專利名稱：囊素三肽作為豬瘟疫苗佐劑的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及囊素三肽作為豬瘟弱毒疫苗佐劑的應用。
背景技術：
法氏囊素(bursin，BS)是從禽類的法氏囊(bursa of fabricius，BF，為禽類 特有的體液免疫中樞淋巴器官)中分離出來的一種活性三肽物質，其氨基酸組成順序是 Lys-His-Gly-NH2，故又稱之為囊素三肽。大量的研究證明囊素三肽具有很好的免疫增強 作用，并且在抗腫瘤研究和動物增重中有一定效果。1986年Audhya報道從雞法氏囊中提取 的天然三肽能誘導禽類和哺乳類動物的前體B細胞的分化，使B細胞選擇性分化激素，可增 加人的Daudi B細胞系中cAMP、cGMP的濃度，但不能導致前體T細胞的分化，同時證實人工 合成的囊素三肽也有相同的作用。有研究表明，天然提取和人工合成的囊素三肽均能提高 新城疫弱毒苗所誘導產生的血清抗體水平，試驗組比對照組平均高1 2個滴度。
發明內容
本發明目的是提供囊素三肽作為豬瘟疫苗佐劑的應用。本發明囊素三肽作為豬瘟疫苗佐劑的應用包以下兩種方式1.囊素三肽以溶液方式作為豬瘟疫苗的稀釋液，囊素三肽溶液由以下方法制得將囊素三肽的凍干粉用生理鹽水或無菌水溶解配成濃度12. 5-100 μ g/mL的溶 液，再用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。可現配現用，每頭豬注射1. 0-2. OmL。2.囊素三肽作為豬瘟疫苗組合物的組分該組合物由以下方法制得每ImL豬瘟病毒培養液中加入5%脫脂奶粉3. 75mL、合成囊素三肽凍干粉1. 25 500mg或從雞法氏囊中提取的天然囊素三肽50mL，混勻，冷凍干燥。本發明以囊素三肽作為豬瘟弱毒疫苗的免疫佐劑，按0. 02mL豬瘟疫苗/頭份， 囊素三肽佐劑以溶液的方式作為疫苗的稀釋液使用時，可現配現用，每頭豬注射囊素三 肽溶液1. 0-2. OmL ；當囊素三肽以疫苗組合物方式為佐劑時，每頭份加囊素三肽的凍干粉 為25-200yg，動物實驗結果表明，囊素三肽能提高豬瘟弱毒疫苗的免疫應答。添加佐劑 的試驗組免疫后42天的豬瘟抗體轉陽率可達90%以上，顯著高于無佐劑的對照組轉陽率 (50% -60% )，從而提高豬預防病毒感染和抗病的能力。
具體實施例方式下面結合實施例進一步闡述本發明。實施例中采用國際通用的化學分子式，各分子式代表的化學名為如下所示DCM: 二氯甲烷FMOC 9-芴甲氧羰基DMF :N，N-二甲 基甲酰胺Lys:賴氨酸
His:組氨酸Gly 甘氨酸TBTU 1-氧-3-雙二甲胺羰基苯胼三氮唑四氟化硼鹽B0C:叔丁氧羰基HOBt 1-羥基-苯并-三氮唑TFA:三氟乙酸Phenol 苯酚Thioanisole 苯甲硫醚EDT:乙二硫醇TIS 三異丙基硅實施例1囊素三肽的固相化學合成制備(1)反應柱的前處理在合成反應之前，用適量的DCM浸泡反應柱3-4小時，用量以能浸沒反應柱體積的 2/3為宜。(2)樹脂的活化取200g FMOC Rink-Amide MBHA 樹脂，用 1. 5L 的 DMF 浸泡 30min，壓濾去除 DMF， 再用20%哌啶的DMF浸泡15min，裝柱。用異丙醇洗滌2次，DMF洗3次。(3)鏈接 Lys取IOOg 的 FMOC-Lys (BOC) _0H、92g 的 TBTU、2. OL 的 DMF 和 152mL 的 HOBt (2M)，混 勻后再加入52mL的DIEA混勻，加入樹脂柱中室溫、氮氣保護下反應2. Oh。反應完畢后，用 異丙醇洗滌樹脂兩次，然后用DMF洗滌樹脂三次。(4)依次鏈接His和Gly按照從C端向N端延伸多肽的順便，分別取106g的FMOC-His-OH和59g的 FMOC-Gly-OH，和上述(3)的條件相同，每次反應后脫除FMOC保護基團。重復脫保護-洗 滌-縮合的過程至剩余的氨基酸連接完畢，完成多肽的連接。(5)合成肽的收獲配制TFA/Pheno 1/H2CVThioanisole/EDT/TIS的混合液作為切割液，其體積比為 80 5 5 5 3 2。首先用氮氣將多肽、樹脂復合物吹干，放入5L的容器中，加入 IOOmL的切割液4°C密閉攪拌反應2h，在加入3. OL的冰乙醚4°C靜置2h。離心收集沉淀，沉 淀用無水乙醇洗滌、干燥重復處理3次，然后用無菌純水溶解，放置_40°C冷凍。最后將凍結 的冰狀物置真空冷凍干燥機，凍干至恒重即得。(6)合成肽的純度和分子量測定采用高壓液相法 測定樣本的純度和出峰時間。用C18柱，以溶液A(含0. 三氟 乙酸乙酯的100%乙腈)和溶液B (含0. 三氟乙酸乙酯的100%水)按表1進行梯度洗 脫，流速1. Oml/min，檢測波長220nm，進樣量為20 μ 1。目的產物在2. 685min出峰，峰面積 是7006711. 500，有少許雜峰，目的產物比重占88. 45%。表1梯度洗脫流程
權利要求
1.囊素三肽作為豬瘟疫苗佐劑的應用。
2.根據權利要求1的應用，其特征是囊素三肽以溶液方式作為豬瘟疫苗的稀釋液， 囊素三肽溶液由以下方法制得將囊素三肽的凍干粉用生理鹽水或無菌水溶解配成濃度12. 5-100 μ g/mL的溶液，再 用0. 22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
3.根據權利要求1的應用，其特征是囊素三肽作為豬瘟疫苗組合物的組分該組合物 由以下方法制得每ImL豬瘟病毒培養液中加入5%脫脂奶粉3. 75mL、合成囊素三肽凍干粉1. 25 500mg或從雞法氏囊中提取的天然囊素三肽50mL，混勻，冷凍干燥。
全文摘要
本發明涉及一種囊素三肽作為豬瘟疫苗佐劑的應用。囊素三肽以溶液方式作為豬瘟疫苗的稀釋液，或作為豬瘟疫苗組合物的組分，直接與豬瘟疫苗及脫脂奶粉進行配苗和分裝，制成凍干粉待用。動物實驗結果表明，囊素三肽能提高豬瘟弱毒疫苗的免疫應答。添加佐劑的試驗組免疫后42天的豬瘟抗體轉陽率可達90％以上，顯著高于無佐劑的對照組轉陽率(50％-60％)，從而提高豬預防病毒感染和抗病的能力。
文檔編號A61P31/14GK102000331SQ20101053556
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年11月9日
發明者侯繼波, 盧宇, 張金秋, 鄧碧華 申請人:國家獸用生物制品工程技術研究中心