專利名稱：雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因的制作方法
雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因技術領域
本發(fā)明屬于生物基因工程技術領域，涉及雞α干擾素與白細胞介素2嵌合基因及 其構建、融合表達和純化技術。
背景技術：
我國是世界上養(yǎng)雞大國，雞的疾病種類繁多，特別是病毒性傳染病造成的發(fā)病率 和死亡率最高，每年給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且有些病毒性疾病(如高致病性禽 流感等)還關系到人類自身的健康。因此對這些病毒性疾病的治療和預防成為養(yǎng)雞業(yè)的首 要任務。
目前，尚無特效藥物可以治療病毒性疾病，盡管一些化學合成的抗病毒藥物如鹽 酸金剛烷胺、利巴偉林等對少數(shù)病毒病有一定的作用，但由于這些藥物在人醫(yī)上也廣泛應 用，為防止藥物殘留及耐藥菌株的產(chǎn)生，目前已禁止在獸醫(yī)臨床上應用；因此對病毒病的防 控主要靠疫苗免疫接種進行預防。但是由于病毒血清型眾多，毒株基因變異速度快，常常導 致疫苗免疫失?。涣硗?，新的病毒病也可能不斷產(chǎn)生，某些病毒病目前仍無疫苗可用；這些 因素往往造成病毒性傳染病流行趨勢擴大。
干擾素(interferon，IFN)是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫 激活功能活性的細胞因子，其抗病毒活性具有種屬特異性，其活性的發(fā)揮受細胞基因組的 調節(jié)與控制，并涉及RNA和蛋白質的合成。干擾素分為I型和II型兩大類，II型干擾素 只有IFN-Y，其主要作用是免疫調節(jié)作用；I型干擾素分為五個亞型種類，其中α干擾 素(IFN-α)主要由單核吞噬細胞、B細胞和成纖維細胞合成，是干擾素中最大的一個基 因家族。機體內產(chǎn)生的IFN-α是病毒誘導白細胞產(chǎn)生的，其主要作用有以下幾個方面 ①IFN-α通過誘導機體產(chǎn)生抗病毒蛋白而發(fā)揮廣譜的抑制病毒繁殖活性；②抑制細胞的 增殖(如腫瘤細胞等)從而發(fā)揮抗腫瘤活性作用；③加強NK細胞殺傷病毒感染細胞的能力 從而抑制病毒的增殖和擴散；④增強MHC I類抗原表達；調節(jié)T、B細胞功能以及許多免疫 反應，特別是增強機體細胞免疫應答水平。
白細胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)又稱T細胞生長因子，能誘導T淋巴細胞增 殖，增強細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的活性，刺激細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF- α )、IFN- γ 等細胞因子，促進機體的細胞免疫能力；同時也能激活B淋巴細胞，參與機體的體液免疫應 答，促進抗體分泌；IL-2還可增強巨噬細胞對抗原遞呈能力、殺菌力及細胞毒性，從而發(fā)揮 其抗病毒和抗腫瘤作用。因而，基因工程重組IL-2蛋白(rIL-幻制劑不僅可作為抗病毒性 疾病、自身免疫病與防治腫瘤方面的治療藥劑，而且還可作為佐劑增強疫苗的免疫效果，具 有廣闊的應用前景。
正常情況下，IFN-α、IL_2等細胞因子在動物體內的表達量較低且難以提取應用， 已有的采用體外抗原刺激動物白細胞使其產(chǎn)生IFN-α的方法得到的產(chǎn)品產(chǎn)量和活性都 低，且生產(chǎn)成本較高?；蚬こ苔粮蓴_素及IL-2具有廣譜的抗病毒活性和增強疫苗免疫 力作用，對細胞內寄生菌和寄生蟲等的增殖和活性也有一定的作用，而且不會產(chǎn)生耐藥性和殘留，不會對人類健康造成危害，因此一直是研究抗病毒制劑關注的焦點。rChIFN-α蛋 白對NDV、馬立克氏病毒及禽流感H9N2型病毒具有抑制作用，rChIL-2蛋白可調節(jié)機體免 疫功能，增強疫苗的免疫效果，并能明顯提高雞胚對IBDV、IBV強毒株攻毒的保護力。由于 IFN-α和IL-2都具有廣譜的抗病毒活性，因此將二者聯(lián)合應用可發(fā)揮更強的抗病毒作用， 可以對雞的病毒性疾病能起到很好的預防作用，目前尚未見此方面的相關報道。發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因構建、表達及其蛋白純化方 法，目的在于提供雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因，以得到抗病毒譜廣、抗病毒活性 高、生產(chǎn)成本低、易于生產(chǎn)、無殘留、不會使病原體產(chǎn)生耐藥性、具有ChIFN-α和ChIL-2抗 病毒功能疊加的高效基因工程復合抗病毒制劑，用于雞病毒性疾病的防治。
