專利名稱：膠原靶向治療增生性瘢痕蛋白藥物的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及免疫學領域的機體免疫功能調節及基因 的重組表達技術領域的人白細胞介素10 (human interlenkin 10，hIL_10)與膠原特異結 合的CBD多肽在基因水平融合后所表達的重組蛋白及其該重組蛋白應用。
背景技術：
皮膚損傷愈合后，瘢痕仍繼續增殖，即可發展成增生性瘢痕。增生性瘢痕突出皮 面，形狀不規則，高低不平，潮紅充血，質地實韌。有灼痛和瘙癢感，于環境溫度增高，情緒激 動，或進食辛辣刺激性食物時癥狀加劇。增生往往延續幾月或幾年后才逐漸發生退行性變 化，表現為突起高度減低，顏色轉暗，充血消退，變軟。有些最終可以平復，痛癢癥狀也大為 減輕或消失。增生瘢痕，好發于損傷深度僅及真皮的創傷，如深2度燒傷和切取厚的中厚度 片的供皮區創面等，偶爾亦見于較深的創傷和手術切口。增生瘢痕與正常瘢痕的病理組織差別，僅在于瘢痕深部膠原纖維的增厚，排列不 規則，或呈旋渦形，或纏繞成繩索狀。究其形成原因，是因為瘢痕組織中膠原蛋白過度沉積， 膠原蛋白的合成代謝超常持續進行，超過分解代謝的速度，在相當長的時間內，大量形成膠 原纖維最終形成增生瘢痕。基因工程是在分子生物學和分子遺傳學綜合發展基礎上于本世紀70年代誕生的 一門嶄新的生物技術科學。1989年Fiorentino等發現小鼠Th2細胞株產生一種新的細 胞因子，能抑制Thl細胞株細胞因子mRNA的轉錄，稱為細胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)，同年命名為白細胞介素 10 (interlenkin 10， IL-10)。人成熟IL-10分子為160氨基酸殘基，分子量18. 7kDa，pI8. 1。白細胞介素10 (IL-10)是人體多種細胞產生的重要免疫調節細胞因子，具有廣泛的生物學活性，包括免疫 抑制、抗炎及免疫調節特性，主要生物學功能是限制和終止炎癥反應，調節多種免疫細胞的 分化和增殖，同時也具有調理免疫刺激的特性，清除感染和非感染的顆粒。體內外和動物實 驗表明IL-I在炎癥、惡變和自身免疫性疾病方面都發揮了重要功能，在臨床上應用于治療 急、慢性炎癥疾病、自身免疫性疾病如炎性腸炎、類風濕性關節炎、克隆病、多發性硬化癥、 銀屑病等。但針對增生性瘢痕，目前還沒有有效的解決方法。
發明內容
本發明的目的在于提供一種膠原靶向hIL-10重組蛋白(簡稱CBD-IL-10)及其臨 床應用，該重組蛋白既保持了 hIL-10的生物學活性，又增加了 hIL-10在體內的靶向性，不 僅賦予了該蛋白具有與hIL-10同樣的抗病毒、抗腫瘤以及機體免疫功能的活性，更為重要 的是其在傷口愈合過程中能夠與膠原特異靶向結合，從而預防抑制瘢痕的形成。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為膠原靶向治療增生性瘢痕蛋白藥物 的制備中所采用的一種靶向CBD-IL-10重組蛋白，其氨基酸序列如下所示H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH,
其中H2N-’代表蛋白質氨基端(N末端)，‘-C00H’代表蛋白質羧基端(C末端)。上述靶向hIL-10重組蛋白在作為治療增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病藥物的應用。瘢痕組織中膠原蛋白過度沉積，而CBD多肽(TKKTLRT，7肽)能夠特異性結合膠原 蛋白，是膠原蛋白特異性結合的多肽序列。將膠原蛋白特異結合的CBD導向肽與IL-10融合 表達，既可以降低用藥劑量及治療成本，減輕用藥帶來的毒副作用；同時更為重要的是在體 內能夠使IL-10藥物“靶向”到達體內作用部位而有效發揮藥理作用。本發明與現有技術相 比，本發明通過基因工程手段把hIL-10與膠原特異結合的CBD多肽在基因水平融合后表達 的重組蛋白，重組后形成了一種新的蛋白(CBD-IL-10)，并且賦予了該蛋白具有與hIL-10 同樣的抗病毒、抗腫瘤以及機體免疫功能的活性；更為重要的是CBD-IL-10在傷口愈合過 程中能夠與膠原蛋白特異靶向結合，從而預防抑制瘢痕的形成。
