專利名稱：小肽tff3治療代謝綜合征的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及代謝相關疾病的治療領域。具體而言，本發明涉及小肽TFF3在治療高血糖、胰島素抵抗、脂肪肝、肥胖癥及心血管相關代謝疾病中的用途。
背景技術：
代謝綜合征好發于現代文明社會，許多個體同時表現出有多種心血管疾病的危險因素，包括糖代謝障礙(空腹血糖受損、糖耐量異常、II型糖尿病)，脂代謝異常(血甘油三脂濃度升高、極低密度脂蛋白濃度升高、高密度脂蛋白膽固醇水平降低)，高血壓，向心性肥胖等。20世紀60年代將糖耐量異常和高血壓稱為“富裕綜合征”。1989年又將以高胰島素血癥為基礎的內臟性肥胖、糖耐量異常、高甘油三脂血癥、高血壓作為冠心病的危險因素，概括為“死亡四重奏”。1991年將這組代謝性心血管疾病癥候群命名為“胰島素抵抗綜合征”。另外也有稱代謝綜合征為“四高一低”(即高血糖或糖耐量異常、高甘油三脂血癥、 高血壓、高密度脂蛋白膽固醇水平降低)等。而最近報道認為代謝綜合征是高血壓、血糖異常、血脂紊亂和肥胖癥等多種疾病在人體內集結的一種狀態，直接導致糖尿病、脂肪肝和嚴重心血管疾病的發生，并造成死亡。代謝綜合征以中老年為多發，美國調查發現20歲以上人群患病率為23.7%，我國統計病學調查為14% -15%，而且隨著年齡的增加而增加。全世界每年死于心腦血管病達1550萬，占總死亡人數的近30%。我國占世界人口 1/5，2000年我國城市冠心病死亡 71. 3/10萬，農村31. 6/10萬，每年死于心血管病約350萬人，據預計，患有代謝綜合征的病人，在未來7年里，每8個人就會有1人因代謝綜合征死亡，因此代謝綜合征是21世紀人類面臨的最嚴重的公眾健康問題之一，其發病率逐年遞增，嚴重威脅人類健康，并且給全世界帶來了沉重的負擔。目前認為代謝綜合征為心血管事件的危險因素，中心環節為胰島素抵抗，而脂肪肝是其根源。胰島素抵抗使葡萄糖利用能力的下降，由于葡萄糖利用減少引起血糖水平升高，繼而胰島素代償性增多，表現為高胰島素血癥，能夠導致感染、心臟病變、腦血管病變、腎功能衰竭、雙目失明、下肢壞疽等而成為致死致殘的主要原因。并且通過對內皮功能的損害，加速動脈粥樣硬化的進程。胰島素抵抗個體的內皮功能障礙表現為粘附因子增多、平滑肌細胞增生以及血管擴張功能下降。這一系列改變是促進動脈粥樣硬化形成的重要因素。胰島素抵抗還引起凝血和纖溶狀態的失衡，出現高凝狀態由于纖維蛋白原、纖溶酶原激活劑抑制因子I(PAI-I)水平明顯增加，一旦體內發生血液凝固，患者不能正常啟動纖溶過程，極易造成血栓的形成。內臟脂肪堆積是代謝綜合征的另一重要特征，也是導致胰島素抵抗的主要原因。在內臟脂肪堆積的個體中，首先受累的臟器是肝臟。當肝內脂肪沉積過多時，可使肝被膜膨脹、肝韌帶牽拉，而引起右上腹劇烈疼痛或壓痛、發熱、白細胞增多，可以有腹水和下肢水腫、電解質紊亂如低鈉、低鉀血癥等。脂肪囊泡破裂時，脂肪顆粒進入血液也可引起腦、肺血管脂肪栓塞而突然死亡；若肝細胞脂肪堆積壓迫肝竇或小膽管時， 門靜脈血流及膽汁排泄受阻，出現門靜脈高壓及膽汁淤積，而過多游離脂肪酸的沉積即可導致脂肪肝，并會引起肝酶水平升高，甚至肝臟結構的改變，而引起的脂肪肝有可能導致脂肪性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。由于代謝綜合征病因復雜，臨床上使用的藥物，大多數有治療失效和不良反應等缺點。本研究發現TFF3小肽可明顯改善代謝綜合征的相關癥狀，且無不良反應發生，在未來可能成為治療代謝綜合征的有效新藥。
發明內容
