專利名稱：一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法
技術領域：
本發明涉及禽類用生物制品技術領域，尤其是一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗 體的制備方法。
背景技術：
鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV)引起的雛鴨的一種高度致死且傳播迅速的 急性傳染病，是養鴨業危害最嚴重的疾病之一，并常與病毒、細菌混合感染，給臨床診斷與 防制帶來了很大的困難。DHV-I主要感染1月齡以下雛鴨，兩周以內雛鴨尤其易感。雛鴨的 發病率為100%，死亡率因雛鴨的周齡有所不同，小于一周齡的雛鴨死亡率可達95%，1-3 周齡雛鴨的死亡率為50%或更低。而成年種鴨可帶毒而不發病，且其產蛋率不受影響。鴨 病毒性肝炎最先發現于美國，其后，在英國、法國、德國、意大利、加拿大、印度等國陸續地報 道了有本病發生。1963年年我國首次報道了上海某鴨場于1958年秋至1962年春暴發本病 的情況，此后，全國各地都相繼報道了本病的爆發與流行。1980年至今，在我國多個地區已 多次爆發該病，流行區域廣，且發病嚴重，給我國的養鴨業帶來了巨大的損失。因為20日齡以內的雛鴨的免疫系統還未發育完全，所以對本病最有效的防制方 法是用DHV-I疫苗免疫種鴨，使后代雛鴨獲得高水平的母源抗體從而起到保護的目的。但 對于母源抗體水平較低的情況，就需要對雛鴨注射卵黃抗體，以保護雛鴨不受鴨病毒性肝 炎病毒的侵襲。禽類卵黃中的抗體主要是卵黃免疫球蛋白，與血清抗體相比，卵黃抗體具有許多 獨特的優點(1)無需采血，只需收集免疫種鴨產下的蛋即可純化得到卵黃抗體；(2)有良 好的穩定性，且耐熱耐酸，常溫下仍能保持一定的活性。( 治療效果明顯，特異性強，且易 大規模生產。(4)安全、無殘留、溫和環保。因此，開發一種安全有效的鴨病毒性肝炎精制卵 黃抗體迫在眉睫。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制 備方法。為解決上述技術問題，本發明的技術方案是—種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，具體步驟為(1)分離高免雞蛋蛋黃；(2)提取卵黃抗體；(3)配制制劑及包裝。優選的，上述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，具體步驟為(1)分離高免雞蛋蛋黃收集高免雞蛋用70% (V/V)的乙醇進行蛋殼表面消毒，晾 干后送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分離；(2)提取卵黃抗體
A 將步驟⑴所收集的蛋黃與無菌水1 1 (V/V)混合后攪拌均勻，65°C密封滅活 10分鐘后迅速冷卻至8°C _12°C，然后與無菌水以1 4的比例混合(V/V)，IM的HCl調節 pH至5. 2，充分攪勻后4°C靜置6小時，5000rpm離心20分鐘，取上清；B:將步驟A所得上清液與飽和硫酸銨溶液以1 1(V/V)的比例混合，4°C靜置12 小時，SOOOrpm離心20分鐘，取沉淀；按質量比為1 3的比例將沉淀用無菌水溶解，所得 溶液和飽和硫酸銨溶液以2 1 (V/V)的比例混合，4°C靜置12小時，8000rpm離心20分鐘， 取沉淀，按質量比為1 3的比例將沉淀用0. OlM pH7. 2的無菌PBS溶解；C 將步驟B所得溶解液用截留量為IOOku的超濾膜除鹽濃縮；D:將40% (V/V)的甲醛溶液與步驟C所得濃縮液混合，使甲醛的終濃度達到 0. 1% (V/V)；充分攪拌均勻后密封2小時；然后用0. 45微米和0. 22微米的微孔濾膜分別 過濾，取濾液4°C保存備用；(3)配制制劑及包裝將步驟( 所得濾液進行鴨病毒性肝炎抗體效價測定，用 0. OlM pH7. 2的無菌PBS稀釋至中和抗體效價為1 512 ；然后加入吐溫80，至吐溫80終 濃度為0.01% (V/V)作為保護劑，攪拌均勻后無菌條件下分裝成成品。