miRNA的抗腫瘤作用、實施方法及用途的制作方法

專利名稱：miRNA的抗腫瘤作用、實施方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種RNA小分子—— miR-199a/b-3p的抗腫瘤作用、實施方法及用途。
背景技術(shù)：
微小RNAOnicro RNA，簡稱miRNA)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA，長約18 Mnt。關(guān)于miRNA的最早報道是1993年Lee等報道的在秀麗線蟲(C. elegants)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種呈時間特異性表達(dá)的小分子RNA，即可調(diào)節(jié)線蟲發(fā)育的 lin-4[Lee,R. C.等，The C.elegans heterochronic gene lin_4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin—14. Cell. 1993，75 :843 854。2000 年，Reinhart 等Reinhart，B. J.等，The 21-nucleotide let~7 RNAregulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature. 2000,403 :901906又發(fā)現(xiàn)不同時期表達(dá)的 let_7。到目前，公用miRNA數(shù)據(jù)庫中已收錄了數(shù)百種人類miRNA序列，其中三分之二已被實驗證實。微小RNA來源于長度約為IOOObp的長鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Pri-miRNA)， Pri-miRNA分子在細(xì)胞核中經(jīng)Drosha酶剪切形成長度約60 80nt的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 miRNA前體(Pre-miRNA)。miRNA前體轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)后，被進(jìn)一步加工成miRNA。微小RNA在動植物細(xì)胞中通過對目標(biāo)mRNA的切割和轉(zhuǎn)錄抑制發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞生長、組織分化和腫瘤形成等多種過程。miRNA在物種間具有高度的保守性、時續(xù)性和組織特異性。目前認(rèn)為miRNA在細(xì)胞凋亡、增殖、分化、血管生成及腫瘤形成等方面均具有重要的調(diào)節(jié)作用，參與人體大約30 %的基因調(diào)節(jié)，與腫瘤、心血管疾病、肝病、免疫紊亂及代謝紊亂等多種發(fā)病有關(guān)。在上述疾病中，miRNA與腫瘤的關(guān)系是很多研究的重點。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干miRNA通過負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)與慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌高度相關(guān)。miRNA的正調(diào)控靶基因現(xiàn)象是最近的發(fā)現(xiàn)，具體機(jī)制還不明確。有學(xué)者提出了“癌 microRNA” (OncomiRs) ” 的觀點Esquela-Kerscher，Α.等， Oncomirs-microRNAs with a role in cancer.Nat Rev Cancer. 2006,6 :259-269 ； Hammond, SM.等，MicroRNAs as oncogenes. Curr Opin Genet. 2006，16 :4_9，即認(rèn)為某些 miRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中充當(dāng)了類似癌基因的角色。miR-199a/b-3p表達(dá)于人基因組的3個位置，分別為miR-199a-l (19號染色體)、 miR-199a-2 (1號染色體)和miR_199b (9號染色體) miRNA的表達(dá)主要由miRNA基因首先表達(dá)為miRNA前體(pr i-mi RNA)，pri-mi RNA經(jīng)轉(zhuǎn)運出核后，由Dicer酶剪切成為pre-miRNA， pre-miRNA表現(xiàn)為典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖部序列不完全互補配對。其莖部序列經(jīng)剪切后成為成熟體miRNA。5p端的序列為5p成熟miRNA，3p端的序列為3p成熟miRNA。miR-199a_l， miR-199a-2，和miR_199b三個miRNA基因所表達(dá)的miRNA成熟體具有相同的3p段序列，即 miR-199a/b-3p。miR-199a/b-3p在人肝臟中的表達(dá)主要來源于基因組的miR-199a-2基因。腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一，其造成了諸多患者和家庭的痛苦，也給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了極大的壓力。目前雖然已開發(fā)和應(yīng)用了多種腫瘤治療的藥物和方法，但本領(lǐng)域仍然迫切需要開發(fā)出可有效地治療和預(yù)防腫瘤的新型藥物。以原發(fā)性肝細(xì)胞癌Ofepatocellular carcinoma,HCC)為例，其是我國常見的惡性腫瘤，患者死亡率在所有惡性腫瘤中居第三位。