一種聚酯類纖維載體培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的方法

專利名稱：一種聚酯類纖維載體培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，具體是一種聚酯類纖維載體培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的方法。
背景技術(shù)：
疫苗是將病原微生物(如細(xì)菌、立克次氏體、病毒等)及其代謝產(chǎn)物，經(jīng)過人工減毒、滅活或利用基因工程等方法制成的用于預(yù)防傳染病的自動(dòng)免疫制劑。疫苗作為一種特殊的藥物，作為免疫學(xué)經(jīng)驗(yàn)理論和生物技術(shù)共同發(fā)展而產(chǎn)生的生物制品，從防患于未然的角度消除了眾多傳染病對(duì)動(dòng)物生命的威脅，保證了人體健康，也促進(jìn)了養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展， 在國計(jì)民生的健康發(fā)展中起到了巨大的作用。疫苗的發(fā)現(xiàn)可謂是人類發(fā)展史上一件具有里程碑意義的事件。因?yàn)閺哪撤N意義上來說人類繁衍生息的歷史就是人類不斷同疾病和自然災(zāi)害斗爭(zhēng)的歷史，控制傳染性疾病最主要的手段就是預(yù)防，而接種疫苗被認(rèn)為是最行之有效的措施。而事實(shí)證明也是如此，威脅人類幾百年的天花病毒在牛痘疫苗出現(xiàn)后便被徹底消滅了，迎來了人類用疫苗迎戰(zhàn)病毒的第一個(gè)勝利，也更加堅(jiān)信疫苗對(duì)控制和消滅傳染性疾病的作用。疫苗的生產(chǎn)主要是通過病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖得到的。病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物， 不能在任何無細(xì)胞的培養(yǎng)液內(nèi)生長(zhǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不成熟之前，人們?yōu)檠芯坎《?，往往采用雞胚接種或動(dòng)物接種的方法來分離，鑒定病毒或制備一定量的病毒液。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展首先在病毒學(xué)研究方面獲得了廣泛的應(yīng)用，為病毒的增值，鑒定提供了來自不同動(dòng)物，不同組織的細(xì)胞來源。通過不同病毒對(duì)不同細(xì)胞的敏感性篩選，目前絕大多數(shù)病毒均可由相應(yīng)的敏感細(xì)胞，為病毒的分離，鑒定和增值創(chuàng)造了條件，同時(shí)也為病毒的大量生產(chǎn)提供了細(xì)胞來源。目前疫苗的工業(yè)化生產(chǎn)主要是通過雞胚細(xì)胞培養(yǎng)的方法。培養(yǎng)方法包括靜置培養(yǎng)，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)。隨著動(dòng)物生物疫苗生產(chǎn)工藝的發(fā)展，傳統(tǒng)的用動(dòng)物和雞胚繁殖病毒的方法已經(jīng)遠(yuǎn)不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。常用的單層靜置培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)由于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，產(chǎn)量低，占用空間大，勞動(dòng)強(qiáng)度大，不能滿足日益增長(zhǎng)的對(duì)細(xì)胞產(chǎn)品的需求。近些年，貼壁細(xì)胞的載體培養(yǎng)技術(shù)是一種新興的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，是當(dāng)前貼壁依賴型細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法。通過對(duì)細(xì)胞沒有毒副作用的載體介質(zhì)，細(xì)胞貼附于載體表面或內(nèi)部，可以大大提高細(xì)胞培養(yǎng)面積和效率，比如微載體培養(yǎng)技術(shù)，具有均相培養(yǎng)兼具平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)條件(溫度、PH值、二氧化碳濃度等)容易控制，并且培養(yǎng)過程系統(tǒng)化、自動(dòng)化，不易被污染。隨著人們對(duì)疾病預(yù)防需求的加強(qiáng)，對(duì)疫苗質(zhì)量，產(chǎn)量的要求也隨之提高，同時(shí)企業(yè)要適應(yīng)市場(chǎng)需求，提高利潤等原因，促成新的大規(guī)模生產(chǎn)疫苗的方法在不斷完善，使用載體培養(yǎng)細(xì)胞的方法必將被廣泛應(yīng)用，而且也是今后規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)。但是，目前市面上的細(xì)胞載體(例如Cytodex系列微載體)大多價(jià)格昂貴， 不適于工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞制備病毒或生產(chǎn)疫苗。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，Rourou S，Majoul S, Trabelsi K，Kallel H.等人在《Appl Microbial Biotechnol》2009 ;85 (1) :53-63.