利用甘草毛狀根及其培養液制備甘草總黃酮的方法

專利名稱：利用甘草毛狀根及其培養液制備甘草總黃酮的方法
利用甘草毛狀根及其培養液制備甘草總黃酮的方法技術領域
本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及甘草毛狀根的培養方法以及 利用甘草毛狀根及其培養液制備甘草總黃酮的方法。另外，本發明還涉及一種由上述制 備方法得到的甘草總黃酮及其醫藥應用。
背景技術：
甘草是我國重要的傳統中藥，具有清熱解毒、潤肺祛痰、緩急止痛、補氣益脾 胃、調和諸藥等功效，被譽為“百草之王”。近年來人們發現甘草中含有的各種黃酮是 除了甘草酸外的另一類活性物質，甘草總黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋、抗炎、抗 潰瘍、抗衰老等藥理作用，需求強勁，目前已應用到醫藥、食品、保健品以及化妝品等 各個領域。
隨著甘草的不斷開發利用，野生資源采挖過度，給自然環境和生態資源造成了 巨大的破壞。2001年9月我國為了保護日益匱乏的甘草資源，限制了對野生甘草的采 挖，并且禁止使用野生甘草及其產品作為保健食品成分，甘草供需矛盾更加突出。甘草 資源的匱乏及其應用的限制成為限制甘草應用的瓶頸，迫切需要開發甘草活性成分的新 來源、新途徑。
利用甘草毛狀根生產甘草總黃酮是一條具有良好前景的有效途徑，且有許多適 應工業化生產的特點，如成本低，生長快，生產能力穩定等。但是甘草毛狀根中的黃酮 含量遠低于生藥根的含量，影響了甘草毛狀根的進一步發展放大和工業化，如張蔭麟等 報道烏拉爾甘草毛狀根的總黃酮含量為干重的0.39%，遠低于生藥根中的黃酮含量。目 前對影響毛狀根中黃酮含量的因素研究較多，如楊睿等報道了茉莉酸甲酯和水楊酸對水 母雪蓮毛狀根中黃酮類化合物含量的影響，在毛狀根接種后第IOd添加濃度為0.02mmOl/ L的茉莉酸甲酯，黃酮類化合物比對照提高34.1% ；在毛狀根接種后第15d添加濃度為 0.03mmol/L的水楊酸時，黃酮類化合物比對照提高52.9%。但是目前對于毛狀根培養液 中黃酮的含量、影響因素及如何利用研究的較少，盡管于樹宏等報道了吐溫-80對野葛 毛狀根中異黃酮(isoflavone)含量的影響，但是不涉及對甘草的研究，更不涉及對甘草毛 狀根及其培養液中黃酮(flavone)含量的研究和啟示。另外，吐溫作為常用的藥用輔劑， 在中藥復方制劑中作為輔料可以與甘草或其提取物等活性成分配制在一起構成藥物組合 物，如中國專利95108283、02100222、和200610035831等，但是在這些藥物中吐溫僅僅 是作為藥用輔劑而存在的。
為此，本發明人經過長期研究，令人意外地發現了，利用含吐溫的液體培養基 培養5天以上的長時間，能夠顯著提高甘草毛狀根組織培養得到的毛狀根及其培養液中 黃酮類化合物的含量，尤其是能夠促使總黃酮從甘草的毛狀根釋放到培養液中，大大提 高培養液中活性成分的含量；另外，本發明人還發現利用簡單的乙醇梯度洗脫聚酰胺層 析柱，即可制備高純度的甘草總黃酮。這樣從毛狀根及其培養液中獲取甘草總黃酮，能 夠有效避免資源的浪費，更為令人意想不到的是，本發明的甘草總黃酮的諸如體外腫瘤殺傷等效果甚至優于現有文獻報道的甘草總黃酮。 發明內容
本發明的目的在于，為解決甘草資源短缺與甘草需求的矛盾，以達到產業化生 產甘草黃酮，替代甘草資源的目標，提供了利用組織培養的甘草毛狀根及其培養液制備 甘草總黃酮的方法，提高了其中甘草總黃酮的含量，并進一步提供了制備或提純這些甘 草總黃酮的方法。因此，本發明提供了甘草毛狀根的培養方法、制備提高甘草總黃酮含 量的甘草毛狀根和/或提高甘草總黃酮含量的甘草毛狀根培養液的應用、制備甘草總黃 酮的方法以及由其制備得到的甘草總黃酮產品。