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，全球每年新增約 60萬HCC患者，而每年死于肝癌的人數(shù)也約為60萬。HCC的發(fā)生是一個多步驟漸進(jìn)的過程， 和慢性肝炎及肝硬化緊密相關(guān)。我國約有1. 2億乙肝病毒攜帶者，占全球感染人數(shù)的1/3。 因此，如何有效的干預(yù)HCC的發(fā)生并治療HCC患者是一個緊迫的重要問題。目前，HCC患者在手術(shù)或藥物治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)比例依然很高，5年存活率僅約為50%。因此，探求HCC的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的治療靶點十分重要。近年來，隨著miRNA功能研究的不斷深入，miRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用也逐漸為研究者所關(guān)注。自 2006 年 Murakami 等Murakami，Y.等，Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellularcarcinoma and non—tumorous tissues. Oncogene. 2006,25 :2537-45首次報道m(xù)iRNA在正常肝臟和HCC中的表達(dá)差異以來，已有多篇文獻(xiàn)報道了 HCC中異常表達(dá)的miRNA。例如，對HCC組織miRNA表達(dá)譜進(jìn)行基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中miR-222、 miR-221 和miR-31 上調(diào)，miR-223、miR-126和miR-122a下調(diào)Wong，QW.等，MicroRNA_223is commonly repressed in hepatocellular carcinoma andpotentiates expression of Stathminl. Gastroenterology. 2008 ；135 :257_269。對 52 例肝癌前和 HCC 患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-122、miR-10和miR-10a在肝癌中表達(dá)上調(diào)，miR-145下降Varnholt，H.等， MicroRNA gene expression profile ofhepatitis C virus associated hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2008 ；47 :1223—1232。對肝硬化患者的肝組織miRNA情況也開展了研究，發(fā)現(xiàn)肝硬化發(fā)病與miRNA表達(dá)異常有關(guān)，而且是發(fā)生肝癌的重要參考指標(biāo)，研究者還對人肝癌標(biāo)本進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-301在肝癌中表達(dá)明顯，且與預(yù)后有關(guān)Jiang，J.等，Association of MicroRNA expressionin hepatocellular carcinomas withhepatitis infection, cirrhosis, and patient surviva 1.Clin Cancer Res. 2008 ;14 :419_427j?；谏鲜鲅芯浚袑W(xué)者認(rèn)為miRNA是肝癌診斷和治療研究的重要靶點Ji，J.等， New kids on the block !diagnostic and prognostic microRNAs inhepatocellular carcinoma. Cancer Br. 2009；8 :1686一1693。總體來說，與HCC癌旁組織相比，在HCC中表達(dá)上調(diào)的miRNA有miR_l、miR-21、 miR-221、miR-222、miR-224和miR-301 等，在HCC 中表達(dá)下調(diào)的miRNA有l(wèi)et_7a、miR-101、 miR-122、miR-125a、miR_139a、miR-143、miR-195、miR-26 和 miR-29 等。然而，本領(lǐng)域中已知的miRNA種類繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關(guān)的 miRNA存在較大的難度。目前尚無miR-199a/b-3p在肝癌中作用的研究報道。綜上所述，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)出可有效針對肝癌診斷和治療的抗腫瘤天然免疫劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明正是從數(shù)百種已知的miRNA中篩選出了腫瘤(尤其是肝癌)表達(dá)相關(guān)性及其對肝癌生長的具有調(diào)控作用的miRNA——miR-199a/b-3p,由此本發(fā)明提供了 miR_199a/ b-3p有效抗腫瘤的新用途。在本發(fā)明的第一方面中，提供了微小RNA miR-199a/b-3p或其前體在制備預(yù)防或治療腫瘤的組合物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述miR-199a/b_3p的序列如SEQ ID NO 1所示。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述miR-199a/b-3p的前體在對象體內(nèi)經(jīng)加工轉(zhuǎn)化為 miR-199a/b-3p。 