專利名稱：一種具有免疫活性的滸苔多糖及其制備方法
技術領域：
本發明涉及是醫藥生物技術，更詳細地講是關于滸苔等天然海藻提煉的一種具有免疫活性的滸苔多糖及其制備方法。
背景技術：
眾所周知，滸苔是一種大型綠藻，為近海灘涂中的天然野生綠藻，其自然繁殖能力特別強，產量巨大。我國海域特別是東海海域的綠藻主要以滸苔為主，其資源十分豐富，僅福建沿海每年天然產量(鮮重)達10萬噸以上。近幾年黃海海域的滸苔，大面積暴發，嚴重的影響了水體美觀，污染海域環境。通常，滸苔作為垃圾丟棄，造成了環境污染，增加了處理成本，浪費了優質資源。因此，針對滸苔的研究開發是目前治理環境污染，優化資源利用的迫切需要。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能消除上述缺點，具有方法簡單、性能穩定、成本低廉、藥用價值大，集降低膽固醇與提高免疫力為一體等特點的一種具有免疫活性的滸苔多糖及其制備方法。尤其是采用提取、脫蛋白、純化的制備方法，以及科學的試驗手段，首創性的研究獲得滸苔多糖及其提煉方法，開創了治理滸苔的新方法和途徑。它有效地開發了滸苔的藥用價值和用途，治理了環境污染，降低了清理成本，提高了社會和經濟效益，是理想的滸苔治理和綜合利用的專用制備技術。本發明的一種具有免疫活性的滸苔多糖是指多糖HT-II，其特征為白色絮狀物，易溶于水和二甲基亞砜，相對分子量為96kDa，主要由葡萄糖和甘露糖組成，其組成比為鼠李糖木糖甘露糖葡萄糖=36 20 6 28。本發明的一種具有免疫活性的滸苔多糖的制備方法，即多糖HT-II的提取純化方法如下1、提取從青島海域采取緣管滸苔做樣品，滸苔樣品用自來水沖洗，自然風干后取100g，打碎，以滸苔渣與水的質量比為1 30加入蒸餾水，95°C提取池，抽濾，濾渣再以 1 15的蒸餾水重復提取兩次。合并濾液，旋轉蒸發濃縮至液體微黏，加入3倍體積的95% 乙醇，4°C靜置過夜。9000rpm離心，沉淀依次用85%、95%、無水乙醇及乙醚脫水，冷凍干燥
得粗多糖。2、脫蛋白將粗多糖配成5%的糖溶液，用木瓜蛋白酶，按酶與粗多糖質量比為 1 50取蛋白酶加入至糖液中，邊加邊攪拌，50°C保溫Mi，9000rpm離心去除沉淀，上清液按糖液總體積的1/4加入kvage試劑(正丁醇氯仿=1 4)，搖床充分震蕩30min，靜置， 離心，取上清重復操作，直至無游離蛋白為止。3、純化將粗多糖溶于pH7. 4磷酸緩沖液中，上DEAE-S^hadex A-50層析柱 (40X2. 5cm)進行初步分離。室溫下，以上限為0. 5mol/L NaCl磷酸緩沖液進行梯度洗脫， 流速Mml/h，自動部分收集洗脫液，每IOmin收集1管(每管約細1)。采用苯酚-硫酸顯色法，于490nm處測定吸光值，檢測多糖含量。合并峰位洗脫液，透析后減壓濃縮，冷凍干燥。獲得的樣品再由kphadex G-100層析柱(100X2cm)進一步純化，洗脫液為0. 05mol/ L NH4AC溶液，流速為8ml/h，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測。合并峰部的洗脫液，透析后濃縮凍干得純化的滸苔多糖HT-II。采用紫外分光光度法，在^K)nm、280nm處檢測樣品的吸光值，
確定其純度。本發明針對緣管滸苔的多糖進行分離提取，其制備方法為打碎一90°C水提一過濾一合并提取液一濃縮一乙醇沉淀一去除蛋白一分離純化一冷凍干燥一多糖純品。經體外細胞活性檢測，該多糖單獨或協同ConA能夠顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖，同時提高細胞白介素II(IL-2)的分泌，可作為提高機體免疫力的食品添加劑。結合多糖的組成分析，對本發明做進一步說明本發明的一種具有免疫活性的滸苔多糖，其多糖HT-II的分子量與單糖組成分析方法及結果1、采用高效凝膠滲透色譜法(HP-GPC)測定南極菌NJ-B3胞外多糖分子量。分析條件TSK-GELG2000PW, 3007. 5mmID 色譜柱；流動相 0. lmol/LNa2S04溶液，流速lOml/min ；柱溫60°C，進樣量2 μ 1，示差折光檢測器檢測。以標準Dextran T系列葡聚糖作標準曲線，計算分子量。分析結果表明HT-II多糖的相對分子量為96kDa。2、單糖組成分析10mg純化多糖中加入2mol/L三氟乙酸2ml置于100°C水浴中水解18h，減壓濃縮至干，加入IOmg鹽酸羥胺和0. 5ml吡啶，放入90°C水浴中加熱反應30min 分鐘并振蕩。取出后冷至室溫，加入0. 