圖1是IL-10氨基酸序列序列表。圖2是靶向CBD-IL-10的重組蛋白氨基酸序列表。
具體實施例方式本發明通過基因工程手段把hIL-10與膠原特異結合的CBD多肽在基因水平融合 后表達的重組蛋白(CBD-IL-10)。所述的hIL-10，其氨基酸序列如下
H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met lie Arg Gln-COOH ；
所述膠原特異結合的CBD導向肽，其氨基酸序列如下 H2N-Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-C00H，‘&N-，代表蛋白質氨基端(N末端)，‘-C00H， 代表蛋白質羧基端(C末端)；hIL-10和CBD導向肽之間通過引入Gly Gly Gly Gly Ser柔
Phe Pro Gly Thr Phe Phe Asp Phe Lys Glu Val Met Gly Glu Asn Glu Asn Lys Gly lie Tyr Thr Met Lys性Linker連接，蛋白表達之后不會影響各自的結構和功能。融合后的靶向CBD-IL-10的氨基酸序列如下
H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn Tyr lie Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys lie Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH, iH2N-'代表蛋 白質氨基端(N末端)，‘-C00H’代表蛋白質羧基端(C末端)。實施例1 :CBD-IL_10的表達、純化及生物學活性測定 (一)CBD-IL-10基因的獲得
1.總RNA的提取
人外周血經淋巴細胞分離液分離單個核細胞，PBS洗滌2次，重懸于10% RPMI 1640 培養液，加入終濃度為10g/L的ConA，置5% C02培養箱，37°C培養48h，收集細胞。參照RNA 抽提試劑盒的方法，抽提總RNA，_80°C保存備用。2.總RNA的提取及IL-10 cDNA的擴增
用Takara公司RNA提取及反轉試劑盒，按說明抽提總RNA，進行RT- PCR反應總RNA 500ng，5X 逆轉錄 Buffer2Pl，oligo dT 0. 5 μ 1,6 mer 0· 5 μ 1，AMV 逆轉錄酶 0· 5μ1，DEPC 水加至10μ1。37°C溫育30min，后85°C溫育3 min，得到細胞cDNA。(二)載體的構建、表達及其鑒定 1. /7MD18-T克隆載體的構建
按大腸桿菌慣用密碼子設計CBD基因序列、引物及相應的酶切位點以及Iinker(G4S), 合成如下2條引物Fl、F2。CBD 導向肽氨基酸序列如下H2N-Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH ； CBD 5' accaaaaaaacccttcgcacc3'；
Fl 5' catatgagcccaggccagggcacccagtctgagaacag3'；
F25' gtcgactcaggtgcgaagggtttttttggtagaaccaccaccaccgtttcgtatcttcattgtcatgt ag3，；
以Fl、F2為引物，以cDNA為模板，隨之按95°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin,30個循環后 72°C進行延伸12min，得到PCR產物，產物回收連入/7MD18-T載體，進行酶切鑒定和序列測 定，得到/7MD18T-IL10-CBD重組克隆載體。2. /7ET-IL10-CBD表達載體的構建
測序正確的PMD18T-IL10-CBD重組克隆載體及原核(+)表達載體，分別經 NdeI /MlI雙酶切，回收目的片段進行連接，連接產物轉化BL21 (DE3)，挑取克隆，同樣回收 質粒，酶切鑒定，進一步經測序鑒定，構建成/7ET-IL10-CBD表達載體的工程菌。3. CBD-IL-10重組蛋白在大腸桿菌中的表達