優選的，上述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，所述步驟(1)中高免 雞蛋是由以下方法獲得的(1)使用禽類專用抗菌肽飼料添加劑連續飼喂健康產蛋雞；(2)制備免疫用油乳劑抗原A:將冷凍保存的鴨肝炎病毒AV2111毒種稀釋后接種10_11日齡SPF雞胚并收集 死亡雞胚，收集胚體病變明顯的雞胚尿囊液；B 將步驟A收集的尿囊液加入終濃度為0. 的福爾馬林密封滅活，取滅活后的 尿囊液與無菌吐溫-80以19 1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸鋁以 93 5 2(ff/ff/ff)的比例混合，攪拌均勻后，高壓滅菌20分鐘制成油相；C:將步驟B所制備的水相和油相以5 2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳 劑抗原；(3)免疫產蛋雞，制備高免雞蛋將步驟( 所制備的油乳劑抗原免疫步驟(1)處 理過的產蛋雞，免疫方式為皮下注射，劑量為1毫升/只，免疫次數為3次，第1次與第2次 免疫間隔10天，第2次與第3次免疫間隔14天，將上述經過3次免疫后的產蛋雞正常飼喂 七天后收集雞蛋，即為高免雞蛋。優選的，上述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，所述步驟(1)中高免 雞蛋是由以下方法獲得的(1)使用禽類專用抗菌肽飼料添加劑連續飼喂健康產蛋雞3周，每日添加一次，日 添加量為基礎日糧的0. -0.3%。(2)制備免疫用油乳劑抗原A 將冷凍保存的鴨肝炎病毒AV2111毒種稀釋200倍后接種10_11日齡SPF雞胚， 接種量為100微升/只，置于37°C培養箱中孵育，48-96小時后收集死亡雞胚，收集胚體病 變明顯的雞胚尿囊液；B 將A步驟收集的尿囊液加入終濃度為0. 的福爾馬林37°C密封滅活48小時， 取滅活后的尿囊液與無菌吐溫-80以19 1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸鋁以93 5 2(ff/ff/ff)的比例混合，攪拌均勻后，121°C高壓滅菌20分鐘制成油 相；C:將B步驟所制備的水相和油相以5 2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳 劑抗原；(3)免疫產蛋雞，制備高免雞蛋將步驟( 所制備的油乳劑抗原免疫步驟(1)處 理過的產蛋雞，免疫方式為皮下注射，劑量為1毫升/只，免疫次數為3次，第1次與第2次 免疫間隔10天，第2次與第3次免疫間隔14天；3次免疫過后，每隔7周進行免疫一次，方 式為皮下注射，劑量為1毫升/只，將上述經過3次免疫后的產蛋雞正常飼喂七天后收集雞 蛋，即為高免雞蛋。優選的，上述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，所述高免雞蛋獲得方 法的步驟(1)中的禽類專用抗菌肽飼料添加劑為肽輕松B-001禽類專用制劑。本發明的有益效果是上述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，不僅易于操作，適合大規模生 產，且制備的鴨病毒性肝炎卵黃抗體性質穩定、純度高、效價高、特異性較強，無藥殘，溫和 環保，對預防鴨病毒性肝炎的預防及治療極具應用價值，為鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗 體的制備提供了新的思路。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明所述技術方案作進一步的說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；下述實施例中所用的試 驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的；以下實施例中的％，如無特 別說明，均為質量百分含量。