專利名稱：白頭翁提取物在制備抗血吸蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用與白頭翁提取物的制備方法及其制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥、獸藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種白頭翁在制備抗血吸蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用， 本發(fā)明還提供白頭翁提取物的制備方法及其制劑的制備方法，該有效組分具有顯著的抗血 吸蟲(chóng)活性，可以用于人或其它哺乳動(dòng)物血吸蟲(chóng)病的預(yù)防治療。
背景技術(shù)：
白頭翁藥材取自毛茛科白頭翁屬植物白頭翁(Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel)的干燥根，味苦，性寒。歸胃、大腸經(jīng)，具清熱解毒，涼血止痢之功。用于熱毒血痢， 陰癢帶下，阿米巴痢。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白頭翁中含原白頭翁素(Protoanemonin)、白頭翁素 (Anemonin)、白頭翁靈(Okinalin，C32H4602)、白頭翁英(Okinalein，C4H602)等，近年來(lái)國(guó) 內(nèi)外學(xué)者從白頭翁屬植物中分離鑒定出幾十種五環(huán)三萜皂苷成分，這些皂苷主要為齊墩果 烷型和羽扇豆烷型兩種。白頭翁屬植物具有廣泛的藥理及生物活性，主要表現(xiàn)在抗腫瘤、抗 炎抗菌、抗病毒、細(xì)胞凋亡、抗生物酶、殺蟲(chóng)、殺精等作用。蘭繼毓等研究發(fā)現(xiàn)白頭翁煎劑對(duì) 殺滅溶組織內(nèi)阿米巴的效果較好。經(jīng)檢索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)白頭翁藥材及其有效組分具有抗血吸 蟲(chóng)活性的文獻(xiàn)報(bào)道。經(jīng)過(guò)反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)白頭翁水提液及醇提液均具有較強(qiáng)的抗血吸蟲(chóng)活性，經(jīng)過(guò)了系 統(tǒng)研究，準(zhǔn)備開(kāi)發(fā)以白頭翁有效組分為主要成分，用于預(yù)防或治療人或其它哺乳動(dòng)物血吸 蟲(chóng)病的藥物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種白頭翁在制備抗血吸蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供白頭翁提取 物的制備方法及其制劑的制備方法，白頭翁提取物具有顯著的抗血吸蟲(chóng)活性，可以用于人 或其它哺乳動(dòng)物血吸蟲(chóng)病的預(yù)防治療。白頭翁提取物中的白頭翁活性組分中皂苷類成分含量為70%以上。本發(fā)明中皂苷類成分含量的測(cè)定方法1、常春藤皂苷元對(duì)照品溶液的制備精密稱取常春藤皂苷元對(duì)照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成 0. lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，冷藏保存?zhèn)溆谩?、常春藤皂苷元最大吸收波長(zhǎng)的確定精密吸取對(duì)照品溶液1ml，2份(一份做空白，一份做顯色)，加入標(biāo)號(hào)的干燥的具 塞試管中，于60攝氏度真空干燥箱中揮干，空白組加入5ml的甲醇，顯色組加入5ml的高氯 酸，搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng)完全后立即置冰水浴中 冷卻15min，隨行試劑為空白，于島津UV-2550紫外分光光度計(jì)，在200 700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi) 進(jìn)行掃描。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液在310nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為 310nmo
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取對(duì)照品溶液0. 3，0. 6，0. 9，1. 2，1. 5，1. 8mL各2份(一份做空白，一份做 顯色)，轉(zhuǎn)移至IOmL的具塞試管中，于60攝氏度真空干燥箱中揮干，空白組加入5ml的甲 醇，顯色組加入5ml的高氯酸，搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反 應(yīng)完全后立即置冰水浴中冷卻15min，隨行試劑為空白，于島津UV-2550紫外分光光度計(jì)， 在200-500nm波長(zhǎng)掃描，在310nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，常春藤皂苷元對(duì) 照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸收度A對(duì)濃度C作最小二乘法回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方 程為:C = 0. 