一種制備偽狂犬病疫苗的方法

專利名稱：一種制備偽狂犬病疫苗的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種偽狂犬病疫苗的生產(chǎn)方法，更具體地說，本發(fā)明涉及一種利用哺 乳動物細胞在潮汐式生物反應器的載體罐中大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬病疫苗的方法。
背景技術：
偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是多種動物共患的傳染病，引起家畜和野生動物急 性致死性的傳染病，以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎為主要癥狀，豬是其自然易感宿主，主要引起 妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，仔豬感染主要是神經(jīng)癥狀，成年豬則以隱性感染為主，該 病已成為種豬繁殖障礙綜合癥的主要病因。疫苗免疫是防制偽狂犬病的根本措施，現(xiàn)在用 得較多的是滅活苗、弱毒疫苗和基因缺失苗。弱毒苗和滅活苗在預防控制偽狂犬病方面雖 然能起一定的作用，但弱毒活疫苗有返強和散毒的危險，滅活疫苗雖然安全性較好，但其免 疫效率卻較低，劑量大，有副作用，而且不能提供血清學標志進行鑒別診斷?；蛉笔б呙?免疫原性強、持久穩(wěn)定，安全性好無致癌性、接種方便安全，還能提供血清學標志的鑒別標 志。遺憾的是目前三種疫苗的生產(chǎn)主要依靠轉瓶生產(chǎn)，甚至仍在利用雞胚成纖維原代細胞 進行生產(chǎn)。傳統(tǒng)的轉瓶培養(yǎng)模式具有結構簡單，投資少，技術成熟，放大只需簡單的增加轉瓶 數(shù)量等優(yōu)點。但也有其缺點(1)作坊式生產(chǎn)，勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細胞 生長的表面積?。?2)細胞生長密度低，產(chǎn)量低；(3)收獲病毒液后，后續(xù)混合，存在批間差， 均一性不好；(4)培養(yǎng)時各項監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。另外，因雞胚原材料的差異 導致雞胚成纖維原代細胞批間差異較大，造成偽狂犬病毒滴度不高，批間差異大，給疫苗的 產(chǎn)量和效力的提高帶來困難。因此，本領域中仍迫切需要能夠進一步改善生產(chǎn)病毒疫苗的 方法。豬偽狂犬病毒具有廣泛嗜性，除了能在雞胚成纖維原代細胞增殖，還能在多種組 織細胞上增殖。但對不同的細胞具有不同的敏感性。中國專利CN101695572A公開了利用豬 睪丸細胞系ST、豬腎細胞系PK15或豬腎IBRS-2大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬活疫苗的方法。該發(fā)明 提到了三種傳代細胞用來培養(yǎng)偽狂犬病毒豬睪丸細胞系ST、豬腎細胞系PK15和IBRS-2， 其中PK15細胞極易受豬圓環(huán)病毒I型的持續(xù)污染，目前國內(nèi)難以找到未受污染的細胞株， 顯然這存在著很大的安全隱患，特別是用來生產(chǎn)活疫苗，所以，至今國內(nèi)未有利用PK15細 胞培養(yǎng)病毒進而生產(chǎn)活疫苗的行政許可。偽狂犬病毒在ST細胞上增殖要比PK15慢(郝 鵬等.PK15、ST細胞增殖偽狂犬弱毒效果的比較.首屆中國獸藥大會-獸醫(yī)生物制品學、 獸醫(yī)微生物學學術論壇論文集(2008). 339-340)，目前也有大量使用IBRS細胞進行偽狂犬 病毒培養(yǎng)的報道，病毒增殖后的滴度也未降低，但IBRS細胞分裂增殖慢(見網(wǎng)址http:// biology, dctt. net/showarticle. asp ？ articleid = 26989)，幾乎比 Vero 細胞慢一倍，這 大大提高了生產(chǎn)成本，降低了生產(chǎn)效率。Vero細胞經(jīng)過全面的研究鑒定，Vero細胞具有遺 傳學穩(wěn)定，沒有外源因子污染和無致瘤性的優(yōu)點，完全符合世界衛(wèi)生組織(WHO)關于用于 生物制品的傳代細胞的規(guī)程要求，已被WHO批準可用做疫苗生產(chǎn)基質(zhì)。本發(fā)明采用Vero細
4胞可以解決目前生產(chǎn)偽狂犬病毒使用的上述傳代細胞存在的問題。另外BHK-21細胞和MDBK細胞也可用來繁殖偽狂犬病毒，目前有利用Vero、 BHK-21、MDBK細胞增殖偽狂犬病毒的報道(王巖等，PK15、Vero、BHK、CEF細胞增殖豬偽狂 犬病病毒的比較，安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35 (18) =5432,5445 ；王樹成等，用PK15、Vero、MDBK 三種細胞增殖偽狂犬病病毒的比較，畜牧與獸醫(yī)，1996，28 (2) 80)，這些報道僅是關于實驗 室階段利用細胞瓶進行偽狂犬病毒增殖的相關研究，不能直接放大，更不能達到工業(yè)化生 產(chǎn)的要求。國內(nèi)外有利用Vero細胞生產(chǎn)乙腦病毒疫苗和狂犬疫苗的專利和報道。至今未 見把Vero細胞、MDBK細胞、BHK-21細胞等傳代細胞利用生物反應器進行進行偽狂犬病毒大 規(guī)模生產(chǎn)的報道。中國專利CNlO 1695572A公開了大規(guī)模生產(chǎn)偽狂犬活疫苗的方法，采用的是 TideCell潮汐式生物反應器，Batch式培養(yǎng)。