專利名稱：副溶血弧菌二價(jià)dna疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的疫苗及其制備技術(shù)，涉及基因工程及免疫學(xué)。具體地 說(shuō)是副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革蘭氏陰性菌，廣泛分布于近岸海水 環(huán)境，能感染海水魚類、對(duì)蝦、甲殼類等多種水產(chǎn)動(dòng)物，是世界許多國(guó)家和地區(qū)養(yǎng)殖對(duì)蝦和 魚類的主要致病菌，每年都給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。該菌也是夏、秋季沿海地區(qū)海 產(chǎn)品食物中毒和急性腹瀉的主要病原菌。副溶血性弧菌的主要致病因子是溶血素、絲氨酸 蛋白酶等。目前已制備的副溶血弧菌疫苗，主要有全菌滅活疫苗和重組蛋白疫苗。滅活疫苗 的優(yōu)點(diǎn)是安全，但其缺點(diǎn)是免疫效果較差。重組蛋白疫苗由于制備過(guò)程中涉及蛋白質(zhì)提取 純化等步驟而造價(jià)昂貴。研究表明，DNA疫苗是一種在重組蛋白疫苗后興起的新型疫苗，其原理是將疫苗抗 原基因克隆于一真核表達(dá)載體中，隨后將該重組載體導(dǎo)入所要免疫的動(dòng)物體內(nèi)。疫苗抗原 蛋白在動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)可以持續(xù)表達(dá)合成，從而刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，達(dá)到免疫保護(hù)目的。因 此，DNA疫苗具有滅活疫苗和重組蛋白疫苗兩者的優(yōu)點(diǎn)而無(wú)其缺點(diǎn)。但是，DNA疫苗免疫保 護(hù)率仍然較低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗的制備方法及應(yīng)用，以克服現(xiàn) 有技術(shù)的不足。二價(jià)DNA疫苗技術(shù)上是來(lái)源于普通DNA疫苗，其原理是將針對(duì)細(xì)菌兩個(gè)重 要致病因子的功能區(qū)域蛋白基因克隆于同一真核表達(dá)載體中，從而實(shí)現(xiàn)針對(duì)同一細(xì)菌的兩 種不同抗原蛋白的表達(dá)。將這種二價(jià)DNA疫苗導(dǎo)入所要免疫的動(dòng)物體內(nèi)，就產(chǎn)生針對(duì)同一 細(xì)菌的兩種不同抗體，其免疫效果優(yōu)于普通DNA疫苗及兩種DNA疫苗的聯(lián)合免疫，且更加安 全、方便、有效。本發(fā)明即是采用這種技術(shù)，將副溶血弧菌的兩個(gè)主要致病因子的基因融合 構(gòu)建于真核表達(dá)載體中，制備成二價(jià)DNA疫苗，從而達(dá)到雙重抵抗副溶血弧菌對(duì)水產(chǎn)魚類 侵染的目的。一種副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗，其特征在于所述疫苗為副溶血弧菌溶血素亞單 位基因tdh2和絲氨酸蛋白酶基因vps通過(guò)6個(gè)核苷酸GAATTC相連而成的tdh2-vps融合 基因蛋白原核或真核表達(dá)工程載體疫苗，其中tdh2-vps融合基因的DNA序列為ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTT GCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTT AATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGA TGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATA AAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGA TGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCA ACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGCCTATTTGCCGCTATG TTGGCTGTGGGCCTTGCACCTGCCGTCTCGGCGTTTGATCCGCTCTATTCAGAACAATGGCATCTCGACAACACTGG TCAAATTGCATTCGCAGCAAACCCTGCTGTTGCAGGTAATGACTTAAACACCAAACTTACGCAAGCCATGGGCATTG CCGGTATTGGCGTTAAAGTTGCGGTCATTGATTCTGGTGTGCAGATCGATCACCCAGACCTTGCAGGTAACGTAGTC ACAGGTAGCAGAAACTTCGTTGAAGACTCTTTATTCCCATCCAGTTATCCCGTCGACACTAACGGCCACGGTACTGC CGTTGCTGGTTTGATTAGTGCGGTAGGTAACAATGGTGAAGGTGGTCGCGGCGTTGCTTCTCGCTCTTCGCTTGTTG GTTTTAACTGGCTTGCAAACCAAACATTAGAAGTTGGTTAATTTCTCACGGTATGGACCCAGCGACGCGAGATGTAC GCGTATTTAACCAAAGTTATGGCTTTAGTCCGATCAACCCAATCGCGTTTGATGAGAATGACCCACAGTTCAAGCTT GAAATGGATGTCATGCAGAACGTCAGCGAAACGAACGCTTGGGGCCGCGGTGCACTGTTTGTCAAGTCTGCGGGGAA TGGTTACCGCTATTTCAACACCGGACGATTCTTCGTTCTTCCTAGCGATTTCTTCGCGGGAGGAGGAAACCAAGGTT TACCGATGCACAACTCGGCGAATCTTACGACAACTCTAGCTACTTCAACCTTGTCACCAGCGCGCTACGCGCAGATG