具體而言，在第一方面，本發明提供了培養能提高甘草總黃酮含量的甘草毛狀 根和/或甘草毛狀根培養液的方法，其包括
(1)將甘草毛狀根在不含吐溫的液體培養基中培養至旺盛生長期；
(2)將步驟(1)得到的旺盛生長期的甘草毛狀根在含有吐溫的液體培養基中培養 5天以上。
甘草總黃酮(total flavonoids of Glycyrrhiza)是提取自甘草的富集了甘草中黃酮類化合物(即，黃酮類成分)的提取物，其具有抗氧化、抗腫瘤、抗艾滋、抗炎、抗潰 瘍、以及抗衰老等藥理作用，常作為藥物活性成分或活性成分之一而使用(參見邢國 秀等.甘草中黃酮類化學成分的研究進展.中國中藥雜志，2003，28(7) 593)。甘草總 黃酮可以提取自甘草的各個部分，通常提取自甘草的根部；在現有甘草組織培養時，由 于培養液中的甘草總黃酮含量低，不太值得在產業化回收，因此未見報道從其培養液中 回收總黃酮。但是，本發明人發現，經過在含有吐溫的液體培養基中培養后，甘草毛狀 根和其培養液中的總黃酮含量都得到了顯著的提升，都可以在產業上加以利用。因此， 優選本發明第一方面還提供了培養甘草毛狀根以提高甘草毛狀根培養液中甘草總黃酮含 量的方法，其包括
(1)將甘草毛狀根在不含吐溫的液體培養基中培養至旺盛生長期；
(2)將步驟(1)得到的旺盛生長期的甘草毛狀根在含有吐溫的液體培養基中培養 5天以上。
甘草總黃酮中成分很多，即使其中黃酮類化合物的種類也有許多，但是可以通 過其中的特定成分來表征。在本發明中，本發明獲得的甘草總黃酮這一混合物可以通過 其中的黃酮類化合物、甘草查爾酮A和/或光甘草定的含量來表征。因此，本發明第一 方面的方法能提高黃酮類化合物、甘草查爾酮A和/或光甘草定的含量。如上文所述， 本發明尤其能提高甘草毛狀根培養液中的甘草總黃酮的含量，提高的黃酮類化合物、甘 草查爾酮A和/或光甘草定的含量不僅體現在甘草毛狀根中，也體現在其培養液中，因此 優選本發明第一方面的方法能提高甘草毛狀根培養液中黃酮類化合物、甘草查爾酮A和/ 或光甘草定的含量5倍以上，優選能提高10倍以上，如10-60倍。
在本發明第一方面的方法中，還可以進一步包括收集產物的步驟，包括收集步 驟( 得到的甘草毛狀根或其培養液，更優選本發明第一方面的方法還進一步包括
C3)收集步驟( 得到的甘草毛狀根和其培養液。這樣，回收甘草毛狀根和其培 養液，分別可以提取其中的總黃酮，可以更有效地利用培養得到的總黃酮，避免浪費；同時，由于培養液中的總黃酮含量較高，使得提取培養液中總黃酮的成本較低，尤其可 以利用本發明第四方面的方法進行，通過乙醇的梯度洗脫就可以從培養液中提純獲得甘 草總黃酮。
在本發明第一方面的方法中，甘草可以先在固體培養基上培養，然后再轉接入 不含吐溫的液體培養基中培養至旺盛生長期。通常可以將健康的甘草毛狀根以0.5% 2%的接種量接種于培養基中培養5 10天，從而達到旺盛生長期。在本發明的一個具 體實施方式中，將濕重為Ig的無褐化死亡部分的毛狀根接種于IOOmL MS液體培養基中 于25°C避光搖床培養7天，達到旺盛生長期。
優選在本發明第一方面的方法中，吐溫可以是經如本申請實施例所述測試證 實能誘導甘草提高總黃酮含量的吐溫種類，在本發明的具體實施方式
中，該種類是吐 溫-80。另外，優選液體培養基中吐溫的質量百分比濃度為1 5% (w/w)，更優選為2% (w/w),具體而言，優選液體培養基中吐溫-80的質量百分比濃度為1 5% (w/w)，更 優選為2% (w/w)。
優選在本發明第一方面的方法中，優選液體培養基為MS液體培養基。甘草毛狀 根可以在液體培養基中以合適條件被培養，優選其中培養的條件為20 30°C避光搖床培 養5天以上，如7 21天，優選如10 20天，更優選其中培養的條件為25°C、黑暗、 在IOOrpm轉速的搖床上培養15天。
