專利名稱：一種提高疫苗生產(chǎn)中雞毒支原體增殖能力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種改進的提高雞毒支原體增殖能力的方法，具體地說，是一種適用于雞毒支原體疫苗生產(chǎn)，用于提高雞毒支原體增殖能力的培養(yǎng)方法。屬生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞毒支原體病是由雞毒支原體(Mycoplasma gallis印ticum，簡稱MG)引起的雞、 火雞慢性呼吸道病(Chronicrespiratory disease，CRD)。臨床上主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕， 呼吸時發(fā)出羅音，嚴重時張口呼吸。隨著養(yǎng)雞規(guī)模加大、飼養(yǎng)方式改變和飼養(yǎng)密度提高，該病的發(fā)病率越來越高。據(jù)統(tǒng)計，雞毒支原體感染雞群后，雛雞的弱雛率增加10%左右，蛋雞的產(chǎn)蛋率下降10 20%，肉雞的體重減少38%，出欄期延長，飼料轉(zhuǎn)化率降低，感染雞群的免疫受到抑制并引起其它疾病的繼發(fā)或伴發(fā)，可間接地引起大量的藥費開支，是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。目前對支原體感染的防治主要在于藥物治療、疫苗預防及健康畜群的建立。用藥物治療CRD雖然有效，但不能清除帶菌狀態(tài)，又有藥物殘留的弊??；有效的疫苗免疫是防控該病的重要手段，疫苗免疫研究成為不可忽視的領(lǐng)域。目前雞毒支原體疫苗生產(chǎn)中，培養(yǎng)雞毒支原體主要應用改良Frey氏培養(yǎng)基或其他支原體培養(yǎng)基。其制苗用菌液培養(yǎng)工藝為將合格的雞毒支原體生產(chǎn)用種子按10%的量接種于培養(yǎng)基，逐步擴大培養(yǎng)，一直到所需的量；每代均置36 37°C培養(yǎng)24 48h，待培養(yǎng)基的PH下降到7. 0左右收獲；按此傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝所獲得的雞毒支原體制苗用菌液(半成品) 的菌液濃度最高只能達到1. OX 109(XU/ml。以上述傳統(tǒng)培養(yǎng)基及培養(yǎng)工藝所培養(yǎng)的雞毒支原體增殖能力差、培養(yǎng)滴度低(培養(yǎng)菌液濃度低)，制苗用菌液(半成品)生產(chǎn)滅活疫苗時不能直接使用，需對半成品進行一定濃縮后方可制備成品疫苗，而半成品的濃縮操作繁瑣、濃縮過程損失較大，最終影響成品疫苗的保護效力，并且使疫苗生產(chǎn)成本提高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題是提供一種提高疫苗生產(chǎn)中雞毒支原體增殖能力的方法， 用以提高雞毒支原體增殖能力及菌液滴度。本發(fā)明所述問題是以下述技術(shù)方案解決的
一種提高疫苗生產(chǎn)中雞毒支原體增殖能力的方法，所述疫苗經(jīng)種子制備、雞毒支原體培養(yǎng)基配制、制苗菌液制備及滅活疫苗制備工序制成，改進后，所述雞毒支原體培養(yǎng)基按如下工藝配制
PPLO 肉湯23. 0 26. Og,
葡萄糖8. 0 10. 0g，
質(zhì)量濃度為1%的醋酸鉈溶液10ml，
質(zhì)量濃度為25%的酵母浸出液100ml，
質(zhì)量濃度為1%的酚紅溶液1. 0 2. 0ml，
3用去離子水定容到790 840ml，在115°C滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入以下成份
質(zhì)量濃度為10%的精氨酸溶液(已過濾除菌) 10ml， 豬血清150 200ml，
青霉素80 120萬單位，
用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7. 6 7. 8。上述提高疫苗生產(chǎn)中雞毒支原體增殖能力的方法，所述制苗用菌液培養(yǎng)按如下步驟進行
(1)將雞毒支原體生產(chǎn)用種子按10%體積量接種于所述支原體培養(yǎng)基中，在36 37°C 培養(yǎng)16 18h收獲；選取收獲菌液體積量的10%，以同體積培養(yǎng)基、同樣方法再傳代1次；
(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基，36 37°C培養(yǎng)24 48h，待培養(yǎng)基的PH下降到7. 0左右收獲。依照此法逐步擴大培養(yǎng)，一直到所需的量，此菌液作為半成品即可用于制備疫苗。本發(fā)明將上述半成品菌液進行活菌數(shù)測定，獲得的雞毒支原體菌液濃度可達 1.0X1013 CCU/ml 1. 0 X 1014CCU/ml。本發(fā)明在傳統(tǒng)雞毒支原體培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，改良了培養(yǎng)基，改進了培養(yǎng)工藝， 提高了雞毒支原體增殖能力及菌液滴度(由原來的1. OX 108 9CCU/ml提高到了目前的 1.0X1013(XU/ml 1. 0 X 1014(XU/ml )，培養(yǎng)的制苗用菌液可以直接或稀釋后制備成品疫苗，免除了濃縮工藝，解決了傳統(tǒng)方法培養(yǎng)雞毒支原體增殖能力差，菌液滴度低，濃縮成本高、操作繁瑣等問題。本發(fā)明經(jīng)實驗證明，有下述優(yōu)點