實施例1一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，具體步驟為(1)分離高免雞蛋蛋黃收集高免雞蛋用70% (V/V)的乙醇進行蛋殼表面消毒，晾 干后送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分離；( 提取卵黃抗體A 將步驟(1)所收集的蛋黃與無菌水1 1 (V/V)混合后攪拌均勻，65°C密封滅活 10分鐘后迅速冷卻至10°C，然后與無菌水以1 4的比例混合(V/V)，IM的HCl調節pH至 5. 2，充分攪勻后4°C靜置6小時，5000rpm離心20分鐘，取上清；B:將步驟A所得上清液與飽和硫酸銨溶液以1 1(V/V)的比例混合，混合方式為 將飽和硫酸銨溶液逐漸加入步驟A所得的上清液，邊加邊攪拌，4°C靜置12小時，SOOOrpm離 心20分鐘，取沉淀；按質量比為1 3的比例將沉淀用無菌水溶解，所得溶液和飽和硫酸銨 溶液以2 1(V/V)的比例混合，混合方式為將飽和硫酸銨溶液逐漸加入步驟A所得的上清 液，邊加邊攪拌，4°C靜置12小時，SOOOrpm離心20分鐘，取沉淀，按質量比為1 3的比例 將沉淀用0. OlM pH7. 2的無菌PBS溶解；C 將步驟B所得溶解液用截留量為IOOku的超濾膜除鹽濃縮；D:將商業售40% (V/V)的甲醛溶液(從商業途徑獲得)與步驟C所得濃縮液以 1 399的比例混合，混合方式將40%的甲醛逐滴加入步驟C所得濃縮液，并不斷攪拌均勻，使甲醛的終濃度達到0.1% (V/V)；充分攪拌均勻后密封2小時；然后用0.45微米和 0. 22微米的微孔濾膜分別過濾，取濾液4°C保存備用；(3)配制制劑及包裝將步驟( 所得濾液進行鴨病毒性肝炎抗體效價測定，用 0. OlM pH7. 2的無菌PBS稀釋至中和抗體效價為1 512 ；然后加入吐溫80 (從商業途徑獲 得)，吐溫80與稀釋后的中和抗體的比例1 9999，至吐溫80終濃度為0. 01 % (V/V)作為 保護劑，加入方式為逐滴加入，邊加邊攪拌，攪拌均勻后無菌條件下分裝成成品。實施例2一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，具體步驟為(1)使用肽輕松B-001禽類專用制劑連續飼喂健康產蛋雞3周，每日添加一次，日 添加量為基礎日糧的0.2%。(2)制備免疫用油乳劑抗原A:將冷凍保存的鴨肝炎病毒AV2111毒種(購自中國獸藥監察所)稀釋200倍后 接種10-11日齡SPF雞胚(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，接種量為100微 升/只，置于37°C培養箱中孵育，48-96小時后收集死亡雞胚，收集胚體病變明顯的雞胚尿
囊液；B 將A步驟收集的尿囊液加入終濃度為0. 的福爾馬林37°C密封滅活48小時， 取滅活后的尿囊液與無菌吐溫-80以19 1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、 硬脂酸鋁以93 5 2(ff/ff/ff)的比例混合，攪拌均勻后，121°C高壓滅菌20分鐘制成油 相；C:將B步驟所制備的水相和油相以5 2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳 劑抗原；(3)免疫產蛋雞，制備高免雞蛋將步驟(2)所制備的油乳劑抗原免疫步驟⑴處 理過的產蛋雞，免疫方式為皮下注射，劑量為1毫升/只，免疫次數為3次，第1次與第2次 免疫間隔10天，第2次與第3次免疫間隔14天；3次免疫過后，每隔7周進行免疫一次，方 式為皮下注射，劑量為1毫升/只，將上述經過3次免疫后的產蛋雞正常飼喂七天后收集雞 蛋，即為高免雞蛋；(4)分離高免雞蛋蛋黃收集上述方法獲得的高免雞蛋用70% (V/V)的乙醇進行 蛋殼表面消毒，晾干后送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分離；(5)提取卵黃抗體A 將步驟(4)所收集的蛋黃與無菌水1 1 (V/V)混合后攪拌均勻，65°C密封滅活 10分鐘后迅速冷卻至10°C，然后與無菌水以1 4的比例混合(V/V)，IM的HCl調節pH至 5. 2，充分攪勻后4°C靜置6小時，5000rpm離心20分鐘，取上清；B:將步驟A所得上清液與飽和硫酸銨溶液以1 1(V/V)的比例混合，混合方式為 將飽和硫酸銨溶液逐漸加入步驟A所得的上清液，邊加邊攪拌，4°C靜置12小時，SOOOrpm離 心20分鐘，取沉淀；按質量比為1 3的比例將沉淀用無菌水溶解，所得溶液和飽和硫酸銨 溶液以2 1(V/V)的比例混合，混合方式為將飽和硫酸銨溶液逐漸加入步驟A所得的上清 液，邊加邊攪拌，4°C靜置12小時，SOOOrpm離心20分鐘，取沉淀，按質量比為1 3的比例 將沉淀用0. OlM pH7. 2的無菌PBS溶解；C 將步驟B所得溶解液用截留量為IOOku的超濾膜除鹽濃縮；