本發(fā)明也采用潮汐式生物反應器，但采用了更 有生物安全保障的細胞，并采用Fed-Batch式培養(yǎng)，通過優(yōu)化參數(shù)實現(xiàn)高滴度多次收獲病 毒液，大大提高了病毒的產(chǎn)量，進而在制備疫苗的后工藝中，不但提高了疫苗產(chǎn)量，也可大 量減少殘余細胞宿主蛋白、殘余細胞DNA、殘余牛血清等異源物質(zhì)的含量，進一步提高了疫 苗接種的安全性，也更能夠符合WHO《使用動物細胞生產(chǎn)生物制品規(guī)程》的要求和市場需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種偽狂犬病疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)方法，它既能解決傳統(tǒng)的轉瓶培養(yǎng)模 式在疫苗生產(chǎn)中存在的病毒產(chǎn)量低，病毒滴度不高，批間差異大的缺點，又能消除現(xiàn)有潮汐 式生產(chǎn)方法中所生產(chǎn)的病毒在后續(xù)生產(chǎn)活疫苗時存在的安全隱患，并通過優(yōu)化參數(shù)實現(xiàn)了 高滴度多次收獲病毒液，大大提高了疫苗的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明首先提供了一種偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，包括 如下步驟1)細胞的接種將哺乳動物細胞接種到潮汐式生物反應器載體罐(8)內(nèi)添加的載 體(9)上，進行細胞的吸附培養(yǎng)；2)在細胞的吸附培養(yǎng)結束后進行細胞的擴增培養(yǎng)；3)將偽狂犬病毒接種到擴增培養(yǎng)的細胞上，進行病毒的吸附培養(yǎng)；4)在病毒的吸附培養(yǎng)結束后進行感染細胞的培養(yǎng)；和5)收獲含有偽狂犬病毒的培養(yǎng)液，其中步驟1)至4)中的培養(yǎng)在潮汐培養(yǎng)條件下進行，所述潮汐培養(yǎng)條件是通過泵 出或泵入載體罐(8)中的培養(yǎng)液以間歇性淹沒與暴露載體實現(xiàn)的。優(yōu)選的是，該方法中所述的載體罐(8)與裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)液袋(6)以能夠?qū)⑴?養(yǎng)液袋內(nèi)的培養(yǎng)液泵入載體罐中和能將載體罐內(nèi)的培養(yǎng)液泵入培養(yǎng)液袋中的方式相聯(lián)通。優(yōu)選的是，該方法中所述的載體罐中的載體由選自聚丙烯、藻素酸、聚酯纖維、明 膠、聚酰胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚氨酯、碳氟聚合物以及陶瓷中的一種或多種制成。更優(yōu)選的是，該方法中所述的載體罐中的載體占載體罐容積的40% 100% (V/ V)。最優(yōu)選的是，該方法中所述的潮汐式生物反應器載體罐容積為2 100L。優(yōu)選的是，該方法中所述的偽狂犬病毒是選自偽狂犬病病毒強毒株、偽狂犬病病毒基因缺失株和偽狂犬病病毒弱毒株中的一種。更優(yōu)選的是，該方法中所述的偽狂犬病病毒為選自偽狂犬病病毒強毒株Fa株、Ea 株、偽狂犬病病毒基因缺失株Fa(TK7gE7gI_)株、Ea(TK7gE7gI_)株、偽狂犬病病毒弱毒株 Bartha 株、Bartha-K61 株、Bucharest 株、BUK 株中的一種。最優(yōu)選的是，該方法中所述的偽狂犬病病毒為選自偽狂犬病毒基因缺失株 Fa (TKVgEVgD、Bartha-K61 株和 BUK 株中的一種。優(yōu)選的是，該方法中所述的在步驟3)中的病毒接種按照感染復數(shù)(M.O. I.)為 0. 0001 1進行。優(yōu)選的是，該方法中所述的哺乳動物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞、MDBK細 胞、ST細胞、PK15細胞和IBRS細胞中的一種。更優(yōu)選的是，該方法中所述的哺乳動物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞和MDBK 細胞中的一種。優(yōu)選的是，該方法中所述的在步驟1)中以8.5\106 4.0父107(^118/^載體的細 胞密度接種細胞。優(yōu)選的是，該方法中所述的在步驟2)中的細胞擴增培養(yǎng)達到5. 5X108 7. 5X108cells/g載體的細胞密度時進行步驟3)所述的病毒接種。優(yōu)選的是，該方法中所述的步驟1)中所述的吸附培養(yǎng)和步驟2)中所述的擴增培 養(yǎng)使用的培養(yǎng)液為細胞生長液，其中所述的細胞生長液由細胞培養(yǎng)液加3% 5% (V/V)的 牛血清組成；步驟3)中所述的病毒吸附培養(yǎng)和步驟4)中所述的感染細胞的培養(yǎng)使用的培 養(yǎng)液為細胞維持液，所述的細胞維持液由細胞培養(yǎng)液加0.5% 1.5% (V/V)的牛血清配制 而成。細胞培養(yǎng)液為MEM培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、EMEM培養(yǎng)液和199培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液、 α -MEM培養(yǎng)液中的任意一種。所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。更優(yōu)選的是，該方法中所述的步驟1)中所述的吸附培養(yǎng)和步驟3)中所述的病毒 吸附培養(yǎng)設定載體罐與培養(yǎng)液袋的換液量為載體罐容積的5% 20% (V/V)，載體罐中培 養(yǎng)液的液面上下行速度均為0. 5 50L/分鐘，液面在載體上下端點停滯時間均為0 150 分鐘，該吸附培養(yǎng)程序運行60 240分鐘，步驟2)中所述的擴增培養(yǎng)和步驟4)中所述的 感染細胞的培養(yǎng)設定換液量為載體罐容積的70% 95% (V/V)，載體罐中液面上下行速度 均為0. 