專利名稱：一種人肺動脈平滑肌細胞分離、培養方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從人肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)剝離物中分離及培養人肺動脈平滑肌細胞的方法和由該方法獲得的平滑肌細胞，以及該種細胞在肺循環相關疾病研究中的應用，屬生物技術領域。
背景技術：
人肺動脈平滑肌細胞是研究肺循環相關疾病、尤其是肺動脈高壓等疾病發病機制的重要細胞材料。目前國內外用于實驗研究的肺動脈平滑肌細胞來源以動物居多，其中主要是來源于大鼠。但由于種屬不同，細胞間的差異較大，所以鼠源的肺動脈平滑肌細胞用于人肺動脈高壓及其發病機制研究的意義明顯小于用人的細胞。為此有部分學者采用引產胎兒(18周內)的肺動脈平滑肌細胞進行實驗研究，因為胎兒細胞增殖能力強且易于培養， 但是因為胎兒肺尚未發育成熟，其肺動脈平滑肌細胞與成人的細胞亦有所差異，因此尋求簡單易行的成人肺血管平滑肌細胞的培養方法就顯得十分重要。此外，由于疾病狀態的不同、發病機制的不同，細胞會具有不同的功能與特性，因此成功分離并培養肺動脈高壓病人肺血管平滑肌細胞并由于轉化醫學研究對于有針對性的探討該種疾病的發病機制，對尋求改善肺血流動力學和阻止肺血管重構的可能手段，尋找新的治療靶點，對預防和治療CTEPH 具有十分重要的意義具有十分重要的意義。慢性血栓栓塞性月市動脈高壓(Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension, CTEPH)指與一次或反復發生的肺血栓栓塞癥相關、以肺血流阻力增加和肺動脈壓力升高為特征的臨床病癥。由于其發病隱匿、進展迅速、死亡率很高(美國NIH資料顯示其平均生存時間僅為2. 8年)，目前已成為頗受關注的公共衛生問題。近10余年有關肺動脈高壓的研究取得了顯著進步，但關于CTEPH發生發展的病理生理學機制的研究內容卻十分匱乏。尤其部分病人肺血管重構的機制還研究其少，其中重要的原因少一,就是缺乏可供研究應用的CTEPH病人的肺血管平滑肌細胞,。肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)是一種采用開胸、體外循環、深低溫等方式，完整清除血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓，剝脫增厚的內膜，以達到恢復肺動脈血管通暢， 降低肺動脈壓力，從而改善心臟功能，延長患者生命，恢復患者生活質量的手術。手術過程是從肺動脈中膜層將血管阻塞物完整剝除，我們已經發現PTE手術的標本含有肺動脈內皮細胞、內皮祖細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞。因為手術難度極大，因而標本十分珍貴。目前只有極少數學者從PTE術后患者標本中獲得了人肺動脈平滑肌細胞，所采取的培養人肺動脈平滑肌細胞的方法包括復合膠原酶法或貼塊法，但單純貼塊法培養周期長，復合膠原酶法所用酶種類過多，不僅不經濟而且獲得的活的原始細胞的數量較少。因此建立一套操作方便，培養周期短，純度高，存活率高的從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物中分離及其培養人肺動脈平滑肌細胞的方法是非常必要的，對于研究血栓栓塞性肺動脈高壓患者的發病機制、了解疾病發生發展過程中平滑肌細胞的遷移、增殖和分泌功能的變化以及其信號轉導過程，了解病人預后具有非常重要的意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物中分離及培養人肺動脈平滑肌細胞的方法。該方法技術穩定，重復性好，培養的細胞形態均一，生長良好，且具有典型的平滑肌細胞的形態及特點。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)剝離物中分離、培養人肺動脈平滑肌細胞的方法，步驟如下1.獲取原代培養的肺動脈平滑肌細胞從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物中分離人血管平滑肌細胞，并進行原代培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞；2.獲取傳代培養的肺動脈平滑肌細胞當步驟1.中的原代細胞長至對數生長期后，取出原代細胞用PBS溶液清洗后，加入0. 2-0. 5ml 0. 1-0. 