1、本發(fā)明用改良的支原體培養(yǎng)基及改進的增殖培養(yǎng)工藝培養(yǎng)雞毒支原體，提高了菌體的增殖能力及菌液滴度，菌液滴度高達1. OX 1013(XU/ml 1. 0 X 1014(XU/ml。在培養(yǎng)制苗用菌液時，前兩代采用16 18h的短時間方式培養(yǎng)，培養(yǎng)時間短，產(chǎn)生的衰亡因子或毒素等代謝產(chǎn)物少，可以降低代謝產(chǎn)物的毒性作用對菌體增殖活力的影響，提高菌體增殖活力，將這種高活力的支原體培養(yǎng)物在含有充足營養(yǎng)的條件下進行擴大培養(yǎng)，可使菌液濃度大大提尚ο2、以本發(fā)明方法培養(yǎng)的雞毒支原體菌液無需濃縮，可以直接或稀釋后制備成品疫苗；該培養(yǎng)方法應用于雞毒支原體疫苗的生產(chǎn)中，可以簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本。3、應用本方法制備雞毒支原體疫苗，成品疫苗免疫雞群后，免疫效果好，免疫力堅強，能抵御雞毒支原體強毒的攻擊。本發(fā)明除用于雞毒支原體CR株，也可用于雞毒支原體R株或其他菌株。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳述。實施例1
應用雞毒支原體(CR株)分別通過本發(fā)明支原體培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基、改良Frey氏培養(yǎng)基對雞毒支原體進行增殖培養(yǎng) 1、本發(fā)明支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)法a、配制本發(fā)明支原體培養(yǎng)基
PPLO 肉湯23g，
葡萄糖8.0g，
1%醋酸鉈溶液10ml，
25%酵母浸出液100ml，
1%的酚紅溶液1.5ml， 用去離子水定容到840ml，在115°C滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入以下成
份
10%的精氨酸溶液(已過濾除菌)10ml，
豬血清150ml，
青霉素100萬單位，
用氫氧化鈉溶液(2M)調(diào)PH值至7. 8。b、制苗用菌液培養(yǎng)
(1)將雞毒支原體(CR株)生產(chǎn)用種子按10%接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基(1800ml)中， 37°C培養(yǎng)18h收獲；選取收獲菌液的10%，以同體積培養(yǎng)基(1800ml)、同樣方法再傳代1次；
(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基(18000ml)，37°C培養(yǎng) 30h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 1，收獲菌液。繼續(xù)傳代，菌液按10%的量接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基(180000ml)，37°C培養(yǎng)31h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 0，收獲菌液。(3)取適量上述半成品菌液進行活菌數(shù)測定，濃度為1. OX 1014(XU/ml。比較實例
2、支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)法
a、配制“支原體培養(yǎng)基” PPLO肉湯葡萄糖
10%的精氨酸溶液 10倍濃縮MEM培養(yǎng)液 1%醋酸鉈溶液 25%酵母浸出液 8萬單位/ml青霉素豬(馬)血清 1%的酚紅溶液
21. Og, 5. Og, 10. Oml, 10. Oml, IOml, 100ml, 10. Oml, 100ml, 1. Oml,
用去離子水定容至IOOOml，用氫氧化鈉溶液(2M)調(diào)整PH值至7. 8，0. 22微米濾過除菌備用。b、制苗用菌液培養(yǎng)
(1)將雞毒支原體(CR株)生產(chǎn)用種子按10%接種于支原體培養(yǎng)基(1800ml)中，37°C培養(yǎng)44h，培養(yǎng)基的PH下降到7. 0時收獲。(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于支原體培養(yǎng)基(18000ml)，37°C培養(yǎng) 42h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 1，收獲菌液。繼續(xù)傳代，菌液按10%的量接種于支原體培養(yǎng)基(180000ml)，37°C培養(yǎng)42h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 1，收獲菌液。