在第二方面，本發明提供了本發明第一方面的方法在制備提高甘草總黃酮含量 的甘草毛狀根和/或提高甘草總黃酮含量的甘草毛狀根培養液的方法中的應用；另外， 本發明還提供了提供了制備提高甘草總黃酮含量的甘草毛狀根和/或提高甘草總黃酮含 量的甘草毛狀根培養液的方法，其中包括本發明第一方面的方法的步驟。
本發明的第二方面提供了本發明第一方面的方法在制備提高甘草總黃酮含量的 甘草毛狀根的方法中的應用，其中可以不收集本發明第一方面的方法中步驟( 得到的 甘草毛狀根培養液，而只收集本發明第一方面的方法中步驟( 得到的甘草毛狀根。
本發明的第二方面還提供了本發明第一方面的方法在制備提高甘草總黃酮含量 的甘草毛狀根培養液的方法中的應用，其中可以不收集本發明第一方面的方法中步驟(2) 得到的甘草毛狀根，而只收集本發明第一方面的方法中步驟( 得到的甘草毛狀根培養 液。
本發明第二方面的方法中的各個優選特征可以優選本發明第一方面的方法中各 個相應的優選特征。
在第三方面，本發明提供了制備甘草總黃酮的方法，其包括
(1)進行本發明第一方面的方法，獲得甘草毛狀根；
(2)干燥步驟(1)得到的甘草毛狀根，用其重量10-20倍的水于60°C-100°C提取 2-8小時，保留固體部分并將固體部分于烘箱中以30°C _60°C干燥；
(3)干燥步驟⑵得到的固體部分，并用50-95% (ν/ν)乙醇于60°C -100°C提取 1-2次，洗滌提取的殘渣，合并提取液及洗滌液，保留液體部分并濃縮和/或干燥。這 樣，可以提取甘草毛狀根中的甘草總黃酮。
優選在本發明第三方面的方法中，步驟(1)得到的甘草毛狀根在干燥前可以用 水提取從而去除水溶性雜質，例如，可以用甘草毛狀根重量10-20倍的水提取2-8小時。在本發明第三方面的方法中，干燥可以在30°C-6(TC的溫度下干燥，優選在50°C-6(TC的 溫度下干燥。
同樣，為了提供提取甘草毛狀根培養液中的甘草總黃酮，在第四方面，本發明 提供了制備甘草總黃酮的方法，其包括
(1)進行本發明第一方面的方法，獲得甘草毛狀根培養液；
(2)將任選經濃縮的步驟(1)得到的培養液上樣于聚酰胺層析柱，用至少兩種 0 85% (ν/ν)乙醇水溶液按乙醇濃度由低到高的順序依次進行洗脫，收集用濃度不小于 60% (ν/ν)乙醇洗脫的洗脫液并濃縮和/或干燥。
在本發明第四方面的方法中，濃縮可以在50°C-8(TC的溫度下減壓濃縮，可以 濃縮至原體積的1/10-1/2 ；干燥可以在30°C -60°C的溫度下干燥，優選在40°C -60°C的 溫度下干燥。另外優選在本發明第四方面的方法中，聚酰胺在裝入層析柱前要將聚酰胺 樹脂用95% (ν/ν)乙醇回流2 5小時(如3小時)，然后經濾布過濾，再在95% (ν/ν) 乙醇中回流2 5小時(如3小時)，濾布過濾后收集樹脂；其中，聚酰胺樹脂優選是粉 碎成30-200目的聚酰胺樹脂，如30-60目，60-100目，80-120目或100-200目的聚酰 胺樹脂。另外，在本發明第四方面的方法中，上樣于聚酰胺層析柱培養液優選是經濃縮 的，如將1/2-1/5柱體積的經濃縮的步驟(1)得到的培養液上樣于聚酰胺層析柱。
我們發現，在聚酰胺層析柱上，通過乙醇梯度洗脫即可提純培養液中的甘草總 黃酮。因此，優選在本發明第四方面的方法中，在步驟O)中，依次用水、10 50% (ν/ν)乙醇和60 95% (ν/ν)乙醇洗脫聚酰胺層析柱。另外，在本發明第四方面的方法 中，優選乙醇洗脫時控制流出液流速為每小時1 3柱體積。