5 50L/分鐘，液面在反應器上下端點停滯時間均為0 150分鐘。優(yōu)選的是，該方法中所述的步驟5)中所述的收獲含有偽狂犬病毒的培養(yǎng)液為在 步驟4)所述的感染細胞的培養(yǎng)過程中，自病毒接種之時算起的第2 4天開始第1次收集， 以后每間隔2 4天收獲1次，共收獲2 4次，每次收獲時，將培養(yǎng)液袋中的培養(yǎng)液全部 收集到病毒收集桶，再將新配制的細胞維持液泵入到培養(yǎng)液袋中繼續(xù)下一輪感染細胞的培 養(yǎng)和培養(yǎng)液的收集。優(yōu)選的是，該方法中所述的在步驟1)至4)的培養(yǎng)過程中控制葡萄糖含量范圍為 0. 5 5g/L。更優(yōu)選的是，該方法中所述的步驟1) 2)中所述的培養(yǎng)在溫度36.5 °C 37. 5°C,pH值調(diào)節(jié)7. 0 8. 0，溶氧調(diào)節(jié)10% 80%，二氧化碳濃度為0% 10%的條件下 進行，步驟3) 4)中所述的培養(yǎng)在溫度36. 5°C 37. 5pH調(diào)節(jié)7. 1 7. 5，溶氧調(diào)節(jié) 25% 80%，二氧化碳濃度為0% 10%的條件下進行。
6
優(yōu)選的是，本發(fā)明采用偽狂犬病毒種在Vero細胞上進行傳代適應后，提高了細胞 對病毒的敏感性，然后將在Vero細胞適應的偽狂犬病毒種接種到生物反應器中，在生產(chǎn)過 程中調(diào)節(jié)各種控制參數(shù)，如恒溫振蕩箱的攪拌速度、PH值、DO值、灌流速度、優(yōu)化接種病毒 的感染復數(shù)(M. 0. I.)，同時，還要掌握好接種病毒時細胞的密度和接毒時間等，使病毒在高 密度的生物反應器中高效繁殖，并連續(xù)灌流收獲病毒，從而實現(xiàn)連續(xù)收獲，并能進一步提高 病毒的滴度。本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述方法制備的偽狂犬病病毒。本發(fā)明的主要目的在于，提供了一種偽狂犬病疫苗的制備方法，在使用上述方法 制備收獲偽狂犬病病毒后，加入凍干保護劑，混勻，定量分裝，凍干，獲得偽狂犬病活疫苗。本發(fā)明還提供了一種根據(jù)上述的方法制備的偽狂犬病疫苗。在發(fā)明中，術語病毒感染復數(shù)(Μ. 0. I.，multiplicity of infection)是指病毒感 染細胞的研究中感染時病毒與細胞數(shù)量之比。術語溶氧(DO)指培養(yǎng)液中溶解氧飽和度。術語CO2濃度指載體罐中CO2占混合氣體的體積百分比。技術效果本發(fā)明采用了傳代細胞，尤其是采用了 Vero細胞，具有遺傳學穩(wěn)定，沒有外源因 子污染和無致瘤性的優(yōu)點。本發(fā)明反應器系統(tǒng)培養(yǎng)的偽狂犬病毒數(shù)量和滴度明顯高于轉 瓶培養(yǎng)，因此在制備疫苗的后工藝中，不但提高了疫苗產(chǎn)量，也可大量減少殘余細胞宿主蛋 白、殘余細胞DNA、殘余牛血清等異源物質(zhì)的含量，進一步提高了疫苗接種的安全性，也更能 夠符合WHO《使用動物細胞生產(chǎn)生物制品規(guī)程》的要求和市場需求。


圖1為Vero細胞接種1天時載體上的顯微照片；圖2為Vero細胞培養(yǎng)至第3天時載體上的顯微照片；圖3為偽狂犬病病毒接種9天時載體上的顯微照片；圖4為潮汐式生物反應器結構示意圖。其中，各個標記分別為1進料桶、2收料桶、 3自動饋料儀、4pH/D0監(jiān)控器、5恒溫振蕩箱、6培養(yǎng)液袋、7電腦控制器、8載體罐、9載體、10 恒溫培養(yǎng)艙、11進/取樣管。
具體實施例方式本發(fā)明的方法對于所用的設備、裝置或儀器沒有特殊要求，其可在各種類型的潮 汐式生物反應器中進行。雖然本申請具體實施例中采用的潮汐式生物反應器是購自賽宇細 胞科技股份有限公司的TideCell生物反應器，但是本領域技術人員在閱讀了本說明書的 描述后可以預計到，其他潮汐式生物反應器(無論大小)也能適用于本發(fā)明的方法。因偽 狂犬病病毒能在多種組織細胞上增殖，但對不同的細胞具有不同的敏感性，因此，本發(fā)明的 較佳實施方案中，選擇使用的是BHK-21細胞、MDBK細胞，更佳的是Vero細胞。本發(fā)明實施例中采用的潮汐式生物反應器結構如圖4所示。其中，各個標記分別 為1進料桶、2收料桶、3自動饋料儀、4pH/D0監(jiān)控器、5恒溫振蕩箱、6培養(yǎng)液袋、7電腦控制 器、8載體罐、9載體、10恒溫培養(yǎng)艙、11進/取樣管。
較佳地，本發(fā)明實施例中采用了依據(jù)潮汐原理而設計的高密度細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，即 TideCell潮汐式生物反應器，該生物反應器的各部分功能及工作原理如下載體罐放置于恒溫培養(yǎng)艙中，恒溫培養(yǎng)艙為載體罐提供一個恒溫的環(huán)境。載體罐 是細胞培養(yǎng)與病毒增殖的場所，細胞貼附生長在載體罐內(nèi)部的載體上，當培養(yǎng)液袋內(nèi)的培 養(yǎng)液泵入載體罐時，載體罐內(nèi)的培養(yǎng)液液面上升并淹沒細胞，向細胞供給養(yǎng)分，并將細胞的 新陳代謝產(chǎn)物從細胞上去除。當載體罐內(nèi)的培養(yǎng)液泵入培養(yǎng)液袋時，載體罐中的培養(yǎng)液液 面隨之下降，細胞露出，進行通風供氧。間歇淹沒與暴露載體床的培養(yǎng)方式使載體上的細胞 能夠得到足夠的營養(yǎng)和氧氣，同時產(chǎn)生的代謝廢物能夠有效地被排出去。載體罐的蓋子上裝有數(shù)根管道，這些管道的作用包括人工手動方式向載體罐內(nèi) 注入液體(如接種細胞懸液等)或排出載體罐內(nèi)的液體；由電腦控制器控制向載體罐注入 氣體，氣體通常是壓縮空氣、氧氣及CO2三種的混合物，三種氣體在混合物中的比例可以自 動調(diào)節(jié)控制，以適應細胞培養(yǎng)需要。