專利名稱：一種海洋鏈霉菌屬菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于海洋微生物領域，具體設計一種由海洋鏈霉菌屬菌株(Str印tomyces sp. HH-1)制備的抗細菌群體感應活性提取物及其應用。
背景技術：
群體感應(Quorum Sensing，QS)是細菌根據自身細胞密度變化進行自我協調的 一種群體行為。細菌利用信號分子，或稱為自誘導物(autoinducers，Al)作為相互交流的 “語言”，細菌在繁殖過程中不斷將信號分子分泌到胞外，并檢測其濃度從而感知其群體密 度的變化；當其密度達到某個閾值時，就會啟動某些基因的表達。群體感應系統廣泛存在于 革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中，控制著包括生物被膜形成、毒素產生、致病基因表達、胞 外多糖生成等一系列的細菌行為和表型，對病原菌致病過程起決定性的作用。大量文獻表 明缺失了群體感應系統的菌株其致病能力大大降低，因此，通過干擾細菌群體感應系統來 控制病原菌致病是一個非常有效的策略，并且以細菌的群體感應系統為靶標篩選的抗菌藥 物，與那些傳統的抗生素藥物的作用機制完全不同，只抑制細菌群體感應調控的致病行為， 不影響細菌的生長，理論上不會產生細菌耐藥性。目前，人們利用不同的篩選模型，發現了 furanone (J EMBO, 2003，22 (15) 3803-3815.)、4-NP0(J Bacteriol,2005,187(5) 1799-1814)、solenopsinA(Infect Dis, 2008，198(8) 1198-1201)等化合物具有細菌群體感應抑制作用。QSIS2篩選模型(J Bacteriol, 2005,187(5) :1799_1814)是利用受銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 群體感應系統(Nature，2000，406 :959_964)調節的下游基因IasB的啟動子，和蔗糖致死 基因SacB為報告基因構建而成；在有蔗糖底物存在的情況下，信號分子3-氧十二烷酰高 絲氨酸內酯(3-OXO-C12-HSL)和IasR受體蛋白結合，啟動IasB啟動子下游致死基因SacB 的表達，若存在群體感應抑制因子如陽性對照物C30 (furanone)，致死作用則會得到補救； 紫色桿菌(Chromobacterium violaceum)是一種革蘭氏陰性細菌，當自身細菌細胞密度的 增加達到一定臨界濃度時，向環境中釋放的信號分子己酰基高絲氨酸內酯(C6-HSL)能與 胞內轉錄調節蛋白CviR結合，啟動紫色菌素等群體感應相關基因的表達；所以紫色桿菌 常作為一種簡便、直觀的群體感應抑制因子篩選模式菌株(Microbiology，1997，143 (12) 3703-3711)。海洋微生物是生物活性物質的巨大寶庫。特殊的海洋環境賦予海洋微生物以新的 活性，高鹽度、高壓力、低溫及特殊的光照等復雜海洋生態環境可能使海洋微生物在物種、 基因組成和生態功能上具有更大的多樣性，產生不同于陸地來源的特殊產物。本發明是從 海洋軟體動物體內分離內共生放線菌，利用QSIS2篩選模型和TTC活菌染色的方法得到一 株具有細菌群體感應抑制活性的鏈霉菌HH-I，并且其發酵液提取物能夠抑制紫色桿菌群體 感應系統調控的紫色菌素的產量。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺點，提供一種由海洋Sti^ptomyces sp. HH-I發酵制備的提取物，該提取物具有抑制銅綠假單胞菌和紫色桿菌群體感應系統的 活性，并且能夠降低致病菌毒力因子的產生，減弱致病菌的耐藥性。