專利名稱：miRNA-195/497化合物共同作為乳腺癌標志物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小分子RNA，即miRNA-195/497的用途，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微小RNA (miR)是一類高度保守的，非編碼小RNA，通常由19_25核苷酸組成。微小 RNA在多種真核生物體中調(diào)控基因表達，從而調(diào)控多種生物過程，如發(fā)育、分化、代謝、免疫、 細胞增生和調(diào)亡。通常，單鏈的微小RNA通過反向互補堿基結(jié)合到靶基因的3-非翻譯區(qū)而 導(dǎo)致翻譯抑制，mRNA切割及降解。在某些條件下，微小RNA也可以上調(diào)靶基因的的翻。越 來越多的證據(jù)顯示在正常組織和腫瘤組織之間，或者不同腫瘤類型之間，微小RNA和它們 的靶基因的表達是不同的，提示了微小RNA可能在腫瘤生成中起原癌基因或抑癌基因的作 用。
乳腺癌是婦女常見的死亡原因。近年來，研究證實微小RNA和乳腺癌相關(guān)，它們可 能參與腫瘤生成，將來也可能對治療有作用。在乳腺癌中有的微小RNA表達上調(diào)，有的下 調(diào)，如mir-21，mir-155, mir-10b, mir_125b和mir-145，提示它們可能在起原癌基因或 抑癌基因的作用。實驗室研究證實mir-27a和mir-17-釙的原癌作用，以及mir-9-l的抑 癌作用。最近發(fā)現(xiàn)mir-497在乳腺癌中表達下調(diào)。既然mir_195和mir_497都位于染色 體17pl3. 1，位置相近，更有文獻顯示兩者的表達在某些腫瘤中可同時被抑制，因而在乳腺 癌中同時研究mir-195和mir-497的作用會很有義意。
近來研究人員力圖尋找導(dǎo)致微小RNA在腫瘤中表達不平衡的原因。遺傳改變及表 觀遺傳改變都可以使微小RNA表達失調(diào)。啟動子高甲基化是導(dǎo)致特定微小RNA表達靜默的 常見原因。哺乳類的DNA常在CpG的C-5位點在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下被甲基化。這種 表觀遺傳修飾對哺乳類發(fā)育至關(guān)重要，其異常引發(fā)很多疾病，包括癌癥。對于微小RNA，CpG 島的甲基化常常出現(xiàn)在有抑癌基因功能的微小RNA上，比如mir-127，mir-124a, mir-1, mir-148a和mir_34b。所以，在抑癌的微小RNA的啟動子DNA甲基化可能參與腫瘤生成。
M Deep sequencing、qPCR 禾口 northern blot 發(fā)現(xiàn) mir—195 禾口 mir—497 在乳腺癌 中顯著下調(diào)。最早人們發(fā)現(xiàn)Mir-195在心肌肥大時表達上調(diào)，而它的過度表達在轉(zhuǎn)基因鼠 中導(dǎo)致心臟病理性生長和心衰。近來，mir-195被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中表達下調(diào)，比如胃癌， 肝癌，膀胱癌等，提示mir-195可能是一個抑癌基因.研究顯示引入mir-195可以顯著抑制 體外癌細胞形成集落以及裸鼠成瘤。同樣地，mir-497在很多癌癥中也是顯著下調(diào)，比如胃 癌和乳腺癌。
關(guān)于mir-195/497作為乳腺癌的共同標志物的研究和mir-195/497作為乳腺癌一 種抑癌基因的用途未見文獻報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供miR-195/497共同作為乳腺癌臨床診斷標志物的應(yīng)用。
本發(fā)明旨在提供miR-195/497共同作為制備治療乳腺癌藥物的應(yīng)用。
首先，檢測了 mir-195/497在乳腺癌組織和細胞系中的表達情況。圖IA所示臨床 樣品的生理學(xué)組織切片結(jié)果。RNA印跡雜交技術(shù)表明mir-195/497在乳腺癌組織表達下調(diào) (圖 1B)。此外，mir-195/497 在乳腺癌細胞系 MCF7，ZR-75-30，MDA-453，MDA-435，MDA-231 下調(diào)表達，表明其扮演著抑癌基因的角色(圖1B-C)。