TFF3是一種小分子肽，發明人研究發現這種小分子肽可以通過調節肝臟與糖代謝相關的重要基因例如GP6C、PEPCK、PGC-I α而具有降低血糖的功能，同時TFF3能夠調節肝臟內脂代謝相關基因來降低肝臟內三油甘脂的含量從而改善脂肪肝癥狀。另一方面TFF3 在糖尿病模型DB/DB鼠中通過影響肝臟內一系列復雜的糖脂代謝通路在改善葡萄糖耐受性以及增加胰島素敏感性方面效果亦十分明顯，因此TFF3小肽可以用于改善II型糖尿病人血糖水平，改善脂肪肝，改善葡萄糖耐受性以及增加胰島素敏感性方面的作用，從而達到治療II型糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、心血管等代謝綜合征方面的疾病。種屬人的TFF3氨基酸序列如下EEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF(SEQ ID No :1)。因此，本發明一方面涉及小肽TFF3在制備治療代謝綜合征的藥物中的用途。在本發明中，代謝綜合征包括脂肪肝和肥胖癥等。在本發明中，小肽TFF3可降低高血糖患者的血糖濃度。在本發明中，小肽TFF3可增加患者中胰島素的敏感性。在本發明中，小肽TFF3可降低患者肝臟甘油三酯的含量。在本發明中，小肽TFF3可通過降低肝臟葡萄糖-6-磷酸酶和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或PGC-I α的mRNA表達水平從而治療代謝綜合征。另一方面，本發明還涉及小肽TFF3在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途。優選地，本發明中小肽TFF3所治療的糖尿病為胰島素抵抗型糖尿病而非胰島功能損傷型糖尿病。另一方面，本發明還涉及小肽TFF3在制備治療高血糖相關疾病的藥物中的用途， 所述的高血糖相關疾病可以是高血糖導致的感染、心臟病變、腦血管病變、腎功能衰竭、雙目失明、下肢壞疽。本發明所定義的TFF3包括單體和二聚體形式，以及其同型類似物，同型類似物可以是與天然的TFF3氨基酸序列不同或者發生糖基化，乙酰化，磷酸化，羧基化等修飾作用但是氨基酸序列并未發生改變的情況，或者兩者都存在。同型類似物的氨基酸序列包括與天然的TFF3氨基酸序列相似程度至少在60%，或相似程度更高的70%，或相似程度更高的 80 %，或相似程度更高的90 %，或相似程度更高的95 %甚至99 %。優選地，本發明中的小肽TFF3為a.氨基酸序列為SEQ ID No :1，或b.在a中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且活性不變的由 a衍生的多肽。
在上述b中所述的經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且活性不變的由a衍生的多肽的序列可以是下述任一序列的多肽AEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQETECTF(SEQ ID No 8)YVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQEAECTF(SEQ ID No
9)ADEEYVGLSANQCAVPAKDRVDCGYPHVTPKECNNRGCCFDSRIPGVPWCFKPLQET(SEQ ID No
10)上述序列的多肽可通過例如人工合成或根據氨基酸序列設計相應的編碼多核苷酸序列并在宿主中通過表達載體表達該多核苷酸序列而制備。根據本發明，所制備的多肽的活性可通過，例如，檢測肝原代細胞中G6PC、PEPCK, PGC-I α的mRNA水平而確定。