上發(fā)表的"A novel animal-component-free medium for rabies virus production in VERO cells grown on Cytodex 1 microcarriers in a stirred bioreactor"(“一個(gè)用于 cytodexl 微載體 VERO細(xì)胞攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬病病毒的創(chuàng)新的無動(dòng)物成分培養(yǎng)基”，《應(yīng)用微生物生物技術(shù)》)中，報(bào)道了使用Cytodex 1微載體進(jìn)行狂犬病病毒的生產(chǎn)。目前常用的商品化微載體有Cytodex系列、Biosilon系列、Solo微載體等，這些微載體對(duì)用于細(xì)胞培養(yǎng)制備病毒或生產(chǎn)疫苗來說，價(jià)格往往過于昂貴，用于大規(guī)模生產(chǎn)成本大，不適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)，作為成型商品，這些細(xì)胞載體的形狀和大小已經(jīng)固定，不易加以改動(dòng)，影響了相應(yīng)工藝的設(shè)計(jì)、改進(jìn)和優(yōu)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有常見細(xì)胞載體的缺陷，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便高效廉價(jià)的病毒疫苗生產(chǎn)。發(fā)明人經(jīng)過研究開發(fā)，提供了利用一種價(jià)格低廉、易于切割加工的無紡布 (聚酯類纖維)作為細(xì)胞培養(yǎng)載體，在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)擴(kuò)增病毒敏感細(xì)胞，并接種增殖目標(biāo)病毒，實(shí)施工業(yè)化大規(guī)模病毒制備或疫苗生產(chǎn)。本發(fā)明使用的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)載體，是一種無紡布纖維。無紡布(英文名Νοη Woven)又稱不織布。是由定向的或隨機(jī)的纖維而構(gòu)成，它是一種不需要紡紗織布而形成的織物，只是將紡織短纖維或者長(zhǎng)絲進(jìn)行定向或隨機(jī)撐列，形成纖網(wǎng)結(jié)構(gòu)，然后采用機(jī)械、熱粘或化學(xué)等方法加固而成。因具有布的外觀和某些性能而稱其為布。無紡布是新一代環(huán)保材料，具有防潮、透氣、柔韌、質(zhì)輕、不助燃、容易分解、無毒無刺激性、色彩豐富、價(jià)格低廉、 可循環(huán)再用等特點(diǎn)。制作無紡布的纖維材料主要有聚丙烯或者聚酯纖維等。其中，聚酯纖維由有機(jī)二元酸和二元醇縮聚而成的聚酯經(jīng)紡絲所得的合成纖維。它是以精對(duì)苯二甲酸 (PTA)或?qū)Ρ蕉姿岫柞?DMT)和乙二醇(EG)為原料經(jīng)酯化或酯交換和縮聚反應(yīng)而制得的成纖高聚物一聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)，經(jīng)紡絲和后處理制成的纖維。本發(fā)明即是使用無紡布為材料制作成的各種形狀和大小的細(xì)胞載體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)制備病毒或生產(chǎn)疫苗的工藝和方法。本發(fā)明包括以下步驟1)將無紡布(聚酯類纖維)材料用物理或者化學(xué)方式進(jìn)行適當(dāng)處理(包括進(jìn)行各種表面處理)，以更利于細(xì)胞貼壁或生長(zhǎng)或改善材料強(qiáng)度；同時(shí)，剪切加工制作成不同形狀和大小的、具有一定強(qiáng)度的、用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)載體。2)在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(包括各種細(xì)胞培養(yǎng)瓶、袋、生物反應(yīng)器等)中，以上述無紡布 (聚酯類纖維)的加工品(包括切片、碎片、碎纖維、碎屑、顆粒等)作為載體，用合適的細(xì)胞增殖培養(yǎng)液(基)，培養(yǎng)用于制備病毒和生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞。3)在所屬步驟幻中細(xì)胞生長(zhǎng)到一定量或密度的時(shí)候，接種含有病毒毒種的維持培養(yǎng)液(基)，使病毒感染細(xì)胞并增殖。4)接毒一定時(shí)間后，收獲所屬步驟幻得到的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液；5)對(duì)收獲的病毒液根據(jù)所需制備疫苗類型進(jìn)行進(jìn)行病毒滅活或?qū)嵤┗钜呙缣幚怼?)濃縮，純化病毒液體。根據(jù)需要，采取裂解處理。\7)添加穩(wěn)定劑和免疫佐劑。8)疫苗的凍存和分包裝。9)疫苗的質(zhì)量檢查。本發(fā)明以無紡布為材料制作成細(xì)胞培養(yǎng)載體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)制備病毒或生產(chǎn)疫苗，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、擁有較高的細(xì)胞培養(yǎng)比表面積，從而可以增加細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)細(xì)胞總量。細(xì)胞量增加，病毒產(chǎn)量亦可提高。例如，應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)滾瓶?jī)?nèi)部，通過增大單個(gè)滾瓶的細(xì)胞培養(yǎng)面積，減少滾瓶數(shù)量，從而降低勞動(dòng)強(qiáng)度，并減小細(xì)胞感染機(jī)率。2、細(xì)胞所承受的剪切力較小，并可保證較高的營養(yǎng)利用率和氧傳遞率。