GCACCCGAGCAAGTTACTCTTCTGTTGGCGCTAACGTGTGGGTTGCCGCGCCAGCAGGGGAATACGGGCAAGACTTC CCTGCGATGGTCACAACTGACCTGATGGGATGTGAAGAAGGACAAAACACCAGTGACGGCCTTGGTATTAATGGTCT ACACGGTGGTACAGAGCTTGACCCGAACTGTAATTACACCAGCACCATGAACGGCACATCATCGGCTGCGCCGAACA CTTCTGGTGCAATCGCCGCTATCATGTCAACTAACCACGCTTTATCTGCCCGTGATATTCGTGCGTTGCTGGCAGAA ACCGCACGCGTTACCGATGCCGAGCATCCGGGTGTTCAACTTGAATTTACCAATAATAAAGGTGAGTTGGTGAGCTA CGAAGCGATCTCACCTTGGCAGAAAAACGCGGCTGGCGTGAACTTCCATACCTTCTATGGTTTTGGTGCCGTTGATT TGGATGAAGCGATGAAACGCGCTCGCATGACAAATAATGTTCTGCCAGCGCAAATCATCACACCGTGGGCAAACAAT GCAACAGAAGTCAGTGTGCCCGATGCAAGCCTTGCTGGTGGTTCGTCAAACATCGCAATTACTGACGACATTACCGT TGAGTCTGTACAGGTGAAGTTGACGCTAGAGCACTCGCGTCTACCTGATTTGGCAATCGAGCTTGTTTCTCCATCAG GCACTCGCTCCGTATTGCAAACACCACGTAACGGCCTTGTTGGTCAGTCTCTTGATCCAAACATTACGGGTTACGAA AACCAACTGATGTTGTCTAACCAATTCTACGGCGAGAATGCCAAGGGTGAATGGACACTGAGAGCTATCGATACAAA CGGTGATGAAGTCTTCTCGTTTATCGCTTACTTCAACTCATCCGCTATCTATGATGTACCGATGGCGAACAACGCAA AACCAGGAGTTATCAAAAACTGGTCTATGCGTATCTTTGGCCACTAA。本發(fā)明的副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗的制備方法或具體步驟如下首先制備副溶血 弧菌的兩個(gè)致病因子的溶血素亞單位基因tdh2和絲氨酸蛋白酶基因vps ；然后利用DNA內(nèi) 切酶雙酶切技術(shù)使目的基因獲得粘性末端，再用DNA連接酶將基因tdh2和基因vps通過(guò)6 個(gè)核苷酸GAATTC相連，并克隆到原核表達(dá)載體pET28a中構(gòu)建得到tdh2-vps融合基因蛋白 原核表達(dá)工程載體；同樣再通過(guò)內(nèi)切酶雙酶切技術(shù)，將tdh2-vps融合基因插入到真核載體 中構(gòu)建得到tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體度苗；最后用常規(guī)的方法擴(kuò)增培養(yǎng) 并收獲上述tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體載體，即制成副溶血弧菌二價(jià)DNA疫 苗懸液。一、制備上述基因tdh2和基因vps的方法1.以副溶血弧菌DNA為模板，用引物a進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有BamHI和EcoRI酶 切位點(diǎn)的基因tdh2 ；引物a為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下5' CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3'
5' CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3'2.以副溶血弧菌DNA為模板，用引物b進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有EcoRI和XhoI酶 切位點(diǎn)的基因vps ；引物b為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下5’ CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’5’ CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3’ ；二、構(gòu)建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表達(dá)工程載體的步驟1.用基因重組方法，在載體pET28a的酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI之間插入基因 tdh2,構(gòu)建成載體 pET28a-tdh2 ；2.用基因重組方法，將基因vps克隆到載體pMD19-T Simple中，構(gòu)建成載體 pMD19_T Simple-vps ；3.分別將載體 pET28a_tdh2 和載體 pMD19_T Simple-vps 用 EcoRI 和 XhoI 進(jìn)行雙 酶切，得到線性載體pET28a-tdh2和基因vps ；將基因vps與線性載體pET28a-tdh2進(jìn)行重 組連接，構(gòu)建成tdh2-vps融合基因蛋白原核表達(dá)工程載體pET28a-tdh2-VpS。將上述工程載體pET28a-tdh2-VpS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL2 1中，培養(yǎng)并進(jìn)行誘導(dǎo)表 達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，tdh2-vps融合基因蛋白得到表達(dá)。