專利名稱：一種提高骨形態發生蛋白與煅燒骨載體復合效率的方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學材料的制備領域。特別是指一種提高骨形態發生蛋白與煅燒骨載體復合效率的方法。
背景技術：
骨形態發生蛋白(bone morphogenet ic protein，簡稱BMP)是一種具有獨特誘導成骨功能的機體蛋白因子，在機體骨組織再生和修復過程中發揮著關鍵作用。現在已可從牛、馬、豬、羊、兔、鼠和人骨或骨肉瘤中生化提取不同種屬來源的骨形態發生蛋白(BMP)，或利用生物工程技術制備基因重組的人的骨形態發生蛋白(BMP)。利用其誘導成骨活性，有望實現人體斷骨的快速再生連接和缺骨的快速再生修復，在骨科和口腔科臨床具有廣泛的應用前景，并具有重大的經濟和社會效益。為了充分發揮骨形態發生蛋白(BMP)的獨特的誘導成骨活性并取得良好的臨床治療效果，需要使骨形態發生蛋白(BMP)與適當的載體復合后使用。載體的作用是多方面的它為被骨形態發生蛋白(BMP)誘導轉化的新生成骨細胞提供附著位點；在骨組織再生和功能重建過程中提供充填、連接、支撐和定位作用；還起到骨形態發生蛋白(BMP)緩釋和引導成骨方向和確定成骨范圍的作用。載體材料應具有良好的生物相容性和安全性，不引起免疫炎癥反應，并易于被組織吸收和同化。煅燒骨與骨形態發生蛋白(BMP)復合有物理和化學兩方面作用。骨形態發生蛋白 (BMP)溶液通過浸泡被吸納入煅燒骨的多孔結構，然后換液使水不溶性的骨形態發生蛋白 (BMP)沉積于其中是物理吸附作用；通過調整骨形態發生蛋白(BMP)溶液的離子強度和pH 值使帶電荷的骨形態發生蛋白(BMP)分子與煅燒骨的無機鈣離子發生電性結合或者使骨形態發生蛋白(BMP)與羥基磷灰石發生非特異性吸附是化學吸附作用。復合效率的高低對骨形態發生蛋白(BMP) —煅燒骨活性復合材料的生理作用有著直接的影響。現有骨形態發生蛋白(BMP)與煅燒骨復合時一般是將水不溶性的骨形態發生蛋白(BMP)用高濃度的強變性劑，如4 mol鹽酸胍溶解后，浸泡預成型的煅燒骨塊，然后透析換液，使骨形態發生蛋白(BMP)沉淀吸附于載體中，最后凍干保存。這種復合方式主要依靠物理浸潤沉積作用和化學非特異性吸附作用。高濃度的鹽酸胍溶液具有很高的離子強度， 不利于骨形態發生蛋白(BMP)分子與載體上無機鈣離子的電性吸附。透析換液的過程緩慢，需要多次反復透析才可能將胍完全除去。
發明內容
本發明的目的是為了克服上述技術問題，提出一種提高骨形態發生蛋白與煅燒骨載體復合效率的方法。對于從事生物醫學材料的人都清楚，煅燒骨是骨形態發生蛋白(BMP)的較好的載體，而煅燒骨的制備是用動物骨骼經過化學處理和高溫煅燒后制成的一種載體材料。它來源于骨，經處理和煅燒后去除了有機成分而保留了骨的無機成分(主要是羥基磷灰石)，經煅燒的松質骨還保留了天然形成的立體多孔網架貫通性骨梁結構。因此，煅燒骨在成分和結構上都與機體骨組織十分接近，有極好的組織相容性，可被新生骨組織完全同化；其天然的多孔網架立體結構有助于細胞的附著和遷移，具有出色的傳導成骨的作用；經高溫煅燒后整體仍保留一定的機械強度，具有一般天然可降解有機材料無法替代的抗壓支撐作用， 在缺骨充填、斷骨連接和矯形支撐定位等方面都有很大的應用價值；經高溫煅燒后去除了有機成分，不會產生免疫排異反應。煅燒骨的主要成分是羥基磷灰石，易于與骨形態發生蛋白(BMP)等骨基質蛋白吸附結合，是一種性能優良的載體材料。根據本發明方法的目的和煅燒骨載體的特點，我們的具體解決方案是由兩部組成，其特征在于(1)煅燒骨載體的制備是取新鮮牛骨或豬骨股骨骺端去肌肉和筋膜，O. 5 m01 NaoH浸泡，30%雙氧水漂白，3 :1氯仿甲醇脫脂，干燥后切削預成型，再置于馬弗爐中， 先緩慢加溫至600。c并恒溫，將有機質基本煅燒除去，緩慢降至常溫；再升溫至11 0(TC并恒溫煅燒，使材料部分陶瓷化以提高強度，緩慢降至常溫，切磨修整成型；