例如在應(yīng)用于固定床技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞工藝中，細(xì)胞可以牢固貼附于無紡布材料表面和內(nèi)部，培養(yǎng)液可以通過在載體間流動(dòng)，提高營養(yǎng)成分的利用率；同時(shí)，細(xì)胞嵌于載體內(nèi)部纖維中，降低了外部剪切力對(duì)細(xì)胞的損傷，從而可以通過加大攪拌速率或流體流經(jīng)速率而提高氧傳遞效率。3、降低成本無紡布纖維用作載體，與傳統(tǒng)常見的商品化細(xì)胞載體相比，價(jià)格低廉，從而可以降低細(xì)胞培養(yǎng)成本，更適合于病毒疫苗的產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。4、價(jià)格低廉，可以一次性使用，減少了生產(chǎn)批次間的交叉污染。5、無紡布材料易于被切割成各種形狀和大小，比如圓形、三角形、四方形、菱形等等，大大增加了使用的范圍，提高了工藝優(yōu)化的空間。


圖1、為本發(fā)明細(xì)胞載體的一種形狀一圓片形；圖2、為本發(fā)明細(xì)胞載體的一種形狀一長(zhǎng)片形；圖3、為本發(fā)明細(xì)胞載體的一種形狀一折疊菱形；圖4、為本發(fā)明細(xì)胞載體的一種形狀一碎屑碎纖維形；
具體實(shí)施例方式具體實(shí)施例1本實(shí)施例子中采用連續(xù)灌注固定床培養(yǎng)的方法，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)擴(kuò)增VERO 細(xì)胞，然后接種、制備狂犬病毒，生產(chǎn)狂犬病毒疫苗。將無紡布制作成直徑為6mm的圓形小片體，作為細(xì)胞生長(zhǎng)載體。1、采用美國 BBA Fiberweb 的 Reemay 公司(Old Hickory, TN, USA)生產(chǎn)的無紡布聚酯類纖維(Non Woven Polyester Fabric), style no. 2214作為無紡布纖維材料，經(jīng)表面處理并切割成直徑為6mm的圓形小片體。2、從種子細(xì)胞庫中復(fù)蘇1支VERO細(xì)胞(由非洲綠猴腎細(xì)胞培育出的可傳代的廣譜宿主細(xì)胞，購買自中國藥品生物制品鑒定所)，48小時(shí)傳代，用方瓶擴(kuò)增。3、細(xì)胞生物反應(yīng)器選擇的是購買自美國NBS公司的5L生物反應(yīng)器Celligen Plus，工作體積3. 5L，采用固定床籃式攪拌系統(tǒng)。在生物反應(yīng)器中加入上述處理切割好的直徑為6mm的圓形聚酯切片作為細(xì)胞載體，并加入磷酸緩沖液，121攝氏度消毒30分鐘。消毒后，排空磷酸緩沖液，加入VERO細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并開始細(xì)胞生物反應(yīng)器條件控制。4、將方瓶擴(kuò)增好的VERO細(xì)胞，作為細(xì)胞生物反應(yīng)器的種子細(xì)胞，以2_5X 105/ml的密度接種到生物反應(yīng)器中的無紡布聚酯纖維圓形小片載體上，用細(xì)胞增殖培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。其中聚酯纖維圓形小片載體的使用量為每升罐體積35g，所使用的細(xì)胞增殖培養(yǎng)液為DMEM-F12培養(yǎng)基加10%新生牛血清。細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件為酸堿度(pH)值7. 2， 溫度37°C，溶氧濃度(DO)空氣飽和的50%，攪拌速度120rpm。5、在VERO細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度時(shí)，一般在接種后7_13天，換用細(xì)胞維持培養(yǎng)基， 以0. 005-0. 125M0I (用于感染的病毒數(shù)目與細(xì)胞數(shù)目的比值)感染復(fù)數(shù)接種狂犬病毒7aG 株，使細(xì)胞感染；細(xì)胞所用的細(xì)胞維持培養(yǎng)液使用DMEM-F12培養(yǎng)基加上的小牛血清配制而成；設(shè)定生物反應(yīng)器培養(yǎng)的條件為PH值7. 6，溫度36°C，溶氧濃度(DO)空氣飽和的 50%，攪拌速度為lOOrpm。連續(xù)灌注收獲20天，病毒滴度保持在81gLD50/ml以上。6、收獲的病毒液用1 4000β-丙內(nèi)酯滅活。7、以s印harose 4 fast flow為填料進(jìn)行層析純化，收集抗原峰。8、純化除菌后病毒原液加入人血白蛋白、蔗糖為保護(hù)劑制成液體制劑。9、病毒滴定，效力測(cè)定，蛋白含量測(cè)定，牛血清蛋白殘留量測(cè)定，殘余DNA測(cè)定按照《中國藥典》2005版相關(guān)要求進(jìn)行。具體實(shí)施例2本實(shí)施例子中采用懸浮培養(yǎng)的方法，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞制備病毒或生產(chǎn)疫苗。將無紡布制作成長(zhǎng)條狀，作為細(xì)胞生長(zhǎng)載體。1、無紡布材料采用國內(nèi)某公司生產(chǎn)的聚酯纖維無紡布，將材料經(jīng)過適當(dāng)剪切，成為形狀不規(guī)則的碎纖維片，作為細(xì)胞培養(yǎng)用載體。2、生物反應(yīng)器選擇的是荷蘭Applicon autoclavable bioreactor 15L反應(yīng)器，工作體積11L。將長(zhǎng)條狀無紡布纖維細(xì)胞載體用PBS沖洗，膨脹過夜，漂洗幾次后加入生物反應(yīng)器，高壓滅菌。加入無菌細(xì)胞生長(zhǎng)液，浸泡載體。3、從種子細(xì)胞庫中復(fù)蘇1支VERO細(xì)胞(由非洲綠猴腎細(xì)胞培育出的可傳代的廣譜宿主細(xì)胞，購買自中國藥品生物制品鑒定所)，48小時(shí)傳代，用方瓶擴(kuò)增。