為了探討引起miR-195/497在乳腺癌中低表達的機制，我們采用COBRA的方法檢 測人乳腺癌組織和癌旁組織中CpG島的甲基化情況。甲基化酶TaqI消化提示基因組DNA的 甲基化狀態(tài)。5對人乳腺癌組織的分析結(jié)果表明其Taq I位點被顯著甲基化(圖2A)。在乳腺 癌細胞系MCF7和ZR-75-30中也可以觀察到同樣的情況。相反，對照組中CpG18卻未被甲基 化。因此，mir-195/497基因的啟動子區(qū)在乳腺癌中發(fā)生了甲基化。為了確定mir-195/497 的甲基化狀態(tài)，我們采用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化測序的方法檢測了相應(yīng)癌組織和細胞系中的CpG 島。結(jié)果表明乳腺癌組織T2，T3及細胞系ZR-75-30確切發(fā)生了甲基化，而在正常的乳腺 DNA中只散布著一些孤立的甲基化CpG島(圖2B)。此外，去甲基化試劑AZA處理的乳腺癌 細胞系介導(dǎo)了 miR-195/497的表達。因此，因此我們推測mir-195/497基因的啟動子區(qū)甲 基化可能是其在乳腺癌癌中沉默的主要原因。
為了進一步研究miR-195/497在乳腺癌的分子機制，我們對二者的功能進行了分 析。與對照相比，乳腺癌細胞分別轉(zhuǎn)染mir-195/497前體后均能顯著的降低細胞克隆數(shù)(圖 3A)。此外，轉(zhuǎn)染mir-195/497會降低ZR-75-30和MCF7細胞的膠侵襲能力(圖;3B)。同時，過 表達mir-195/497會引起細胞周期Gl延滯和細胞凋亡(圖3D)。這些結(jié)果提示，mir-195/497 可以顯著抑制乳腺癌細胞的腫瘤形成。
miRNAs主要是通過調(diào)控靶基因的表達發(fā)揮其生物學(xué)特性。因此我們對 mir-195/497靶基因進行預(yù)測。結(jié)果表明RAFl可能是mir 195/497的靶基因(圖4B)。 mir-195/497對Rafl位點的保守性甚至比之前驗證的CCNDl作用位點更保守。熒光素酶 報告實驗表明mir-195/497可以顯著抑制RAF-I報告質(zhì)粒熒光的表達，而突變體則不然(圖 4C)。圖4B紅色標示突變位點。miR-195/497轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系ZR-75-30和MCF7，蛋白免 疫印跡技術(shù)分析提示RAFl和磷酸化Erkl/2被顯著抑制(圖4D-E)。
最后，本發(fā)明探討了 mir-195/497在腦膠質(zhì)瘤早期診斷中的意義。如圖5A所示， 與正常對照組和乳腺纖維瘤組相比較，mir-195/497在惡性腫瘤組織中表達顯著降低 (p<0. 0001)，提示mir-195/497可以作為惡性乳腺癌腫瘤早期診斷的共同標志(圖5A)。此 外，在惡性乳腺癌組織Rafl (6/6)，Erkl/2 (6/6)，磷酸化-Erkl/2 (3/6)具有明顯表達(圖 5B)。因此，Rafl與mir-195/497的表達呈負相關(guān)。這進一步證實了 mir-195/497與其靶 標Rafl之間的相互關(guān)系。研究結(jié)果表明，對mir-195/497表達水平同人乳腺癌惡性程度呈 負相關(guān)，系乳腺癌的共同標志物，對乳腺癌臨床早期診斷具有重要的應(yīng)用價值。
本發(fā)明首次證明表明miR-195/497在乳腺癌中表達均顯著下調(diào)，原因是其啟動子 上游CpG島的甲基化所致。結(jié)合靶基因的預(yù)測方法我們發(fā)現(xiàn)miR-195/497在RAFl gene中 有作用位點，熒光素酶報告實驗及免疫印跡證實了 RAFl是miR-195/497的可能靶標。為進 一步研究miR-195/497在乳腺癌發(fā)生過程中的分子機制，構(gòu)建了能分別穩(wěn)定表達miR-195 和miR-497的乳腺癌細胞株。在此基礎(chǔ)上，進一步證實了 RAFl是miR-195/497的直接靶 標。為探討miR-195/497在乳腺癌早期診斷中的意義，對乳腺癌臨床各期標本進行了定量研究。首次證明發(fā)現(xiàn)mir-195/497的表達水平和乳腺腫瘤的良惡性負相關(guān)，故可作為乳腺 癌臨床診斷共同標志物。
圖1，Mir-195/497在人乳腺癌組織和細胞系中下調(diào)表達。
A)H&E染色對乳腺癌組織的病理檢測。正常的乳腺癌組織包含高度分化的腺細胞 和乳管，而在乳腺癌中，未完全分化的細胞呈過度生長并且侵入到乳導(dǎo)管中。