本發明所述的活性提取物的獲得方法主要有海洋Str印tomyces sp. HH-I分離 與提取物的制備兩個步驟。取活化后的海洋Sti^ptomyces sp. HH-1，接種到發酵培養基 中進行發酵培養，發酵結束后用等體積乙酸乙酯萃取3次，將萃取液過濾，真空低溫濃縮至 干，得到褐色浸膏，稱取適量褐色浸膏用甲醇溶解后用于生物活性測定。本發明所涉及的海洋Sti^ptomyces sp. HH-I制備的提取物具有抑制銅綠假單胞 菌和紫色桿菌感染的作用；該提取物在0-200mg/mL濃度范圍內不抑制紫色桿菌CV026的生 長；但能顯著降低紫色桿菌紫色菌素的生成，且該提取物的群體感應抑制作用呈濃度依賴 性；該提取物在0-500mg/mL的范圍內對篩選模型QSIS2的生長不產生影響。本發明與現有技術相比，具有海洋Sti^ptomyces sp. HH-I菌株發酵培養條件簡 單，其制取提取物的工藝過程簡單易控，產量高，制備的提取物抑制細菌群體感應作用明顯 等優點。
圖1為本發明的活性提取物的活性篩選圖。圖2為本發明的提取物對篩選模型QSIS2生長曲線測試圖。圖3為本發明的提取物對紫色桿菌CV026生長曲線測試圖。圖4為本發明不同濃度的提取物對紫色桿菌紫色菌素產量的測定圖。
具體實施例方式下面通過實例并結合附圖對本發明做進一步的說明。實施例1 海洋放線菌的分離培養樣品采集2009年1月從膠州灣不同地區采集野生海洋軟體動物海虹、蛤蜊、海蠣 子，存放于無菌瓶中。放線菌分離和斜面保存培養基Solublestarch 20g ；KNO3Ig ;K2HP040. 5g ； MgSO4O. 5g ；FeSO4·7Η20 0. Olg ；agar 20g ；sea salts 33. 3g ；distilled water IOOOmL ；pH 7. 2 7. 4，121°C，1. OlXlO5Pa滅菌20min備用，分離培養基臨用前加終濃度為50mg/L的 放線菌酮和25mg/L的萘啶酮酸。放線菌發酵培養基Glucose IOg ；soluble starch IOg ；yeast extract IOg ； peptonelOg ；K2HPO4O. 5g ；NaCl 0. 5g ；MgSO4O. 5g ；beefextract 0. 3g ；CaC032g ；sea salts 33. 3g ；distilledwater IOOOmL ；pH 7. 2 7. 4，121°C, 1. OlXlO5Pa 滅菌 20min 備用。海洋放線菌的分離方法用無菌海水浸泡樣品，75%酒精表面消毒，去掉貝殼取軟 體，再次用75%酒精表面消毒，無菌海水沖洗3次，粉碎研磨，梯度稀釋，涂布到分離培養基 平板上，在28°C培養6 10d，將菌落挑出劃線分離純化，觀察和排重。發酵工藝將海洋放線菌平板活化后，挑取適量菌絲塊接種到內裝150mL上述液 體培養基的三角瓶中，溫度28°C、轉速140rpm，震蕩培養10天。發酵結束后，將發酵物菌絲體與上清混合液超聲破碎，加入等體積乙酸乙酯，室溫攪拌過夜，BOOOrpm離心取上清液，再 加入等體積乙酸乙酯重復萃取2次，將總萃取液真空低溫濃縮至干，得到褐色浸膏，褐色浸 膏提取物干燥后用甲醇溶解成lOOmg/mL儲液，用0. 22 μ M濾膜過濾后于4°C保存備用。實施例2 海洋Sti^ptomyces sp. HH-I提取物活性測試一.提取物群體感應抑制活性測試篩選模型所用培養基為LB 培養基Tryptone IOg ；yeast extract 5g ；NaCl IOg ； distilledwater IOOOmL ；固體 LB 培養基加入 15g agar ；pH 7. 