4、將方瓶擴(kuò)增擴(kuò)增好的VERO細(xì)胞，以3_6X 105/ml的密度接種到裝有長(zhǎng)條狀聚酯類纖維切片為載體的生物反應(yīng)器罐中，用細(xì)胞增殖培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，其中無紡布聚酯類纖維載體的使用量為每升罐體積45g，所使用的細(xì)胞增殖培養(yǎng)液使用DMEM-F12培養(yǎng)基加 10%新生牛血清。細(xì)胞增殖培養(yǎng)條件為Ph值7. 0-7. 2，溫度37°C，溶氧濃度(DO)空氣飽和的50%，攪拌速度15-35rpm。5、培養(yǎng)約4天，通過生物反應(yīng)器的細(xì)胞/載體截流裝置，抽棄細(xì)胞生長(zhǎng)液，換用細(xì)胞維持培養(yǎng)基，以0. 005-0. 125M0I (用于感染的病毒數(shù)目與細(xì)胞數(shù)目的比值)感染復(fù)數(shù)接種乙腦病毒株，繼續(xù)培養(yǎng)，接毒后3-5日收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液，收獲的毒液置于_70°C保存。6、將檢驗(yàn)合格的病毒培養(yǎng)液，混合于同一容器內(nèi)，加入穩(wěn)定劑，同時(shí)加入抗生素， 充分搖勻，定量分裝，分裝后迅速進(jìn)行冷凍真空干燥后即得成品。具體實(shí)施例3本實(shí)施例子中采用懸浮培養(yǎng)的方法，在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)棉鈴蟲卵巢細(xì)胞系 SFE-HA制備棉鈴蟲單粒包埋型核多角體(HaSNPV)病毒，以生產(chǎn)病毒農(nóng)藥。將無紡布制作成不規(guī)則碎纖維，作為細(xì)胞生長(zhǎng)載體。1)紡布材料采用國產(chǎn)的聚酯纖維無紡布，將材料經(jīng)過適當(dāng)裁剪，成為形狀不規(guī)則的纖維類碎片，作為細(xì)胞培養(yǎng)用載體。2)在15L生物反應(yīng)器中，將長(zhǎng)條狀無紡布纖維細(xì)胞載體用PBS沖洗，膨脹過夜，漂洗幾次后加入生物反應(yīng)器，高壓滅菌。加入無菌細(xì)胞生長(zhǎng)液，浸泡載體。3)將方瓶擴(kuò)增擴(kuò)增好的棉鈴蟲卵巢細(xì)胞，以2-4X 105/ml的密度接種到裝有不規(guī)則碎片狀聚酯類纖維切片為載體的生物反應(yīng)器罐中，用細(xì)胞增殖培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，其中無紡布聚酯類纖維載體的使用量為每升罐體積25g，所使用的細(xì)胞增殖培養(yǎng)液使用BML-TClO培養(yǎng)基添加20%小牛血清，100U/ml卡那霉素。細(xì)胞增殖培養(yǎng)條件為pH值 7. 0-7. 2，溫度37°C，溶氧濃度(DO)空氣飽和的50%，攪拌速度15_35rpm。4)棉鈴蟲單粒包埋型核型多角體病毒(HaSNPV)，先用人工飼養(yǎng)的棉鈴蟲4齡幼蟲進(jìn)行增殖，經(jīng)口感染后6天，收集病蟲血淋巴為感染細(xì)胞的初始毒源。隨后則用被感染細(xì)胞的培養(yǎng)上清液作為實(shí)驗(yàn)用感染源。5)在經(jīng)M小時(shí)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞中加入病毒液，感染復(fù)數(shù)約為7TCID5(1/細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)毒液，收獲的毒液置于-70°C保存。6)將收獲液分裝，保存。也就是說，本發(fā)明提供了一種無紡布(聚酯類纖維)載體培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的方法，包括以下步驟1)將無紡布(聚酯類纖維)材料用物理或者化學(xué)方式進(jìn)行適當(dāng)處理(包括進(jìn)行各種表面處理)，以更利于細(xì)胞貼壁或生長(zhǎng)或改善材料強(qiáng)度；同時(shí)，剪切加工制作成不同形狀和大小的、具有一定強(qiáng)度的、用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)載體。2)在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(包括各種細(xì)胞培養(yǎng)瓶、袋、生物反應(yīng)器等)中，以上述無紡布 (聚酯)的加工品(包括切片、碎片、碎纖維、碎屑、顆粒等)作為載體，用合適的細(xì)胞增殖培養(yǎng)液(基)，培養(yǎng)用于制備病毒和生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞。3)在所屬步驟幻中細(xì)胞生長(zhǎng)到一定量或密度的時(shí)候，接種含有病毒毒種的維持培養(yǎng)液(基)，使病毒感染細(xì)胞并增殖。4)接毒一定時(shí)間后，收獲所屬步驟幻得到的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液；5)對(duì)收獲的病毒液進(jìn)行病毒滅活或?qū)嵤┗钜呙缣幚?；如需要，并進(jìn)行濃縮。6)濃縮，純化病毒液體。根據(jù)需要，采取裂解處理。7)添加穩(wěn)定劑和免疫佐劑。8)疫苗的凍存和分包裝。9)疫苗的質(zhì)量檢查。細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)包括常見的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，比如攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、細(xì)胞懸浮或貼壁式生長(zhǎng)生物反應(yīng)器、間歇式或流加式或連續(xù)灌注式生物反應(yīng)器、wave生物反應(yīng)器等，以及其他各種形式和基于各種原理的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或裝置，包括各種細(xì)胞培養(yǎng)瓶、袋系統(tǒng)、一次性塑料袋系統(tǒng)等。