2% (w/v)胰蛋白酶溶液(含 0.01-0. 05%EDTA)33-37°C消化1 2分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸出胰蛋白酶液，加入5 7ml完全培養液，溫柔震蕩使之形成細胞懸液，接種至新的培養瓶中，每兩天換液一次，即完成傳代細胞培養，獲得傳代培養的慢性血栓栓塞性肺動脈高壓病人肺動脈平滑肌細胞。所述步驟1中的所述獲取原代培養的肺動脈平滑肌細胞的具體步驟為1)內膜剝脫術中剝離下來的肺血管組織標本置于HBSS液中4°C保存；2)超凈臺紫外線照射30-40min，75%酒精擦拭，所有器械、器皿高壓滅菌；3)預熱消化液，HBSS及完全培養液至37°C ；4)將標本置于37°C含HBSS的器皿中清洗8-15min ；5)將IOml消化液用2. 2 μ m過濾至小燒杯待用；6)將約1.5cm長Imm寬條狀的白色標本在消化液中用無菌剪子剪成約 ImmX ImmX Imm的碎片，繼續消化25_35min ；7)將標本組織碎片轉移至無菌離心管中，室溫^0_350g梯度離心12-20min ；8)吸出上清液棄去，吸出細胞懸液收集于另一個無菌離心管中，加入完全培養液調整細胞密度3-4X 105/ml，并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5% CO2培養箱內靜置培養；9)消化后的組織碎片再用完全培養基重懸后分種至6孔板中。10)次日觀察，3-4天后全部或半量更換培養液。11)當細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞；上述步驟中的的HBSS溶液為氯化鈣1. 0-1. 5mM,氯化鈉120_150mM，氯化鉀5. 0-6. OmM,氯化鎂0. 3-1. OmM,磷酸氫二鉀0. 2-1. OmM,硫酸鎂0. 2-1. OmM,碳酸氫鈉 3. 5-4. 5mM，磷酸氫二鈉 0. 1-0. 5mM，無糖葡萄糖 4. 0-7. OmM 和 HEPES 5. 0-10. OmM，該溶液的 PH值為7. 2-7. 4，實驗前M小時配制并高壓除菌。消化液為HBSS平衡鹽溶液中加入II型膠原酶配制而成，比例為8_12mlHBSS平衡鹽溶液8-30mg II型膠原酶。完全培養液為由M231基礎培養基(SMBS)，培養基補充物(SMGS)，青霉素和鏈霉素的抗生素配制而成，其中M231基礎培養基和培養基補充物SMGS的體積比為 90-100 1-5，青霉素的終濃度為80-100U/ml，鏈霉素的終濃度為80-100mg/ml。本發明還涉及一種由上述培養方法獲得的人肺動脈平滑肌細胞。本發明還涉及一種所述人肺動脈平滑肌細胞在研究肺循環相關疾病的應用。本發明的一個技術方案中，肺循環相關疾病是肺動脈高壓。本發明的一個技術方案中，所述肺動脈高壓是血栓栓塞性肺動脈高壓。本發明方法與現有技術相比具有以下有益效果1.借助普通的手術器械、運用單一酶消化法對細胞膜的損害程度輕，利于細胞存活，解決了從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)剝離物中分離培養人肺動脈平滑肌細胞的技術難題。2.培養方法技術穩定，重復性好，培養的細胞形態均一，生長良好。3.獲得的細胞經顯微鏡觀察及細胞免疫化學鑒定具有典型的肺動脈平滑肌細胞形態及特點，而且因其來源于血栓栓塞性肺動脈高壓患者，因此為進一步深入研究肺循環疾病，尤其是血栓栓塞性肺動脈高壓患者的發病機制，疾病發生發展過程以及其PTE預后等實驗提供了豐富的特異性強的材料來源。
圖1是肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物(PTA) (IX)圖2是普通倒置相差顯微鏡G0X)下血栓栓塞性肺動脈高壓患者原代培養肺動脈平滑肌細胞；圖3是熒光顯微鏡(20 X)下血栓栓塞性肺動脈高壓患者傳代培養肺動脈平滑肌細胞，可見核胞漿中出現藍色的陽性熒光反應，平滑肌細胞漿SM-α-Actin抗原發紅色陽性熒光反應；圖4是熒光顯微鏡(20 X)下血栓栓塞性肺動脈高壓患者傳代培養肺動脈平滑肌細胞漿SM- α -Actin抗原發紅色陽性熒光反應；圖5是熒光顯微鏡(20 X)下血栓栓塞性肺動脈高壓患者傳代培養肺動脈平滑肌細胞核中出現藍色的陽性熒光反應；