5上述工程菌/7ET-IL10-CBD/BL21接種于含氨芐青霉素的LB培養基中，37°C振蕩培養過 夜，次日以洲的接種量接種到同樣的培養基中，繼續在37°C振蕩培養至對數生長中期、培 養液光密度OD6tltl為0. 5^0. 6時，加入IPTG繼續培養壙5 hr誘導表達，離心收集菌體。4、CBD-IL-10蛋白表達的檢測及鑒定
將誘導表達的菌體培養物離心，收集菌體，采用12 %的SDS-PAGE電泳分析表達產物， IPTG誘導者與未誘導者相比，在分子量相應處有一條明顯的深染新生蛋白帶，蛋白表達量 占菌體總蛋白的40%，與預計融合蛋白的分子量大小相符。將蛋白從凝膠電轉移至PVDF膜 上，常規Western blot分析，ECL發光，可見一明顯顯色帶，分子量一致。未誘導菌株，標準 蛋白及表達菌中其它條帶無陽性反應。(三)基因工程菌的培養及高密度發酵 1. 一級種子的制備
挑選LB(含氨芐青霉素)平板上的單菌落接種于IOml LB (含氨芐青霉素)液體培養 基中，37°C 200 rpm振蕩培養過夜。2.發酵種子液的培養
把一級種子按洲的接種量接種于適量的改良的LB液體培養基(含氨芐青霉素) 中，同樣條件下培養菌體的密度至0D_為1. 5-2左右。3、基因工程菌的高密度發酵
按5%的接種量把發酵種子液接種于含蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、 磷酸鹽、甘氨酸和甘油等為主要成分的復合培養基中，攪拌速度為100-800rpm，溶氧控制 在20-40%，溫度為37°C條件下，補料流加至OD6tltl約為30時，加入終濃度為lmmol / L的 IPTG，再發酵4hr離心收集菌體。(四)CBD-IL-10融合蛋白的純化 1.融合蛋白的粗提
取誘導表達的菌體 30g，用 150mL 20mmol/L pH6. 8 的 PB (1. 5mllmol/LMgCl2、 3. 5mgDNaSe，適量EDTA)細胞破碎儀破碎細胞，4°C攪拌裂解!3hr。經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢 測發現表達的融合蛋白存在于上清和沉淀中，說明誘導表達的重組蛋白是以可溶性及包涵 體形式存在的。4°C 12000rpm離心15min，收集上清，裝入透析袋，用pH6. 8的10mmol/L的 PB透析M-3^!r，換液2-3次，離心收集上清液。2.包涵體的溶解及復性
裂菌沉淀IL-10包涵體經洗滌、尿素溶解，于4°C在復性緩沖液的逐漸稀釋下緩慢復性。3、融合蛋白的純化
取陽離子交換基質SP-S印harose Fast Flow裝柱，柱體積5· 4X20cm，用10mmol/L pH6. 8的PB平衡，上樣后用含0. 5 mol/L NaCl的lOmmol/L pH6. 0的PB線性梯度洗脫，收 集主峰即得到融合蛋白。即為CBD-IL-10，氨基酸序列如圖2所示。(五)CBD-IL-10的生物活性測定
MC/9細胞來源于小鼠的肥大細胞，在小鼠IL-4或IL-3以及小鼠IL-10或人IL-10的 協同刺激下生長繁殖，且細胞數量隨著IL-10濃度的增加而增長，具體如下
給100μ1 MC/9細胞QX IO4細胞/ml)加入小鼠IL-4 20 U、人IL-10標準品2 U或表達的CBD-IL-10，370C，5%C02孵箱培養72hr，臺盼藍染色，血細胞計數板計數MC/9活細胞 數。根據細胞數量計算IL-10的活性單位，與對照組mIL-4、陰性上清液比較差異均無顯著 意義(/7>0. 05)，而IL-10標準品和表達的CBD-IL-10均能刺激MC/9細胞的增殖，細胞數量 與單抗中和組、陰性對照組比較差異均有顯著意義(ρ<0· 05)。因此，大腸桿菌表達的可溶性 和包涵體復性的IL-10均具有生物學活性。經ELISA定量檢測及MC/9細胞的活性分析，粗 制品的可溶性和包涵體復性IL-10的比活性分別為1. 02X 104U/mg和4. IX 102U/mg。實施例2 =CBD-IL-IO抑制瘢痕增生試驗 (一)增生性瘢痕組織