電腦控制器可自動控制混合氣體向載體罐內(nèi)的注入與 排出，并為潮汐提供動力。培養(yǎng)液袋用以盛裝培養(yǎng)液，并通過兩條管道與載體罐底部相通，兩條管道分別為 液體灌流通道，通過與載體罐之間的液體流動，從而完成潮汐過程。培養(yǎng)液在潮汐過程中的 灌流速度可通過電腦控制器進行調(diào)整。培養(yǎng)液的換液量是指在一次潮汐過程中，泵入或泵 出載體罐的液體量，換液量的大小決定了載體罐內(nèi)液面頂部和底部所處的位置。在培養(yǎng)液袋與載體罐之間相連通的管道上設有進/取樣管，可使用無菌注射器通 過進/取樣管對培養(yǎng)液進行取樣，用以檢測其中的葡萄糖含量及病毒含量等指標。葡萄糖 的添加若葡萄糖低于規(guī)定標準，則根據(jù)葡萄糖測定儀測定培養(yǎng)液中剩余葡萄糖的含量，及 培養(yǎng)液的總體積計算出需補加的葡萄糖量，利用無菌注射器抽取配制的葡萄糖溶液從進/ 取樣管中注射到載體罐與培養(yǎng)液袋之間的導管中，葡萄糖溶液隨著載體罐的換液得以從導 管進入培養(yǎng)液袋并做進一步混勻。恒溫振蕩箱通過加熱與振蕩，來維持培養(yǎng)液袋內(nèi)培養(yǎng)液溫度的恒定及成分的勻質(zhì) 性。pH/DO監(jiān)控器可以監(jiān)測培養(yǎng)液袋內(nèi)培養(yǎng)液的酸堿度(pH值)及溶氧(DO)，并通過 注入堿性溶液(NaOH或NaHCO3溶液)將培養(yǎng)液的pH值控制在合適范圍內(nèi)。收料桶及進料桶均通過自動饋料儀與培養(yǎng)液袋相連，培養(yǎng)液袋內(nèi)的培養(yǎng)液需要進 行收獲時，可通過自動饋料儀進入收料桶，而進料桶內(nèi)的培養(yǎng)液則可以通過自動饋料儀對 培養(yǎng)液袋進行補充。在本發(fā)明實施例中，所用的生物反應器的載體罐體積為2 100L，電腦控制器可 以調(diào)節(jié)控制多種參數(shù)，如潮汐過程中載體罐內(nèi)培養(yǎng)液的潮汐速率及頻率、恒溫培養(yǎng)艙的溫 度、溶氧、CO2濃度等。本發(fā)明實施例所用的載體由聚丙烯與藻素酸等材料制成。本領域細胞培養(yǎng)常用的 其他材質(zhì)制作的載體如聚酯纖維載體、明膠載體、聚酰胺載體、聚乙烯醇載體、聚苯乙烯載 體、聚丙烯載體、聚氨酯載體、碳氟聚合物載體以及陶瓷載體等，均可使用本發(fā)明之方法生 產(chǎn)偽狂犬病病毒。本發(fā)明實施例所用的病毒株包括偽狂犬病病毒基因工程株、弱毒株、強毒株等，均 可使用本發(fā)明的方法進行大規(guī)模培養(yǎng)。本發(fā)明實施例所用的病毒株采用的毒株分別為偽狂犬病病毒強毒株Fa株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、Ea株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)； 偽狂犬病病毒缺失株Fa(TK7gE7gI_)(該毒株參見中國專利CNlO 1186902A，該毒株以保藏 編號V200002保藏于中國典型培養(yǎng)物典藏中心(CCTCC)，Ea株(TK_/gE7gI_)(該毒株參見中 國專利CN1523103A，該毒株以保藏編號0907保存于CGMCC)；偽狂犬病病毒弱毒株Bartha 株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、Bartha_K61株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、Bucharest 株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)、BUK株(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。傳代細胞使用的Vero細 胞，來源于美國典型培養(yǎng)物典藏中心(ATCC)，傳代數(shù)124，保藏號為CCL-81。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這 些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1利用Vero細胞在潮汐式生物反應器中連續(xù)生產(chǎn)偽狂犬病病毒生物反應器=TideCell生物反應器，購自賽宇細胞科技股份有限公司。載體BioN0C II載體，購自賽宇細胞科技股份有限公司。CVD細胞核計數(shù)試劑盒購自賽宇細胞科技股份有限公司，貨號AB0100，批號 3007。葡萄糖測定儀購自賽宇細胞科技股份有限公司。偽狂犬病毒Bartha-K61株(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司(貨號12800-082，批號1309922)。胰酶購自BD-Difco 公司(貨號215250，批號=5213753)。胎牛血清購自PAA公司(貨號A15-151，批號A64905_0972)葡萄糖購自SIGMA 公司(貨號:7021，批號:MFCD00063774)。碳酸氫鈉(NaHCO3)購自SIGMA公司(貨號:S_4019)。1)細胞的復蘇培養(yǎng)先進行細胞的復蘇，將一支工作細胞庫中的Vero細胞(該 細胞株以保藏編號CCL-81保藏于美國典型培養(yǎng)物典藏中心(ATCC)具體可見ATCC網(wǎng) 頁:http://www. atcc. org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/ Default, aspx ？ ATCCNum = CCL_81&Template = cellBiology)從液氮中取出，把細胞懸液 加入到方瓶中，利用細胞生長液(先按照說明書把DMEM培養(yǎng)基配成細胞培養(yǎng)液，每IL DMEM 細胞培養(yǎng)液中加入40ml PAA胎牛血清即為細胞生長液)進行培養(yǎng)，每3天傳代1次，具體 為，把已培養(yǎng)3天的細胞瓶中的細胞生長液倒掉，利用消化液(稱取8g NaCl、4g KClUOg 葡萄糖、2g EDTA-2Na、5. 8g NaHCO3和胰酶5g溶于800ml超純水中，最后加超純水定容至IL 過濾除菌)消化完全后，將細胞懸液與細胞生長液(配方如上所述)按1 3的比例重懸 進行分散。當利用方瓶培養(yǎng)一定數(shù)量后，再利用轉瓶進行傳代培養(yǎng)，方法與方瓶一樣。2)生物反應器中細胞的接種稱取BioNOC II載體600g(體積為10L)倒入IOL載 體罐中，加入 9. 5L PBS 緩沖液(0. 01mol/L，pH7. 2，稱取 8g NaCl,0. 2g KCl、1.44g Na2HP04 和0. 24g KH2P04，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 2，最后加蒸餾水定容 至1L，121°C高壓蒸氣滅菌30分鐘，室溫保存)至完全浸沒載體過夜，將載體罐連同載體以 蒸汽高溫高壓(121°C)滅菌30分鐘，然后利用雙耳球把載體罐中的PBS緩沖液泵出。把 轉瓶培養(yǎng)的Vero細胞利用消化液(配方如上所述)消化分散，用細胞生長液(配方如上所 述)重懸后，按照1. 5X 107cells/g載體的終密度接入IOL載體罐中，并補加細胞生長液至
98. 0L，將載體罐放入37°C恒溫培養(yǎng)艙中。把50L無菌培養(yǎng)液袋置入恒溫攪拌箱中，把50L細 胞生長液(配方如上所述)泵入無菌培養(yǎng)液袋中，恒溫攪拌箱的溫度設為37.0°C，攪拌速 度45轉/分，再通過導管把載體罐與培養(yǎng)液袋進行連接，啟動細胞吸附程序設定換液量為 1L，載體罐中培養(yǎng)液的液面上下行速度均為2600ml/分鐘，液面在反應器上下端點(上下端 點為載體罐內(nèi)的液面在潮汐過程中所能達到的最高點和最低點，隨著換液量的大小不同而 不同。)停滯時間為30/20S，該程序運行180min。利用葡萄糖測定儀測定生長液中的葡萄 糖含量，若葡萄糖低于lg/L則利用無菌注射器抽取30%的葡萄糖溶液(稱取30g葡萄糖 完全溶解于超純水中，定容至100ml，過濾除菌)控制葡萄糖含量范圍lg/L 3g/L。利用 7. 5% NaHCO3(稱取7. 5g NaHCO3完全溶于超純水中，定容至100ml，過濾除菌)由pH監(jiān)控 器自動調(diào)節(jié)pH值7. 2 士 0. 2，溶氧自動控制65 %，二氧化碳濃度自動調(diào)節(jié)5.0%。3)生物反應器中細胞的培養(yǎng)細胞吸附程序結束后改為細胞培養(yǎng)程序設定換液 量為9. 0L，載體罐中培養(yǎng)液的液面上下行速度為2000ml/min，液面在反應器上下端點(上 下端點為載體罐內(nèi)的液面在潮汐過程中所能達到的最高點和最低點，隨著換液量的大小不 同而不同)停滯時間為40s/40s。培養(yǎng)期間，自接種細胞時算起，每24小時把TideCell載 體罐的蓋子打開利用載體取樣器取載體5片，并把其分別放入Iml的CVD細胞核染色液中， 37°C作用Ih后利用細胞計數(shù)板計數(shù)，以了解細胞增殖情況；同時也每24小時通過進/取樣 管利用無菌注射器抽取少量培養(yǎng)液，采用葡萄糖測定儀測定培養(yǎng)液中葡萄糖含量。葡萄糖 含量、PH值、溶氧和二氧化碳濃度的參數(shù)設定同步驟2)。載體與Vero細胞結合的電子顯微 鏡照片參見圖1。可以看出，Vero細胞培養(yǎng)至第1天，基本上全貼附于載體之上，細胞圓潤 長勢良好，但細胞稍稀疏。4)生物反應器中接種病毒自細胞接種之時算起，Vero細胞培養(yǎng)至第3天，Vero 細胞與載體結合的電子顯微鏡照片，如圖2所示，細胞密度較高，緊密貼附于載體之上，且 有大量細胞附著于載體縫隙中。此時細胞密度已達到6. OX 108cellS/g載體則開始接毒，先 把載體罐中的培養(yǎng)液泵出，按照病毒與細胞的比即感染復數(shù)(M.O. I.)為0.001接毒。然后 往載體罐中補加細胞維持液(先按照說明書把DMEM培養(yǎng)基配成細胞培養(yǎng)液，每IL DMEM細 胞培養(yǎng)液中加入IOml PAA胎牛血清即為細胞維持液)8. OL,同時把培養(yǎng)液袋中50L的細胞 生長液泵出，再泵進50L的細胞維持液(配方如上所述)。啟動病毒吸附程序設定載體罐 與培養(yǎng)液袋的換液量為1L，載體罐中培養(yǎng)液的液面上下行速度均為2500ml/分鐘，液面在 反應器上下端點(上下端點為載體罐內(nèi)的液面在潮汐過程中所能達到的最高點和最低點， 隨著換液量的大小不同而不同。)停滯時間為40s/10s，該程序運行200min。利用30%的 葡萄糖溶液(配方如上所述)控制葡萄糖含量范圍lg/L 3g/L，利用7. 5% NaHCO3(配方 如上所述)自動調(diào)節(jié)PH值7. 35 士 0. 15，溶氧自動控制40 %，二氧化碳濃度自動調(diào)節(jié)5.0%。5)生物反應器中病毒的收獲病毒吸附程序結束后，仍運行步驟3)中的細胞培養(yǎng) 程序。利用30%的葡萄糖溶液(配方如上所述)控制葡萄糖含量范圍lg/L 3g/L，利用 7. 5^NaHCO3(配方如上所述)自動調(diào)節(jié)pH值7. 25士0. 15，溶氧自動控制30%，二氧化碳濃 度自動調(diào)節(jié)1.0%。自接毒之時算起，分別于第3、6、9天收獲病毒液。每次收獲病毒液時， 利用自動饋料儀先把培養(yǎng)液袋中50L的培養(yǎng)液(即病毒液)按照5L/min的流速收集到病 毒收集桶，并于-40°C凍存，再利用自動饋料儀把新配制的細胞維持液(配方如上所述)泵 入到50L培養(yǎng)液袋中。最后一次收獲時，載體罐中的載體連同其中的培養(yǎng)液(即病毒液)