具體實施例方式下面結合實例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。實施例11、主要實驗材料(1)標本來源血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中獲得的剝離物。(2)HBSS平衡鹽溶液1000ml三蒸水中加入8. Og氯化鈉、0. 4g氯化鉀、0. Ig氯化鎂、1. Og葡萄糖0. 14g氯化鈣0. 06g磷酸二氫鉀，0. Ig硫酸鎂，0. 35g碳酸氫鈉，0. 09g磷酸氫二鈉和2. 08gHEPES,實驗前M小時配制并過濾除菌或高壓滅菌pH值為7. 4。
(3)消化液=IOmlHBSS平衡鹽溶液中加入25mg II型膠原酶配制而成。(4)完全培養液為由46. 5ml的M231基礎培養基(SMBS)，2. 5ml的培養基補充物 (SMGS)，100U/ml的青霉素、100mg/ml的鏈霉素的抗生素配制而成。2、操作步驟(1)獲取血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中的剝離物1)在手術臺獲得清除血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓即肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中的剝離物，置入冰盒中低溫保存并盡快于4小時內送入實驗室超凈臺進行實驗。2)將組織送入超凈臺內操作，用37°C含HBSS清洗lOmin，去除血污。(2)獲取原代培養血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞。1)將約1. 5cm長Imm寬條狀的白色標本用無菌眼科剪盡量剪碎標本，至小塊約 ImmXlmmX 1mm，用消化液消化30min，可見組織塊松軟，邊緣發毛。2)將標本轉移至無菌離心管中，室溫300g離心15min ；3)輕輕吸出上清消化液棄去，吸出細胞懸浮液收集于另一個無菌離心管中，加入完全培養液重懸細胞調整細胞密度3 4 X 105/ml并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5 % CO2培養箱內靜置培養；4)消化后的組織碎片再用完全培養基重懸后分種至6孔板中。5)次日觀察，3-4天后全部更換完全培養液或半量更換完全培養液。當細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞。(3)獲取傳代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞當原代細胞生長密度達90%后，即可傳代。屆時，用aiil PBS溶液清洗細胞3次， 加入OJml 0. 1% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0.02%EDTA)35°C消化1 2分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，加入5ml完全培養液，輕輕吹打瓶壁上的細胞， 使之形成細胞懸浮液，以2X IO5個/ml的細胞密度接種于新的培養瓶中，置于37°C、5%二氧化碳孵箱中培養，每2天換液一次，至細胞生長至對數生長期，獲得傳代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞。3、培養結果(1)倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細胞呈圓形、透亮、單個均勻分布。原代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞生長2-3天左右可見部分細胞貼壁、展開細胞形態多樣，呈棱形、多角形、星形或不規則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞核多為卵圓形多數細胞為單核，少數細胞有雙核或三核，有一個或多個核仁。4-6天后細胞數量明顯增多呈積聚性生長，細胞間常有突起相連。7-10天細胞生長達到對數期生長，部分區域細胞重疊堆積生長形成“峰”，“峰”與“峰”之間細胞層數漸少，形成“谷”。當細胞生長至融匯后，細胞間相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌細胞生長特征“峰” “谷”狀生長(參見圖2)。(2) SM- α -Actin抗原的免疫熒光檢測采用平滑肌SM- α -Actin單克隆抗體對培養的細胞進行鑒定，并采用國際常用的復染法進行染色，用hochest對所有細胞核進行染色，保證細胞純度計算的可靠性。