燒傷愈合后3個月的前臂增生性瘢痕組織(病理證實)，紅色、硬，高出正常皮膚 約4 7 mm。應用BALA/c-nu雄性小鼠30只，6 8周齡，體重18 20g。(二)燒傷后增生性瘢痕的動物模型的制備
去除增生性瘢痕下脂肪組織，將瘢痕切成6mmX5mmX 3mm大小組織塊，置于預冷 DMEM (含青霉素、鏈霉素雙抗各100 U/ml)的培養液中，無菌條件下在裸鼠肩胛皮膚作一小 切口，將瘢痕組織小塊移植在皮下，不予縫合。在3 h內完成30只動物模型。觀察動物模 型有無感染、排斥反應，選擇穩定的瘢痕模型作為治療動物使用。瘢痕模型建立20d，此時增 生性瘢痕血液循環建立，瘢痕穩定。(三)實驗動物分組
實驗分為對照組、hIL-10標準組及CBD-IL-10大劑量治療組、中劑量治療組、小 劑量治療組，裸鼠數目每組分別為6只，采用瘢痕內注射的方法，IL-10為IOyg /ml/次， CBD-IL-10分別為5、10和20 μ g /ml/次，200 μ 1/次，3次/周，總共治療3周；對照組每 次僅給以PBS，其余相同。停藥3d后取材，用游標卡尺直接測量瘢痕最大徑a和最小徑b換 算成瘢痕體積，公式為V=ab2/2。與對照組相比，IL-10及CBD-IL-10個治療組，均能明顯抑 制瘢痕的生長(如表1. P<0. 05)。表1治療前后瘢痕體積變化(mm3)
權利要求
1. 一種靶向CBD-IL-10重組蛋白，其氨基酸序列如下所示H2N--MetSerProGlyGlnGlyThrGlnSerGluAsnSerCysThrHisPheProGlyAsnLeuProAsnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThrPhePheGlnMetLysAspGlnLeuAspAsnLeuLeuLeuLysGluSerLeuLeuGluAspPheLysGlyTyrLeuGlyCysGlnAlaLeuSerGluMetlieGlnPheTyrLeuGluGluValMetProGlnAlaGluAsnGlnAspProAsplieLysAlaHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArgPheLeuProCysGluAsnLysSerLysAlaValGluGlnValLysAsnAlaPheAsnLysLeuGlnGluLysGlylieTyrLysAlaMetSerGluPheAsplieLyslieAsnTyrlieGluAlaTyrMetThrMetLyslie Arg Gln Gly Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr-COOH,其中H2N-’代表蛋白質氨基端(N末端)，‘-C00H’代表蛋白質羧基端(C末端)。
2.權利要求1所述的靶向CBD-hIL-10重組蛋白在作為治療增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾 病藥物的應用。
全文摘要
本發明屬基因工程領域，涉及靶向hIL-10的重組蛋白及其應用。本發明重組蛋白是由人白細胞介素10(humaninterlenkin10,hIL-10)與膠原特異結合的CBD多肽在基因水平融合后表達的重組蛋白，重組后形成了一種新的蛋白。該蛋白具有與hIL-10同樣的抗病毒、抗腫瘤以及機體免疫功能的活性；更為重要的是CBD-IL-10在傷口愈合過程中能夠與膠原特異靶向結合，作為治療增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病藥物的應用中，可預防抑制瘢痕的形成。
文檔編號A61P17/02GK102115495SQ20101060435
公開日2011年7月6日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者張戰風, 朱雄翔, 湯朝武, 白曉智, 石繼紅, 胡大海, 董茂龍, 韓軍濤 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學