細(xì)胞培養(yǎng)方式包括常見的貼壁固定床式細(xì)胞培養(yǎng)、載體懸浮式細(xì)胞培養(yǎng)等，以及該些培養(yǎng)方式的各種衍變形式。所述病毒可以是下列中之一個(gè)或多個(gè)禽、獸類病毒狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus) > ^: ^ (Canine Distemper Virus)、Λ _/]、__ _ (Canine parvovirus virus) (Infectious canine hepatitis(Mink Parvovirus Enteritis Virus)、禽流感病毒(Avian influenza virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、豬繁殖禾口呼吸系統(tǒng)綜合癥病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)、豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus)、豬細(xì)小病毒 (Swine Parvovirus)、豬流行性腹灣病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)、豬傳染個(gè)生胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of pigs)、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、豬流行性感冒病毒(Swine influenza virus) ,Parapoxvirus ovis病毒；上述各病毒應(yīng)包含其各所屬所有亞型毒株和各種致弱型毒株。所述病毒可以是下列中之一個(gè)或多個(gè)人類病毒人用狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus) > ) ^^! (Measles virus)、月g _ _ (Mumps virus)、M # _ _ (Rubella virus)、/K痘病毒(varicella virus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio virus)、流感病毒(influenza virus)、乙月干病毒(Hepatitis B virus)、流腦病毒(meningitis virus)、 艾滋病病毒(HIV)、口服輪狀病毒(oral rotavirus)、染性肝炎病毒Gnfectious canine hepatitis virus)、禽流感病毒(Avian influenza virus)；上述各病毒應(yīng)包含其各所屬所有亞型毒株和各種致弱型毒株。所述疫苗可以是下列中之一個(gè)禽、獸用疫苗包括單價(jià)和多價(jià)疫苗，或具下列中之多個(gè)禽、獸用疫苗之效能的多聯(lián)疫苗，基因工程亞單位疫苗，基因重組疫苗等常見疫苗類型中的一種或多種狂犬病疫苗(Rabies vaccine)、犬瘟熱疫苗(Canine Distemper Vaccine)、；^ _/]、___ ^ (Canine parvovirus vaccine) > ^ # ^ HT iit ^ Iej (Infectious canine hepatitis vaccine、水|§腸炎疫苗(Mink Parvovirus Enteritis vaccine)、禽流感疫苗(Avian influenza vaccine)、新城疫疫苗(Newcastle disease virus)、豬繁殖和呼吸系統(tǒng)綜合癥疫苗(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome vaccine)、豬癌疫苗(Classical Swine Fever vaccine)、豬細(xì)小病毒疫苗(swine Parvovirus vaccine)、豬^f f生月復(fù) 寫疫苗(Porcine epidemic diarrhea vaccine)、豬傳染 f生胃腸炎疫苗(Transmissible gastroenteritis vaccine for pigs)、 豬圓環(huán)疫苗(Porcine circovirus vaccine)、豬偽犬病疫苗(Pseudorabies vaccine)、 豬流行性感冒疫苗(Swine influenza vaccine)；上述各疫苗可以是活疫苗(Live virus vaccine) Κ滅 舌苗(Inactivated or killed virus vaccine)。所述疫苗可以是下列中之一個(gè)人用疫苗包括單價(jià)和多價(jià)疫苗，或具下列中之多個(gè)人用疫苗之效能的多聯(lián)疫苗，基因工程亞單位疫苗，基因重組疫苗等常見疫苗類型中的一種或多種人用狂犬病疫苗(Rabies Vaccine for human use)、麻疹疫苗 (Measles vaccine)、腿腺炎疫苗(Mumps vaccine)、風(fēng)疫疫苗(Rubella vaccine)、7_K痘疫苗(varicella vaccine)、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(polio vaccine)、流感疫苗(influenza vaccine)、乙月干疫苗(Hepatitis B vaccine)、流腦疫苗(meningitis vaccine)、艾滋病疫苗(HIV vaccine)、口服輪狀疫苗(oral rotal vaccine)、染性肝炎疫苗 Qnfectious canine hepatitis vaccine)、 ^ 胃^ (Avian influenza vaccine) ；^1 ^ bJ 是 舌疫苗(Live virus vaccine)或滅 舌疫苗(Inactivated or killed virus vaccine) 所述病毒可以是下列之一的昆蟲病毒，以生產(chǎn)相關(guān)類型的病毒殺蟲劑生物農(nóng)藥 核型多角體病毒(NPV)，如家蠶NPV、棉鈴蟲NPV、松毛蟲NPV、春尺蠖NPV、舞毒蛾NPV、斜紋夜蛾NPV、粘蟲NPV、中國刺蛾NPV ；顆粒體病毒(GV)，如黃地老虎GV、菜粉蝶GV、茶小卷葉蛾GV;細(xì)胞質(zhì)多角體病毒(CPV)、虹彩病毒等等。