022A+0. 045，R2 = 0. 999 (η = 4)，線性范圍為 7. 0 ；34. 3 μ g/mL,質(zhì)量濃度與 吸收度值的線性關(guān)系良好。4、樣品中皂苷類成分含量測(cè)定方法取白頭翁藥材適量，粉碎，稱取藥材34. 90g，用10倍量70%乙醇(即350ml)，提 取2次，每次1. 5小時(shí)，所得溶液用中速濾紙過(guò)濾，濃縮至IOOml以下，轉(zhuǎn)移至IOOml的容量 瓶，定容至刻度，即得0. 349g/ml的白頭翁提取物；移取白頭翁提取液1ml，轉(zhuǎn)移至250ml的 容量瓶中，定容至刻度，即得1. 396mg/ml的白頭翁供試品溶液。精密吸取供試品溶液1ml， 2份(一份做空白，一份做顯色)，加入標(biāo)號(hào)的干燥的具塞試管中，于60攝氏度真空干燥箱 中揮干，空白組加入5ml的甲醇，顯色組加入5ml的高氯酸，搖勻，顯色組于70攝氏度水浴 中反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng)完全后立即置冰水浴中冷卻15min，隨行試劑為空白，于島 津UV-2550紫外分光光度計(jì)，在200-500nm波長(zhǎng)掃描，在310nm處測(cè)定其吸收度。由標(biāo)準(zhǔn)曲 線求得白頭翁有效組分樣品中總皂苷濃度并計(jì)算含量。白頭翁提取物的制備方法，將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用10-95 %乙醇浸泡 0. 5-2h,6-12倍量加熱回流提取2-3次，每次l_3h，過(guò)濾，合并濾液；上述濾液于50-70°C 減壓濃縮至0. 5-1. Og生藥材/mL，0-4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，有機(jī)溶劑萃取，回收有機(jī)溶 劑，殘留物用適量水溶解，濾過(guò)，濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，上樣后依次用6-12倍量蒸餾水、 20-40%乙醇洗脫，50-80%乙醇洗脫，洗脫流速為1. 0-2. Oml/min,收集50-80%乙醇洗脫 液；上述乙醇洗脫液于50-70°C減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濃縮液0-4°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液中 加入生藥量5-15 %的聚酰胺，攪拌0. 5-4h，靜置4-12h，濾過(guò)，濾液中再加入活性炭，攪拌 0. 5-4h，靜置4-12h，濾過(guò)，濾液用噴霧干燥法進(jìn)行干燥，收集噴干粉，即得白頭翁活性組分。 其中大孔樹(shù)脂可以選擇各種型號(hào)的皂苷類吸附樹(shù)脂，包括D4020型、NKA-9型、AB-8型、ZTC 型、DlOl型及ADS-F8型，優(yōu)選DlOl型和DlOlC型大孔樹(shù)脂。本發(fā)明白頭翁提取物可以用于制備人或其它哺乳動(dòng)物血吸蟲(chóng)病的預(yù)防治療，該有 效組分可以作為活性成分與藥物載體配制成藥劑學(xué)上的各種制劑，白頭翁有效組分在制劑 中的分散狀態(tài)可以是液體，也可以是固體，該制劑的給藥途徑可以是口服、注射和局部給藥。白頭翁抗腫瘤活性組分中化學(xué)成分的HPLC標(biāo)定1、混合對(duì)照品溶液的制備將15種皂苷類成分對(duì)照品，精密稱定各約10 20mg， 分別置于5mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，作為儲(chǔ)備液，精密量取各儲(chǔ)備液2mL，分別 置于25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，作為每種對(duì)照品溶液；精密量取各儲(chǔ)備液2mL， 置于同一個(gè)25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，作為15種對(duì)照品溶液。2、供試品溶液的制備取白頭翁抗腫瘤活性組分粉末約50mg，精密稱定，置于50mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，濾過(guò)，取續(xù)濾液IOmL作為供試品溶液。3、色譜條件色譜柱Diamonsil C18 色譜柱 6mmX 250mm，5 μ m)；流動(dòng)相 甲醇-水梯度洗脫(甲醇=Omin為50%，90min為80%，120min為80 % ) ；UV檢測(cè)波長(zhǎng) 203nm，流速1. OmL/min ；柱溫35°C ；進(jìn)樣量 20ml ；ELSD 檢測(cè)器SHIMADZU ELSD-LT II型 檢測(cè)器；檢測(cè)溫度40°C ；ELSD載氣高純氮?dú)廨d氣壓力0. 35MPa。