我們發現，70% (ν/ν)乙醇洗脫的洗脫液中保留了絕大多數甘草總黃酮，而之 前用水、30% (ν/ν)乙醇和50% (ν/ν)乙醇依次洗脫就能去除絕大多數諸如吐溫等的雜 志，從而實現了甘草總黃酮的提純；而進一步用更高濃度(如，90% (ν/ν))乙醇洗脫， 并不能顯著提升提純效果。因此，更優選在本發明第四方面的方法中，在步驟O)中， 依次分別用2-7倍柱床體積的水、30% (ν/ν)乙醇、50% (ν/ν)乙醇和70% (ν/ν)乙醇洗 脫聚酰胺層析柱，收集用70% (ν/ν)乙醇洗脫的洗脫液。
本發明第三和第四方面的方法可以組合成優選的制備甘草總黃酮的方法，其包 括
(1)進行本發明第一方面的方法，獲得甘草毛狀根及其培養液；
(2)干燥步驟(1)得到的甘草毛狀根，用其重量10-20倍的水于60°C-10(TC提取 2-8小時，保留固體部分并將固體部分于烘箱中以30°C _60°C干燥；
(3)干燥步驟⑵得到的固體部分，并用50-95% (ν/ν)乙醇于60°C -100°C提取 1-2次，洗滌提取的殘渣，合并提取液及洗滌液，保留液體部分并濃縮和/或干燥。這 樣，可以提取甘草毛狀根中的甘草總黃酮；
(4)將任選經濃縮的步驟(1)得到的培養液上樣于聚酰胺層析柱，用至少兩種 0 85% (ν/ν)乙醇水溶液按乙醇濃度由低到高的順序依次進行洗脫，收集用濃度不小于 60% (ν/ν)乙醇洗脫的洗脫液并濃縮和/或干燥。其中，可以優選本發明第三和第四方 面的方法所述的各個相應的優選特征。
在第五方面，本發明提供了本發明第三和/或第四方面的方法制備的甘草總黃酮，其中黃酮類化合物含量大于對％，更優選其中黃酮類化合物含量大于60%，更優選 其中還富含甘草查爾酮A和光甘草定。例如，所述甘草總黃酮的HPLC圖譜可以如圖1、 2或3的70%乙醇洗脫液的圖譜所示，其中HPLC的條件如本申請實施例所述。
我們通過本發明第四方面的方法制備后發現，其中活性成分損失量非常少。因 此，優選在本發明第五方面的甘草總黃酮中，所述甘草總黃酮中的甘草查爾酮A和光甘 草定的量相較本發明第四方面的方法中步驟(1)得到的培養液中的甘草查爾酮A和光甘草 定的量，基本沒有減少，優選前者的量是后者的90%以上，如90%-99%，更優選95% 以上，如 95%-99%或者 97%-99%。
由于純度的提高以及可能存在的有效成分配比等方面的改善，本發明第五方面 的甘草總黃酮可以更有效地殺傷腫瘤，因此，本發明還提供了藥物組合物，其包含本發 明第五方面的甘草總黃酮和藥學上可接受的載體，優選所述藥物組合物用于抗腫瘤，尤 其用于抗胃腺癌；本發明還提供了本發明第五方面的甘草總黃酮在制備用于抗腫瘤(尤 其用于抗胃腺癌)的藥物的方法中的應用；另外，本發明還提供了用于抗腫瘤(尤其用于 抗胃腺癌)的方法，其包括給予患者有效治療量的本發明第五方面的甘草總黃酮。
藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑 (如水等)，填充劑(如淀粉、蔗糖等)、粘合劑(如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙 烯吡咯烷酮)、濕潤劑(如甘油)、崩解劑(如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉)、吸收促進劑 (如季銨化合物)、吸附載體(如高嶺土和皂粘土)、潤滑劑(如滑石粉、硬脂酸鈣/鎂、 聚乙二醇等)。另外還可以在藥物組合物中加入其它輔劑，如香味劑、甜味劑等。