10一起于_40°C凍融1次收獲。接毒后隨著病毒的增殖Vero細胞病變逐漸加重，先后出現(xiàn)變 圓從載體上脫落、萎縮、破碎的現(xiàn)象，連續(xù)關注至接毒后第9天細胞大量脫落，破碎附著在 載體上，如圖3所示。病毒液的病毒含量TCID5tl測定按照常規(guī)方法進行，比如可以按照文獻 方法進行(如參照中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程，2000年版附錄446頁)，第3、6、9天 收獲的病毒液的滴度分別為 109_ 8TCID50/ml、109_ 75TCID50/ml、109_ 8TCID50/ml。Vero細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器和其他偽狂犬病毒毒株時，細胞培 養(yǎng)和病毒增殖情況基本相同，收獲病毒也的滴度也無明顯差異。實施例2BHK-21細胞在潮汐式生物反應器中連續(xù)生產(chǎn)偽狂犬病病毒細胞培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司(貨號61100-087，批號678277)，按產(chǎn) 品說明書所述配制成細胞培養(yǎng)液。牛血清購自Hyclone 公司(貨號:SV30087. 02，批號:NSK0069)偽狂犬病毒Fa基因缺失株(TK_/gE7gr)(該毒株參見中國專利CN101186902A， 該毒株以保藏編號V200002保藏于中國典型培養(yǎng)物典藏中心(CCTCC))。其他材料與試劑同實施例1。本實施例采用的BHK-21細胞以保藏號CCL-10保藏于美國典型培養(yǎng)物典藏中 心(ATCC)具體可見 ATCC 網(wǎng)頁 http://www. atcc. org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ ProductDetails/tabid/452/Default. aspx ？ ATCCNum = CCL—lO&Template = cellBiology，在本實例中采用載體罐為IOL的TideCell生物反應器，該實施例的步驟、 方法和參數(shù)與實施例1的步驟、方法和參數(shù)基本相同，使用的細胞生長液和細胞維持液中 牛血清的配比也相同，不同之處在于，使用的細胞培養(yǎng)液和牛血清如上所述，BHK-21細胞 以1.3X107cellS/g載體的密度接入反應器。實施例中病毒接種感染復數(shù)也為0.001， 潮汐式培養(yǎng)9天，每次收毒50L，第3、6、9天收獲潮汐式培養(yǎng)的病毒液，病毒滴度分別為 ΙΟ9' 75TCID50/ml、ΙΟ9' 8TCID50/ml、IO9' 75TCID50/ml。BHK-21細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器和其他偽狂犬病毒毒株時，細胞 培養(yǎng)和病毒增殖情況基本相同，收獲病毒也的滴度也無明顯差異。實施例3MDBK細胞在潮汐式生物反應器中連續(xù)生產(chǎn)偽狂犬病病毒細胞培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司(貨號61100-087，批號678277)，按產(chǎn) 品說明書所述配制成細胞培養(yǎng)液。新生牛血清(GIBC0公司生產(chǎn)，貨號16010-14，批號693745)其他材料與試劑同實施例1。本實施例中MDBK細胞(NBL-I)以保藏號CCL-22保藏于美國典型培養(yǎng)物典藏中 心(ATCC)具體可見 ATCC 網(wǎng)頁。http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ ProductDetails/tabid/452/Default. aspx ？ ATCCNum = CCL_22&Templ￡ite = CellBiology0本實施例采用載體罐為IOL的潮汐式生物反應器，采用的步驟、方法和參 數(shù)與實施例1的步驟、方法和參數(shù)基本相同，采用的細胞生長液和細胞維持液也與實施 例1中牛血清的配比相同，不同之處在于，使用的細胞培養(yǎng)液和牛血清如上所述，MDBK細 胞以1.5X107cellS/g載體的密度接入反應器。實施例中病毒接種時感染復數(shù)為0.001。 潮汐式培養(yǎng)9天，每次收毒50L，第3、6、9天收獲潮汐式培養(yǎng)的病毒液，病毒滴度分別為 ΙΟ9' 75TCID50/ml、ΙΟ9' 8TCID50/ml、IO9' 8TCID50/ml。
11
MDBK細胞在利用其他體積的潮汐式生物反應器和其他偽狂犬病毒毒株時，細胞培 養(yǎng)和病毒增殖情況基本相同，收獲病毒也的滴度也無明顯差異。實施例4偽狂犬病疫苗的制備由實施例1 3所述方法制備的偽狂犬病病毒按照現(xiàn)行《中華人民共和國獸藥典》 相關規(guī)定檢驗合格，無細菌和霉菌、支原體、外源病毒污染。將收獲的檢驗合格的病毒液加 入凍干保護劑，混勻，定量分裝，凍干制備偽狂犬病活疫苗。實施例5偽狂犬病疫苗的效力與生物學檢驗將實施例4中制備的活疫苗按照現(xiàn)行獸用生物制品規(guī)程要求進行檢驗。用檢驗合 格的制品進行臨床試驗——仔豬攻毒試驗。①安全性試驗按瓶簽注明頭份用PBS(0.01mol/L pH7. 2)稀釋為每5ml含14頭份，肌肉注射6 18月無偽狂犬病病毒中和抗體的綿羊2只，每頭5ml，觀察14日，無臨床反應。結果如表1。表1注射疫苗綿羊的臨床癥狀