在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述miR-199a/b-3p或其前體來自人、大鼠、小鼠、犬、馬、牛、兔或猴。在一個優(yōu)選例中，所述腫瘤選自肝癌(優(yōu)選肝細(xì)胞癌)、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、 子宮頸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌，優(yōu)選肝細(xì)胞癌。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述組合物是藥物組合物或疫苗組合物。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種組合物，所述組合物包含(a)有效量的微小 RNA miR-199a/b-3p或其前體；和(b)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體。在一個優(yōu)選例中，組分(a)的含量占組合物總重量的0. 001 99. 9wt%，優(yōu)選1 95wt %，更優(yōu)選 5 90wt %。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述組合物還包含治療或預(yù)防腫瘤的其它活性成分。在一個優(yōu)選例中，所述治療或預(yù)防腫瘤的其它活性成分包括化療劑或放療劑。在一個優(yōu)選例中，所述其它活性成分選自烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑，優(yōu)選細(xì)胞有絲分裂抑制劑、喜樹堿、高三尖杉酯堿、丙卡巴胼、門冬酰胺酶、順鉬、卡鉬、米托蒽醌、他莫昔芬、環(huán)磷酰胺、鹽酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、優(yōu)氟啶、卡莫氟、巰嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、巰鳥嘌呤、六甲蜜胺、羥基脲、絲裂霉素、阿霉素、表柔比星、博萊霉素、培萊霉素、阿伐司汀、赫賽汀、格列衛(wèi)、吉西他濱、托泊替康和/或亮丙瑞林。在另一個優(yōu)選例中，所述細(xì)胞有絲分裂抑制劑選自長春堿、長春新堿、長春地辛、 長春瑞濱、秋水仙胺、秋水仙堿、秋水仙酰胺、鬼白毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇或多西他賽。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述組合物的形式適于直接裸RNA注射法、脂質(zhì)體包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒RNA法或復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的RNA法。在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種預(yù)防和/或治療腫瘤的方法，所述方法包括 給予需要預(yù)防和/或治療的對象有效量的微小RNA miR-199a/b-3p或其前體。在一個優(yōu)選例中，所述微小RNA miR-199a/b-3p或其前體是通過如下方法給予對象的直接裸DNA注射法、脂質(zhì)體包裹DNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒DNA法或復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的DNA法。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1 :HCC中miR-199a/b-3p的表達(dá)與患者生存時間的相關(guān)性。其中，圖IA為無瘤生存時間的Kaplan-Meier生存曲線；圖IB為總體生存時間的Kaplan-Meier生存曲線(P 值使用 SPSS 17. 0 中的 log-rank test 計算)。圖2 :miR-199a/b-3p對HCC細(xì)胞系H印3B的作用。其中，圖2A為細(xì)胞增殖的MTT 法檢測結(jié)果，圖2B和圖2C分別為用流式細(xì)胞法檢測的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)展結(jié)果(結(jié)果顯示為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 4) ；*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01)。圖3 :miR-199a/b-3p在正常肝臟組織、SMMC-LTNM腫瘤以及瘤內(nèi)注射miR_199a/ b-3p后的表達(dá)情況的qRT-PCR檢測(結(jié)果為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 4)，#，P < 0. 01)。圖4:瘤內(nèi)注射miR-199a/b-3p后對腫瘤生長的影響。其中，圖4A為腫瘤生長曲線；圖4B為血清AFP含量(結(jié)果顯示平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η = 8) ；*，P <0.05 ；#，P <0.01)。圖5 瘤內(nèi)注射miR-199a/b-3p后腫瘤組織的H&E染色檢測壞死腫瘤組織分析， 50X圖中的黑框部分為在100X圖中的放大部分。圖6 為靜脈注射miR-199a/b-3p腺相關(guān)病毒后對腫瘤生長的影響。