D:將商業售40% (V/V)的甲醛溶液(從商業途徑獲得)與步驟C所得濃縮液以 1 399的比例混合，混合方式將40%的甲醛逐滴加入步驟C所得濃縮液，并不斷攪拌均 勻，使甲醛的終濃度達到0.1% (V/V)；充分攪拌均勻后密封2小時；然后用0.45微米和 0. 22微米的微孔濾膜分別過濾，取濾液4°C保存備用；(6)配制制劑及包裝將步驟( 所得濾液進行鴨病毒性肝炎抗體效價測定，用 0. OlM pH7. 2的無菌PBS稀釋至中和抗體效價為1 512 ；然后加入吐溫80 (從商業途徑獲 得)，吐溫80與稀釋后的中和抗體的比例1 9999，至吐溫80終濃度為0. 01 % (V/V)作為 保護劑，加入方式為逐滴加入，邊加邊攪拌，攪拌均勻后無菌條件下分裝成成品。實施例3步驟(5)A中將步驟(4)所收集的蛋黃與無菌水1 1(V/V)混合后攪拌均勻，65°C 密封滅活10分鐘后迅速冷卻至8°C ；其余步驟同實施例2。實施例4步驟(5)A中將步驟(4)所收集的蛋黃與無菌水1 1(V/V)混合后攪拌均勻，65°C 密封滅活10分鐘后迅速冷卻至12°c ；其余步驟同實施例2。本發明所述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法采用了抗原性較好的鴨 病毒性肝炎病毒AV21111-20毒種，系從中國獸藥監察所購買的AV21111毒株在10日齡SPF 雞胚傳代20代后獲得，接種后雞胚后，雞胚一般穩定在48-96小時左右死亡；且本發明所述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法采用了水稀釋硫酸銨兩 部沉淀法來沉淀分離卵黃抗體，然后用截留量為IOOku的超濾膜除鹽濃縮，該法易于大規 模生產，且所得到的抗體純度高、效價高、特異性強，為鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的 制備提供了新的思路。上述參照實施例對該一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法進行的詳 細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫 離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，其特征在于具體步驟為(1)分離高免雞蛋蛋黃；(2)提取卵黃抗體；(3)配制制劑及包裝。
2.根據權利要求1所述的鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，其特征在于 具體步驟為(1)分離高免雞蛋蛋黃收集高免雞蛋用70%(V/V)的乙醇進行蛋殼表面消毒，晾干后 送入蛋清蛋黃分離機進行蛋黃分離；(2)提取卵黃抗體A:將步驟(1)所收集的蛋黃與無菌水1 1(V/V)混合后攪拌均勻，65°C密封滅活10 分鐘后迅速冷卻至8°C _12°C，然后與無菌水以1 4的比例混合(V/V)，IM的HCl調節pH 至5. 2，充分攪勻后4°C靜置6小時，5000rpm離心20分鐘，取上清；B:將步驟A所得上清液與飽和硫酸銨溶液以1 1(V/V)的比例混合，4°C靜置12小 時，SOOOrpm離心20分鐘，取沉淀；按質量比為1 3的比例將沉淀用無菌水溶解，所得溶 液和飽和硫酸銨溶液以2 1 (V/V)的比例混合，4°C靜置12小時，8000rpm離心20分鐘，取 沉淀，按質量比為1 3的比例將沉淀用0. OlM pH7. 2的無菌PBS溶解；C 將步驟B所得溶解液用截留量為IOOku的超濾膜除鹽濃縮；D 將40% (V/V)的甲醛溶液與步驟C所得濃縮液混合，使甲醛的終濃度達到0. 1% (V/ V)；充分攪拌均勻后密封2小時；然后用0. 45微米和0. 22微米的微孔濾膜分別過濾，取濾 液4°C保存備用；(3)配制制劑及包裝將步驟( 所得濾液進行鴨病毒性肝炎抗體效價測定，用0.OlM PH7. 2的無菌PBS稀釋至中和抗體效價為1 512 ；然后加入吐溫80，至吐溫80終濃度為 0.01% (V/V)作為保護劑，攪拌均勻后無菌條件下分裝成成品。