B)Northern印跡雜交分析miR-195/497的表達。miR-195/497在正常的乳腺組 織高表達而在乳腺癌中則明顯下調(diào)。C1-C5代表MCF7，ZR-75-30, MDA-453, MDA-435, MDA-231。
C)實時定量PCR檢測mir-195，mir-497和mir-21成熟體的表達，U6作為標準化 對照。每個數(shù)據(jù)重復(fù)3次，平均值士方差，*，P<0.01 t檢驗。
圖2，miR-195/497在人乳腺癌組織及細胞系中的DNA甲基化分析。
A)人乳腺癌組織及細胞系的COBRA分析。基因組DNA用亞硫酸氫鹽處理，PCR擴 增，然后以TaqI酶消化。+代表TagI酶消化；-代表不用TaqI酶消化。N，癌旁組織；T，腫 瘤組織。
B)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化測序分析17號染色體miR-195/497上游18個CpG島在腦膠質(zhì) 瘤及細胞系中的甲基化狀態(tài)。■甲基化CpG島；□未甲基化CpG島。
C)實時定量PCR分析miR_3k在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(AZA，5_氮雜_2’ -脫氧 胞嘧啶核)處理前后的乳腺癌細胞系中的表達差異。
圖3，miR-195/497抑制乳腺癌細胞的生長和浸潤。
A)軟瓊脂克隆實驗分析MCF7和ZR-75-30細胞系轉(zhuǎn)染mir-195/497與對照組的差異。
直徑大于50um的克隆將被計數(shù)(10X)，實驗重復(fù)3次。
B)腦膠質(zhì)瘤細胞系MCF7和ZR-75-30轉(zhuǎn)染miR-195及miR_C的基質(zhì)膠侵襲實驗分 析(X200)。Mir-195轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞系呈顯著下降*，Ρ<0· 05。
C)流式細胞計數(shù)分析ZR-75-30的細胞周期分布。Mir-195/497過表達的乳腺癌 細胞呈顯著的Gl期延滯(P<0. 01 t檢驗)。
D)蛋白免疫印跡檢測激活型Casp3和PARP在mir 195/497過表達乳腺癌細胞系中 的表達情況。Caspase 3和PARP在轉(zhuǎn)染mir-195/497的乳腺癌細胞系ZR-75-30中被剪切 激活，暗示mir-195/497介導(dǎo)了細胞凋亡。
圖4，RAFl 是 mir-195/497 的直接靶標。
mir-195/497在染色體上的分布。
B)圖示miR-195/497對RAFl的預(yù)測位點及其在不同物種中的保守情況。首先通 過MiRanda vl. Ob (Enright et al. 2003)預(yù)測軟件針對miR-195/497可能作用靴基因的 3’UTR和CDS區(qū)域進行搜索，然后在UCSC的基因組窗口瀏覽器中分析預(yù)測位點的保守型情 況(NCBI36/hgl8，http://genome, ucsc. edu/,紅色框標示相應(yīng)預(yù)測位點)。Rafl位點的保 守性要好于之前發(fā)表的mir-195/497的靶標CCNDl。
C)RAF-1在mir-195/497過表達乳腺癌細胞中的熒光素酶報告實驗。過表達miR-195/497顯著抑制了 RAF-I載體的熒光表達。(n=3, *p < 0.05)。
D)蛋白免疫印跡分析RAFl在mir-195/497轉(zhuǎn)染的乳腺癌細胞株中的表達。 Mir-195/497轉(zhuǎn)染后RAFl的表達顯著下調(diào)。Rafl的表達模式同CCNDl呈一致性。
E)RAF-1及其下游基因在mir-195/497過表達的MCF7細胞株中的蛋白印跡結(jié)果。
miR- 195/497可以顯著抑制RAF-1，ERK1/2，磷酸化的ERK1/2的表達。
F)慢病毒miR-195/497轉(zhuǎn)染MDM231后的表達情況。半定量RT-PCR表明轉(zhuǎn)染后的 細胞顯著表達miR-195/497，2%DNA瓊脂糖電泳結(jié)果見圖。同時mir-195/497轉(zhuǎn)染后細胞生 長緩慢且生存期變短。
G)蛋白免疫印跡分析Rafl在MDM231中的表達。同另一癌基因CCNDl相似，Rafl 在mir-195/497轉(zhuǎn)染48小時后被顯著抑制，Beta-actin作為參照。