所述細(xì)胞可以是下列中之一個(gè)或多個(gè)組合BHK21細(xì)胞(幼金倉鼠腎細(xì)胞/Baby hamster kidney cell)、Marcl45 細(xì)胞(克隆恒河猴腎細(xì)胞/Maacague kidney cell) ,VERO 細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞/Kidney cells of Afrcan Green Monkey)、F81細(xì)胞(貓腎細(xì)胞/ Kidney cells of Cat,Felis catus)、豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15或IBRS-2)或其它敏感豬源細(xì)胞系、ST細(xì)胞(胎豬睪丸細(xì)胞/Testis cells of Swine)、牛睪丸細(xì)胞(Testis cells of fetus bovine)、牛羊犬等的腎細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、按蠶蛾(anteraea eucalypti)卵巢細(xì)胞、白紋伊岐(Aedes albopictus Skuse)細(xì)胞Aa2_678、小菜蛾(Plutell xylostella L innaeus)細(xì)胞 BCIRL-Px2_HNU3、草地貪葉蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢細(xì)胞 Sf21 及其克隆株Sf9和粉紋夜蛾(Trichop lusiani)胚胎細(xì)胞系BTI_Tn5-BI-4等昆蟲細(xì)胞，以及其他種類的適合感染病毒和制備病毒的細(xì)胞；上述各種細(xì)胞應(yīng)包含其各所屬所有亞型細(xì)胞株及其各種馴化、基因工程改造型細(xì)胞株。上述所述細(xì)胞培養(yǎng)包括動(dòng)物組織培養(yǎng)。還有，本發(fā)明提供一種可用于培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的無紡布(聚酯類纖維)細(xì)胞載體，包括制作該載體的無紡布(聚酯類纖維)纖維類材料包括聚丙烯類、聚酯類、粘膠類、丙烯酸纖維類、聚酰胺類以及其他纖維，即包括聚酯纖維(聚酯類纖維)無紡布、聚丙烯纖維無紡布、粘膠類無紡布、聚酰胺類無紡布等等。聚酯類纖維包括無紡布聚酯纖維、聚酯纖維無紡布、普通聚酯纖維，以及一切以聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)為材料做成的聚酯纖維；該載體的制作過程包括將無紡布(聚酯類纖維)材料用物理或者化學(xué)方式進(jìn)行適當(dāng)處理(包括進(jìn)行各種表面處理)，以更利于細(xì)胞貼壁或生長(zhǎng)或改善材料強(qiáng)度；該載體可以是按照不同應(yīng)用情況而將無紡布(聚酯類纖維)通過剪切、加工等手段制作而成的、 具不同形狀和不同大小的、具一定強(qiáng)度的、可用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)載體。所述的聚酯纖維類無紡布又可稱為無紡布聚酯纖維或者聚酯非織造纖維，英文名稱是non woven polyester fabric，主要化學(xué)成分是聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(pet)。所述載體由無紡布(聚酯類纖維)材料制作切割的方式和切割成的形狀可隨具體應(yīng)用而任意變化；可以但不局限于制作成包括圓形、方形、三角形、碎屑、碎纖維等各種可以設(shè)想和制作出來的形狀和任意大小。所述載體可以但不局限于是球狀、棒狀、條狀、片狀在內(nèi)的任何規(guī)則和不規(guī)則載體。以上公開的僅為本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，但本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化，都應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種聚酯類纖維載體培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將聚酯類纖維材料用物理或者化學(xué)方式進(jìn)行包括表面處理在內(nèi)的處理，以更利于細(xì)胞貼壁或生長(zhǎng)或改善材料強(qiáng)度；同時(shí)，剪切加工制作成不同形狀和大小的、具有一定強(qiáng)度的、用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)載；2)在包括各種細(xì)胞培養(yǎng)容器和生物反應(yīng)器在內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，以所述聚酯類纖維材料的加工品作為載體，用合適的細(xì)胞增殖培養(yǎng)液/基，培養(yǎng)用于制備病毒和生產(chǎn)疫苗的細(xì)胞；3)在所屬步驟幻中細(xì)胞生長(zhǎng)到預(yù)先設(shè)定的量或密度的時(shí)候，接種含有病毒毒種的維持培養(yǎng)液/基，使病毒感染細(xì)胞并增殖；4)接毒到預(yù)先設(shè)定的時(shí)間后，收獲所屬步驟幻得到的細(xì)胞培養(yǎng)病毒液；5)對(duì)收獲的病毒液進(jìn)行病毒滅活或?qū)嵤┗钜呙缣幚?；如需要，并進(jìn)行濃縮；6)純化病毒液體；7)添加穩(wěn)定劑和免疫佐劑；)疫苗的凍存和分包裝。