0，121°C，1. 01 X IO5Pa 滅菌 20min備用。銅綠假單胞菌群體感應抑制因子(QSI)篩選模型QSIS2是由Thomas Bovbjerg Rasmussen等(JBacteriol，2005，187 (5) :1799_1814)構建的，該篩選模型是利用銅綠假單 胞菌受QS系統調節的致病相關基因IasB的啟動子域作為報道基因的啟動子，以果聚糖轉 移酶基因sacB(致死基因)為報道基因構建的，當向培養基中加入蔗糖時，由于sacB基因 的表達，菌體的生長會受到抑制，而當QSI存在時，sacB基因的表達受到抑制，保護菌體的 生長，從而能夠以菌體生長的變化來有效地篩選出群體感應系統的抑制物。紫色菌素在紫 色桿菌中是受群體感應嚴謹調控的(Microbiology，1997，143 (12) 3703-3711)，紫色桿菌 CV026為信號分子缺失菌株，在加入信號分子C6-HSL后，能夠啟動群體感應調控的紫色菌 素的產生，若有群體感應抑制因子的存在，則能抑制紫色菌素的產生，在瓊脂板上表現出渾 濁但不透明的圓圈。篩選模型QSIS2平板篩選方法13. 5mL融化的固體LB培養基冷卻至40°C，加入 1. 5mL 60%的蔗糖，150 μ L過夜培養的QSIS2菌液、6 μ L 500 μ mol/L的信號分子3-氧 十二烷酰高絲氨酸內酯3-ΟΧΟ-α2-!Β ，75μ 5% (w/v)的活菌染色劑紅四氮唑TTC和 24 μ L 50mg/mL的慶大霉素，混勻后倒平板。待平板凝固后，用打孔器打孔，每個孔內分別加 3μ L不同濃度的提取物，然后37°C培養箱培養，觀察加樣孔周圍菌圈生長情況，若提取物 具有群體感應抑制活性，則加樣孔周圍應有細菌生長圈出現，菌圈直徑越大即為活性越強， 檢測結果如圖所示Ia所示與陽性對照C30(6. 35 μ g)相比，0. 45mg、0. 3mg、0. 15mg提取物 呈現陽性結果，且成濃度依賴性。紫色桿菌平板篩選方法15mL融化的固體LB培養基冷卻至40°C，加入150 μ L過 夜培養的紫色桿菌CV026菌液、15 μ L 500 μ mol/L的信號分子己酰高絲氨酸內酯C6-HSL 和15yL 20mg/mL的卡那霉素，混勻后倒平板。待平板凝固后，用打孔器打孔，每個孔內 加3 μ L提取物，于30°C培養箱培養，若該提取物為群體感應抑制因子，則能抑制紫色菌 素的產生，在瓊脂板上表現出渾濁但不透明的圓圈，篩選結果如圖Ib所示與陽性對照 C30(6. 35 μ g)相比，0. 45mg、0. 3mg、0. 15mg提取物呈現陽性結果，且成濃度依賴性。二 .不同濃度提取物對QSIS2生長影響挑取篩選模型菌株QSIS2于新鮮LB培養基中，37°C、140rpm培養至對數期；用新 鮮LB將培養至對數期的菌液稀釋至0D_ ^ 0. 05，分裝6組，每組3個平行；每組分別加 入終濃度提取物終濃度 0mg/mL，50mg/mL, 100mg/mL, 200mg/mL, 300mg/mL, 400mg/mL, 37 °C、 140rpm搖床培養；每隔1_2小時分別測各管0D_直至對數后期；以培養時間Time(h)為橫 坐標，以600nm處的吸光度為縱坐標，繪制菌株QSIS2在海洋Str印tomyces sp. HH-I提取 物作用下的生長曲線，從生長曲線(圖2)可以看出，該提取物在0-400mg/mL濃度范圍內不 抑制篩選模型QSIS2的生長。