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究發(fā)現(xiàn)HCC患者的腫瘤組織中微小RNAmiR-199a/ b-3p的表達(dá)會顯著下調(diào)，且下調(diào)的幅度與患者的生存時間存在相關(guān)性，其低表達(dá)與患者的預(yù)后差顯著相關(guān)，從而證實了 miR-199a/b-3p在腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后中起重要作用。發(fā)明人在此基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)miR-199a/b-3p可在體、內(nèi)外有效抑制腫瘤細(xì)胞的繁殖和生長，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。由此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 miR-199a/b-3p在抗腫瘤中的新用途，從而在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)成”、“基
本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”;“主要由......構(gòu)成”、“基本上由......構(gòu)成”
和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，“分離的”或“分離純化的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。本發(fā)明提到的特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的
一般性例子。miR-199a/b~3p 及其前體如本文所用，術(shù)語“miR-199a/b_3p”或“微小RNA miR-199a/b_3p”可互換使用，是指包含SEQ ID NO :1所示序列或其同源序列的微小RNA。本領(lǐng)域中已知各種來源的miR-199a/b-3p，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發(fā)明的術(shù)語 “miR-199a/b-3p”中。本發(fā)明的術(shù)語中還包含上述天然存在的miR-199a/b_3p序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸，或經(jīng)過生物學(xué)化學(xué)修飾，且仍然具有抗腫瘤活性的衍生 RNA。如本文所用，術(shù)語“miR-199a/b-3p前體”是指在被施予對象的細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)可被加工成為miR-199a/b-3p的miRNA前體。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉獲得天然存在的miR-199a/b-3p前體的方法和手段，也可基于分子和遺傳學(xué)理論和手段構(gòu)建所述前體，例如Kim, S.等 MicroRNA miR_199a*regulates the METproto-oncogene and the downstream extracellular signal-regulated kinase 2(ERK2)。J Biol Chem. 2008 ；283 18158-18166.。本領(lǐng)域中已知miR-199a/b-3p編碼基因的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過一系列的加工成熟之后，形成成熟的miR-199a/b-3p。MiR_199a/b_3p前體只有在加工成成熟的miR-199a/ b-3p后才具有相應(yīng)的生物學(xué)功能，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可合理預(yù)期利用miR-199a/ b_3p的成熟序列及能夠產(chǎn)生或加工成為miR-199a/b-3p的各種其它形式的核酸物質(zhì)(即本發(fā)明所述的“miR-199a/b-3p前體”)均可獲得本發(fā)明所需獲得的效果，即起到抗腫瘤的效果，從而均可用于制備治療或預(yù)防腫瘤的組合物。本發(fā)明還包括一種載體，它含有攜帶所述miRNA或其前體的構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有啟動子、復(fù)制起點和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的構(gòu)建物或表達(dá)載體。這些方法包括但不限于基因重組技術(shù)、體外合成技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。組合物本發(fā)明還提供了一種組合物(尤其是藥物組合物或疫苗組合物)，所述的組合物可用于預(yù)防和/或治療腫瘤、及由其引起的相關(guān)癥狀和疾病。所述組合物含有有效量的本發(fā)明的miR-199a/b-3p以及藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體。