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括裂解處理操作。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括細(xì)胞培養(yǎng)方式包括貼壁固定床式細(xì)胞培養(yǎng)、載體懸浮式細(xì)胞培養(yǎng)，以及該些培養(yǎng)方式的各種衍變形式。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述病毒可以是下列中之一個(gè)或多個(gè)禽、獸類病毒狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus)、犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus)、Λ_/]、___ (Canine parvovirus virus)、個(gè)生月(Infectious canine hepatitis virus、(Mink Parvovirus Enteritis Virus) 感病毒(Avian influenza virus)、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、豬繁殖禾口呼吸系統(tǒng)綜合癥病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)、豬(Classical Swine Fever Virus)、■_/]、__ (Swine Parvovirus) Λ ^Mt^if ft 腹灣病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of pigs)、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus)、豬流行性感冒病毒(Swine influenza virus)、Parapoxvirus OVis病毒；上述各病毒應(yīng)包含其各所屬所有亞型毒株和各種致弱型毒株。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述病毒可以是下列中之一個(gè)或多個(gè)人類病毒人用狂犬病病毒(Rabies Vaccine Virus)、麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎 ^ (Mumps virus)(Rubella virus)(varicella virus)炎病毒(polio virus)、流感病毒(influenza virus)、乙月干病毒(Hepatitis B virus)、流腦病毒(meningitis virus)、艾滋病病毒(HIV)、口服輪狀病毒(oral rotavirus)、染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus)、禽感病毒(Avian influenza virus)； 上述各病毒應(yīng)包含其各所屬所有亞型毒株和各種致弱型毒株。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述疫苗可以是下列中之一個(gè)禽、 獸用疫苗包括單價(jià)和多價(jià)疫苗，或具下列中之多個(gè)禽、獸用疫苗之效能的多聯(lián)疫苗，基因工程亞單位疫苗，基因重組疫苗等常見疫苗類型中的一種或多種狂犬病疫苗(Rabiesvaccine) > ^ 1 |ej (Canine Distemper Vaccine)、；^ _/]、___ (Canine parvovirus vaccine)、i 7I專染 f生月干炎苗(Infectious canine hepatitis vaccine、 7-KlnJSi^ialEi (Mink Parvovirus Enteritis vaccine) >(Avian influenza vaccine)、新城疫疫苗(Newcastle disease virus)、豬繁殖和呼吸系統(tǒng)綜合癥疫苗 (Porcine Reproductive and Res piratory Syndrome vaccine)、豬癌疫苗(Classical Swine Fever vaccine)、豬細(xì)小病毒疫苗(Swine Parvovirus vaccine)、豬流行性腹 寫疫苗(Porcine epidemic diarrhea vaccine)、豬傳染 f生胃腸炎疫苗(Transmissible gastroenteritis vaccine for pigs)、豬圓環(huán)疫苗(Porcine circovirus vaccine)、豬偽狂犬病疫苗(Pseudorabies vaccine)、豬流行性感冒疫苗(Swine influenza vaccine)； 上述各疫苗可以是 舌疫苗(Live virus vaccine)或滅 舌疫苗(Inactivated or killed virus vaccine)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述疫苗可以是下列中之一個(gè)人用疫苗包括單價(jià)和多價(jià)疫苗，或具下列中之多個(gè)人用疫苗之效能的多聯(lián)疫苗，基因工程亞單位疫苗，基因重組疫苗等常見疫苗類型中的一種或多種人用狂犬病疫苗(Rabies Vaccine for human use)、麻疫疫苗(Measles vaccine)、腿腺炎疫苗(Mumps vaccine)、風(fēng)疫疫苗 (Rubella vaccine)、7_K 痘疫苗(varicella vaccine)、脊髓灰質(zhì)炎疫苗(polio vaccine)、 流感疫苗(influenza vaccine)、乙肝疫苗(Hepatitis B vaccine)、流腦疫苗(meningitis vaccine)、艾滋病疫苗(HIV vaccine)、口服輪狀疫苗(oral rotal vaccine)、染性肝炎疫 It (Infectious canine hepatitis vaccine)、 ^ 胃^5 (Avian influenza vaccine)； 上述各疫苗可以是 舌疫苗(Live virus vaccine)或滅 舌疫苗(Inactivated or killed virus vaccine)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述病毒可以是下列之一的昆蟲病毒，以生產(chǎn)相關(guān)類型的病毒殺蟲劑生物農(nóng)藥核型多角體病毒(NPV)，如家蠶NPV、棉鈴蟲 NPV、松毛蟲NPV、春尺蠖NPV、舞毒蛾NPV、斜紋夜蛾NPV、粘蟲NPV、中國刺蛾NPV ；顆粒體病毒(GV)，如黃地老虎GV、菜粉蝶GV、茶小卷葉蛾GV ；細(xì)胞質(zhì)多角體病毒(CPV)、虹彩病毒。