15種對(duì)照品溶液液 相色譜圖(圖1)和供試品溶液的液相色譜圖(圖2)其中1為3-0-a-L-吡喃鼠李糖 基-(1 — 2) - α -L-吡喃阿拉伯糖春藤皂苷元28-0- α -L-吡喃鼠李糖-(1 — 4) - β -D-吡 喃葡萄糖-(1 — 6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，2為白頭翁苷皂Ε，3為3-0-α-L-吡喃鼠李 糖-(1 — 2) - α -L-吡喃阿拉伯糖-3 β -羥基-20⑵)_烯_羽扇豆烷-28-0- α -L-吡喃鼠李 糖-(1 — 4) - β -D-喃葡萄糖-(1 — 6) - β -D-吡喃葡萄糖酯苷，4為齊墩果酸-3-0- β -D-吡 喃葡萄糖-(1 — 4) - β -D-吡喃葡萄糖-(1 — 3) - α -L-吡喃鼠李糖-(1 — 2) - α -L-吡喃 阿拉伯糖苷，5為白頭翁皂苷B，6為齊墩果酸-3-0- β -D-吡喃葡萄糖-(1 — 4) - β -D-吡喃 葡萄糖-(1 — 3)-a-L-吡喃鼠李糖-(1 — 2)-β-D-吡喃葡萄糖-(1 — 4) - α-L-吡喃阿 拉伯糖苷，7為白頭翁皂苷Β4，8為3-0- α -L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元觀-0_ α -L-吡 喃鼠李糖-(1 — 4) - β -D-吡喃葡萄糖-(1 — 6) - β -D-吡喃葡萄糖苷，9為常春藤皂苷元 28-0- α -L-吡喃鼠李糖-(1 — 4) - β -D-吡喃葡萄糖-(1 — 6) - β -D-吡喃葡萄糖苷，10為 3 β ,23- 二羥基羽扇豆烷-Δ 20 (29)烯-28-0- α -L-吡喃鼠李糖-(1 — 4) - β -D-吡喃葡萄 糖-(1 — 6)-β -D-吡喃葡萄糖苷，11為白頭翁皂苷B，12為常春藤皂苷元-3-0-β -D-吡 喃葡萄糖-(1 — 3)-a-L-吡喃鼠李糖-(1 — 2)-a-L-吡喃阿拉伯糖苷，13為常春藤皂苷 元-3-0- α -L-吡喃鼠李糖-(1 — 2) - β -D-吡喃葡萄糖-(1 — 4) - α -L-吡喃阿拉伯糖苷， 14為齊墩果酸-3-0- α -L-吡喃阿拉伯糖-(1 — 3) - [ α -L-吡喃鼠李糖-(1 — 2) ] - β -D-吡 喃阿拉伯糖苷，15為常春藤皂苷元-3-0-α -L-吡喃阿拉伯糖-(1 — 3)-[ α _L_吡喃鼠李糖 基-(1 — 2)]-β -D-吡喃阿拉伯糖苷。
圖1. 15種皂苷對(duì)照品液相色譜圖；圖2.供試品溶液液相色譜圖。
具體實(shí)施例實(shí)施例1、白頭翁提取物的制備方法，其中將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用50%乙 醇浸泡0. 5h，12倍量加熱回流提取3次，每次1. 5h,過(guò)濾，合并濾液。上述濾液于70°C減壓 濃縮至l.Og生藥材/mL，0-4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液再用正丁醇萃取，減壓回收正丁 醇，殘留物用水溶解并稀釋至濃度為1. Og生藥材/mL，濾過(guò)，濾液上DlOl大孔吸附樹(shù)脂柱， 上樣量為40mg總皂苷/g濕樹(shù)脂，上樣液總皂苷濃度10mg/ml、上樣流速1. Oml/min、上樣液 PH值為7. 0，上樣后依次用12倍量蒸餾水、30%乙醇洗脫，60%乙醇洗脫洗脫流速為1. 5ml/ min，收集60%乙醇洗脫液。上述洗脫液于70°C減壓濃縮至無(wú)乙醇味(相對(duì)密度為1. 07g/ ml (50 60°C ))，濃縮液0-4°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液中加入生藥量5%的聚酰胺，攪拌2h， 靜置12h，濾過(guò)，濾液中再加入生藥量2 %的活性炭，攪拌池，靜置12h，濾過(guò)，濾液用噴霧干 燥法進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為140°C，出風(fēng)溫度為90°C，收集噴干粉，即得。經(jīng)BTS皂苷檢測(cè)法檢測(cè)，總皂苷含量為74%。實(shí)施例2、白頭翁提取物的制備方法，其中將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用50%乙 醇浸泡0. 5h，12倍量加熱回流提取3次，每次1. 5h,過(guò)濾，合并濾液。上述濾液于70°C減壓 濃縮至1. Og生藥材/mL，0-4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液再用正丁醇萃取，減壓回收正丁 醇，殘留物用水溶解并稀釋至濃度為1. Og生藥材/mL，濾過(guò)，濾液上AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱， 上樣量為40mg總皂苷/g濕樹(shù)脂，上樣液總皂苷濃度10mg/ml、上樣流速1. Oml/min、上樣液 PH值為7. 0，上樣后依次用12倍量蒸餾水、20%乙醇洗脫，60%乙醇洗脫洗脫流速為1. 5ml/ min，收集60%乙醇洗脫液。上述洗脫液于70°C減壓濃縮至無(wú)乙醇味(相對(duì)密度為1. 07g/ ml (50 60°C ))，濃縮液0-4°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液中加入生藥量5%的聚酰胺，攪拌2h， 靜置12h，濾過(guò)，濾液中再加入生藥量2%的活性炭，攪拌池，靜置12h，濾過(guò)，濾液用噴霧干 燥法進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為140°C，出風(fēng)溫度為90°C，收集噴干粉，即得。經(jīng)BTS皂苷檢測(cè)法 檢測(cè)，總皂苷含量為78%。其余同實(shí)施例1。實(shí)施例3 白頭翁提取物的制備方法，其中將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用50%乙 醇浸泡0. 5h，12倍量加熱回流提取3次，每次1. 5h,過(guò)濾，合并濾液。