藥物組合物可以通過口服，鼻吸入、直腸或者腸胃外給藥等方式施用于需要這 種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊 等，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥 時，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。給藥劑量可以由醫師根據患者的情 況(如，病情、體重、年齡、性別)來確定，通常在lyg/kg-100mg/kg患者體重之間。
本發明與傳統的甘草總黃酮獲得方法相比具有以下優勢以生物工程技術獲得 的甘草毛狀根產生的甘草黃酮為來源，有成本低、生長快、生產能力穩定等許多適應工 業化生產的特點；以吐溫-80對甘草毛狀根進行誘導處理，使毛狀根中的黃酮類化合物 含量提高了 44%-55%，同時使其培養液中的黃酮類化合物含量提高了 10-50倍；不僅利 用了毛狀根中的黃酮類化合物，還利用了其培養液中的黃酮類化合物，使綜合獲得的黃 酮類化合物總量提高了 10-50倍；其中甘草查爾酮A總量提高10-60倍，光甘草定總量提 高10-60倍。本方法獲得的甘草黃酮來源穩定，不受應用領域的限制，填補了甘草藥材 受限制領域的空白，保護了有限的甘草野生資源及其生態環境；同時本方法工藝簡單， 經濟價值可觀，是甘草黃酮產業化的新途徑。
為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實施例對本發明進行詳細地描述。需 要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據 本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。 另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容 均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。


圖1顯示了實施例4中各步驟洗脫液中黃酮的高效液相色譜法檢測結果。
圖2顯示了實施例4中各步驟洗脫液中甘草查爾酮A的高效液相色譜法檢測結^ ο
圖3顯示了實施例4中各步驟洗脫液中光甘草定的高效液相色譜法檢測結果。
具體實施方式
實施例1、甘草毛狀根的培養
將新鮮烏拉爾甘草種子(可購自亳州市藥材總公司公司)用70% (ν/ν)乙醇浸泡 10秒，用無菌水沖洗3次，然后用2% (w/w)次氯酸鈉溶液浸泡10分鐘，用無菌水沖洗 3次，然后將種子接種于MS固體培養基(即，MS液體培養基中添加(w/w)瓊脂)， 于25°C、黑暗培養4天，將其根中部切成0.5cm長的小段。
將小段轉接到添加有2，4- 二氯苯氧乙酸0，4-D)(終濃度為2mg/L)和激動素 (KT)(終濃度為0.2mg/L)的MS固體培養基中，于25°C、黑暗培養40天，得到絨毛狀 的不定根(即，毛狀根)。
然后，將毛狀根轉接于MS液體培養基中，于25°C、黑暗、在IOOrpm轉速的搖 床上培養20天。之后，除去褐化死亡的毛狀根，其余毛狀根接種于含IOOmL MS液體培 養基的300mL培養瓶里，每瓶毛狀根濕重為lg，于25°C、黑暗、在IOOrpm轉速的搖床 上培養7天。然后，將每瓶中培養的毛狀根再轉移到IOOmL含有2% (w/w)吐溫_80的 MS液體培養基里，于25°C、黑暗、在IOOrpm轉速的搖床上培養15天，然后離心，分別 收獲甘草毛狀根及其培養液；相應地，對照組是在MS液體培養基(不含2% (w/w)吐 溫-80)中培養。