3.根據權利要求1或2所述的鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，其特征在 于所述步驟(1)中高免雞蛋是由以下方法獲得的(1)使用禽類專用抗菌肽飼料添加劑連續飼喂健康產蛋雞；(2)制備免疫用油乳劑抗原A 將冷凍保存的鴨肝炎病毒AV2111毒種稀釋后接種10-11日齡SPF雞胚并收集死亡 雞胚，收集胚體病變明顯的雞胚尿囊液；B 將步驟A收集的尿囊液加入終濃度為0. 的福爾馬林密封滅活，取滅活后的尿 囊液與無菌吐溫-80以19 1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂酸鋁以 93 5 2(ff/ff/ff)的比例混合，攪拌均勻后，高壓滅菌20分鐘制成油相；C:將步驟B所制備的水相和油相以5 2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳劑抗原；(3)免疫產蛋雞，制備高免雞蛋將步驟(2)所制備的油乳劑抗原免疫步驟⑴處理過 的產蛋雞，免疫方式為皮下注射，劑量為1毫升/只，免疫次數為3次，第1次與第2次免疫 間隔10天，第2次與第3次免疫間隔14天，將上述經過3次免疫后的產蛋雞正常飼喂七天 后收集雞蛋，即為高免雞蛋。
4.根據權利要求3所述的鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中高免雞蛋是由以下方法獲得的(1)使用禽類專用抗菌肽飼料添加劑連續飼喂健康產蛋雞3周，每日添加一次，日添加 量為基礎日糧的0. -0.3%。(2)制備免疫用油乳劑抗原A 將冷凍保存的鴨肝炎病毒AV2111毒種稀釋200倍后接種10-11日齡SPF雞胚，接種 量為100微升/只，置于37°C培養箱中孵育，48-96小時后收集死亡雞胚，收集胚體病變明 顯的雞胚尿囊液；B 將A步驟收集的尿囊液加入終濃度為0. 的福爾馬林37°C密封滅活48小時，取滅 活后的尿囊液與無菌吐溫-80以19 1(W/W)的比例混合后制成水相；取白油、司本、硬脂 酸鋁以93 5 2(W/W/W)的比例混合，攪拌均勻后，121°C高壓滅菌20分鐘制成油相； C:將B步驟所制備的水相和油相以5 2(V/V)的比例混合，乳化制成免疫用油乳劑抗原；(3)免疫產蛋雞，制備高免雞蛋將步驟(2)所制備的油乳劑抗原免疫步驟⑴處理過 的產蛋雞，免疫方式為皮下注射，劑量為1毫升/只，免疫次數為3次，第1次與第2次免疫 間隔10天，第2次與第3次免疫間隔14天；3次免疫過后，每隔7周進行免疫一次，方式為 皮下注射，劑量為1毫升/只，將上述經過3次免疫后的產蛋雞正常飼喂七天后收集雞蛋， 即為高免雞蛋。
5.根據權利要求4所述的鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，其特征在于 所述高免雞蛋獲得方法的步驟(1)中的禽類專用抗菌肽飼料添加劑為肽輕松B-001禽類專 用制劑。
全文摘要
本發明提供了一種鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，具體步驟為(1)分離高免雞蛋蛋黃；(2)提取卵黃抗體；(3)配制制劑及包裝；所述鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備方法，不僅易于操作，適合大規模生產，且制備的鴨病毒性肝炎卵黃抗體性質穩定、純度高、效價高、特異性較強，無藥殘，溫和環保，對預防鴨病毒性肝炎的預防及治療極具應用價值，為鴨病毒性肝炎精制異源卵黃抗體的制備提供了新的思路。
文檔編號A61K39/42GK102078609SQ20101060301
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者張樹偉, 李小雙, 秦文安, 范文輝, 陳業金 申請人:天津康萊森生物科技集團有限公司