5ml醋酸酐，90°C下繼續反應30min分鐘進行乙酰化。反應產物減壓濃縮至干，加入0.5ml氯仿萃取。同時將D-阿拉伯糖，D-木糖、D-半乳搪、D-葡萄糖和D-甘露糖按上述步驟轉化成糖氰乙酸酯衍生物作為標準對照，接著進行氣相(GC)色譜分析。氣相色譜分析條件0V-225柱，載氣N2,90ml/min ；柱溫240°C，檢測器溫度250°C， 氣化室溫度280°C，氫火焰離子檢測器。分析結果表明HT-II主要由葡萄糖和甘露糖組成，其組成比為鼠李糖木糖 甘露糖葡萄糖=36 20 6 28。本發明制備的HT-II多糖具備良好的免疫活性。可在醫藥、食品、美容、生物技術等領域具有潛在的應用前景。本發明的特點在于1、以青島海域的緣管滸苔為原料，開創性地建立提取、分離、 純化滸苔多糖的生產工藝；2、提供了緣管滸苔多糖的潛在用途；細胞免疫試驗表明HT-II多糖能夠顯著的提高小鼠脾淋巴細胞的增殖和促進小鼠白介素II的分泌，顯示出良好的免疫活性。本發明制備的多糖純品為生物技術產品，可廣泛地用于醫藥、食品、生物技術等領域。
具體實施例方式結合實施例進一步說明本發明的技術方案實施例1 :HT-II多糖的制備方法
1、提取從青島海域取緣管滸苔做樣，滸苔樣品用自來水沖洗，自然風干后取 100g，打碎，以滸苔渣與水的質量比為1 30加入蒸餾水，95°C提取池，抽濾，濾渣再以 1 15的蒸餾水重復提取兩次。合并濾液，旋轉蒸發濃縮至液體微黏，加入3倍體積的95% 乙醇，4°C靜置過夜。9000rpm離心，沉淀依次用85%、95%、無水乙醇及乙醚脫水，冷凍干燥得粗多糖HT。2、脫蛋白將粗多糖配成5%的糖溶液，用木瓜蛋白酶，按酶與粗多糖質量比為 1 50取蛋白酶加入至糖液中，邊加邊攪拌，50°C保溫Mi，9000rpm離心去除沉淀，上清液按糖液總體積的1/4加入kvage試劑(正丁醇氯仿=1 4)，搖床充分震蕩30min，靜置， 離心，取上清重復操作，直至無游離蛋白為止。3、純化將粗多糖溶于pH7. 4磷酸緩沖液中，上DEAE-S^hadex A-50層析柱 (40X2. 5cm)進行初步分離。室溫下，以上限為0. 5mol/L NaCl磷酸緩沖液進行梯度洗脫， 流速Mml/h，自動部分收集洗脫液，每IOmin收集1管(每管約細1)。采用苯酚-硫酸顯色法，于490nm處測定吸光值，檢測多糖含量。合并峰位洗脫液，透析后減壓濃縮，冷凍干燥。獲得的樣品再由kphadex G-100層析柱(100X2cm)進一步純化，洗脫液為0. 05mol/ L NH4AC溶液，流速為8ml/h，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測。合并峰部的洗脫液，透析后濃縮凍干得純化的滸苔多糖HT-II。采用紫外分光光度法，在^K)nm、280nm處檢測樣品的吸光值， 確定其純度。實施例2 =HT-II多糖的免疫活性試驗1、HT-II多糖對脾淋巴細胞的增殖作用采用MTS-PMS比色法。BALB/c小鼠斷頸椎處死，無菌取脾，制備脾淋巴細胞，用RPMI1640完全培養液調整細胞濃度為4109/L cell/ ml ο將BALB/c小鼠4109/L cell/ml的脾細胞懸液加入96孔細胞培養板內，每孔 100 μ 1，多糖組每孔加入用RPMI1640完全培養液稀釋成濃度為6. 25、12. 5、25、50、IOOmg/ L的HT-II各10μ 1，每個濃度5個重復，空白對照組以等體積的RPMI1640代替。置37°C， 5% CO2飽和濕度培養箱中培養72h。取出，加入20 μ IMTS-PMS繼續培養4 他，用酶標儀
測定A492nm值。將BALB/c小鼠4109cell/ml的脾細胞懸液加入96孔細胞培養板內，隨后每孔加入 ConAlOy 1，終濃度為5mg/L，多糖組每孔加入用RPMI1640完全培養液稀釋成濃度為6. 25、 12. 5、25、50、100mg/L的HT-II各10 μ 1，每個濃度3個重復，空白對照組以等體積的RPMI 1640代替，置37°C ,5% CO2飽和濕度培養箱中培養72h。取出，加入20 μ 1 MTS-PMS繼續培養4 他，用酶標儀測定A492nm值，測定結果見表1。表IHT多糖對脾淋巴細胞增殖的影響