上述濾液于70°C減壓 濃縮至1. Og生藥材/mL，0-4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液上HPD-450大孔吸附樹(shù)脂柱，上樣 量為40mg總皂苷/g濕樹(shù)脂，上樣液總皂苷濃度10mg/ml、上樣流速1. Oml/min、上樣液pH 值為7.0，上樣后依次用12倍量蒸餾水、20%乙醇洗脫，60%乙醇洗脫洗脫流速為1.5ml/ min，收集60%乙醇洗脫液。上述洗脫液于70°C減壓濃縮至無(wú)乙醇味(相對(duì)密度為1. 07g/ ml (50 60°C ))，濃縮液0-4°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液中加入生藥量5%的聚酰胺，攪拌2h， 靜置12h，濾過(guò)，濾液中再加入生藥量2 %的活性炭，攪拌池，靜置12h，濾過(guò)，濾液用噴霧干 燥法進(jìn)行干燥，進(jìn)風(fēng)溫度為140°C，出風(fēng)溫度為90°C，收集噴干粉，即得。經(jīng)BTS皂苷檢測(cè)法 檢測(cè)，總皂苷含量為80%。其余同實(shí)施例1。實(shí)施例4、白頭翁提取物的制備方法，其中將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用10%乙 醇浸泡0. 5h, 6倍量加熱回流提取2次，每次lh，過(guò)濾，合并濾液；上述濾液于50°C減壓濃縮 至0. 5g生藥材/mL，0°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液再用正丁醇有機(jī)溶劑萃取，回收有機(jī)溶 劑，殘留物用適量水溶解，濾過(guò)，濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，上樣后依次用6倍量蒸餾水、20% 乙醇洗脫，50 %乙醇洗脫，洗脫流速為1. Oml/min,收集50 %乙醇洗脫液；上述乙醇洗脫液 于50°C減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濃縮液0°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液中加入生藥量5%的聚酰胺， 攪拌0. 5h,靜置4h，濾過(guò)，濾液中再加入活性炭，攪拌0. 5h,靜置4h，濾過(guò)，濾液用噴霧干燥 法進(jìn)行干燥，收集噴干粉，即得白頭翁活性組分。經(jīng)BTS皂苷檢測(cè)法檢測(cè)，總皂苷含量為 82%。其余同實(shí)施例1。實(shí)施例5、白頭翁提取物的制備方法，其中將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用95%乙 醇浸泡2h，12倍量加熱回流提取3次，每次3h，過(guò)濾，合并濾液；上述濾液于70°C減壓濃 縮至1. Og生藥材/mL，4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液再用正丁醇有機(jī)溶劑萃取，回收有機(jī) 溶劑，殘留物用適量水溶解，濾過(guò)，濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，上樣后依次用12倍量蒸餾水、 40 %乙醇洗脫，70 %乙醇洗脫，洗脫流速為2. Oml/min,收集70 %乙醇洗脫液；上述乙醇洗 脫液于70°C減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濃縮液4°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液中加入生藥量15%的聚 酰胺，攪拌4h，靜置12h，濾過(guò)，濾液中再加入活性炭，攪拌4h，靜置12h，濾過(guò)，濾液用噴霧干 燥法進(jìn)行干燥，收集噴干粉，即得白頭翁活性組分。經(jīng)BTS皂苷檢測(cè)法檢測(cè)，總皂苷含量為77%。其余同實(shí)施例1。實(shí)施例6、白頭翁提取物的制備方法，其中將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用50%乙 醇浸泡lh，8倍量加熱回流提取2. 5次，每次池，過(guò)濾，合并濾液；上述濾液于60°C減壓濃縮 至0. 7g生藥材/mL，3°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液再用正丁醇有機(jī)溶劑萃取，回收有機(jī)溶 劑，殘留物用適量水溶解，濾過(guò)，濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，上樣后依次用8倍量蒸餾水、30% 乙醇洗脫，60%乙醇洗脫，洗脫流速為1.5ml/min，收集60%乙醇洗脫液；上述乙醇洗脫液 于60°C減壓濃縮至無(wú)乙醇味，濃縮液3°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，濾液中加入生藥量10%的聚酰 胺，攪拌池，靜置他，濾過(guò)，濾液中再加入活性炭，攪拌池，靜置他，濾過(guò)，濾液用噴霧干燥法 進(jìn)行干燥，收集噴干粉，即得白頭翁活性組分。經(jīng)BTS皂苷檢測(cè)法檢測(cè)，總皂苷含量為75%。 其余同實(shí)施例1。實(shí)施例7、白頭翁提取物的制備方法，其中所述的大孔吸附樹(shù)脂可以是D4020型、 NKA-9型、AB-8型、ZTC型、HPD型、DlOl型、DlOlC型及ADS-F8型吸附樹(shù)脂中的一種或兩種 以上。其余同實(shí)施例1、2、3、4、5、6中的任意一項(xiàng)。實(shí)施例8、白頭翁提取物的制備方法，其中所述的大孔吸附樹(shù)脂可以是優(yōu)選DlOl 型和DlOlC型大孔吸附樹(shù)脂。