所述“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學(xué)上/免疫學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑或疫苗給藥的載體，包括各種賦形劑、稀釋劑和佐劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑或疫苗載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物/疫苗制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，例如，本發(fā)明的組合物可以用生理鹽水或含有葡萄糖和其它輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備，以制得針劑形式。所述組合物宜在無菌條件下制造。本發(fā)明的制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明的miR-199a/b-3p的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于miR-199a/b-3p的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。當(dāng)本發(fā)明的miR-199a/b-3p或其前體以適當(dāng)劑量給予對象時可獲得令人滿意的效果。例如，當(dāng)本發(fā)明的miR-199a/b-3p或其前體，每天以約2. 5-25nmol/20g(優(yōu)選的為 20nmol/20g)動物(如小鼠)體重的劑量給予動物時，可獲得令人滿意的抗腫瘤效果。給藥方式本發(fā)明的組合物，可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其它合適的形狀。給藥途徑可采用例如(但不限于)(1)直接裸RNA注射法；(2)脂質(zhì)體包裹RNA 直接注射法；(3)金包被RNA基因槍轟擊法；(4)繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒RNA法；(5)復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的RNA法；(6)電打孔法，等等。此外，本發(fā)明的組合物中還可含有用于改善和/或治療腫瘤的其它活性物質(zhì)，所述的其它活性物質(zhì)選自下組(包括但不限于)臨床常用抗腫瘤藥物(包括但不限于)化療劑或放療劑，優(yōu)選烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑，更優(yōu)選細(xì)胞有絲分裂抑制劑、喜樹堿、高三尖杉酯堿、丙卡巴胼、門冬酰胺酶、順鉬、卡鉬、米托蒽醌、他莫昔芬、環(huán)磷酰胺、鹽酸氮芥、洛莫司汀、司莫司汀、塞替派、白消安、氮甲、苯丁酸氮芥、氟尿嘧啶、喃氟啶、優(yōu)氟啶、卡莫氟、巰嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環(huán)胞苷、巰鳥嘌呤、六甲蜜胺、羥基脲、絲裂霉素、阿霉素、表柔比星、博萊霉素、培萊霉素、阿伐司汀、赫賽汀、格列衛(wèi)、吉西他濱、托泊替康和/或亮丙瑞林。本發(fā)明的miR-199a/b-3p還可以與其它藥物和治療手段(例如手術(shù)療法)聯(lián)合， 用于腫瘤的預(yù)防和治療。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的優(yōu)點主要在于(a)本發(fā)明揭示了 miR-199a/b-3p在預(yù)防和/或治療腫瘤中的新用途，為 miR-199a/b-3p、乃至miRNA的研究和開發(fā)利用提供了新的思路和途徑；(b)本發(fā)明的miR-199a/b-3p或其前體可有效用于抗腫瘤，從而為本領(lǐng)域提供了一種新穎的腫瘤發(fā)生診斷劑和/或治療劑，具有一定的臨床應(yīng)用前景。實施例下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人《分子克隆實驗室指南》(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1 :miR-199a/b-3p表達(dá)量與HCC的關(guān)系采用實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法對2002至2006年收集的共142例HCC 患者的HCC組織與癌旁組織(來自東方肝膽醫(yī)院標(biāo)本庫)中miR-199a/b-3p的表達(dá)進(jìn)行了分析。采用TRIzol (Invitrogen 公司)抽提組織總 RNA。qRT-PCR 使用 SYBR RT-PCR 試劑盒(Takara公司)，在LightCyclerl. 5 (Roche公司)實時定量PCR儀上完成。
miR-199a/b-3p 反轉(zhuǎn)錄引物為5' -GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCCGAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACT AAC CA_3' (SEQ ID NO 2)；定量PCR 引物5' -GTCACAGTAGTCTGCACAT-3 ‘(上游，SEQ ID NO 3)和 5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3‘(下游，SEQ ID NO :4)。內(nèi)參TO小核RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物與定量PCR的下游引物相同，序列為5-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3(SEQ ID NO 5)；定量PCR引物為5-CTC GCT TCG GCA GCA CA_3(上游，SEQ ID NO 6)；禾口5-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT_3(下游，同上 SEQ ID NO 5)。