(3)取適量上述半成品菌液進行活菌數(shù)測定，濃度為1. OX 108(XU/ml。3、改良Frey氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法 a、配制改良Frey氏培養(yǎng)基
(1)基礎(chǔ)液
NaCl5g
KCl0.4g
MgS04 · 7H200. 2g
Na2HP04 · 12H201. 6g
K2HP040. Ig
葡萄糖IOg
乳蛋白水解物5g
溶于1000ml去離子水中，115°C 20分鐘滅菌。(2)培養(yǎng)基
基礎(chǔ)液IOOml
豬血清13ml
25%酵母浸出液IOml
青霉素10萬單位
1% 酚紅0. Iml
1/80醋酸鉈Iml
以IN NaOH調(diào)PH值至7. 7。b、制苗用菌液培養(yǎng)
(1)將雞毒支原體(CR株)生產(chǎn)用種子按10%接種于改良Frey氏培養(yǎng)基(1800ml)中， 37°C培養(yǎng)36h，培養(yǎng)基的PH下降到7. 1時收獲。(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于改良Frey氏培養(yǎng)基(18000ml)，37°C 培養(yǎng)38h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 6. 9，收獲菌液。繼續(xù)傳代，菌液按10%的量接種于改良Frey氏培養(yǎng)基4 (180000ml )，37°C培養(yǎng)37h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7.0，收獲菌液。
藏號為心。
(3)取適量上述半成品菌液進行活菌數(shù)測定，濃度為1.0X109(XU/ml。 所述雞毒支原體名稱為Mycoplasma gallis印ticum，簡稱為MG，菌株為CR株，保 = CGMCC No. 3900，于2010年06月25日保藏在中國微生物保藏委員會普通微生物中
實施例2
應用雞毒支原體(R株)分別通過本發(fā)明支原體培養(yǎng)基、支原體培養(yǎng)基、改良Frey氏培養(yǎng)基對雞毒支原體進行增殖培養(yǎng)。
1、本發(fā)明支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)法 a、配制本發(fā)明支原體培養(yǎng)基
PPLO 肉湯24g，
葡萄糖10.0g，
1%醋酸鉈溶液10ml，
25%酵母浸出液100ml，
61%的酚紅溶液
1. 5ml,
用去離子水定容到790ml，在115°C滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入以下成
份
用氫氧化鈉溶液(2M)調(diào)PH值至7. 7。b、制苗用菌液培養(yǎng)
(1)將雞毒支原體(R株)生產(chǎn)用種子按10%接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基(1800ml)中，， 37°C培養(yǎng)18h收獲；選取收獲菌液的10%以同體積培養(yǎng)基(1800ml)、同樣方法再傳代1次；
(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基(18000ml)，37°C培養(yǎng) 32h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7.0，收獲菌液。繼續(xù)傳代，菌液按10%的量接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基(180000ml)，37°C培養(yǎng)30h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 1，收獲菌液。(3)取適量上述半成品菌液進行活菌數(shù)測定，濃度為1. OX 1013(XU/ml。比較實例
2、支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)法
a、按實施例1中相應方法，配制支原體培養(yǎng)基；
b、制苗用菌液培養(yǎng)
(1)將雞毒支原體(CR株)生產(chǎn)用種子按10%接種于支原體培養(yǎng)基(1800ml)中，37°C培養(yǎng)42h，培養(yǎng)基的PH下降到7. 0時收獲。(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于支原體培養(yǎng)基(18000ml)，37°C培養(yǎng) 39h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 1，收獲菌液。繼續(xù)傳代，菌液按10%的量接種于支原體培養(yǎng)基(180000ml)，37°C培養(yǎng)40h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 1，收獲菌液。(3)取適量上述半成品菌液進行活菌數(shù)測定，濃度為1. OX 109(XU/ml。3、改良Frey氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法
a、按實施例1中相應方法，配制改良Frey氏培養(yǎng)基，調(diào)PH值至7.8 ；
b、制苗用菌液培養(yǎng)