在熒光顯微鏡下觀察，可見羅丹明標記的細胞漿平滑肌 SM-a-Actin抗原發紅色熒光，hochest標記的細胞核發藍色熒光(圖3)。陰性對照無加一抗，僅檢測到hochest標記的細胞核沒有檢測羅丹明標記的SM-α -Actin，所以僅見發藍色熒光(圖幻。低倍鏡計算細胞純度，每張片隨機取5個視野，每個視野至少檢測200個細胞。計算每個視野中SM-a-Actin表達陽性細胞占該視野總細胞數的比例，為平滑肌細胞純度平均達95%以上。實施例21、主要實驗材料(1)標本來源血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中獲得的剝離物。(2) HBSS平衡鹽溶液1000ml三蒸水中加入7. Olg氯化鈉、0. 37g氯化鉀、0. 06g氯化鎂、0. 79g葡萄糖0. Ilg氯化鈣，0. 03g磷酸二氫鉀，0. 05g硫酸鎂。0. 29g碳酸氫鈉，0. 04g 磷酸氫二鈉和1. 19gHEPES，實驗前M小時配制并過濾除菌或高壓滅菌pH值為7. 2。(3)消化液8mlHBSS平衡鹽溶液中加入30mg II型膠原酶配制而成。(4)完全培養液為由90ml的M231基礎培養基(SMBS)，Iml的培養基補充物 (SMGS)，80U/ml的青霉素、80mg/ml的鏈霉素的抗生素配制而成。2、操作步驟(1)獲取血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中的剝離物1)在手術臺獲得清除血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓即肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中的剝離物，置入冰盒中低溫保存并盡快于4小時內送入實驗室超凈臺進行實驗。2)將組織送入超凈臺內操作，用37°C含HBSS清洗15min，去除血污。(2)獲取原代培養血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞。1)將約1.5cm長Imm寬條狀的白色標本用無菌眼科剪盡量剪碎標本，小塊約 ImmXlmmX 1mm，用消化液消化35min，可見組織塊松軟，邊緣發毛。2)將標本轉移至無菌離心管中，室溫350g離心15min ；3)輕輕吸出上清消化液棄去，吸出細胞懸浮液收集于另一個無菌離心管中，加入完全培養液重懸細胞調整細胞密度3 4 X 105/ml并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5 % CO2培養箱內靜置培養；4)消化后的組織碎片再用完全培養液重懸后分種至6孔板中。5)次日觀察，3-4天后全部更換完全培養液或半量更換完全培養液。當細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞；(3)獲取傳代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞當原代細胞生長密度達約90%后，即可傳代。屆時，用aiilPBS溶液清洗細胞3次， 加入0. 5ml 0. 1% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0. 05% EDTA)37°C消化1 2分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，每孔加入2ml完全培養液，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸浮液，以2. 5X IO5個/ml的細胞密度接種于新的培養瓶中，置于 37°C、5 %二氧化碳孵箱中培養，每2天換液一次，至細胞生長至對數生長期，獲得傳代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞。3、培養結果(1)倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細胞呈圓形、透亮、單個均勻分布。原代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞生長4天左右可見部分細胞貼壁、展開細胞形態多樣，呈棱形、多角形、星形或不規則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞核多為卵圓形多數細胞為單核，少數細胞有雙核或三核，有一個或多個核仁。