miRNA的相對定量使用2_ΔΔ"法計算(U6為內(nèi)參)Livak，KJ.等，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ Δ Ctmethod. Methods. 2001 ；25 :402_408。qRT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁非腫瘤組織相比，miR-199a/b-3p在約88 % (125/142)的HCC組織中表達(dá)降低(結(jié)果未顯示)。將該142例HCC患者分為兩組，第一組為HCC中miR-199a/b-3p表達(dá)極低(小于其在癌旁組織中表達(dá)量的10%，計81例患者)，第二組為HCC中miR-199a/b-3p較第一組表達(dá)相對較高(大于癌旁的10%，計61例患者)。對miR-199a/b-3p的低表達(dá)與患者生存時間的性關(guān)性進(jìn)行分析，P值使用SPSS 17.0中的log-rank test計算，結(jié)果分別如圖IA和圖IB所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn):miR-199a/b-3p 的低表達(dá)與患者更低的無瘤生存時間(圖1A)和總體生存時間顯著相關(guān)(圖1B)。對影響HCC預(yù)后的危險因素進(jìn)行Cox回歸分析，危害比(95%可信區(qū)間)和P值使用SPSS 17.0中的單因素和多因素Cox回歸分析計算。表1示出了影響HCC患者預(yù)后危險因素的單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果，其中HCC患者計142例(與圖1相同)。HCC中miR-199a/b-3p的表達(dá)量分組見圖1。多因素分析使用了年齡性別校正。表1影響HCC患者預(yù)后危險因素的單因素和多因素Cox回歸分析臨床因素患者數(shù)量危害比(95%CI) P值單因素分析
^yff比 目對較高表達(dá))81/612.1 (L3-3·3)°·001
性別(男比女)127/150.8 (0.4-1.6)0.616
年齡(>50 歲比彡 50 歲)64/781.1 (0.7-1.6)0.796
HBV感染(陽性比陰性)127/151.5 (0.7-3.3)0.281
肝硬化(是比否)103/391.4 (0.8-2.3)0.207
AFP(鄉(xiāng)500比<500ng/ml)55/871.2 (0.8-1.8)0.426
月中瘤大小(彡5 cm比<5 cm)74/682.4 (1.6-3.8)<0.001
腫瘤數(shù)目(>1 比 1)31/1113.3 (2.1-5.2)<0.001
門靜脈癌栓(是比否)22/1208.8 (4.9-15.8)<0.001
TNM分級(II/III比I)73/692.8 (1.8-4.3)<0.001
組織學(xué)分級(〉11 比I/II)78/641.3 (0.8-1.9)0.273 多因素分析
；^氐1ff比￥目對較高表達(dá))81/61L9 d.2—3·1)_6
月中瘤大小(彡5 cm比<5 cm)74/681.0 (0.4-2.6)0.953
腫瘤數(shù)目(>1 比 1)31/111 2.3 (1.4-3.8)0.001
門靜脈癌栓(是比否)22/120 7.0 (3.7-13.1)<0.001
TNM分級(II/III比I)73/69 2.3 (0.9-6.1)0.096通過單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)，miR-199a/b-3p的低表達(dá)是一個顯著獨立的預(yù)測 HCC患者較低無瘤生存時間的危險因素。
上述結(jié)果表明miR-199a/b-3p的表達(dá)在HCC中顯著降低，且其低表達(dá)與患者較差的預(yù)后顯著相關(guān)，該結(jié)果提示了miR-199a/b-3與HCC腫瘤的發(fā)生和發(fā)展之間存在密切相關(guān)性。實施例2 :miR-199a/b-3p體外抑制HCC細(xì)胞的牛長分別采用如下序列(由上海吉瑪公司合成)在人HCC細(xì)胞系Hep3B細(xì)胞中使得 miR-199a/b-3p 高表達(dá)miR-199a/b-3p:ACAGUAGUCUGCACAUUG(iUUA(SEQ ID NO 1)對照RNA :UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT(SEQ ID NO 7,3'端加 TT 突出是小 RNA 序列
合成中常用的修飾方法，對其功能沒有影響，主要是起到穩(wěn)定核苷酸的作用Wilda，Μ.等，Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference(RNAi). Oncogene. 2002；21 :5176_5124)。人HCC細(xì)胞系!fep3B細(xì)胞購自中科院上海生化細(xì)胞所。使用INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus公司)轉(zhuǎn)染小RNA，miR-199a/b-3p轉(zhuǎn)染終濃度為IOnM和/或50nM，對照RNA 轉(zhuǎn)染濃度為50nM，步驟按說明書標(biāo)準(zhǔn)步驟操作。細(xì)胞增殖檢測!fep3B細(xì)胞的體外增殖使用MTT法檢測。將5 X IO3個!fep3B細(xì)胞鋪入96孔板每孔并培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)染對照RNA或miR-199a/b-3p，并于轉(zhuǎn)染后0、24、48、 72小時檢測。首先，棄去培養(yǎng)上清，換入100 μ 1含MTT 0. 5mg/ml (Sigma公司)的新鮮培養(yǎng)基；然后37°C孵育4小時；最后換入100 μ 1DMS0(Sigma公司)并振蕩10分鐘。