圖1 在0Β/0Β肥胖鼠中TFF3的mRNA水平比野生型鼠下降了 7. 38倍。圖2 :A，過表達TFF3小肽的肝原代細胞中，G6PC的mRNA水平比GFP組下降了 14. 5 倍；B，過表達TFF3小肽的肝原代細胞中，PEPCK的mRNA水平比GFP組下降了 6. 7倍；C，過表達TFF3小肽的肝原代細胞中，PGC-I α的mRNA水平比GFP組下降了 6. 1倍。圖3 過表達TFF3小肽的肝原代細胞中甘油三酯含量比GFP組有所下降。圖4 =A,饑餓16小時后按lg/Kg的劑量注射葡萄糖后，在0分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘，60分鐘，90分鐘的時候分別檢測血糖，TFF3能夠很好的增加胰島素的敏感性 (n = 5) ；B，檢測血清中葡萄糖含量，TFF3組比GFP組的血糖明顯降低(n = 5) ；C，分別注射Ad-GFP和Ad-TFF3腺病毒10天后G6PC的mRNA水平TFF3組比GFP組明顯降低。圖5 :A，饑餓16小時后按Ig葡萄糖/Kg體重的劑量注射葡萄糖后，在0分鐘，15 分鐘，30分鐘，45分鐘，60分鐘，90分鐘的時候分別檢測血糖，TFF3能夠改善葡萄糖的耐受性(n = 4) ；B，注射TFF3腺病毒5天后的DB/DB鼠比GFP組的血糖有明顯的下降；饑餓6Η 后按IU胰島素/Kg體重的劑量注射胰島素后，在0分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘，60分鐘， 90分鐘，120分鐘的時間點分別檢測血糖，TFF3能夠增加胰島素的敏感性。
具體實施例方式實驗材料載體pGEM-T EASY、實時定量PCR試劑盒購自于!Iomega公司；pcDNA4/ myc-His、TransScript II First-Strand cDNASynthesis SuperMix 試劑盒、轉染試劑 Iipofectamine 2000 購自于 Invitrogen 公司；pAdTrack-CMV 禾口 pAdEasy-1 均購自于 Mratagene公司；各種內切酶均購自TAKARA公司；各類實驗動物模型購自南京大學模式動物研究所；OneTouch Ultra 穩豪型血糖測試儀及相配套血糖試紙購自強生公司。實驗方案1.克隆小鼠TFF3基因:按照hvitrogen公司Trizol試劑說明書提取C57BL/6J鼠肝臟細胞總RNA，使用 TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒將肝臟組織的總 RNA 逆轉錄成cDNA，以小鼠肝臟cDNA為模板進行PCR(聚合酶鏈式反應)，引物設計為
F 5' -GAATTCCCACCATGGAGACC-3，R 5' -CGAGAAATGTGCATTCTGTCT-3，將PCR產物連接到pGEM-T EASY載體上，測序序列正確，得到質粒pGEM_T EASY-TFF3。2.小鼠TFF3過表達載體的構建以pGEM_T EASY-TFF3模板，引物設計為F 5' -CGGAATTCCCACCATGGAGACC-3’ R 5 ’ -ACATACTCGAGAAATGTGCATTCTGTCT-3’將PCR產物分別用EcoRI和XholI雙酶切，同樣用EcoRI和XholI雙酶切pcDNA4/ myc-His空載體，兩者連接16°C過夜后轉化到DH5 α大腸桿菌中，涂于含有氨芐青霉素抗性的LB平板上培養，挑取的克隆用EcoRI和B10II雙酶切鑒定，得到的陽性克隆即為 pcDNA4-TFF3-myc-His 表達質粒。3.小鼠TFF3腺病毒的構建與包裝以pGEM-T EASY-TFF3為模板，引物設計為F 5' -ACAGATCTCCACCATGGAGACCAGAGCCCTCTGG-3’R :5’ -ACCTCGAGTCACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCAAATGTGCATTCTGTCT-3’PCR產物分別用Bgl II和XholI雙酶切，同樣用Bgl II和XholI雙酶切 PAdTrack-CMV空載體，兩者連接16 °C過夜后轉化到DH5 α大腸桿菌中，涂于含有氨芐青霉素抗性的LB平板上培養，挑取克隆用Bgl II和B10II酶切鑒定得到陽性克隆 pAdTrack-CMV-TFF3 質粒。