三、構(gòu)建tdh2-vps融合基因蛋白的真核表達(dá)工程載體的步驟將上述(2)構(gòu)建的工程載體pET28a-tdh2-VpS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，培養(yǎng)并 回收載體，用引物c進(jìn)行PCR，得到含有XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)的融合基因tdh2-vps ；引物 c為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3’ ；1.將融合基因tdh2_vps再次克隆到pMD19-T Simple上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α 中，擴(kuò)增培養(yǎng)后提取載體，用XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切，得到融合基因tdh2-vps，2.將真核載體pEGFP-Nl用XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切，得到線性真核載體 pEGFP-Nl ；3.將融合基因tdh2-vps插入到線性真核載體pEGFP-Nl酶切位點(diǎn)XhoI和BamHI 之間，構(gòu)建成tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體pEGFP-Nl-tdh2-vps，將tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞) 中，培養(yǎng)并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，tdh2-vps融合基因蛋白得到表達(dá)；四、制備副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗1.將上述所得的tdh2-vps融合基因真核表達(dá)工程載體轉(zhuǎn)化到CHO細(xì)胞或大腸桿 菌DH5ci中，進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增培養(yǎng)，然后將含有tdh2-vps融合基因蛋白的真核表達(dá)工程載體 提取出來(lái)，溶于0. 05 0. 20mol/L磷酸鹽緩沖液PBS中至濃度為200ug/ml，即得到副溶血 弧菌二價(jià)DNA疫苗懸液，該步驟所用器皿、材料及試劑均須無(wú)菌無(wú)熱原處理；2.按常規(guī)免疫方法，以IOOul/尾的劑量對(duì)魚類進(jìn)行免疫。本發(fā)明的副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗應(yīng)用于魚類，即副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗懸液 以50 200ul/尾的劑量應(yīng)用于魚類免疫。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)在二價(jià)DNA疫苗制備過(guò)程中所使用的方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)可操作性強(qiáng)重復(fù)率高；并且制備過(guò)程中將融合基因先連接到原核表達(dá)載體中，有利于檢驗(yàn)融合 基因蛋白的表達(dá)情況，可以提高融合基因蛋白真核表達(dá)的效率；本二價(jià)DNA疫苗雙基因融 合蛋白表達(dá)，雙重免疫保護(hù)；應(yīng)用于魚類的免疫效果較滅活疫苗、重組蛋白疫苗及一價(jià)DNA 疫苗高；免疫保護(hù)率高于其他類型的疫苗；使用安全無(wú)毒副作用；省時(shí)省力，只需一次免疫 即可獲得有效保護(hù)。
圖1 :tdh2-vps融合基因蛋白原核及真核表達(dá)載體基因PCR結(jié)果電泳圖。其中Ml :DL2000DNA Marker ；M2 :DL15000DNA Marker ；1:陰性對(duì)照；2 用引物a進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，即基因tdh2 ；3 用引物b進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，即基因vps ；4和5 用引物c進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果，即融合基因tdh2-vps。圖2 :tdh2-vps融合基因蛋白原核表達(dá)蛋白電泳圖。其中，M 蛋白 Marker ；1 基因tdh2單獨(dú)表達(dá)的結(jié)果；2 基因vps單獨(dú)表達(dá)的結(jié)果；3 :tdh2-vps融合基因的表達(dá)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在舉例描述，而非以任何 形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法進(jìn)行，如 J.Sambrook et al :Molecular Cloning :ALaboratory manual(NewYork :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。所用載體 與試劑皆可從相關(guān)廠商購(gòu)得。實(shí)施例1 構(gòu)建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表達(dá)設(shè)苗載體pET28a-tdh2-VpS 一、提取基因組DNA:1、取副溶血弧菌FYZ8621.4的單菌落，接入5ml 2216E液體培養(yǎng)基，28°C振蕩培養(yǎng) 24小時(shí)；3、將振蕩培養(yǎng)好的菌液，以12000rpm離心2min收集菌體；3、用酚-氯仿抽提法，提取得到副溶血弧菌的基因組DNA。二、PCR反應(yīng)獲得基因tdh2和基因vps的方法1.