其余同實(shí)施例4、5、6中的任意一項(xiàng)。實(shí)施例9、白頭翁提取物在制備抗血吸蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用，其中白頭翁提取物中皂 苷類成分含量為70%以上。其余同實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8中的任意一項(xiàng)。實(shí)施例10、白頭翁提取物制成的制劑，其中該白頭翁提取物與藥物輔料配制成 藥劑學(xué)上的各種制劑。其余同實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8中的任意一項(xiàng)。實(shí)施例11、白頭翁提取物制成的制劑，其中該白頭翁活性組分在制劑中的分散 狀態(tài)可以是液體，也可以是固體。其余同實(shí)施例10。實(shí)施例12、白頭翁提取物，其中該制劑的給藥途徑可以是口服、注射和局部給 藥。其余同實(shí)施例10。實(shí)施例13、用本發(fā)明實(shí)施例1或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?實(shí)施 例6或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?的方法制備的白頭翁提取物為原料，進(jìn)行下列制劑制備1、片劑制備處方(50片)成分重量(g)本發(fā)明提取物5.0乳糖4. 8糊精9微晶纖維素6硬脂酸鎂0. 2按照常規(guī)片劑的操作方法，以上混合均勻，濕法制粒，最后加入硬脂酸鎂混合均勻 壓制成每片500mg。2、膠囊制備處方(90粒)成分重量(g)本發(fā)明提取物8
乳糖5
糊精9
微晶纖維素5
按照常規(guī)片劑的操作方法，以上混合均勻，濕法制粒，灌裝成膠囊，每粒300mg。
3、巴布劑制備
處方
成分重量(g)
本發(fā)明提取物2
聚丙烯酸酯18
月桂氮卓酮0. 6
月桂酸1. 8
丙二醇5. 4
乙酸乙酯15
按照通常巴布劑的做作進(jìn)行，將上述攪拌均勻，涂布于聚酯防粘層上，60度干燥2分鐘后，覆蓋聚氨基甲酯膜背襯層，切片即可。
4、粉針劑制備
處方
成分重量(g)
本發(fā)明提取物0. 05鹽酸適量甘露醇50按照常規(guī)凍干粉針的操作進(jìn)行，將本發(fā)明有效組分加適量注射用水溶解，加入甘 露醇，定容至1000ml，調(diào)節(jié)PH值至4. 0-5. 5之間，除菌過(guò)濾，冷凍干燥即得。5、水針劑的制備白頭翁提取物，溶于適量注射用水中，加入計(jì)量的注射用水溶性輔料，加 0. 1-0. 5 %的活性炭除去熱原，調(diào)節(jié)PH至6. 0-7. 5，經(jīng)微孔濾膜超濾后，補(bǔ)充注射用水至規(guī) 定量，灌裝于安瓿瓶中或輸液瓶中，熔封/軋蓋，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包裝即得。6、滴丸劑制備處方成分重量(g)本發(fā)明提取物0. Ig聚乙二醇6000IOg聚乙二醇400020g聚山梨酯800. 3g乙醇Iml制成1000 丸 制法將本發(fā)明提取物解于乙醇中充分溶解，成為白頭翁抗血吸蟲(chóng)活性部位分散 乙醇液，加入已熔融的聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚山梨酯80組成的基質(zhì)中，充分?jǐn)嚢?至均勻，以二甲基硅油為冷卻劑，15°C下滴制成丸，擦丸，干燥，即得。
7、溶液劑制備處方成分重量(g)本發(fā)明提取物10.0蒸餾水IOOOml防腐劑適量按照常規(guī)溶液劑的操作進(jìn)行，將本發(fā)明提取物加適量蒸餾水溶解，加入防腐劑，定 容至1000ml，4°C冷藏過(guò)夜，濾過(guò)，即得。實(shí)施例14、用本發(fā)明實(shí)施例1中的方法制備的活性組分為原料，進(jìn)行抗血吸蟲(chóng)活 性組分藥效學(xué)研究。1.體外對(duì)血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)雌雄合抱體的殺滅作用取白頭翁提取物(BTQ適量，加入蒸餾水配置成不同濃度的待試品溶液，備用。取 成蟲(chóng)雌雄合抱體適量，無(wú)菌灌注沖蟲(chóng)后，按成蟲(chóng)雌雄合抱體培養(yǎng)條件，加入2ml培養(yǎng)液體外 培養(yǎng)，并每皿加入62. 5ug/ml BTS藥液0.02ml。一天后觀察雌雄解離，蟲(chóng)體死亡。未加藥組 正常，雌雄合抱，活力正常。2.體內(nèi)對(duì)血吸蟲(chóng)的殺滅作用取昆明種小鼠，每只小鼠感染80條尾蚴，20天后以不同濃度^ng/ml，lmg/ml， 0. 5mg/ml，0. 25mg/ml，0. 125mg/ml)BTS藥液連續(xù)灌胃五天，每次lml。42天后剖殺。與青 蒿琥脂組劑量(300mg/kg，一次灌服)比較其中2mg/ml濃度BTS組效果明顯優(yōu)于青蒿琥脂 組。肝臟病變?nèi)庋塾^察質(zhì)軟，粟粒結(jié)節(jié)較少。取昆明種小鼠，每只小鼠感染80條尾蚴，22天后以不同濃度^ng/ml，lmg/ml， 0. 5mg/ml，0. 25mg/ml，0. 125mg/ml)BTS藥液連續(xù)灌胃五天，每次lml。藥物對(duì)照組用吡喹 酮。42天后剖殺，結(jié)果表明BTS具有明顯的抗血吸蟲(chóng)活性。3.體外對(duì)血吸蟲(chóng)尾蚴的殺滅作用取白頭翁提取物BTQ適量，加入蒸餾水配置成不同濃度的待試品溶液，分別加入 M孔板，對(duì)照加入脫氯水，加入活尾蚴過(guò)夜觀察。