三.不同濃度的提取物對紫色桿菌CV026生長的影響挑取紫色桿菌CV026于新鮮LB培養基中，30°C、140rpm培養至對數期；用新鮮LB 將培養至對數期的菌液稀釋至OD6tltl ^ 0. 05，分裝5組，每組3個平行；每組分別加入提取 物至終濃度 Omg/mL，50mg/mL, 100mg/mL, 150mg/mL, 200mg/mL, 37 °C、140rpm 搖床培養；每隔 1-2小時分別測各管0D_直至對數后期；以培養時間Time(h)為橫坐標，以600nm處的光 吸光度為縱坐標，繪制紫色桿菌CV026在該提取物作用下的生長曲線(圖3)，該提取物在 0-200mg/mL濃度范圍內對紫色桿菌CV026的生長不產生影響。四.不同濃度的提取物對紫色桿菌紫色菌素產量測試挑取紫色桿菌CV026于新鮮LB培養基中，30°C、140rpm培養至對數期；用新鮮LB 將培養至對數期的菌液稀釋至OD6tltl為0. 05，分裝5組，每組3個平行；每組中加入信號分 子(C6HSL)至終濃度為500η μ mol/L，提取物的終濃度分別為Omg/mL、50mg/mL、100mg/mL、 150mg/mL，200mg/mL，30°C、140rpm振蕩培養12h。紫色菌素定量吸取ImL上述培養好的 菌液于1. 5mL Eppendorf管，HOOOrpm離心lOmin，使紫色菌素和菌體充分沉淀。去掉上 清液，加ImL DMSO于Eppendorf管，渦旋，充分振蕩使紫色菌素溶解于DMSO。HOOOrpm再 離心lOmin，沉淀菌體及碎屑。吸取上清測定OD585處的光吸收，濃度為50mg/mL、100mg/mL、 150mg/mL，200mg/mL該提取物分別對紫色桿菌紫色菌素降低量達25 %、47 %、65 %、82 % (圖 4)。
權利要求
一株來源于從海洋軟體動物體體內的具有細菌群體感應抑制活性的海洋Streptomycessp.HH 1，由該菌株發酵制備的提取物經銅綠假單胞菌篩選模型QSIS2和紫色桿菌模式菌株CV026篩選呈現陽性結果。
2.根據權利要求1該提取物在0-400mg/mL的范圍內對銅綠假單胞菌篩選模型QSIS2 的生長不產生影響，提取物在0-200mg/mL濃度范圍內不抑制紫色桿菌CV026的生長；但能 顯著降低紫色桿菌紫色菌素的生成，且該提取物的群體感應抑制作用呈濃度依賴性，隨著 濃度逐漸增加，其抑制作用逐漸增強，該提取物可用于防治紫色桿菌疾病感染方面上的研 允。
3.根據權利要求2由該海洋Str印tomyces sp. HH-I發酵提取物中分離出的抑制細菌 群體感應的有效成分可用于醫藥領域新型抗菌藥物的研發。
全文摘要
本發明涉及一種海洋鏈霉菌屬菌株及其應用。從海洋軟體動物體內分離內共生放線菌菌株，通過銅綠假單胞菌篩選模型QSIS2和紫色桿菌模式菌株CV026進行篩選，最終得到了一株具有細菌群體感應抑制活性的海洋Streptomyces sp.HH-1。本發明首次證明了由該株鏈霉菌屬菌株發酵制備的提取物對銅綠假單胞菌和紫色桿菌群體感應系統具有雙重抑制作用，并且在有效濃度范圍內對篩選模型QSIS2和紫色桿菌CV026的生長不產生抑制作用。該提取物能顯著降低紫色桿菌紫色菌素的產量，減弱致病菌的耐藥性。本發明制備原料易獲得，菌株發酵培養條件簡單，化合物制取的工藝過程易控，產量高等優點，由該海洋Streptomyces sp.HH-1發酵提取物中分離出的抑制細菌群體感應的有效成分可用于醫藥領域新型抗菌藥物的研發。
文檔編號A61P31/04GK101974456SQ201010295829
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者于文功, 宮倩紅, 尹守亮, 王清池 申請人:中國海洋大學