為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本研究采用重疊延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR, SOE-PCR)方法將ChIFN-α和ChIL_2成熟肽基因通過一個基因柔性接頭 (linker) (G4S)3構建成ChIFN-α -linker-ChIL-2嵌合基因，將嵌合基因連接入pQE30原核 表達載體進行融合表達，采用尿素溶解-低濃度蛋白復性液復性-PBS透析方法對融合蛋白 進行復性和純化，對純化后的融合蛋白進行細胞上和雞體內活性測定。
主要內容如下
1、雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因，其構建、表達及其蛋白純化
1. 1引物序列
共設計4條引物用于SOE-PCR的擴增，Ρ1/Ρ2引物對分別為擴增 ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因的ChIFN-α -linker部分所用上/下游引物；P3/P4引 物對分別為擴增ChIFN- α -linker-ChIL-2嵌合基因的linker+ChIL2部分所用上/下游引 物。引物核苷酸序列如下
Pl :tcagcatgcg cctgcaacca ccttcgcc 28
P2 :gccaccgcca gagccacctc cgcctgaacc gcctccacca gtgcgcgtgt tgcctgtg 58
P3 :ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg catctctatc atcagcaaa 59
P4:tacaagcttt ttttgcagat atctcacaaa g 31
1. 2 ChIFN-α-linker-ChIL-2 嵌合基因的構建
1. 2. 1 ChIFN-a -linker 基因片段的 PCR 擴增
采用P1/P2引物對，以含ChIFN- α基因的重組pQE_30質粒(rpQE-30/ChIFN- a ) 為模板，按照 TaKaRa 的 Pyrobest DNA Chlymerase 說明書進行 ChIFN-α -linker 基因 片段的PCR擴增。擴增產(chǎn)物3’端帶有39個核苷酸的linker序列，反應總體系為50 μ L， 其中 10XPCR Buffer 5 μ L, dNTP (2. 5mM each) 4 μ L, rpQE-30/ChIFN- α 質粒模板添加量Ρ1/Ρ2 引物各 50pmol，Pyrobest DNA Chlymerase 2. 5U，用滅菌雙蒸水補齊至 50 μ L0反應條件如下94°C預變性:3min，進入循環(huán)94°C變性lmin，64°C退火45s，72°C延 伸45s，進行5個循環(huán)；接著94°C lmin,65°C lmin,72°C lmin共進行30個循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin。利用低熔點瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收大小為529bp左右的PCR產(chǎn)物，利用紫 外-可見光分光光度計檢測回收的PCR產(chǎn)物的純度和含量。
1. 2. 2 linker-ChIL-2 基因片段的 PCR 擴增采用P3/P4引物對，以含ChIL-2基因的的重組pQE-30質粒(rpQE-30/ChIL_2) 為模板，按照TaKafci的Pyrobest DNA Chlymerase的說明書進行l(wèi)inker-ChIL-2基因片 段的擴增。PCR擴增產(chǎn)物5’端帶39個核苷酸的linker序列，反應總體系為50 μ L，其中 rpQE-30/ChIL-2 質粒添加量為 1 μ g，10 X PCR Buffer 5 μ L, dNTP (2. 5mM each) 4 μ L，P3/P4 引物各50pmol，Pyrobest DNA Chlymerase 2. 5U，用滅菌雙蒸水補齊至50 μ L。反應條件 如下94°C預變性3min，進入循環(huán)94°C變性lmin，64°C退火45s，72°C延伸45s，進行5個循 環(huán)；接著94°C lmin, 65°C 45s, 72°C 45s共進行30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。利用低 熔點瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收linker-ChIL-2基因片段的PCR產(chǎn)物(約40!3bp)，利用紫 外-可見光分光光度計檢測回收的PCR產(chǎn)物的純度和含量。
1. 2. 3 ChIFN- α -linker 與 linker-ChIL-2 基因片段的拼接
將回收的ChIFN- α -1 inker和1 inker-ChIL-2基因片段的PCR產(chǎn)物按質量比 1.2 1的比例混合后，取0.3yg混合物用作拼接模板，拼接反應體系中另加入IOXExTaq buffer (Mg2+ plus) 5 μ L ;2· 5mM dNTP 4 μ L，ExTaq 聚合酶 1. 25U,用無菌去離子水補至總體 系 50μ L。94°C預變性 anin，進入循環(huán)94°C變性 lmin，65°C退火 1. 5min，72°C延伸 1. 5min， 共進行20個循環(huán)。