制備基因 tdh2 (1)根據(jù)GeneBank中所收錄的副溶血弧菌的熱穩(wěn)定溶血素亞單位基因tdh2的序 列，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增基因tdh2的引物a，其序列為5' CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3'5' CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3'(2)以上述提取的副溶血弧菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到570bp的PCR產(chǎn)物反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性1分鐘，58°C退火1分鐘，72°C延伸1分 鐘；如此反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)體系為:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0. 5μ 1的引物a，然后用滅菌去離子水補(bǔ)足到50 μ 1。。(3) PCR產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有570bp目的片段的凝膠切下， 回收純化后得到含有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)的基因tdh2。2.制備基因vps (1)根據(jù)GeneBank中所收錄的的副溶血弧菌的假定絲氨酸蛋白酶基因vps的序 列，設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增基因vps的引物b，其序列為5’ CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’5’ CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3’ ；(2)以上述提取的副溶血弧菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到1779bp的 PCR產(chǎn)物。反應(yīng)條件為94 V預(yù)變性5分鐘；94 V變性1分鐘，61°C退火1分鐘，72 °C延伸2分 鐘；如此反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸10分鐘。反應(yīng)體系為:5μ1 的 Buffer，3 μ 1 的 MgCl2,0. 5 μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶，2 μ 1 的模板DNA，各0.5μ 1的引物b，然后用滅菌去離子水補(bǔ)足到50 μ 1。(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有1779bp目的片段的凝膠切 下，回收純化后得到含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)的基因vps。三、克隆基因tdh2和基因vps 1.克隆基因 tdh2:(1)取4. 5 μ 1純化的基因tdh2，加入0. 5 μ 1的載體pMD19_T Simple,混合，再加 入5 μ IDNA連接酶，于16°C連接反應(yīng)16小時(shí)，得到基因tdh2連接產(chǎn)物；(2)將基因tdh2連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌DH5ci中，并于含有氨芐青霉 素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12小時(shí)；(3)培養(yǎng)后利用常規(guī)的藍(lán)白斑篩選方法，挑選白斑接入含氨芐青霉素的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，提取基因tdh2載體DNA ；(4)以提取的基因tdh2載體DNA為模板，以引物a進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)，并且 用BamHI和EcoRI對(duì)基因tdh2載體進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，篩選出含有重組載體pMD 19-T Simple-tdh2的陽(yáng)性菌株。2.克隆基因vps (1)取4. 5μ 1純化的基因vps，加入0. 5μ 1的載體pMD19_T Simple，混合，再加入 5μ 1 DNA連接酶，于16°C連接反應(yīng)16小時(shí)，得到基因vps連接產(chǎn)物。(2)將上述基因vps連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌DH5 α中，并于含有氨芐青 霉素、40 μ g/ml X-gal以及、40 μ g/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12小時(shí)。(3)培養(yǎng)后利用藍(lán)白斑篩選的方法，挑選白斑接入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，提取基因vps載體DNA。(4)依提出的上述基因vps載體DNA為模板，以引物b進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)，并 且用EcoR I和Xho I對(duì)基因vps載體進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，篩選出含有重組載體pMD 19-T