(1)將雞毒支原體(CR株)生產(chǎn)用種子按10%接種于改良Frey氏培養(yǎng)基(1800ml)中， 37°C培養(yǎng)37h，培養(yǎng)基的PH下降到7. 1時收獲。(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于改良Frey氏培養(yǎng)基(18000ml)，37°C 培養(yǎng)36h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7. 1，收獲菌液。繼續(xù)傳代，菌液按10%的量接種于改良Frey氏培養(yǎng)基4 (180000ml )，37°C培養(yǎng)37h，測定培養(yǎng)基的PH下降到了 7.0，收獲菌液。(3)取適量上述半成品菌液進行活菌數(shù)測定，濃度為1. OX 108(XU/ml。實施例3
用實施例1中應用本發(fā)明支原體培養(yǎng)基培養(yǎng)的雞毒支原體(CR株)半成品菌液制備雞毒支原體滅活疫苗，并進行疫苗的安全檢驗和效力檢驗。a、雞毒支原體(CR株)滅活疫苗制備
(1)滅活在雞毒支原體菌液中加入甲醛溶液滅活，34%甲醛溶液滅活培養(yǎng)液=2 1000 (體積體積)，37°C作用20h，每2h搖勻一次。
10%的精氨酸溶液(已過濾除菌) 豬血清
IOml 200ml 100萬單位
青霉素
(2)水相制備取滅菌吐溫-80 4份加入到96份滅活培養(yǎng)液中，在滅活容器內(nèi)搖勻，制得水相物。(3)油相制備取獸用白油94份，加司本-80 6份，混勻后加入2%硬脂酸鋁2份， 加熱至完全溶解后，115°C滅菌40分鐘，冷卻后即得油相物備用。(4)乳化取油相3份加入到膠體磨中，在低速攪拌的同時，緩慢加入水相1份，以 8000r/min攪拌12分鐘，即制得雞毒支原體(CR株)滅活疫苗。b、安全檢驗取40日齡SPF雞8只，大腿肌肉注射疫苗，每只lml，連續(xù)觀察14天。 結(jié)果表明，注苗雞無體溫升高現(xiàn)象，飲食及精神狀態(tài)無異常。注射部位無紅腫、無組織液化及肉芽組織增生等不良反應，注射部位吸收良好。C、效力檢驗取40日齡SPF雞8只，頸背部皮下或大腿肌肉注射疫苗，每只0. 5ml, 30日后，連同條件相同的對照雞6只，在3m2的密室內(nèi)噴霧攻擊R株培養(yǎng)物600ml (每Iml 含109顏色變色單位)，霧滴在2微米左右。觀察14日，剖檢觀察氣囊病變，對其評分，免疫組雞平均氣囊損傷保護率應在60%以上，疫苗判為合格。檢驗結(jié)果，本次生產(chǎn)的疫苗保護率達到100%。
權(quán)利要求
1.一種提高疫苗生產(chǎn)中雞毒支原體增殖能力的方法，所述疫苗經(jīng)種子制備、雞毒支原體培養(yǎng)基配制、制苗菌液制備及滅活疫苗制備工序制成，其特征在于，所述雞毒支原體培養(yǎng)基按如下工藝配制PPLO 肉湯23. 0 26. Og,葡萄糖8. 0 10. 0g，質(zhì)量濃度為1%的醋酸鉈溶液10ml，質(zhì)量濃度為25%的酵母浸出液100ml，質(zhì)量濃度為1%的酚紅溶液1. 0 2. Oml，用去離子水定容到790 840ml，在115°C滅菌20min，待冷卻后，在無菌條件下加入以下成份質(zhì)量濃度為10%的精氨酸溶液(已過濾除菌)10ml，豬血清150 200ml，青霉素80 120萬單位，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7. 6 7. 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高疫苗生產(chǎn)中雞毒支原體增殖能力的方法，其特征在于， 所述培養(yǎng)制苗用菌液按如下步驟進行(1)將雞毒支原體生產(chǎn)用種子按10%接種于所述支原體培養(yǎng)基中，在36 37°C培養(yǎng) 16 18h收獲；選取收獲菌液體積量的10%，以同體積培養(yǎng)基、同樣方法再傳代1次；(2)將上述傳代后的菌液按10%的量接種于本發(fā)明支原體培養(yǎng)基，36 37°C培養(yǎng)24 48h，待培養(yǎng)基的PH下降到7. 0左右收獲；依照此法逐步擴大培養(yǎng)，一直到所需的量，此菌液作為半成品即可用于制備疫苗。
全文摘要
一種提高疫苗生產(chǎn)中雞毒支原體增殖能力的方法，所述疫苗經(jīng)種子制備、雞毒支原體培養(yǎng)基配制、制苗菌液制備及滅活疫苗制備工序制成，改進后，加大了PPLO肉湯、豬血清和葡萄糖含量，去掉了MEM成份，調(diào)整后的培養(yǎng)基成份配比更科學、營養(yǎng)價值更高。本發(fā)明方法制備的半成品菌液濃度高達1.0×1013～CCU/ml～1.0×1014CCU/ml，菌液無需濃縮，可以直接或稀釋后制備滅活疫苗，既簡化了生產(chǎn)工藝，又降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號A61P31/04GK102168073SQ201010566200
公開日2011年8月31日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者劉濤, 楊保收, 焦玉蘭, 趙玉龍, 郁宏偉 申請人:瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司