將 pAdTrack-CMV-TFF3_myc 用 PmeI 酶切線性化后與 pAdEasy-1 同源重組，若重組成功，用I^acI酶切鑒定時將出現301Λ，4. 5kb或31Λ條帶。將重組成功的 pAd-TFF3質粒用I^cI線性化轉染細胞，7_10天左右可用熒光顯微鏡觀察到綠色熒光，至30% -50%細胞懸浮時收取細胞，50xg離心去上清，沉淀重懸于PBS中，液氮反復凍融三次用于再次擴增病毒。將上輪病毒再次感染細胞，24-48小時后細胞懸浮約50% 左右收細胞，收取細胞步驟同上。擴增病毒3次后小鼠TFF3腺病毒的包裝完成，包裝完成的腺病毒可用于細胞實驗。采用氯化銫密度梯度離心的方法純化包裝完成TFF3腺病毒。 純化后的腺病毒可用于動物實驗。注射方式采用鼠尾靜脈注射，注射劑量為C57BL/6J鼠 IxlO9Pfu ；DB/DB 鼠 dxK^pfu。4. C57BL/6J肝原代的分離分離肝原代前先給培養皿鋪上鼠尾膠原，紫外滅菌2小時以上。使用0. 3 %異戊巴比妥鈉按照0. 15ml/10g體重的劑量麻醉小鼠。解剖小鼠前先用乙醇擦拭皮膚消毒，然后呈 U字型剪開皮膚，打開腹腔。分離下腔靜脈，打一假結，在假結靠下處插入導管套管，固定假結(建議打兩個結以防止脫落。在打死第二個結前先固定下第一個結)。退出套管，留置導管。立即注入肝素0.2-0. :3ml。然后立即打開胸腔，結扎上腔靜脈并剪開門靜脈。向下腔靜脈的導管緩慢注射灌流液I 2-3分鐘。稱取0.015g I型膠原酶溶于30ml 37°C預熱的灌流液II (膠原酶終濃度0.05%)，混勻。向導管中緩慢注射灌流液II 5分鐘至肝出現皸裂或水泡后將肝臟轉移至75cm2大皿。撕破肝包膜，加入1640培養基。用鑷子去除大的組織塊，使用400目濾網篩選肝細胞(小心勿將含有組織塊的液體滴落)。靜置5分鐘，沉降下來的則為肝細胞。上層液體中含有大量細菌，用槍吸走上層液體(不要直接倒上層液體， 否則細胞損失很多)，留少量液體將細胞轉移至50ml離心管。使用1641培養基清洗細胞，50xg離心2分鐘，棄上層液體，重復2-3次。然后使用臺盼藍計數活細胞數(活細胞數比例應達到70%以上才能達到實驗要求)，100%接種細胞于先前鋪過鼠尾膠原的培養皿中。5.各項指標檢測實時定量PCR儀檢測mRNA水平，反應條件為95°C 10分鐘、95°C 30秒、57°C 30秒、 72°C30秒(捕捉熒光值)，循環45次，并作溶解曲線。數據分析軟件由IQ5實時定量PCR 儀提供。甘油三酯等指標檢測由北京協和醫院完成。實驗結果1.在0Β/0Β肥胖鼠中，TFF3的mRNA水平顯著性下降，約為7. 38倍，說明TFF3小肽的下降可能與肥胖有著密切聯系(圖1)。2.對C57BL/6J分離出的肝臟原代細胞，分別加入能夠過表達GFP和TFF3的腺病毒M小時后饑餓6小時，并繼續用地塞米松(Dexamethasone)和福斯高林(R)rskolin)處理6小時后處理細胞。結果發現在過表達TFF3小肽的肝原代細胞中，與對照組(GFP)相比， 糖異生相關的重要基因例如葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)，過氧化物酶體增生物激活受體Y共激活因子1 α (PGC-1 α )的mRNA水平分別下降了 14. 5倍， 6. 7 倍，6. 1 倍(圖 2)。3.在C57BL/6J分離出的肝臟原代細胞，分別加入能夠過表達GFP和TFF3的腺病毒30小時后處理細胞，使用甘油三酯(Triglyceride)試劑盒測量TG含量發現，過表達 TFF3小肽的肝原代細胞TG含量明顯比GPF組有所下降(圖3)。