圖5，mir-195/497在人乳腺癌中的表達同惡性程度負相關(guān)。
A)實時定量PCR分析mir-195/497在原發(fā)性乳腺癌中的表達。正常組織來源于無 病個體(n=9)；纖維乳腺瘤(n=9)；侵襲性導(dǎo)管瘤(n=23)。U6 rRNA作為標準化對照。相對 于正常組織mir-195/497在惡性瘤(p=0. 0306)和早期瘤(ρ《0. 0001》中呈顯著下調(diào)。
B)蛋白免疫印跡分析Rafl及其下游基因在乳腺癌組織中的表達。橫線代表中位 值。惡性乳腺癌具明顯表達的蛋白有Raf 1 (6. /6)，Erkl//2 (6/6)和磷酸化Erkl/2 (3//6)。
具體實施方式
1.乳腺癌臨床樣品采集正常乳腺組織樣品及腦膠質(zhì)瘤組織樣品由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院和北京協(xié)和醫(yī)院乳 腺外科組織樣品庫提供。組織樣品經(jīng)手術(shù)取出后，以PBS或生理鹽水清洗三次后迅速切成 小塊，大部分樣品于2ml凍存管中置液氮中保存?zhèn)溆?。小部分用多聚甲醛固定后用于組織 切片分析。用于分子分析的樣本在液氮中研磨為粉末后分別提取RNA或蛋白質(zhì)。
2. RNA抽提每100 mg組織加入1 mL Trizol，用液氮研磨充分研碎組織塊。加 入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右，室溫下靜置5分鐘。4°C，12，000 rpm 離心15分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清液入新的1. 5ml離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻， 室溫靜置10分鐘。4°C，12000 rpm離心10分鐘后，去上清，向沉淀中加入2/5體積的70% 乙醇，4°C，12000 rpm離心洗滌沉淀5分鐘。去上清，將沉淀室溫晾干后加入適量無RNA酶 的水充分溶解，測定0D260和0D280值。采用無RNA酶的DNA酶I處理，QIAGEN RNeasy試 劑盒純化總RNA，詳細操作原理和方法見試劑盒說明書。瓊脂糖膠電泳評價總RNA質(zhì)量，在 凝膠成像儀上觀測、拍照，保存圖像，一般認為^S: 18S彡2可以初步判定總RNA質(zhì)量較好。
3. QR-PCR 檢測方法miRNA 的 qPCR 檢測使用 invitrogen 的 iTrizol 抽提總 RNA， 定量并質(zhì)檢。取50-100ng總RNA為模板，使用針對特定miRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物及invitrogen 的 Superscript III First-Strand Synthesis System 試劑盒合成 cDNA。以 cDNA 為模 板，使用針對目標miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R) Premix Ex TaqTM熒光定量PCR 體系，在stratagen MX3000P定量PCR儀上進行擴增，并測得樣品的Ct值。將所得Ct值通 過代入測定標準曲線得出的公式，采用絕對定量的計算方法得出樣品中的目標miRNA的含 量。TO基因作為內(nèi)照對miRNA qPCR檢測結(jié)果進行標準化校正。對于預(yù)測中的目標基因的 qPCR檢測使用invitrogen的1Trizol抽提總RNA，定量并質(zhì)檢。取3 μ g總RNA為模板，以隨機寡核苷酸為引物，使用 invitrogen 的 Superscript Ill First-Strand Synthesis System試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，使用針對目標基因的特異引物及Takara的 SYBR (R) Premix Ex TaqTM 熒光定量 PCR 體系，在 stratagen MX3000P 定量 PCR 儀上進行 擴增，并測得樣品的Ct值。同時測定待測樣品中的看家基因(如肌動蛋白、GAPDH)的 Ct值，以此來校正各組樣品之間上樣量差別，將所得數(shù)據(jù)標準化后進行比較各組之間目的 基因的變化(即相對定量法)。
