇溶蛋白毒性消化液一起培育的溶酶體)和提取物處理的樣品(在加入溶酶體前醇溶蛋白毒性消化液與酶提取物預培育)，可以測得保護的程度。保護指數(P. I.)可按如下公式計算
權利要求
1.一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物，該組合物包含至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體。
2.如權利要求1所述的組合物，包含占組合物總重量約5%w/w至約95% w/w的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體。
3.如權利要求1或2所述的組合物，其中所述番木瓜半胱氨酸蛋白酶得自番木瓜 (Carica papaya)0
4.如權利要求1-3之一所述的組合物，其中所述番木瓜半胱氨酸蛋白酶包含圖1或2 所示氨基酸序列或其生物活性片段、類似物或變異體。
5.如權利要求1-4之一所述的組合物，所述組合物包含腸道提取物。
6.如權利要求1-5之一所述的組合物，所述組合物包含菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體。
7.如權利要求1-6之一所述的組合物，所述組合物制劑成腸溶包衣片或膠囊。
8.一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物，該組合物包含編碼重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的核酸分子。
9.如權利要求8所述的組合物，其中所述核酸分子包括圖3或4所示核酸序列或其功能等同物。
10.如權利要求8所述的組合物，其中所述核酸分子編碼圖1或2所示氨基酸序列或其生物活性片段、類似物或變異體。
11.如權利要求8-10之一所述的組合物，所述組合物包含編碼重組菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的核酸分子。
12.一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的組合物，所述組合物包含一種宿主細胞，其中所述宿主細胞可表達重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體。
13.如權利要求12所述的組合物，所述組合物包含一種可表達重組菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的宿主細胞。
14.一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的方法，該方法包括對需要施用該方法的患者施用一種包含至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體的組合物。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述番木瓜半胱氨酸蛋白酶得自番木瓜(Carica papaya)0
16.如權利要求14或15所述的方法，其中所述番木瓜半胱氨酸蛋白酶包含圖1或2所示氨基酸序列或其生物活性片段、類似物或變異體。
17.如權利要求14-16之一所述的方法，包括對需要施用該方法的患者施用一種包含腸道提取物的組合物。
18.如權利要求14-17之一所述的方法，包括對需要施用該方法的患者施用一種包含菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的組合物。
19.如權利要求14-18之一所述的方法，其中所述組合物包括腸溶包衣片或膠囊。
20.如權利要求14-19之一所述的方法，其中所述組合物包含至少15mg番木瓜半胱氨酸蛋白酶。
21.一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的方法，該方法包括對需要施用該方法的患者施用一種如權利要求5或6所述的組合物。
22.一種用于預防或治療谷蛋白不耐受相關病癥的方法，該方法包括對需要施用該方法的患者施用一種核酸分子，其中所述核酸分子可在患者體內表達重組番木瓜半胱氨酸蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體。
23.如權利要求22所述的方法，其中所述核酸分子編碼如圖1或2所示氨基酸序列或其生物活性片段、類似物或變異體。
24.如權利要求22所述的方法，其中所述核酸分子包括圖3或4所示核酸序列或其功能等同物。
25.如權利要求22-M之一所述的方法，所述方法包括對需要施用該方法的患者施用一種編碼菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、類似物或變異體的核酸分子。
26.一種從來自含谷蛋白的材料制備食品的方法，該方法包括用番木瓜半胱氨酸蛋白酶(caricain)或其生物活性片段、類似物或變異體處理食品或含谷蛋白的材料，從而減少存在于食品中的源自谷蛋白的毒性寡肽的量。
27.如權利要求沈所述的方法，該方法進一步包括用菠蘿蛋白酶或其生物活性片段、 類似物或變異體處理食品或含谷蛋白的材料。
全文摘要
本發明提供一種用于預防或治療由谷蛋白不耐受引起的相關病癥的組合物，如說明書所述，這些組合物單獨包含至少部分純化的番木瓜半胱氨酸蛋白酶(或其生物活性片段、類似物或變異體)，或還混有其它合適的酶(包括菠蘿蛋白酶)和/或腸道提取物。本發明還提供用這樣的組合物預防或治療由谷蛋白不耐受引起的相關病癥的方法。
文檔編號A61K48/00GK102365112SQ201080009607
公開日2012年2月29日 申請日期2010年1月6日 優先權日2009年1月15日
發明者休·詹姆斯·貝蒂·科內爾, 特奧多爾·斯坦爾馬西克 申請人:澳大利亞格倫塔根有限公司