其中，MS液體培養基的配方為硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650mg/L，磷酸 二氫鉀 170mg/L，硫酸鎂 370mg/L，氯化鈣 440mg/L，碘化鉀 0.83mg/L，硼酸 6.2mg/ L，硫酸錳22.3mg/L，硫酸鋅8.6mg/L，鉬酸鈉0.25mg/L，硫酸銅0.025mg/L，氯化鈷 0.025mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3mg/L，硫酸亞鐵27.8mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸 2mg/L，鹽酸硫胺素(VBl) O.lmg/L，鹽酸吡哆醇(VB6)0.5mg/L，維生素 B5 0.5mg/L， 蔗糖30g/L，余量為水。
實施例2、甘草毛狀根中總黃酮的制備
取根據實施例1制備的吐溫誘導培養的甘草毛狀根150g，置于烘箱中，60°C干 燥12小時，得干燥的毛狀根10g。將毛狀根置于500mL的圓底燒瓶中，加入水200mL， 于85°C浸泡7小時，冷卻至室溫，濾紙過濾，棄去濾液，再用60°C溫水洗滌3次，每次 200mL,然后將過濾截留的毛狀根殘渣置于烘箱中，60°C干燥12小時。將干燥的甘草毛 狀根殘渣置于500mL的圓底燒瓶中，加入95% (ν/ν)的乙醇200mL，85°C回流提取2小 時，冷卻置室溫，濾紙過濾，保留濾液。濾渣用10mL95% (ν/ν)的乙醇洗滌2次，保留 洗滌液，殘渣再加入95% (ν/ν)的乙醇200mL，85°C回流提取2小時，冷卻置室溫，濾紙 過濾，保留濾液。合并兩次濾液和洗滌液，60°C減壓濃縮至20mL，將濃縮液置于烘箱中 60°C干燥，得黃酮類化合物含量為對.22% (w/w，根據HPLC測量)的甘草總黃酮0.5g。
相應地，用對照組的甘草毛狀根重復以上過程，獲得黃酮類化合物含量為20.56% (w/w,根據HPLC測量)的甘草總黃酮0.51g。
由此可見，本發明的培養方法能夠培養出高黃酮類化合物含量的毛狀根并適于 提取制備。
實施例3、甘草毛狀根培養液中總黃酮的制備
(1)甘草毛狀根培養液的濃縮取根據實施例1制備的吐溫-80誘導培養的甘草 毛狀根培養液60mL，60°C濃縮至原體積的1/2 (即30mL)。
(2)聚酰胺樹脂的預處理將柱層析用的聚酰胺樹脂(可購自國藥集團化學試劑 公司)IOOg用95% (ν/ν)乙醇500ml于85°C回流3小時，濾布過濾，再加入95% (ν/ν) 乙醇500mL于85°C回流1次，濾布過濾，以除去聚酰胺樹脂中殘留的醇溶性雜質。將處 理后的聚酰胺樹脂裝柱，使柱體積為60mL，依次各以300mL70% (ν/ν)乙醇、50% (ν/ ν)乙醇和30% (ν/ν)乙醇沖洗層析柱，再用去離子水沖洗層析柱至流出液無乙醇味。
(3)上樣將經步驟⑴濃縮好的毛狀根培養液30mL上到柱體積為60mL的層 析柱柱頂，控制流出液流速為60mL/h，至提取液完全上樣進入樹脂床，靜止0.5-lh，讓 其充分吸附。
(4)洗脫以120mL去離子水沖洗樹脂床，控制流出液流速為60mL/h。再依 次各用120mL30% (ν/ν)乙醇和50% (ν/ν乙醇)沖洗層析柱，控制流出液流速為60mL/ h。再用180mL70% (ν/ν)乙醇洗脫層析柱，控制流出液流速為60mL/h，收集該部分洗 脫液，60°C減壓濃縮至IOmL,然后將濃縮液置于烘箱中60°C干燥，獲得黃酮類化合物含 量為61.49% (w/w,根據HPLC測量)的甘草總黃酮94.0mg。
層析柱最后可以再用120mL 95% (ν/ν)乙醇沖洗，控制流出液流速為60mL/h， 以供研究之用。
相應地，根據上述方法，用對照組的甘草毛狀根重復以上過程，獲得黃酮類化 合物含量僅為18.52% (w/w,根據HPLC測量)的甘草總黃酮。
由此可見，本發明的培養方法能夠培養出高黃酮類化合物含量的甘草毛狀根培 養液并適于提取制備。