9Simple-vps的陽(yáng)性菌株。四、構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-VpS 1.用EcoRI和XhoI對(duì)上述重組載體pMD 19-T Simple-vps進(jìn)行雙酶切，通過(guò)瓊脂 糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后，切膠純化回收含有基因vps的目的片段。2.將原核表達(dá)載體PET28a也通過(guò)EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物同樣通 過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后切膠回收線性載體PET28a。3.將獲得的基因vps和線性載體pET28a，通過(guò)DNA連接酶在16°C下連接反應(yīng)16 小時(shí)，得到基因vps連接產(chǎn)物。4.將基因vps連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌DH5 α中，并于含有0. 6%卡那霉素 的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12小時(shí)。5.挑取長(zhǎng)出的菌落，接入含有0. 6%卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下振蕩 培養(yǎng)12小時(shí)后提取基因vps載體DNA。6.以提出的載體DNA為模板，以引物b進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測(cè)，并且用EcoRI和XhoI 對(duì)載體進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，經(jīng)過(guò)上述雙重檢測(cè)后篩選出含有重組載體pET28a-VpS的陽(yáng)性菌 株。7.將重組載體pET28a-VpS再轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌BL21中，通過(guò)異丙基硫代半乳 糖苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，基因vps目的蛋白能夠正常表達(dá)。五、構(gòu)建tdh2_vps融合蛋白原核表達(dá)載體pET28a-tdh2_vps 1.用BamH I和EcoR I對(duì)重組載體pMD 19_T Simple_tdh2進(jìn)行雙酶切，，通過(guò)瓊 脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后，切膠純化回收含有基因tdh2的目的片段。2.將已構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET28a-Vps同樣用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切， 酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后切膠回收線性載體pET28a-Vps。3.將基因tdh2與線性載體pET28a-vps通過(guò)DNA連接酶16°C連接反應(yīng)16小時(shí)得 到。4.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌DH5 α中，并于含有0. 6%卡那霉素的LB固體 培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)12小時(shí)。5.挑取長(zhǎng)出的菌落，接入含有0. 6%卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng) 12小時(shí)后提取載體DNA。6.以提出的載體DNA為模板，分別用基因tdh2的擴(kuò)增引物a，基因vps的擴(kuò)增引 物b進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)；分別用EcoRI、XhoI以及BamHI、EcoRI這兩對(duì)內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切 檢測(cè)，篩選出了含有tdh2-vps融合基因的原核表達(dá)載體pET28a-tdh2-VpS的陽(yáng)性菌株，結(jié) 果表明分別都得到了 1779bp左右和570bp左右的目的片斷。即tdh2-vps融合基因蛋白原 核表達(dá)載體pET28a-tdh2-vps構(gòu)建成功。為了驗(yàn)證tdh2-vps融合基因在原核表達(dá)載體中能夠正常表達(dá)，將重組載體 pET28a-tdh2-VpS再轉(zhuǎn)化到受體大腸桿菌BL21中，通過(guò)異丙基硫代半乳糖苷IPTG進(jìn)行誘導(dǎo) 表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，得到了與預(yù)想的分子量大小相同的目的蛋白，證明該融合 蛋白能夠正常表達(dá)，結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例2 構(gòu)建tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-Nl-tdh2-vps 1.將連接在一起的tdh2-vps融合基因作為一個(gè)單獨(dú)的基因，以上述的原核表達(dá)載體pET28a-tdh2-VpS為模板，重新設(shè)計(jì)一對(duì)用來(lái)擴(kuò)增tdh2-vps融合基因的引物c，其序列 為5’ CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3’5’ CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3’2.