4.細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞株 DA-MB-231, MDA-MB-435s, MDA-MB-453, ZR-75-30, SK-BR-3, T47D和MCF 7在MEM培養(yǎng)基(Gibco, CA)中細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)基含有 10% 的FBS(PAA Laboratories, Linz, Austria)、青霉素(100 單位/mL)和鏈霉素(100 ng/ mL)。細胞培養(yǎng)在含有10% FBS,2 mM L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)。 所有細胞置37°C培養(yǎng)箱、5%C02培養(yǎng)。
5.細胞轉(zhuǎn)染microRNA前體購自美國Ambion公司，轉(zhuǎn)染另設(shè)正常對照組，miRNA 前體組和miRNA前體通用陰性對照組。細胞于鋪板18-24h后至70%_80%融合開始轉(zhuǎn) 染，所用試劑為Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 0轉(zhuǎn)染按本室常規(guī)方法并參照說明 書進行。細胞于鋪板18_24h后約有70%-80%融合開始轉(zhuǎn)染，所用試劑為Lipofectamine 2000 (Invitrogen).具體轉(zhuǎn)染方法參照說明書進行，寡核苷酸及siRNA的工作濃度均為 1OOnmol/L。
6.體外侵潤實驗MCF 7和ZR-75-30細胞分別用miRNA_195/497轉(zhuǎn)染。，轉(zhuǎn)染48 h后的細胞(5X 104個)懸浮于含5% BSA的MEM培養(yǎng)基中，接種于鋪有膠原膜的M孔培養(yǎng) 板中，置于培養(yǎng)箱上層培養(yǎng)M h，未吸附的細胞用棉簽小心移除。侵入膠原膜下表面的細胞 用細胞染色劑染色，繼而計數(shù)，最終用微孔板讀取器于560 nm處定量測定。
7.流式細胞周期分析MCF 7和ZR-75-30細胞以30%密度接種于12孔培養(yǎng)板 中培養(yǎng)M h。分別轉(zhuǎn)染miR-195和miR-497前體(100 nM)。轉(zhuǎn)染M h后，用諾考達唑 (nocodazole)處理18 h。接著收集細胞并用70%的乙醇于4°C下固定M h。固定后的細胞 用PBS洗滌后再分散于含有10 mg/mL碘化丙錠和50 mg/mL RNase的PBS溶液中(500 mL), 室溫下培養(yǎng)30 min。所得細胞用流式細胞儀進行分析測定(BD FACSaria cell sorter, BD Bioscences, San Jose, CA, USA)。
8. 蛋白印跡實驗將分別轉(zhuǎn)染miR-195和miR-497前體(100 nM) MCF 7和 ZR-75-30細胞于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h。收集細胞，抽取蛋白液進行PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。多 克隆抗體 RAFl (Santa Cruz, CA, USA)和 CCNDl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)按照使用說明書稀釋并于4° C下孵育過夜。隨后與AP-標記的兔抗山羊IgG 二 級抗體室溫下孵育2 h。最后采用BCIP/NBT (Ameresco)顯色并用Labworks Instrument software (UVP LLC，Upland, CA)進行定量分析。β -肌動蛋白表達水平作為內(nèi)參照。
9.熒光素酶報告實驗人源Rafl和CCNDl基因3’UTR用下列引物進行PCR擴增 RAF1-3UTR-F: 5' -GAATTCGCAATGAAGAGGCTGGTA-3‘，RAF1-3UTR-R: 5’ - CTCGAGGCCCAAAGGG ATAGAAA-3，， CCND1-3UTR-F 5' -GGTACCGTTTGGCGTTTCCCAGAGT-3’ CCND1-3UTR-R: 5' -CGTCTAGATGGCTAAGTGAAGCATGAGG-3，。