4. C57BL/6J 動物實驗葡萄糖耐受實驗按照Ig葡萄糖/Kg體重的劑量給饑餓16小時后的C57BL/6J注射葡萄糖，檢測血糖變化情況發現注射Ad-TFF3的C57鼠在15分鐘后比GFP組血糖下降的更快，說明TFF3能夠增加胰島素的敏感性(圖4中的A圖)。注射Ad-GFP和Ad_TFF3腺病毒10天后檢測的C57鼠血清中的葡萄糖含量發現， TFF3具有明顯的降低血糖的功能(圖4中的B圖)。注射Ad-GFP和Ad-TFF3腺病毒10天后檢測肝臟組織中G6PC的mRNA水平發現 G6PC的mRNA水平較GFP組下降了 3. 9倍，從分子水平說明了 TFF3的降糖功能(圖4中的 C圖)。5.糖尿病模型DB/DB鼠動物實驗葡萄糖耐受實驗按照Ig葡萄糖/Kg體重的劑量給饑餓16小時后的DB/DB鼠注射葡萄糖，在不同時間點檢測血糖變化情況發現注射Ad-TFF3后的DB/DB鼠在單位時間內血糖上升速度比GFP組緩慢，在45分鐘后比GFP組血糖恢復原水平更快，由此證明TFF3小肽能夠降低葡萄糖的耐受性(圖5中的A圖)。胰島素耐受性實驗(ITT)按照IU胰島素/Kg體重的劑量給饑餓6小時后的DB/ DB鼠注射胰島素，在不同時間點檢測血糖變化情況，數據顯示注射Ad-TFF3后的DB/DB鼠在單位時間內血糖下降速度比GFP組快，尤其在15分鐘時間點血糖下降更加明顯，由此證明 TFF3小肽能夠增加胰島素的敏感性(圖5中的B圖)。
權利要求
1.小肽TFF3在制備治療代謝綜合征的藥物中的用途。
2.根據權利要求1所述的小肽TFF3在制備治療代謝綜合征的藥物中的用途，其中代謝綜合征包括脂肪肝、肥胖癥。
3.根據權利要求1所述的小肽TFF3在制備治療代謝綜合征的藥物中的用途，其中小肽 TFF3降低患者的血糖濃度。
4.根據權利要求1所述的小肽TFF3在制備治療代謝綜合征的藥物中的用途，其中小肽 TFF3增加患者胰島素的敏感性。
5.根據權利要求1所述的小肽TFF3在制備治療代謝綜合征的藥物中的用途，其中小肽 TFF3降低患者肝臟甘油三酯含量。
6.根據權利要求1所述的小肽TFF3在制備治療代謝綜合征的藥物中的用途，其中小肽TFF3降低患者肝臟葡萄糖-6-磷酸酶和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或PGC-I α的 mRNA表達水平。
7.小肽TFF3在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途。
8.根據權利要求7所述的小肽TFF3在制備治療II型糖尿病的藥物中的用途，其中所述的糖尿病為胰島素抵抗型糖尿病而非胰島功能損傷型糖尿病。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的用途，其中所述的小肽TFF3為a.氨基酸序列為SEQID No :1，或b.在a中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且活性不變的由a衍生的多肽。
全文摘要
本發明涉及小肽TFF3治療代謝綜合征的用途。發明人研究發現TFF3這種小分子肽能夠治療代謝綜合征相關疾病，能夠通過調節肝臟內糖代謝相關基因而具有降低血糖的功能，并且能夠降低肝臟內甘油三酯含量，改善脂肪肝癥狀，在改善葡萄糖耐受性以及增加胰島素敏感性方面效果亦十分明顯。因此，小肽TFF3可用于改善II型糖尿病人血糖水平，改善脂肪肝癥狀，改善葡萄糖耐受性以及增加胰島素敏感性，從而治療代謝綜合征如II型糖尿病、脂肪肝、肥胖癥、心血管等疾病。
文檔編號A61P3/10GK102526702SQ20101060337
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者左瑾, 常永生, 方福德, 薛源 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所