以pET28a-tdh2-vps為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到2355bp的PCR產(chǎn)物。其反應(yīng) 條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性1分鐘，58°C退火1分鐘，72°C延伸2分30秒；如此 反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸10分鐘。其反應(yīng)體系為5μ1 的 Buffer，3y 1 的 MgCl2，0. 5μ 1 的 dNTP，0. 5μ 1 的 Taq 酶， 2μ1的模板DNA，各0. 5μ 1的引物C，最后用滅菌去離子水補(bǔ)足50 μ 1。3.上述PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的片段的凝膠切下，回 收后得到純的含有XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)的tdh2-vps融合基因。4.將tdh2-vps融合基因與原核載體pMD19-T Simple連接，16°C連接反應(yīng)16小時(shí) 后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中。挑取白斑培養(yǎng)后提取載體DNA，經(jīng)PCR反應(yīng)和Xho I.BamH I 雙酶切檢測(cè)后，篩選出含有重組載體PMD19-T Simple-tdh2-vps的陽(yáng)性菌株。5.將 pEGFP-Nl 和 pMD19-T Simple-tdh2_vps 同時(shí)經(jīng) Xho I.BamH I 雙酶切，酶切 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并切膠回收得到線性載體PEGFP-Nl和tdh2-vps融合基因。將 線性載體PEGHP-Nl和tdh2-vps融合基因通過(guò)DNA連接酶進(jìn)行連接，得到tdh2-vps融合基 因蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-Nl-tdh2-vps。為了驗(yàn)證構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP-Nl-tdh2-vps中同時(shí)包含基因tdh2和基因 vps，將含有上述真和表達(dá)的菌株接入到0. 6%卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng) 12小時(shí)后提取載體DNA，并經(jīng)PCR和雙酶切檢測(cè)。PCR檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。實(shí)施例3 二價(jià)DNA疫苗懸液的制備和使用將上述實(shí)施例2所得的pEGFP-Nl-tdh2-vps工程載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中， 在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-18小時(shí)后，提取工程載體pEGFP-Nl-tdh2-vps， 對(duì)此載體進(jìn)行去除內(nèi)毒素處理后，將載體溶于0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液PBS中至濃度為 200ug/ml，即得到副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗懸液。便可對(duì)魚類進(jìn)行免疫。以養(yǎng)殖的牙鲆魚 為例。免疫實(shí)驗(yàn)前兩周購(gòu)買同一批次的健康牙鲆，飼養(yǎng)于水箱中，通氣并正常換水、投餌，水 溫 20°C。用本發(fā)明制備的工程載體pEGFP-Nl-tdh2-vps對(duì)牙鲆進(jìn)行肌肉注射免疫，注射 部位為靠近背鰭的肌肉較為厚實(shí)的地方，注射劑量為ΙΟΟμΙ/尾。同時(shí)設(shè)置注射等量滅菌 磷酸鹽緩沖液PBS的對(duì)照組。接種后不同時(shí)間尾靜脈取血，制備血清用于抗體檢測(cè)。當(dāng)實(shí) 驗(yàn)牙鲆免疫接種4-5周后，用副溶血弧菌對(duì)其進(jìn)行肌肉注射攻毒，攻毒后觀察并記錄實(shí)驗(yàn) 牙鲆的死亡情況，其計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率RPS為80%。
權(quán)利要求
一種副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗，其特征在于所述的疫苗為副溶血弧菌溶血素亞單位基因tdh2和絲氨酸蛋白酶基因vps通過(guò)6個(gè)核苷酸GAATTC相連而成的tdh2 vps融合基因蛋白原核或真核表達(dá)工程載體疫苗，其中tdh2 vps融合基因的DNA序列為ATGAAGTACCGATATTTTGCAAAAAAATCATTTTTATTTATATCCATGTTGGCTGCATTCAAAACATTTGCCTTTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATTGTTTGTTGTTCGAGATACAACTTTTAATACCAATGCACCGGTCAATGTAGAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCAGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAGCTTCAACATTCCTATGATTCTGTAGCTAACTTTGTTGGTGAAGATGAAGATTCTATTCCAAGTAAAATGTATTTGGATGAAACTCCAGAATATTTTGTTAATGTAGAAGCATATGAGAGTGGTAGTGGTAATATATTGGTAATGTGTATATCCAACAAAGAATCGTTTTTTGAATGTAAACATCAACAAGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGCCTATTTGCCGCTATGTTGGCTGTGGGCCTTGCACCTGCCGTCTCGGCGTTTGATCCGCTCTATTCAGAACAATGGCATCTCGACAACACTGGTCAAATTGCATTCGCAGCAAACCCTGCTGTTGCAGGTAATGACTTAAACACCAAACTTACGCAAGCCATGGGCATTGCCGGTATTGGCGTTAAAGTTGCGGTCATTGATTCTGGTGTGCAGATCGATCACCCAGACCTTGCAGGTAACGTAGTCACAGGTAGCAGAAACTTCGTTGAAGACTCTTTATTCCCATCCAGTTATCCCGTCGACACTAACGGCCACGGTACTGCCGTTGCTGGTTTGATTAGTGCGGTAGGTAACAATGGTGAAGGTGGTCGCGGCGTTGCTTCTCGCTCTTCGCTTGTTGGTTTTAACTGGCTTGCAAACCAAACATTAGAAGGTTGGTTAATTTCTCACGGTATGGACCCAGCGACGCGAGATGTACGCGTATTTAACCAAAGTTATGGCTTTAGTCCGATCAACCCAATCGCGTTTGATGAGAATGACCCACAGTTCAAGCTTGAAATGGATGTCATGCAGAACGTCAGCGAAACGAACGCTTGGGGCCGCGGTGCACTGTTTGTCAAGTCTGCGGGGAATGGTTACCGCTATTTCAACACCGGACGATTCTTCGTTCTTCCTAGCGATTTCTTCGCGGGAGGAGGAAACCAAGGTTTACCGATGCACAACTCGGCGCAATCTTACGACAACTCTAGCTACTTCAACCTTGTCACCAGCGCGCTACGCGCAGATGGCACCCGAGCAAGTTACTCTTCTGTTGGCGCTAACGTGTGGGTTGCCGCGCCAGCAGGGGAATACGGGCAAGACTTCCCTGCGATGGTCACAACTGACCTGATGGGATGTGAAGAAGGACAAAACACCAGTGACGGCCTTGGTATTAATGGTCTACACGGTGGTACAGAGCTTGACCCGAACTGTAATTACACCAGCACCATGAACGGCACATCATCGGCTGCGCCGAACACTTCTGGTGCAATCGCCGCTATCATGTCAACTAACCACGCTTTATCTGCCCGTGATATTCGTGCGTTGCTGGCAGAAACCGCACGCGTTACCGATGCCGAGCATCCGGGTGTTCAACTTGAATTTACCAATAATAAAGGTGAGTTGGTGAGCTACGAAGCGATCTCACCTTGGCAGAAAAACGCGGCTGGCGTGAACTTCCATACCTTCTATGGTTTTGGTGCCGTTGATTTGGATGAAGCGATGAAACGCGCTCGCATGACAAATAATGTTCTGCCAGCGCAAATCATCACACCGTGGGCAAACAATGCAACAGAAGTCAGTGTGCCCGATGCAAGCCTTGCTGGTGGTTCGTCAAACATCGCAATTACTGACGACATTACCGTTGAGTCTGTACAGGTGAAGTTGACGCTAGAGCACTCGCGTCTACCTGATTTGGCAATCGAGCTTGTTTCTCCATCAGGCACTCGCTCCGTATTGCAAACACCACGTAACGGCCTTGTTGGTCAGTCTCTTGATCCAAACATTACGGGTTACGAAAACCAACTGATGTTGTCTAACCAATTCTACGGCGAGAATGCCAAGGGTGAATGGACACTGAGAGCTATCGATACAAACGGTGATGAAGTCTTCTCGTTTATCGCTTACTTCAACTCATCCGCTATCTATGATGTACCGATGGCGAACAACGCAAAACCAGGAGTTATCAAAAACTGGTCTATGCGTATCTTTGGCCACTAA。
2.副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗的制備方法，首先制備副溶血弧菌的兩個(gè)致病因子的溶血 素亞單位基因tdh2和絲氨酸蛋白酶基因vps ；然后利用DNA內(nèi)切酶雙酶切技術(shù)使目的基因 獲得粘性末端，再用DNA連接酶將基因tdh2和基因vps通過(guò)6個(gè)核苷酸GAATTC相連，并克 隆到原核表達(dá)載體pET28a中構(gòu)建得到tdh2-vps融合基因蛋白原核表達(dá)工程載體；同樣再 通過(guò)內(nèi)切酶雙酶切技術(shù)，將tdh2-vps融合基因插入到真核載體中構(gòu)建得到tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體疫苗；最后用常規(guī)的方法擴(kuò)增培養(yǎng)并收獲上述tdh2-vps融合 基因蛋白真核表達(dá)工程載體，即制成副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗懸液。