PCR 擴增產(chǎn)物克隆到 pmd_19t 載體(TaKaRa)，繼而克隆到 pGL3_Control vector(Promega)熒光素下游。核苷酸替換突變基于PCR的方法(KOD-Plus-Mutagenesis Kit, ΤΟΥΟΒΟ) ο 引物為Mut 3' UTR of CCNDl 5' - CGACGAACCGTTGACTTCCAGGCAC-3‘禾口 5’ - GCAATAAGAAAATGGAGCTGCGGCCT-3’ ；Mut 3’ UTR of RAFl 5’ - CGACGAGCTAAGGACCTTCTAGACT -3，禾口 5’ - TTCTCTGAAAACATGTGTTC TGCCTC -3’。
上述質(zhì)粒載體采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)分別與 miR-195 和 miR-497前體共轉(zhuǎn)染ZR-75-30細胞，48小時后按Promega提供的方法處理細胞，在多功能 酶標儀(BioTek)讀取熒光值。所有實驗結(jié)果重復(fù)三次。
10.組合亞硫酸氫鈉限制分析實驗(COBRA)和亞硫酸氫鈉測序?qū)嶒灢捎?California Santa Cruz (UCSC)大學(xué)數(shù)據(jù)庫測定CpG島(CGI)跨越miRNA_3k基因。用于 CGI的組合亞硫酸氫鈉限制分析(COBRA)采用Methprimer 6軟件設(shè)計。亞硫酸鈉轉(zhuǎn)換的基 因組(只能將非甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為脲嘧啶)用引物的特定鏈進行擴增，繼而用甲基化敏 感酶進行消化。純化的PCR產(chǎn)物克隆到pMD19 - T載體(TaKaRa:D102A)進行測序。用于 CGI PCR擴增引物序列為mir-195/497-CG-BSFl GTGTTTATTTGTAGTGATTT, mir-195/497-CG-BSRl TAACTCCCTCAATCTCTTATTCTT.11.慢病毒制備和滴度測定在10厘米的組織培養(yǎng)板，QygWpLemir -195 (Openbiosystems) pLemir - 497 (Openbiosystems) J^ RU ^ ^26ul (Openbiosystems)共轉(zhuǎn)染的 187.5 微升 Arrest-In transfection reagent (Openbiosystems)感染6 X 106 HEK293T。轉(zhuǎn)染48和72小時后收集含有該病毒培養(yǎng)上 清，用0. 45微米的過濾器filted和病毒儲存分裝。病毒滴定于轉(zhuǎn)染前一天在M孔組織培 養(yǎng)板培養(yǎng)HEK293T細胞(5 X 104)，稀釋后的病毒液分別用于感染細胞，感染后48小時后， 統(tǒng)計每毫升RFP表達細胞數(shù)，計算病毒滴度。
12.統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)取平均值t SE利用Microsoft Excel中的Dunnett，s 法進行數(shù)據(jù)分析。取雙尾P<0. 05認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
權(quán)利要求
1.miRNA-195/497化合物共同作為乳腺癌臨床診斷標志物的應(yīng)用。
2.miRNA-195/497化合物共同作為制備治療乳腺癌藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及乳腺癌新的標志物miR-195/497的用途。首次證實了miR-195/497在乳腺癌中表達均顯著下調(diào)的原因是miR-195/497基因啟動子CpG島的甲基化所致。同時，本發(fā)明也首次證實了乳腺癌中RAF致癌因子1是miR-195/497共同的直接作用靶標，過表達miR-195/497均能顯著抑制乳腺癌細胞的增殖和浸潤。進一步對乳腺癌臨床樣本進行定量研究證明miR-195/497的表達水平和乳腺腫瘤的良惡性程度呈顯著負相關(guān)。本發(fā)明研究結(jié)果表明miR-195/497能作為乳腺癌早期診斷的共同標志物或乳腺癌治療的靶標。
文檔編號A61P15/00GK102031310SQ20101056479
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者劉順英, 李丹, 賴立輝, 趙宇嵐, 陳小娜 申請人:華東師范大學(xué)