1. 2. 4 ChIFN- α -linker-ChIL-2 嵌合基因的 PCR 擴增
利用P1/P4引物對、以上步的拼接反應產(chǎn)物為模板進行ChIFN- α -linker-ChIL-2 嵌合基因的PCR擴增，反應體系為50 μ L，其中上步的拼接反應產(chǎn)物2 μ L，Ρ1/Ρ4引物各 50pmol, IOXPyrobest Buffer 5μ L,2. 5mM dNTP 4 μ L, Pyrobest DNA Polymerase 2. 5U。 按以下條件進行PCR擴增，94°C預變性:3min，進入30個循環(huán)(94°C lmin，65°C lmin，72°C lmin)，最后72°C延伸lOmin。用低熔點瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收915bp左右的PCR產(chǎn)物， PCR產(chǎn)物兩端分別帶有Sph I和Hind III限制性內切酶位點。
1.3 ChIFN-a-linker-ChIL-2嵌合基因的克隆、測序與表達
將上步中回收的915bp左右的PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T fesy載體，篩選陽性 克隆質粒(pGEM-T/ChIFN-a-linker-ChIL-2)送大連(寶)生物工程有限公司自兩端 測序。陽性克隆質粒經(jīng)Sph I和Hind III雙酶切后粘端連接到經(jīng)相同酶雙切后的表 達載體PQE30，將構建好的重組pQE30/ChIFN- a -linker-ChIL-2表達質粒(rpQE30/ ChIFN-a-linker-ChIL-2)轉入宿主菌大腸桿菌(Ε. coli.) JM109中，篩選陽性重組菌送大 連(寶)生物工程技術公司測序。選取核苷酸序列和插入方向都正確的重組菌、JM109空 菌對照、PQE30/JM109空載體菌對照進行IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物，經(jīng)凝膠成 像系統(tǒng)薄層掃描分析表達蛋白的含量。
1. 4 重組 ChIFN- a -linker-ChIL-2 融合蛋白(rChlFN- a -linker-ChIL-2)的表 達和純化
具體方法見申請單位已申請專利，申請?zhí)?00910064233. 7。其核苷酸序列見序列 表NO. 1中所表述。
2、合成(G4S)3基因柔性接頭(linker)
設計并合成富含甘氨酸(G)和絲氨酸⑶的柔性接頭(&S)3，通過(QS)3基因柔 性linker連接的2個基因表達后各自的蛋白空間構象和活性不會相互影響，保證了表達后 融合蛋白的生物學活性，其核苷酸序列見序列表N0. 2。
本發(fā)明創(chuàng)新點及優(yōu)點1、通過采用基因柔性linker將雞α干擾素與白細胞介 素2基因構建成嵌合基因并對其進行表達、復性和純化從而得到在雞體內外具有α干擾 素和白細胞介素2抗病毒活性疊加的融合蛋白。2、設計合成了富含甘氨酸(G)和絲氨酸 (S)的柔性接頭(G4S)3,通過該Linker連接雞α干擾素與白細胞介素2基因，使表達后 各自的空間構向和活性不相互影響，保證了 Linker兩端所連接的基因表達蛋白的雙重活 性。3、采用“尿素溶解-低濃度蛋白復性液復性-PBS透析”進行融合蛋白的快速復性、純 化，免去過鎳鉻親合層析柱進行純化的步驟，得到的rChIFN-a-linker-ChIL-2融合蛋白 純度可達96%以上，大大簡化了操作過程，使基因工程重組雞α干擾素/白細胞介素2融 合蛋白可以商品化應用。4、該融合蛋白在細胞上、雞體內外均具有好的抗病毒活性，在雞 胚成纖維細胞(CEF)上具有抑制水泡性口炎病毒(VSV)和傳染性法氏囊病毒(IBDV)的增 殖活性；在雞胚上具有抑制新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV Η9Ν2)的增殖活性；在 雞體內具有顯著的抗NDV和IBDV活性和免疫增強活性。在體外具有促ConA刺激的雞T 淋巴細胞增殖活性，可以和抗ChIL-2單抗發(fā)生特異性免疫反應；從實驗數(shù)據(jù)上可以看出， rChIFN- α -linker-ChIL-2融合蛋白在細胞上、雞體內外的活性均具有ChIFN- α與ChIL_2 蛋白活性的疊加，其抗病毒活性優(yōu)于rChIFN-α蛋白。作為抗病毒制劑的主要成分，用于雞 病毒性疾病的預防和治療，對雞的病毒性疾病能起到很好的防治作用，高效、廣譜、安全、價 格低廉。
圖1 :S0E-PCR 擴增全長 ChIFN-α -linker-ChIL-2 嵌合基因圖；圖中 M. IOObp 梯度 DNA 分子量標記，1. ChIFN-α -linker 部分；2. linker-ChIL-2 部分； 3. ChIFN-α -linker-ChIL-2 嵌合基因；