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述細(xì)胞可以是下列中之一個(gè)或多個(gè)組合BHK21細(xì)胞(幼金倉鼠腎細(xì)胞/Baby hamster kidney cell)、Marcl45細(xì)胞(克隆恒河猴腎細(xì)胞/Maacague kidney cell)、VER0細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞/Kidney cells of Afrcan Green Monkey)、F81 細(xì)胞(貓腎細(xì)胞/Kidney cells of Cat, Felis catus)、豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15或IBRS-2)或其它敏感豬源細(xì)胞系、ST細(xì)胞(胎豬睪丸細(xì)胞/Testis cells of Swine)、牛睪丸細(xì)胞(Testis cells of fetus bovine)、牛羊犬等的腎細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞、按蠶蛾(anteraea eucalypti)卵巢細(xì)胞、白紋伊蚊(Aedes albopictus Skuse)細(xì)胞 Aa2-678、小菜蛾(Plutell xylostella L innaeus)細(xì)胞 BCIRL-Px2_HNU3、草地貪葉蛾 (Spodoptera frugiperda)卵巢細(xì)胞 Sf21 及其克隆株 Sf9 和粉紋夜蛾(Trichop lusiani) 胚胎細(xì)胞系BTI-Tn5-BI-4等昆蟲細(xì)胞，以及其他種類的適合感染病毒和制備病毒的細(xì)胞； 上述各種細(xì)胞應(yīng)包含其各所屬所有亞型細(xì)胞株及其各種馴化、基因工程改造型細(xì)胞株。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括所述細(xì)胞培養(yǎng)包括動(dòng)物組織培養(yǎng)。
11.一種可用于培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的聚酯類纖維細(xì)胞載體，其特征在于， 包括制作該載體的無紡布纖維類材料包括聚丙烯類、聚酯類、粘膠類、丙烯酸纖維類、聚酰胺類以及其他纖維，聚酯類纖維包括無紡布聚酯纖維、聚酯纖維無紡布、普通聚酯纖維，以及一切以聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯為材料做成的聚酯纖維；該載體包括將無紡布材料用物理或者化學(xué)方式進(jìn)行處理，以更利于細(xì)胞貼壁或生長(zhǎng)或改善材料強(qiáng)度；該載體是將無紡布通過剪切、加工等手段制作而成的、具不同形狀和不同大小的、具一定強(qiáng)度的、可用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)載體。
12.如權(quán)利要求11所述的載體，其特征在于，包括所述載體由無紡布(聚酯類纖維) 材料制作切割的方式和切割成的形狀可隨具體應(yīng)用而任意變化；可以但不局限于制作成包括圓形、方形、三角形、碎屑、碎纖維等各種可以設(shè)想和制作出來的形狀和任意大小。所述載體可以但不局限于是球狀、棒狀、條狀、片狀在內(nèi)的任何規(guī)則和不規(guī)則載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚酯類纖維載體培養(yǎng)細(xì)胞以制備病毒或生產(chǎn)疫苗的方法。具體包括1)聚酯類纖維細(xì)胞培養(yǎng)載體及其加工制作方法；2)在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，用處理好的聚酯類纖維細(xì)胞培養(yǎng)載體，在細(xì)胞增殖培養(yǎng)液中培養(yǎng)增殖細(xì)胞；3)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度或數(shù)量后，換用細(xì)胞維持培養(yǎng)液，接種病毒感染細(xì)胞；4)擴(kuò)增病毒；5)收獲病毒液；6)根據(jù)需要的制備類型，滅活或?qū)嵤┗钜呙缣幚恚?)病毒液濃縮、純化和裂解；8)添加穩(wěn)定劑和免疫佐劑；9)疫苗包裝。本發(fā)明使用了一種價(jià)格低廉且適合細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的材料，制作細(xì)胞培養(yǎng)載體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，制備病毒或生產(chǎn)疫苗，大大降低了細(xì)胞載體成本。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102406926SQ20101029239
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者馮見, 李敏, 高迪晶, 齊念民 申請(qǐng)人:上海泰因生物技術(shù)有限公司