4-6天后細胞數量明顯增多呈積聚性生長，細胞間常有突起相連。8-10天細胞生長達到對數期生長，部分區域細胞重疊堆積生長形成“峰”，“峰”與“峰”之間細胞層數漸少，形成“谷”。當細胞生長至融匯后， 細胞間相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌細胞生長特征“峰” “谷”狀生長。(2)平滑肌α -Actin抗原的免疫熒光檢測采用SM- α -Actin單克隆抗體對培養的細胞進行鑒定，并采用國際常用的復染法進行染色，用hochest對所有細胞核進行染色， 保證細胞純度計算的可靠性。在熒光顯微鏡下觀察，可見羅丹明標記的細胞漿SM-α-Actin 抗原發紅色熒光，hochest標記的細胞核發藍色熒光。陰性對照無加一抗，僅檢測到 hochest標記的細胞核沒有檢測羅丹明標記的SM-α -Actin，所以僅見發藍色熒光。低倍鏡計算細胞純度，每張片隨機取5個視野，每個視野至少檢測200個細胞。計算每個視野中SM- α -Actin表達陽性細胞占該視野總細胞數的比例，為平滑肌細胞純度平均達90%以上。實施例31、主要實驗材料(1)標本來源血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中獲得的剝離物。(2) HBSS平衡鹽溶液1000ml三蒸水中加入8. 77g氯化鈉、0. 45g氯化鉀、0. 2g氯化鎂、1.39g葡萄糖0. 17g氯化鈣，0. 136g磷酸二氫鉀，0. 25g硫酸鎂。0. 38g碳酸氫鈉， 0. 18g磷酸氫二鈉和2. 38gHEPES，實驗前 小時配制并過濾除菌或高壓滅菌pH值為7.4。(3)消化液12mlHBSS平衡鹽溶液中加入20mg II型膠原酶配制而成。(4)完全培養液為由IOOml的M231基礎培養基，5ml的培養基補充物SMGS，90U/ ml的青霉素、90mg/ml的鏈霉素的抗生素配制而成。2、操作步驟(1)獲取血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中的剝離物1)在手術臺獲得清除血栓栓塞性肺動脈高壓患者肺動脈血栓即肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中的剝離物，置入冰盒中低溫保存并盡快于4小時內送入實驗室超凈臺進行實驗。2)將組織送入超凈臺內操作，用37°C含HBSS清洗8min，去除血污。(2)獲取原代培養血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞。1)將約1.5cm長Imm寬條狀的白色標本用無菌眼科剪盡量剪碎標本，小塊約 ImmXlmmX 1mm，用消化液消化25min，可見組織塊松軟，邊緣發毛。2)將標本轉移至無菌離心管中，室溫^Og離心20min ；3)輕輕吸出上清消化液棄去，吸出細胞懸浮液收集于另一個無菌離心管中，加入完全培養液重懸細胞調整細胞密度3 4 X 105/ml并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5 % CO2培養箱內靜置培養；4)消化后的組織碎片再用完全培養基重懸后分種至6孔板中。5)次日觀察，3-4天后全部更換完全培養液或半量更換完全培養液。當細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞；(3)獲取傳代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞當原代細胞生長密度達約90%后，即可傳代。屆時，用aiilPBS溶液清洗細胞3次， 加入0. aiil 0.2% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0.01%EDTA)33°C消化1 2分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸除胰蛋白酶溶液，用anlPBS溶液清洗細胞3次，加入5ml完全培養液，輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之形成細胞懸浮液，以3. 0 X IO5個/ml的細胞密度接種于新的培養瓶中，置于37°C、5% 二氧化碳孵箱中培養，每2天換液一次，至細胞生長至對數生長期，獲得傳代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞。3、培養結果(1)倒置相差顯微鏡下觀察，剛種植的細胞呈圓形、透亮、單個均勻分布。原代培養的血栓栓塞性肺動脈高壓患者的肺動脈平滑肌細胞生長3天左右可見部分細胞貼壁、展開細胞形態多樣，呈棱形、多角形、星形或不規則形，大小略有差異；胞漿豐富；胞核多為卵圓形多數細胞為單核，少數細胞有雙核或三核，有一個或多個核仁。4-5天后細胞數量明顯增多呈積聚性生長，細胞間常有突起相連。7-9天細胞生長達到對數期生長，部分區域細胞重疊堆積生長形成“峰”，“峰”與“峰”之間細胞層數漸少，形成“谷”。當細胞生長至融匯后， 細胞間相互平行排列成束，高低起伏，形成典型的平滑肌細胞生長特征“峰” “谷”狀生長。(2) SM-α-Actin抗原的免疫熒光檢測采用平滑肌α -Actin單克隆抗體對培養的細胞進行鑒定，并采用國際常用的復染法進行染色，用hochest對所有細胞核進行染色， 保證細胞純度計算的可靠性。在熒光顯微鏡下觀察，可見羅丹明標記的細胞漿SM-α-Actin 抗原發紅色熒光，hochest標記的細胞核發藍色熒光。陰性對照無加一抗，僅檢測到 hochest標記的細胞核沒有檢測羅丹明標記的SM-α -Actin，所以僅見發藍色熒光。低倍鏡計算細胞純度，每張片隨機取5個視野，每個視野至少檢測200個細胞。計算每個視野中SM- α -Actin表達陽性細胞占該視野總細胞數的比例，為平滑肌細胞純度平均達92%以上。實施例4采用實例1的分離及培養方法和申請號為200710033016. 2專利提出的多種酶消化方法及國外文獻采用的多種酶消化方法作對比試驗，結果顯示本專利所采用的實驗方法從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物中所獲得的病人肺動脈平滑肌細胞比多種酶消化法獲得的平滑肌細胞達到對數生長期的時間平均提早M小時，表明本專利采用的單一酶消化法對細胞膜的損害程度較輕，利于細胞存活及生長。實施例5采用實例1的方法分離肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物中病人肺動脈平滑肌細胞和非肺動脈高壓的人肺動脈平滑肌細胞，培養結果顯示病人肺動脈平滑肌細胞體積比非肺動脈高壓病人的平滑肌大，形態上稍有差異，而且平滑肌細胞“峰” “谷”狀生長特征也比其它來源的平滑肌細胞欠明顯。表明本專利采用的實驗標本對研究肺動脈高壓等疾病更具特異性。實施例6按照實例1-3的培養方法，本研究團隊從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物中分離病人肺動脈平滑肌細胞二十余例，試驗重復性好，培養的細胞形態均一，生長良好。
權利要求
1.一種從人肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)剝脫物中分離培養人肺動脈平滑肌細胞的方法，其特征在于(包括以下步驟)1)獲取原代培養的肺動脈平滑肌細胞從人肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)中剝脫物中分離人血管平滑肌細胞，并進行原代培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞；2)獲取傳代培養的肺動脈平滑肌細胞當步驟1)中的原代細胞長至對數生長期后， 用PBS溶液清洗后，加入0.2-0. 5ml 0. 1-0.2% (w/v)胰蛋白酶溶液(含0. 01-0. 05 % EDTA) 33-37°C消化1 2分鐘，當細胞出現回縮、細胞間隙增大時，吸出胰蛋白酶液，加入 5 7ml完全培養液，輕柔震蕩使之形成細胞懸液，接種至新的培養瓶中，每兩天換液一次， 即完成傳代細胞培養，獲得傳代培養的慢性血栓栓塞性肺動脈高壓病人肺動脈平滑肌細胞。
2.如權利要求1所述的培養方法中，獲取原代培養肺動脈平滑肌細胞的具體步驟為1)內膜剝脫術中剝離下來的肺血管組織標本置于HBSS液中4°C保存；2)超凈臺紫外線照射30-40min，75%酒精擦拭，所有器械、器皿高壓滅菌；3)預熱消化液，HBSS及完全培養液至37°C；4)將標本置于37°C含HBSS的器皿中清洗8-15min；5)將IOml消化液用2.2 μ m過濾至小燒杯待用；6)將約1.5cm長Imm寬條狀的白色標本在消化液中用無菌剪子剪成約ImmX ImmX Imm 的碎片，繼續消化25-35min ；7)將標本組織碎片轉移至無菌離心管中，室溫觀0-35(^梯度離心12-20min；8)棄上清，將細胞懸液收集于另一個無菌離心管中，加入完全培養液調整細胞密度 3-4X105/ml，并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5% CO2培養箱內靜置培養；9)消化后的組織碎片再用完全培養液重懸后分種至6孔板中；10)次日觀察，3-4天后半量或全部更換完全培養液；11)當細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞。