結(jié)果表明BTS對(duì)血吸蟲(chóng)尾蚴.的最低殺滅 濃度達(dá)到0.031ug/ml。4.體外對(duì)血吸蟲(chóng)毛蚴的殺滅作用取白頭翁提取物(BTQ適量，加入蒸餾水配置成不同濃度的待試品溶液，分別加 入M孔板，對(duì)照加入脫氯水，加入活毛蚴過(guò)夜觀察。結(jié)果表明BTS對(duì)血吸蟲(chóng)毛蚴.的最低 殺滅濃度達(dá)到0.031ug/ml。5.體外對(duì)血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的殺滅作用取感染42天后的老鼠肝臟，勻漿后1. 2%鹽水經(jīng)不同目數(shù)篩網(wǎng)過(guò)濾，取卵加入EP 管離心，加入不同濃度的BTS藥液，放置一天，對(duì)照組加入脫氯水。離心后，用脫氯水迅速洗 滌。將洗滌后的蟲(chóng)卵加入脫氯水混勻25°孵育一小時(shí)觀察是否有毛蚴孵出。一天后再繼續(xù) 觀察是否有毛蚴孵出。結(jié)果表明BTS對(duì)血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵.的最低殺滅濃度達(dá)到0. 03lug/ml06.體外對(duì)釘螺的殺滅作用取白頭翁提取物(BTQ適量，加入蒸餾水配置成不同濃度的待試品溶液，加入大 試管，每管放入釘螺二十只，管口在液面下一厘米處放入篩網(wǎng)防釘螺爬出，分別在對(duì)，48， 72hr后取出，脫氯水清洗后觀察活釘螺數(shù)。結(jié)果表明BTS對(duì)血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵.的最低殺滅濃度 達(dá)到 0. 03lug/ml。
7.體外對(duì)魚(yú)類的毒性取白頭翁提取物(BTQ適量，加入湖水配置成不同濃度的待試品溶液，將鯽魚(yú)、鱔 魚(yú)、黑魚(yú)(每種3-5條)等常見(jiàn)魚(yú)類加入其中養(yǎng)殖，M小時(shí)后，觀察魚(yú)類的活動(dòng)情況，結(jié)果表 明0. lmg/mL濃度條件下對(duì)上述幾種魚(yú)類的活動(dòng)沒(méi)有明顯影響。8.半數(shù)致死量采用抗血吸蟲(chóng)的白頭翁提取物的粉末，用蒸餾水配制成所需濃度的溶液，采用清 潔級(jí)小鼠，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明白頭翁有效組分口服時(shí) 的半數(shù)致死量為3. 56g/kg(n = 20)，腹腔注射時(shí)的半數(shù)致死量為0. 165g/kg(n = 20)。實(shí)施例15、采用實(shí)施例2或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?實(shí)施例6或?qū)嵤├? 或?qū)嵤├?的方法制備的白頭翁提取物進(jìn)行抗血吸蟲(chóng)藥效學(xué)研究，效果與實(shí)施例14類似。實(shí)施例16、采用實(shí)施例2或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?或?qū)嵤├?實(shí)施例6或?qū)嵤├? 或?qū)嵤├?的方法制備的白頭翁提取物與藥物輔料配制成藥劑學(xué)上的各種制劑。實(shí)施例17、采用實(shí)施例16所述的白頭翁提取物制成的制劑，其中白頭翁提取物 作為抗血吸蟲(chóng)活性組分在制劑中的分散狀態(tài)可以是液體，也可以是固體。實(shí)施例18、根據(jù)實(shí)施例4或5或6或9所述的白頭翁提取物制成的制劑，其中白 頭翁提取物作為抗血吸蟲(chóng)活性組分制成的制劑的給藥途徑可以是噴灑、口服、注射和局部 給藥。實(shí)施例19、根據(jù)實(shí)施例4或5或6或7或8所述的任意一種白頭翁提取物作為抗 血吸蟲(chóng)活性組分，其中白頭翁提取物作為抗血吸蟲(chóng)活性組分可以用于制備人或其它哺乳 動(dòng)物血吸蟲(chóng)病的預(yù)防或治療藥物。
權(quán)利要求
1.白頭翁提取物的制備方法，其特征在于將白頭翁藥材粉碎成粗粉，經(jīng)過(guò)提純后獲 得的白頭翁抗血吸蟲(chóng)活性組分中皂苷類成分含量為70%以上；預(yù)知子抗血吸蟲(chóng)活性組分 中皂苷類成分含量的測(cè)定方法如下A、常春藤皂苷元對(duì)照品溶液的制備精密稱取常春藤皂苷元對(duì)照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0. lmg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，冷藏保存?zhèn)溆?。B、常春藤皂苷元最大吸收波長(zhǎng)的確定精密吸取對(duì)照品溶液lml，2份(一份做空白，一份做顯色)，加入標(biāo)號(hào)的干燥的具塞試 管中，于60攝氏度真空干燥箱中揮干，空白組加入5ml的甲醇，顯色組加入5ml的高氯酸， 搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng)完全后立即置冰水浴中冷 卻15min，隨行試劑為空白，于島津UV-2550紫外分光光度計(jì)，在200 700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi) 進(jìn)行掃描。