最終吸光度使用570nm波長檢測。細(xì)胞凋亡檢測上述!fep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)染72小時之后，使用Vybrant凋亡檢測試劑盒 (Invitrogen公司)對細(xì)胞進(jìn)行收取、洗滌、重懸和檢測。標(biāo)記后的細(xì)胞使用FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測，并用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)(購自BectonDickinson公司)，膜聯(lián)蛋白 V (Annexin V)陽性且PI陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡的細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。上述Hep3B細(xì)胞轉(zhuǎn)染72小時后， 收取細(xì)胞并用PBS洗滌一遍，隨后使用75%的乙醇4°C固定1小時。固定后的細(xì)胞使用PBS 洗三遍，再加入Iml含40 μ g碘化丙啶(Sigma公司)和100 μ gRNA酶A (Sigma公司)的 PBS0最后使用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期情況。轉(zhuǎn)染miR-199a/b-3p后對H印3B HCC細(xì)胞系增殖的影響結(jié)果如圖2A所示，對H印3B HCC細(xì)胞凋亡的影響結(jié)果如圖2B所示，對H印3B HCC細(xì)胞周期的影響結(jié)果如圖2C所示。結(jié)果顯示在HCC細(xì)胞系H印3B中，高表達(dá)miR-199a/b_3p能夠抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞周期。
上述結(jié)果表明miR-199a/b-3在體外具有抑癌作用。實施例3 :miR-199a/b-3p在棵鼠人肝癌荷瘤樽型SMMC-LTNM中表汰降低按照文獻(xiàn)方法構(gòu)建人原代HCC組織皮下荷瘤裸鼠模型SMMC-LraMTao，WZ.等， The tumor invasion and metastasis in the transplantation of transplantedhuman hepatocellular carcinoma into nude mice abdominal cavity and orthotopichepatic tissue. Dier Junyi Daxue Xuebao. 1998 ; 19 :54_56。根據(jù)文獻(xiàn)報道，與常規(guī)使用的 HCC 細(xì)胞系構(gòu)建的裸鼠荷瘤模型相比，SMMC-LTW與人HCC的臨床進(jìn)展更為相似，它能夠發(fā)生局部侵襲和其它器官的轉(zhuǎn)移，此外還能大量分泌甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)。利用實施例1所述qRT-PCR方法對人正常肝臟組織(來自東方肝膽醫(yī)院標(biāo)本庫) 和SMMC-LraM腫瘤中miR-199a/b-3p的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，SMMC-LraM中miR-122和miR-192表達(dá)與正常肝臟組織相同；但對 miR-199a/b-3p的表達(dá)表達(dá)分析顯示miR-199a/b_3p在SMMC-LTNM腫瘤中表達(dá)量顯著降低 (圖 3)。
該結(jié)果表明miR-199a/b-3在體內(nèi)傳代的HCC腫瘤中的表達(dá)也明顯降低。該結(jié)果提示了 miR-199a/b-3與HCC腫瘤之間存在密切相關(guān)性。實施例4 :miR-199a/b-3p抑制HCC細(xì)胞在體內(nèi)的牛長利用人原代HCC組織皮下荷瘤裸鼠模型SMMC-LraM觀察miR-199a/b-3p的體內(nèi)抑
瘤效果。(1)膽固醇偶聯(lián)的miR-199a/b-3p及膽固醇偶聯(lián)的對照RNA(即SEQ ID NO 7所示的RNA)均由廣州銳博公司合成(膽固醇偶聯(lián)后可的miRNA可自主通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率較高Wolfrum, C.等，Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs. Nat Biotechnol. 2007 ;25 :1149_1157.)。體內(nèi)轉(zhuǎn)染 RNA 時，將 IOnmol (0. lml)膽固醇偶聯(lián)的miR-199a/b-3或膽固醇偶聯(lián)的對照RNA)直接瘤內(nèi)注射，每三天注射一次，持續(xù)注射兩周。利用實施例1所述qRT-PCR方法對人正常肝臟組織和SMMC-LT匪腫瘤中 miR-199a/b-3p的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。腫瘤體積的計算按文獻(xiàn)操作Qi，R.等，Notchl signaling inhibits growth of human hepatocellular carcinoma throughinduction of cell cycle arrest and apoptosis. Cancer Res. 2003 ;63 :8323_8329。血清 AFP 的測定使用AFP ELISA試劑盒(購自Autobio公司)。miR-199a/b-3p瘤內(nèi)注射后SMMC-LTNM腫瘤中miR-199a/b_3p的表達(dá)情況如圖3所示。