(2)煅燒骨與骨形態發生蛋白(BMP)復合是先將骨形態發生蛋白(BMP)溶解于含6— 8 mol尿素的磷酸鹽緩沖液pH7. 2，離心后取上清浸泡煅燒骨載體，浸泡并攪動24小時，然后根據體積加入無水乙醇至終濃度85% (V / V)，經充分混勻后再于-70。C放置2小時，使骨形態發生蛋白(BMP)沉淀出來，漩渦振蕩后離心，用85%乙醇洗滌3— 5遍，用無水乙醇洗滌3遍，凍干保存。采用本發明方法所制備的煅燒骨與骨形態發生蛋白(BMP)復合后具有以下特點， 首先是利用了煅燒骨材料在結構和組成成分上與天然骨組織十分相近的特點，使骨形態發生蛋白(BMP)與載體材料構成的活性復合體能夠彼此協同促進，更好地發揮誘導成骨的作用。其次尿素在溶液中并不解離，故此8 m01尿素溶液的離子強度很低，有利于骨形態發生蛋白(BMP)分子與煅燒骨中的羥基磷灰石發生電性吸附；在pH7. 2的磷酸鹽緩沖液中，PH值為5. 5的骨形態發生蛋白(BMP)分子帶負電荷，易于與羥基磷灰石中帶正電荷的 Ca2+離子相結合。提高了復合效率。再有85%乙醇沉淀和洗滌可以快速除去變性劑尿素，同時起到消毒作用。總之骨形態發生蛋白(BMP)依靠物理和化學的多方面協同作用與煅燒骨載體相復合，提高了復合效率，也縮短了復合操作所需的時間。
具體實施方式
冶金部鋼鐵研究總院生物材料與工程中心于1996年用豬和牛的股骨松質骨按照上述方法制備了一批煅燒骨材料。通過與提純骨形態發生蛋白(BMP) 復合，按照上述方法制成骨形態發生蛋白(BMP) —煅燒骨活性復合材料。經小鼠骨囊腫充填實驗，表明這種復合劑型易于成型和復合，具有良好的生物相容性和安全性，成骨效果良好。實施例1
本發明實施例首先是煅燒骨載體的制備應取新鮮的豬骨股骨后端，去肌肉和筋膜，ο. 5 mol NaoH浸泡，30%雙氧水漂白，3 1氯仿甲醇脫脂，干燥后切削預成型，再置于馬弗爐中， 先緩慢加溫至600。C并恒溫，將有機質基本煅燒除去，緩慢降至常溫；再升溫至11 00。C并恒溫煅燒，使材料部分陶瓷化以提高強度，緩慢降至常溫，切磨修整成型。然后是煅燒骨與骨形態發生蛋白的復合，是將骨形態發生蛋白(BMP)溶解于含6 m01尿素的磷酸鹽緩沖液PH7. 2，離心后取上清浸泡煅燒骨載體，浸泡并攪動24小時，然后根據體積加入無水乙醇至終濃度85% (V / V)，經充分混勻后再于-70。C放置2小時，使骨形態發生蛋白(BMP)沉淀出來，漩渦振蕩后離心，用85%乙醇洗滌3— 5遍，用無水乙醇洗滌3遍，凍干保存。
實施例2
本發明實施例首先是煅燒骨載體的制備應取新鮮的牛骨股骨后端，去肌肉和筋膜，ο. 5 m01 NaOH浸泡，30%雙氧水漂白，3 1氯仿甲醇脫脂，干燥后切削預成型，再置于馬弗爐中， 先緩慢加溫至600。C并恒溫，將有機質基本煅燒除去，緩慢降至常溫；再升溫至1100。C并恒溫煅燒，使材料部分陶瓷化以提高強度，緩慢降至常溫，切磨修整成型。然后是煅燒骨與骨形態發生蛋白的復合，是將骨形態發生蛋白(BMP)溶解于含8 mol尿素的磷酸鹽緩沖液 PH7. 2，離心后取上清浸泡煅燒骨載體，浸泡并攪動24小時，然后根據體積加入無水乙醇至終濃度85% (V / V)，經充分混勻后再于-70。C放置2小時，使骨形態發生蛋白(BMP)沉淀出來，漩渦振蕩后離心，用85%乙醇洗滌3— 5遍，用
無水乙醇洗滌3遍，凍干保存。
權利要求
1.一種提高骨形態發生蛋白與煅燒骨載體復合效率的方法，其特征在于該方法是由煅燒骨的制備和煅燒骨載體與骨形態發生蛋白的復合兩部份組成。
2.根據權利要求1所述的一種提高骨形態發生蛋白與煅燒骨載體復合效率的方法，其特征在于煅燒骨載體的制備是取新鮮牛骨或豬骨股骨骺端，去肌肉和筋膜，0.5 mol NaoH 浸泡，30%雙氧水漂白，3 1氯仿甲醇脫脂，干燥后切削預成型，再置于馬弗爐中，先緩慢加溫至600。C并恒溫，將有機質基本煅燒除去，緩慢降至常溫；再升溫至11 0(TC并恒溫煅燒， 使材料部分陶瓷化以提高強度，緩慢降至常溫，切磨修整成型。
3.根據權利要求1所述的一種提高骨形態發生蛋白與煅燒骨載體復合效率的方法，其特征在于煅燒骨與骨形態發生蛋白的復合是將骨形態發生蛋白(BMP)溶解于含6—8 mol 尿素的磷酸鹽緩沖液PH7. 2，離心后取上清浸泡煅燒骨載體，浸泡并攪動M小時，然后根據體積加入無水乙醇至終濃度85% (V / V)，經充分混勻后再于-70。C放置2小時，使骨形態發生蛋白(BMP)沉淀出來，漩渦振蕩后離心，用85%乙醇洗滌3— 5遍，用無水乙醇洗滌3 遍，凍干保存。
全文摘要
本發明所涉及的是生物醫學材料的制備領域。特別是一種提高骨形態發生蛋白與煅燒骨載體復合效率的方法。本發明方法是采用(1)煅燒骨的制備，(2)煅燒骨載體與骨形態發生蛋白(BMP)的復合。該方法是通過物理浸潤沉積，離子電性吸附和非特異性化學吸附等因素協同作用，因此提高了骨形態發生蛋白(]BMP)與煅燒骨載體的復合率。
文檔編號A61L27/54GK102475914SQ20101055341
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月22日 優先權日2010年11月22日
發明者王爽 申請人:大連創達技術交易市場有限公司