圖2 =ChIFN- α -linker-ChIL-2的表達與純化SDS-PAGE電泳圖；圖中M.低分 子量蛋白Marker ；1. JM109誘導表達對照；2. pQE30空載體菌表達對照；3.含pQE_30/ ChIFN-a-linker-ChIL-2重組質粒的全菌誘導表達產(chǎn)物；4.包涵體沉淀；5.純化后的 rChIFN-a -linker-ChIL-2 蛋白；
圖3 :rChIFN_a -linker-ChIL-2蛋白促雞外圍血T淋巴細胞促增殖活性(MTS 法)；圖中，
權利要求
1. 一種雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因，其特征在于，其有如下DNA序列gcctgcaaccaccttcgcctccaggatgccaccttctctcacgacagcctccagctcctc60cgggacatggctcccacactaccccagctgtgcccacagcacaacgcgtcttgctccttc120aacgacaccatcctggacaccagcaacacccggcaagccg3. C 3.3.3.3. C C 3. Cccacgacatc180cttcagcacctcttcaaaatcctcagcagccccagcactccagcccactggaacgacagc240caacgccaaagcctcctcaaccggatccaccgctacacccagcacctcgagcaatgcttg300gacagcagcgacacgcgctcccggacgcgatggcctcgcaaccctcacctC 3. C C 3. C 3.3.3.360aaacacttcagctgcctccacaccttcctccaagacaacgattacagcgcctgcgcctgg420gaacacgtccgcctgcaagctcgtgcctggttcctgcacatccacaacctcacaggcaac480acgcgcactggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggcatct540ctatcatcagcaaaaaggaaacctcttcaaaggatttagaaatattggaa600aacatcaagaacaagattcatctcgagctc 3. C 3. C 3. C C 3.3.ctgagacccaggagtgcacc660cagcaaactctgcagtgttacctgggagaagtggttactctgaagaaagaaactgaagat720gacactgaaattaaagaagaatttgtaactgctattcaaaatatcgaaaagaacctcaag780agtcttacgggtctaaatcacaccggaagtgaatgcaagatctgtgaagctaacaacaag840ctgattttctccatgaactgaccatctttgtgagatatctgcaaaaa897。
2. 一種用于構建如權利要求1所述的雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因所用 物，其特征在于，其分別有如下DNA序列引物 Pl :tcagcatgcg cctgcaacca ccttcgcc 28引物P2 :gccaccgcca gagccacctc cgcctgaacc gcctccacca gtgcgcgtgt tgcctgtg 58 引物 P3 :ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt ggcggatcgg catctctatc atcagcaaa59引物 P4 :tacaagcttt ttttgcagat atctcacaaa g 310
3. 一種用于構建如權利要求1所述的雞α干擾素/白細胞介素2嵌合基因所用的基 因柔性接頭，其特征在于，其DNA序列如下ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45。
全文摘要
本發(fā)明屬生物基因工程技術領域，公開了一種雞α干擾素(ChIFN-α)/白細胞介素2(ChIL-2)嵌合基因。該技術采用重疊延伸PCR方法通過一基因柔性接頭(linker)(G4S)3將ChIFN-α與ChIL-2的成熟肽基因構建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy載體，將嵌合基因亞克隆入pQE-30表達載體中進行原核表達并對表達的重組融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)進行快速復性和純化。純化的rChIFN-α-linker-ChIL-2融合蛋白在細胞上、雞體內外的活性均具有ChIFN-α與ChIL-2蛋白活性的疊加，其抗病毒活性優(yōu)于rChIFN-α蛋白。作為抗病毒制劑的主要成分，用于雞病毒性疾病的預防和治療，高效、廣譜、安全、價格低廉。
文檔編號A61K38/21GK102041263SQ201019097009
公開日2011年5月4日 申請日期2010年2月8日 優(yōu)先權日2010年2月8日
發(fā)明者劉先敏, 劉光輝, 劉梅芬, 吳志明, 孫清蓮, 安春霞, 張健, 張志凌, 張盼盼, 李桂喜, 王東方, 盛敏, 程俊貞, 荊汝頂, 謝彩華, 錢勇, 閆若潛 申請人:河南省動物疫病預防控制中心