組別0 (Control)6. 25多糖濃度(mg/L) 12.5 2550100HT0. 291 ±0. 0240. 319±0. 027*0. 361 ±0.016**0. 341 ±0.014**0. 359 士 0.015**0. 383±0.025**HT+ConA0. 743 土 0. 0931.074±0. 076**1.102±0.115**1.156±0. 037**1.037 土 0.058**0. 727 土 0· 044氺ρ < 0. 05 氺氺ρ < 0. 01 vs control從表1中看出，HT在6. 25 100mg/L的濃度范圍內可顯著刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，隨著多糖濃度增加，刺激效應呈增強趨勢。HT在6. 25 50mg/L的濃度范圍內與ConA刺激的淋巴細胞增殖有協同作用，但這種協同效應與多糖濃度無明顯相關性。2、HT-II多糖對細胞白介素II的誘導作用制備脾單細胞懸液同上，加入48孔板，每孔1000 μ L，每樣3個復孔，加ConA與多糖濃度同上，培養4 取上清用ELISA法測定 IL-2含量，測定結果見表2。表2HT多糖對IL-2分泌的影響
權利要求
1.一種具有免疫活性的滸苔多糖，其特征在于是指多糖HT-II，為白色絮狀物，易溶于水和二甲基亞砜，相對分子量為96kDa，它主要由葡萄糖和甘露糖組成，其組成比為鼠李糖木糖甘露糖葡萄糖=36 20 6 28。
2.用于權利要求1所述的一種具有免疫活性的滸苔多糖的制備方法，其特征在于該制備方法為打碎一90°C水提一過濾一合并提取液一濃縮一乙醇沉淀一去除蛋白一分離純化一冷凍干燥一多糖純品。
3.如權利要求1或2所述的一種具有免疫活性的滸苔多糖的制備方法，其特征在于是多糖HT-II的提取純化方法，其步驟如下a、提取從青島海域采取緣管滸苔做樣品，滸苔樣品用自來水沖洗，自然風干后取 100g，打碎，以滸苔渣與水的質量比為1 30加入蒸餾水，95°C提取池，抽濾，濾渣再以 1 15的蒸餾水重復提取兩次，合并濾液，旋轉蒸發濃縮至液體微黏，加入3倍體積的95% 乙醇，4°C靜置過夜。9000rpm離心，沉淀依次用85%、95%、無水乙醇及乙醚脫水，冷凍干燥得粗多糖；b、脫蛋白將粗多糖配成5%的糖溶液，用木瓜蛋白酶，按酶與粗多糖質量比為1 50 取蛋白酶加入至糖液中，邊加邊攪拌，50°C保溫Mi，9000rpm離心去除沉淀，上清液按糖液總體積的1/4加入kvage試劑(正丁醇氯仿=1 4)，搖床充分震蕩30min，靜置，離心， 取上清重復操作，直至無游離蛋白為止；c、純化將粗多糖溶于pH7.4磷酸緩沖液中，上DEAE-S^hadex A-50層析柱 (40X2. 5cm)進行初步分離。室溫下，以上限為0. 5mol/L NaCl磷酸緩沖液進行梯度洗脫， 流速2%il/h，自動部分收集洗脫液，每IOmin收集1管(每管約細1)，采用苯酚-硫酸顯色法，于490nm處測定吸光值，檢測多糖含量，合并峰位洗脫液，透析后減壓濃縮，冷凍干燥，獲得的樣品再由kphadex G-100層析柱(100X2cm)進一步純化，洗脫液為0. 05mol/L NH4AC溶液，流速為8ml/h，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測，合并峰部的洗脫液，透析后濃縮凍干得純化的滸苔多糖HT-II，采用紫外分光光度法，在^K)nm、280nm處檢測樣品的吸光值，確定其純度。
4.如權利要求1或2或3所述的一種具有免疫活性的滸苔多糖及其制備方法，其特征在于所述的滸苔多糖HT-II可單獨或協同ConA使用，能夠有效促進小鼠脾淋巴細胞增殖， 提高小鼠細胞白介素II的分泌。
全文摘要
一種具有免疫活性的滸苔多糖是指多糖HT-II，為白色絮狀物，易溶于水和二甲基亞砜，相對分子量為96kDa，它主要由葡萄糖和甘露糖組成，其組成比為鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖＝36∶20∶6∶28。其制備方法打碎→90℃水提→過濾→合并提取液→濃縮→乙醇沉淀→去除蛋白→分離純化→冷凍干燥→多糖純品。具有方法簡單、性能穩定、成本低廉、藥用價值大，可集降低膽固醇與提高免疫力為一體等特點。尤其是采用提取、脫蛋白、純化的制備方法，以及科學的試驗手段，開創了治理滸苔的新方法和途徑。開發了滸苔的藥用價值和用途，治理了環境污染，降低了清理成本，提高了經濟效益，是理想的滸苔治理和綜合利用的專用制備技術。
文檔編號A61P39/00GK102399297SQ20101028197
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月15日 優先權日2010年9月15日
發明者李江, 林學政, 譚姣姣, 黃曉航 申請人:國家海洋局第一海洋研究所