3.如權利要求2所述的培養方法，其中HBSS溶液成分為氯化鈣1.0-1.5mM，氯化鈉120-150mM，氯化鉀5. 0-6. OmM,氯化鎂0. 3-1. OmM，磷酸氫二鉀0. 2-1. OmM,硫酸鎂0. 2-1. OmM,碳酸氫鈉3. 5-5. OmM,磷酸氫鈉0. 1-0. 5mM，無糖葡萄糖4. 0-7. OmM和 HEPES7. 0-10. OmM,該溶液的PH值為7. 2-7. 4，實驗前M小時配制并高壓除菌。
4.如權利要求3所述的培養方法，其中HBSS溶液為氯化鈣1.3mM，氯化鈉136. 9mM, 氯化鉀5. 4mM,氯化鎂0. 5mM,磷酸氫二鉀0. 4mM,硫酸鎂0. 4mM,碳酸氫鈉4. 2mM,磷酸氫鈉 0. 3mM,無糖葡萄糖5. 5mM和HEPES 8. OmM,該溶液的PH值為7. 4，實驗前M小時配制并高壓除菌。
5.如權利要求2所述的培養方法，其中消化液為HBSS平衡鹽溶液中加入II型膠原酶配制而成，比例為8-12mlHBSS平衡鹽溶液20-30mgII型膠原酶。
6.如權利要求5所述的培養方法，其中，消化液中HBSS平衡鹽溶液與II型膠原酶的比例為 IOml 25mg。
7.如權利要求1或2所述的培養方法，其中完全培養液為由M231基礎培養基(SMBS)， 培養基補充物(SMGS)，青霉素和鏈霉素的抗生素配制而成，其中M231基礎培養基和培養基補充物SMGS的體積比為90-100 1-5，青霉素的終濃度為80-100U/ml，鏈霉素的終濃度為 80-100mg/mlo
8.如權利要求7的培養方法，其中完全培養液中的M231基礎培養基和培養基補充物 SMGS的體積比為93 5。
9.如權利要求1-8任意所述的培養方法，其中，獲取原代培養的肺動脈平滑肌細胞的具體步驟為1)內膜剝脫術中剝離下來的肺血管組織標本置于HBSS液中4°C保存；2)超凈臺紫外線照射30min，75%酒精擦拭，所有器械、器皿高壓滅菌；3)預熱消化液，HBSS及完全培養液至37°C；4)將標本置于37°C含HBSS的器皿中清洗IOmin；5)將IOml消化液用2.2 μ m過濾至小燒杯待用；6)將約1.5cm長Imm寬條狀的白色標本在消化液中用無菌剪子剪成約ImmX ImmX Imm 的碎片，繼續消化30min ；7)將標本組織碎片轉移至無菌離心管中，室溫300g梯度離心15min；8)吸出上清液棄去，吸出細胞懸液收集于另一個無菌離心管中，加入完全培養基調整細胞密度3XlO5Ail，并以該密度分種至6孔板中，置37°C、5% CO2培養箱內靜置培養；9)消化后的組織碎片再用完全培養基重懸后分種至6孔板中；10)次日觀察，3-4天后更換培養液或半量更換培養基，當細胞生長至對數生長期，即完成原代細胞培養，獲得原代培養的人肺動脈平滑肌細胞。
10.一種由權利要求1-9任意培養方法獲得的人肺動脈平滑肌細胞。
11.權利要求10所述人肺動脈平滑肌細胞在研究肺循環相關疾病的應用。
12.如權利要求11所述的應用，其中肺循環相關疾病是肺動脈高壓。
13.如權利要求12所述的應用，其中肺動脈高壓是血栓栓塞性肺動脈高壓。
全文摘要
本發明涉及一種從肺動脈血栓內膜剝脫術(PTE)的剝離物中分離、培養人肺動脈平滑肌細胞的方法以及該細胞在肺循環相關疾病研究中的應用。所述方法包括用單一酶消化法對細胞膜進行處理，使細胞損害程度輕，利于細胞存活。該培養方法技術穩定，重復性好，培養的細胞形態均一，生長良好。同時，獲得的細胞為進一步深入研究肺循環疾病，尤其是血栓栓塞性肺動脈高壓患者的發病機制，疾病發生發展過程以及其PTE預后等實驗提供了豐富的特異性強的材料來源。
文檔編號A61P11/00GK102168062SQ201010603709
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者劉巖, 劉杰, 張知非, 李晶, 李積鳳, 王軍, 王辰, 繆冉, 郭麗娟, 顧松 申請人:首都醫科大學, 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院