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液在310nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為 310nmoC、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取對(duì)照品溶液0. 3,0. 6,0. 9，1. 2，1. 5，1. 8mL各2份(一份做空白，一份做顯 色)，轉(zhuǎn)移至IOmL的具塞試管中，于60攝氏度真空干燥箱中揮干，空白組加入5ml的甲醇， 顯色組加入5ml的高氯酸，搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng) 完全后立即置冰水浴中冷卻15min，隨行試劑為空白，于島津UV-2550紫外分光光度計(jì)，在 200-500nm波長(zhǎng)掃描，在310nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，常春藤皂苷元對(duì)照 品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸收度A對(duì)濃度C作最小二乘法回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 為C = 0. 022A+0. 045，R2 = 0. 999 (n = 4)，線性范圍為 7. 0 34. 3 μ g/mL,質(zhì)量濃度與吸 收度值的線性關(guān)系良好。D、樣品中皂苷類成分含量測(cè)定方法取白頭翁藥材適量，粉碎，稱取藥材:34.90g，用10倍量70%乙醇(即350ml)，提取2 次，每次1. 5小時(shí)，所得溶液用中速濾紙過(guò)濾，濃縮至IOOml以下，轉(zhuǎn)移至IOOml的容量瓶， 定容至刻度，即得0. 349g/ml的白頭翁提取物；移取白頭翁提取液1ml，轉(zhuǎn)移至250ml的容 量瓶中，定容至刻度，即得1. 396mg/ml的白頭翁供試品溶液。精密吸取供試品溶液lml，2 份(一份做空白，一份做顯色)，加入標(biāo)號(hào)的干燥的具塞試管中，于60攝氏度真空干燥箱中 揮干，空白組加入5ml的甲醇，顯色組加入5ml的高氯酸，搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中 反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng)完全后立即置冰水浴中冷卻15min，隨行試劑為空白，于島津 UV-2550紫外分光光度計(jì)，在200-500nm波長(zhǎng)掃描，在310nm處測(cè)定其吸收度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線 求得白頭翁有效組分樣品中總皂苷濃度并計(jì)算含量。
2.白頭翁提取物的制備方法，其特征在于將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用10-95%乙 醇浸泡0. 5-2h,6-12倍量加熱回流提取2-3次，每次l_3h，過(guò)濾，合并濾液。上述濾液于 50-70°C減壓濃縮至0. 5-1. Og生藥材/mL，0-4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液上大孔吸附樹(shù) 脂柱，收集50-80%乙醇洗脫液，脫色，回收溶劑，用噴霧干燥法、真空微波干燥法或其它方 法進(jìn)行干燥，收集干浸膏或噴干粉，即得白頭翁提取物，白頭翁抗血吸蟲(chóng)活性組分中皂苷類 成分含量為70%以上，白頭翁抗血吸蟲(chóng)活性組分中皂苷類成分含量的測(cè)定方法如下A、常春藤皂苷元對(duì)照品溶液的制備精密稱取常春藤皂苷元對(duì)照品5mg于50mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容，配成0. lmg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，冷藏保存?zhèn)溆?。B、常春藤皂苷元最大吸收波長(zhǎng)的確定精密吸取對(duì)照品溶液lml，2份(一份做空白，一份做顯色)，加入標(biāo)號(hào)的干燥的具塞試 管中，于60攝氏度真空干燥箱中揮干，空白組加入5ml的甲醇，顯色組加入5ml的高氯酸， 搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng)完全后立即置冰水浴中冷 卻15min，隨行試劑為空白，于島津UV-2550紫外分光光度計(jì)，在200 700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi) 進(jìn)行掃描。結(jié)果供試品溶液與對(duì)照品溶液在310nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定測(cè)定波長(zhǎng)為 310nmoC、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取對(duì)照品溶液0. 3,0. 6,0. 9，1. 2，1. 5，1. 8mL各2份(一份做空白，一份做顯 色)，轉(zhuǎn)移至IOmL的具塞試管中，于60攝氏度真空干燥箱中揮干，空白組加入5ml的甲醇， 顯色組加入5ml的高氯酸，搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng) 完全后立即置冰水浴中冷卻15min，隨行試劑為空白，于島津UV-2550紫外分光光度計(jì)，在 200-500nm波長(zhǎng)掃描，在310nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，常春藤皂苷元對(duì)照 品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸收度A對(duì)濃度C作最小二乘法回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 為C = 0. 