結(jié)果顯示通過瘤內(nèi)注射膽固醇偶聯(lián)的miR-199a/b-3p后，miR-199a/b-3p在 SMMC-LTNM腫瘤中的表達(dá)顯著增高(圖3)。miR-199a/b-3p體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞生長和血清AFP含量作用試驗結(jié)果如圖4A和圖 4B所示。結(jié)果顯示瘤內(nèi)注射膽固醇偶聯(lián)的miR-199a/b-3p顯著抑制了腫瘤的生長和血清 AFP的含量(圖4)。瘤內(nèi)注射miR-199a/b-3p后腫瘤組織的H&E染色結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示瘤內(nèi)注射膽固醇偶聯(lián)的miR-199a/b-3p后顯著導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的壞死(圖5)。(2)表達(dá) miR-199a/b-3p 的腺相關(guān)病毒 AAV8-miR-199a/b_3p (AAV-199)以及對照病毒(ctrl AAV)由上海吉瑪公司制備、包裝并擴(kuò)增。SMMC-L !人肝癌荷瘤裸鼠模型構(gòu)建一周后，使用IX IO12Vg (載體基因組，vector genome) AAV8-miR-199a/b_3p經(jīng)尾靜脈注射。 注射后3周解剖裸鼠，觀察肝臟腫瘤大小。腫瘤體積的計算按文獻(xiàn)操作Qi，R.等，Notchl signaling inhibits growth of humanhepatocellular carcinoma through induction of cell cycle arrest and apoptosis. Cancer Res. 2003 ;63 :8323_8329。miR-199a/b-3p體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞生長作用試驗結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示尾靜脈注射miR-199a/b-3p顯著抑制了腫瘤的生長(圖6)。
該結(jié)果表明miR-199a/b-3p在體內(nèi)能夠顯著抑制HCC的生長。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.微小RNAmiR-199a/b-3p或其前體在制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-199a/b-3p的序列如SEQIDNO=I 所示。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-199a/b-3p的前體在對象體內(nèi)經(jīng)加工轉(zhuǎn)化為 miR-199a/b-3p。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述miR-199a/b-3p或其前體來自人、大鼠、小鼠、犬、馬、牛、兔或猴。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤選自肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、子宮頸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌。
6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述組合物是藥物組合物或疫苗組合物。
7.一種組合物，所述組合物包含(a)有效量的微小RNA miR-199a/b-3p或其前體；和 (b)藥學(xué)上或免疫學(xué)上可接受的載體。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含治療或預(yù)防腫瘤的其它活性成分。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述治療或預(yù)防腫瘤的其它活性成分包括化療劑或放療劑。
10.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述組合物的形式適于直接裸RNA注射法、脂質(zhì)體包裹RNA直接注射法、金包被RNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細(xì)菌攜帶質(zhì)粒RNA 法或復(fù)制缺陷腺病毒攜帶目的RNA法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種miRNA的抗腫瘤作用、實施方法及用途，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及miR-199a/b-3p在抑制肝癌生長中的用途和應(yīng)用方法。本發(fā)明的miR-199a/b-3p在肝癌中表達(dá)顯著低于正常肝組織；此外，本發(fā)明的miR-199a/b-3p在體外、體內(nèi)均能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長。本發(fā)明的miR-199a/b-3p可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物，尤其是用于制備預(yù)防或治療肝癌的藥物。
文檔編號A61K48/00GK102451473SQ201010527380
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者侯晉, 曹雪濤, 李楠 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)