3.如權(quán)利要求2所述的副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗的制備方法，其特征是上述tdh2-vps 融合基因蛋白原核表達(dá)工程載體的構(gòu)建方法首先制備基因tdh2和基因vps 以副溶血弧菌DNA為模板，用引物a進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn) 的基因tdh2 ；引物a為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下 5' CGCGGATCCATGAAGTACCGATATTTTGCA 3' 5 ‘ CGCGAATTCTTGTTGATGTTTACATTCAAAA 3‘以副溶血弧菌DNA為模板，用引物b進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn) 的基因vps ；引物b為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下 5’ CGCGAATTCATGGAAACACGCTTTAATCGC 3’ 5' CCGCTCGAGGTGGCCAAAGATACGCATAGAC 3' (1)構(gòu)建tdh2-vps融合基因蛋白的原核表達(dá)工程載體在載體pET28a的酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI之間插入tdh2，構(gòu)建成載體pET28a_tdh2 ； 在載體PMD19-T Simple的酶切位點(diǎn)EcoRI和XhoI之間插入vps，構(gòu)建成載體pMD 19-T Simple-vps ；分別將載體pET28a-tdh2和載體pMD19_T Simple-vps用EcoRI和XhoI進(jìn)行雙酶切， 得到線性載體pET28a-tdh2和基因vps ；將基因vps與上述線性載體pET28a-tdh2進(jìn)行重組連接，構(gòu)建成tdh2-vps融合基因蛋 白原核表達(dá)工程載體pET28a-tdh2-Vps ；將上述工程載體pET28a-tdh2-VpS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中培養(yǎng)并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測(cè)，tdh2-vps融合基因蛋白得到表達(dá)。
4.如權(quán)利要求2所述的副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗的制備方法，其特征是上述的 tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體的構(gòu)建方法將上述權(quán)利要求4構(gòu)建的工程載體pET28a-tdh2-VpS轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，培養(yǎng) 回收載體，用引物c進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到含有XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)的tdh2-vps融合基因； 引物c為人工設(shè)計(jì)的DNA片段，其序列如下 5' CGCCTCGAGATGAAGTACCGATATTTTGCA 3' 5' CGCGGATCCCCTTAGTGGCCAAAGATACGCAT 3'將tdh2-vps融合基因再次克隆到載體pMD19-T Simple上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中， 提取載體后用XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切，得到融合基因tdh2-vps ；將融合基因tdh2-vps與經(jīng)XhoI和BamHI進(jìn)行雙酶切處理過(guò)的載體pEGFP-Nl進(jìn)行重 組連接，構(gòu)建成tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體pEGFP-Nl-tdh2-vps。
5.如權(quán)利要求2所述的副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗的制備方法，其特征是上述副溶血弧 菌二價(jià)DNA疫苗懸液的制備將上述所得的tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體轉(zhuǎn)化到CHO細(xì)胞或大腸桿菌 DH5a中，進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增培養(yǎng)，然后將含有tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體提取 出來(lái)，溶于005 0. 20mol/L磷酸鹽緩沖液PBS中至濃度為200ug/ml，即得到副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗懸液。
6.副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗懸液以50 200ul/尾的劑量應(yīng)用于魚類免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗及其制備方法和應(yīng)用，其特征是將副溶血弧菌tdh2基因和vps基因通過(guò)6個(gè)核苷酸GAATTC相連成的tdh2-vps融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體疫苗；其制備方法包括利用雙酶切技術(shù)使基因tdh2和vps獲得粘性末端后相連，并克隆到原核表達(dá)載體pET28a中構(gòu)建得到融合基因蛋白原核表達(dá)工程載體；再通過(guò)雙酶切技術(shù)，將該融合基因插入到真核載體中構(gòu)建得到融合基因蛋白真核表達(dá)工程載體疫苗；最后用常規(guī)的方法制成副溶血弧菌二價(jià)DNA疫苗懸液。本發(fā)明操作性強(qiáng)重復(fù)率高，安全無(wú)毒副作用，可對(duì)魚類雙重免疫保護(hù)，免疫效果較滅活疫苗、重組蛋白疫苗及一價(jià)DNA疫苗高。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101947325SQ20101029225
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者何慶芳, 劉瑞, 徐廣峰, 陳吉祥 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)