022A+0. 045，R2 = 0. 999 (n = 4)，線性范圍為 7. 0 34. 3 μ g/mL,質(zhì)量濃度與吸 收度值的線性關(guān)系良好。D、樣品中皂苷類成分含量測(cè)定方法取白頭翁藥材適量，粉碎，稱取藥材:34.90g，用10倍量70%乙醇(即350ml)，提取2 次，每次1. 5小時(shí)，所得溶液用中速濾紙過(guò)濾，濃縮至IOOml以下，轉(zhuǎn)移至IOOml的容量瓶， 定容至刻度，即得0. 349g/ml的白頭翁提取物；移取白頭翁提取液1ml，轉(zhuǎn)移至250ml的容 量瓶中，定容至刻度，即得1. 396mg/ml的白頭翁供試品溶液。精密吸取供試品溶液lml，2 份(一份做空白，一份做顯色)，加入標(biāo)號(hào)的干燥的具塞試管中，于60攝氏度真空干燥箱中 揮干，空白組加入5ml的甲醇，顯色組加入5ml的高氯酸，搖勻，顯色組于70攝氏度水浴中 反應(yīng)15min，并時(shí)時(shí)振搖，反應(yīng)完全后立即置冰水浴中冷卻15min，隨行試劑為空白，于島津 UV-2550紫外分光光度計(jì)，在200-500nm波長(zhǎng)掃描，在310nm處測(cè)定其吸收度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線 求得白頭翁有效組分樣品中總皂苷濃度并計(jì)算含量。
3.白頭翁提取物的制備方法，其特征在于將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用10-95%乙 醇浸泡0. 5-2h, 6-12倍量加熱回流提取2-3次，每次l_3h，過(guò)濾，合并濾液。上述濾液于 50-70°C減壓濃縮至0. 5-1. Og生藥材/mL，0-4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液上大孔吸附樹(shù) 脂柱，收集50-80%乙醇洗脫液，脫色，回收溶劑，用噴霧干燥法、真空微波干燥法或其它方 法進(jìn)行干燥，收集干浸膏或噴干粉，即得白頭翁提取物。
4.白頭翁提取物的制備方法，其特征在于將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用6-12倍量 的水加熱回流提取2-3次，每次1-池，過(guò)濾，合并濾液；上述濾液于50-70°C減壓濃縮至 0. 5-1. Og生藥材/mL，0-4°C冷藏過(guò)夜，析膠，濾過(guò)，濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，收集50-80%乙 醇洗脫液，脫色，回收溶劑，用噴霧干燥法、真空微波干燥法或其它方法進(jìn)行干燥，收集干浸 膏或噴干粉，即得白頭翁提取物。
5.白頭翁提取物在制備抗血吸蟲(chóng)有效組分中的應(yīng)用，其特征在于白頭翁提取物中的白頭翁活性組分中皂苷類成分含量為70%以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的白頭翁提取物，其特征在于白頭翁提取 物可以作為抗血吸蟲(chóng)活性成分與藥物輔料配制成藥劑學(xué)上的各種制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的白頭翁提取物制成的制劑，其特征在于白頭翁提取物作為 抗血吸蟲(chóng)活性組分在制劑中的分散狀態(tài)可以是液體，也可以是固體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的白頭翁提取物制成的制劑，其特征在于白頭翁 提取物作為抗血吸蟲(chóng)活性組分制成的制劑的給藥途徑可以是噴灑、口服、注射和局部給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5所述的任意一種白頭翁提取物作為抗血吸蟲(chóng)活性 組分，其特征在于頭翁提取物作為抗血吸蟲(chóng)活性組分可以用于制備人或其它哺乳動(dòng)物血 吸蟲(chóng)病的預(yù)防或治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種白頭翁提取物在制備抗血吸蟲(chóng)藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明還提供白頭翁提取物的制備方法及其制劑的制備方法，白頭翁提取物的制備方法是將白頭翁藥材粉碎成粗粉，用10-95％乙醇浸泡0.5-2h，6-12倍量加熱回流提取2-3次，每次1-3h，過(guò)濾，合并濾液；濾液上大孔吸附樹(shù)脂柱，精制得白頭翁提取物。白頭翁提取物具有顯著的抗血吸蟲(chóng)活性，可以用于人或其它哺乳動(dòng)物血吸蟲(chóng)病的預(yù)防治療。
文檔編號(hào)A61K125/00GK102078389SQ20101062479
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者馮育林, 劉艷麗, 夏超明, 李孝賢, 李笑然, 楊世林, 簡(jiǎn)暉, 羅曉健, 范玫玫, 許瓊明, 饒毅, 龔建平 申請(qǐng)人:江西中醫(yī)學(xué)院