綿羊編號觀察天數(shù)臨床癥狀精神狀態(tài)良好，體溫正常,皮0900114d膚沒有瘙疼癥狀精神狀態(tài)良好，體溫正常,皮0900214d膚沒有瘙痹癥狀②效力檢驗按瓶簽注明頭份用PBS稀釋為每Iml含0. 2個使用劑量，肌肉接種 6 18月齡綿羊4頭，每頭lml，14日后連同條件相同的無偽狂犬病病毒中和抗體對照綿羊 3頭，每頭肌肉注射強毒lml (1000LD50)，觀察14天，對照綿羊2頭發(fā)病死亡，免疫綿羊全部 保護為合格。如表2。表2實驗綿羊與對照組的動物反應注射疫苗后反應注射強毒后反應 死亡曰期
實驗組
精神狀態(tài)良好， 體溫正常，沒有 瘙痹癥狀
對照組
精神狀態(tài)良好， 體溫在1 2日略 有升高，皮膚沒 有瘙癢癥狀
精神沉郁，體溫 升高，皮膚有瘙 癢癥狀
均健康成活
攻毒后4、5 天各死一只， 另一只存活， 但精神沉郁， 身體削痩實施例6轉瓶培養(yǎng)與潮汐式生物反應器的比較材料與試劑同實施例1。另外有10L轉瓶購自四川萬福玻璃儀器有限責任公司。 轉瓶機(型號ZP01)購自湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司。1)在IOL轉瓶中生產(chǎn)偽狂犬病毒，先將Vero細胞進行細胞的復蘇、方瓶擴增培養(yǎng)， 具體方法如實施例1中的步驟1)，再以終濃度為4. 5X104cells/ml接種至IOL轉瓶，加細 胞生長液(配方如實施例1所述)至3.0L。至37°C溫室中于轉瓶機上以5轉/小時培養(yǎng)， 以此方式培養(yǎng)細胞至2天接種偽狂犬病毒，接毒前，先把IOL轉瓶中的細胞生長液倒掉，然 后按照以0. 001的感染復數(shù)進行接毒，補加細胞維持液至3L，至37°C溫室中于轉瓶機上以 10轉/小時培養(yǎng)，此過程為病毒吸附1小時后，1小時后把轉瓶機的轉速改為5轉/小時， 其他條件不變，自接毒之時算起培養(yǎng)至第3天，收獲病毒液，即IOL轉瓶連同其中的細胞、細 胞維持液置-40°C凍融一次后完全收獲，測定病毒滴度TCID5tl，方法同實施例1。2)在載體罐為IOL的生物反應器中生產(chǎn)偽狂犬病毒，方法步驟同實施例1。3)實驗結果=Vero細胞在IOL轉瓶中培養(yǎng)偽狂犬病毒的的滴度為108 8TCID5Q/ml ；
在IOL反應器中培養(yǎng)的偽狂犬病; 體見表3。表3兩種培養(yǎng)方式比較
權利要求
一種偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟1)細胞的接種將哺乳動物細胞接種到潮汐式生物反應器載體罐(8)內(nèi)添加的載體(9)上，進行細胞的吸附培養(yǎng)；2)在細胞的吸附培養(yǎng)結束后進行細胞的擴增培養(yǎng)；3)將偽狂犬病毒接種到擴增培養(yǎng)的細胞上，進行病毒的吸附培養(yǎng)；4)在病毒的吸附培養(yǎng)結束后進行感染細胞的培養(yǎng)；和5)收獲含有偽狂犬病毒的培養(yǎng)液，其中步驟1)至4)中的培養(yǎng)在潮汐培養(yǎng)條件下進行，所述潮汐培養(yǎng)條件是通過泵出或泵入載體罐(8)中的培養(yǎng)液以間歇性淹沒與暴露載體實現(xiàn)的。
2.根據(jù)權利要求1所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述載體罐 (8)與裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)液袋(6)以能夠?qū)⑴囵B(yǎng)液袋內(nèi)的培養(yǎng)液泵入載體罐中和能將載體 罐內(nèi)的培養(yǎng)液泵入培養(yǎng)液袋中的方式相聯(lián)通。
3.根據(jù)權利要求1所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述載體罐 中的載體由選自聚丙烯、藻素酸、聚酯纖維、明膠、聚酰胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯、聚氨酯、碳 氟聚合物以及陶瓷中的一種或多種制成。
4.根據(jù)權利要求1所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述載體罐 中的載體占載體罐容積的40% 100% (V/V)。
5.根據(jù)權利要求1 4任一項所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所 述的潮汐式生物反應器載體罐容積為2 100L。
6.根據(jù)權利要求1 4任一項所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所 述偽狂犬病毒是選自偽狂犬病病毒強毒株、偽狂犬病病毒基因缺失株和偽狂犬病病毒弱毒 株中的一種。
7.根據(jù)權利要求6所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的偽狂 犬病病毒為選自偽狂犬病病毒強毒株Fa株、Ea株、偽狂犬病病毒基因缺失株Fa (TKVgEV gF)株、Ea(TK7gE7gr)株、偽狂犬病病毒弱毒株 Bartha 株、Bartha_K61 株、Bucharest 株、 BUK株中的一種。
8.根據(jù)權利要求7所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的偽狂 犬病病毒為選自偽狂犬病毒基因缺失株Fa(TK7gE7gI_)株、Bartha-K61株和BUK株中的一 種。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，在步驟 3)中的病毒接種按照感染復數(shù)為0. 0001 1進行。
10.根據(jù)權利要求9所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述哺乳動 物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞、MDBK細胞、ST細胞、PK15細胞和IBRS細胞中的一 種。
11.根據(jù)權利要求10所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，所述哺乳 動物細胞為選自Vero細胞、BHK-21細胞和MDBK細胞中的一種。
12.根據(jù)權利要求10或11所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，在步 驟1)中以8. 5 X IO6 4. OX 107cells/g載體的細胞密度接種細胞。
13.根據(jù)權利要求12所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，在步驟2)中的細胞擴增培養(yǎng)達到5. 5X IO8 7. 5X108cells/g載體的細胞密度時進行步驟3)所述 的病毒接種。
14.根據(jù)權利要求13所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟1)中 所述的吸附培養(yǎng)和步驟2)中所述的擴增培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液為細胞生長液，其中所述的細 胞生長液由細胞培養(yǎng)液加3% 5% (V/V)的牛血清組成；步驟3)中所述的病毒吸附培養(yǎng) 和步驟4)中所述的感染細胞的培養(yǎng)使用的培養(yǎng)液為細胞維持液，所述的細胞維持液由細 胞培養(yǎng)液加0.5% 1.5% (V/V)的牛血清配制而成，其中所述的細胞培養(yǎng)液為選自MEM培 養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液、EMEM培養(yǎng)液、199培養(yǎng)液、1640培養(yǎng)液和α -MEM培養(yǎng)液中的任意一種， 所述的牛血清為胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
15.根據(jù)權利要求14所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟1)中 所述的吸附培養(yǎng)和步驟3)中所述的病毒吸附培養(yǎng)設定載體罐與培養(yǎng)液袋的換液量為載體 罐容積的5% 20% (V/V)，載體罐中生長液的液面上下行速度均為0. 5 50L/分鐘，液面 在載體上下端點停滯時間均為0 150分鐘，該吸附培養(yǎng)程序運行60 240分鐘，步驟2) 中所述的擴增培養(yǎng)和步驟4)中所述的感染細胞的培養(yǎng)設定換液量為載體罐容積的70% 95% (V/V)，載體罐中液面上下行速度均為0. 5 50L/分鐘，液面在反應器上下端點停滯時 間均為0 150分鐘。
16.根據(jù)權利要求15所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟5)中 所述的收獲含有偽狂犬病毒的培養(yǎng)液為在步驟4)所述的感染細胞的培養(yǎng)過程中，自病毒 接種之時算起的第2 4天開始第1次收集，以后每間隔2 4天收獲1次，共收獲2 4 次，每次收獲時，將培養(yǎng)液袋中的培養(yǎng)液全部收集到病毒收集桶，再將新配制的細胞維持液 泵入到培養(yǎng)液袋中繼續(xù)下一輪感染細胞的培養(yǎng)和培養(yǎng)液的收集。
17.根據(jù)權利要求13 16中任一項所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在 于，在步驟1)至4)的培養(yǎng)過程中控制葡萄糖含量范圍為0. 5 5g/L。
18.根據(jù)權利要求17所述的偽狂犬病病毒的大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟1) 2)中所述的培養(yǎng)在溫度36. 5 0C 37. 5 0C，pH值調(diào)節(jié)7. 0 8. 0，溶氧調(diào)節(jié)10% 80%，二氧 化碳濃度為0% 10%的條件下進行，步驟3) 4)中所述的培養(yǎng)在溫度36. 5°C 37. 5°C， pH調(diào)節(jié)7. 1 7. 5，溶氧調(diào)節(jié)25% 80%，二氧化碳濃度為0% 10%的條件下進行。
19.一種由權利要求1 18任意一項所述的方法制備的偽狂犬病病毒。
20.一種偽狂犬病病毒疫苗的制備方法，其特征在于，由權利要求1 18任意一項所述 的方法制備收獲偽狂犬病病毒，加入凍干保護劑，混勻，定量分裝，凍干，獲得偽狂犬病活疫田ο
21.一種根據(jù)權利要求20所述的方法制備的偽狂犬病活疫苗。全文摘要
本發(fā)明涉及一種用潮汐式生物反應器培養(yǎng)傳代細胞生產(chǎn)偽狂犬病疫苗的方法(1)復蘇細胞進行傳代培養(yǎng)；(2)應用特定生物反應器和載體系統(tǒng)進行細胞的高密度培養(yǎng)，讓細胞在載體上貼附，讓培養(yǎng)基循環(huán)、充氧、調(diào)控pH值和葡萄糖；(3)應用生物反應器進行病毒感染，更換成病毒培養(yǎng)基，接入病毒，讓病毒在細胞上吸附完全；(4)特定的條件培養(yǎng)、擴增病毒；(5)收獲病毒；(6)加入凍干保護劑，混勻，定量分裝，凍干，獲得偽狂犬病活疫苗。
文檔編號A61K39/245GK101979519SQ20101051345
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權日2010年5月10日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司