實施例4、制備甘草毛狀根培養液中總黃酮的方法中各步驟雜質和有效產物檢測
由于某些雜質將影響到甘草總黃酮的質量，而過分嚴格的純化將大大增加產物 的損失，因此以下對實施例3中各步驟洗脫(沖洗)出的產物進行雜質和有效產物的檢 測。
(1)各步驟洗脫液的雜質檢測
由于采用了聚酰胺樹脂為吸附劑，根據其吸附原理知道培養基中的大部分雜質 在用水為洗脫溶劑除雜時能被洗脫，但是吐溫-80卻不能被水洗脫完全除去，故各步驟 洗脫液主要檢測吐溫-80的有無。具體而言，分別取120mL各步驟的洗脫液，于60°C減 壓濃縮至5mL，將濃縮液用該步驟的洗脫(沖洗)溶劑溶解并定容至lOmL。取定容的 溶液l.OmL置于烘箱中60°C烘干，然后加入水lml，超聲溶解，離心，取上清液并加入 0.1M氫氧化鈉溶液lmL，煮沸3分鐘，冷卻至室溫，用10% (w/w)稀鹽酸酸化，如產生 白色渾濁則含有吐溫-80。具體結果見表1，可見實施例3的步驟中使用50 70% (ν/ ν)乙醇洗脫，就能夠有效除去吐溫-80等雜質。
表1.洗脫液中吐溫-80檢測結果
權利要求
1.培養能提高甘草總黃酮含量的甘草毛狀根和/或甘草毛狀根培養液的方法，其包括(1)將甘草毛狀根在不含吐溫的液體培養基中培養至旺盛生長期；(2)將步驟(1)得到的旺盛生長期的甘草毛狀根在含有吐溫的液體培養基中培養5天 以上。
2.權利要求1所述的方法，其進一步包括(3)收集步驟(2)得到的甘草毛狀根和其培養液。
3.權利要求1或2所述的方法，其中吐溫是吐溫-80，優選液體培養基中吐溫-80的 質量百分比濃度為1 5% (w/w)，更優選為2% (w/w)。
4.權利要求1或2所述的方法，其中液體培養基為MS液體培養基，優選其中培養的 條件為20 30°C避光搖床培養10 20天，更優選為25°C、黑暗、在IOOrpm轉速的搖 床上培養15天.。
5.權利要求1或2所述的方法，其能提高黃酮、甘草查爾酮A和/或光甘草定的含 量，尤其能提高甘草毛狀根培養液中黃酮、甘草查爾酮A和/或光甘草定的含量5倍以 上，優選能提高10倍以上。
6.權利要求1至5之任一所述的方法在制備提高甘草總黃酮含量的甘草毛狀根和/或 提高甘草總黃酮含量的甘草毛狀根培養液的方法中的應用。
7.制備甘草總黃酮的方法，其包括(1)進行權利要求1至5之任一所述的方法，獲得甘草毛狀根；(2)干燥步驟(1)得到的甘草毛狀根，用其重量10-20倍的水于60°C-100°C提取2_8 小時，保留固體部分并將固體部分于烘箱中以30°C _60°C干燥；(3)干燥步驟⑵得到的固體部分，并用50-95%(ν/ν)乙醇于60°C -100°C提取1_2 次，洗滌提取的殘渣，合并提取液及洗滌液，保留液體部分并濃縮和/或干燥。
8.制備甘草總黃酮的方法，其包括(1)進行權利要求1至4之任一所述的方法，獲得甘草毛狀根培養液；(2)將任選經濃縮的步驟(1)得到的培養液上樣于聚酰胺層析柱，用至少兩種0 85% (ν/ν)乙醇水溶液按乙醇濃度由低到高的順序依次進行洗脫，收集用濃度不小于 60% (ν/ν)乙醇洗脫的洗脫液并濃縮和/或干燥。
9.權利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，依次用水、10 50%(ν/ν) 乙醇和60 95% (ν/ν)乙醇洗脫聚酰胺層析柱。
10.權利要求9或8所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中，依次分別用2-7倍柱 床體積的水、30% (ν/ν)乙醇、50% (ν/ν)乙醇和70% (ν/ν)乙醇洗脫聚酰胺層析柱，收 集用70% (ν/ν)乙醇洗脫的洗脫液。
11.權利要求7至10之任一所述的方法制備的甘草總黃酮，其中黃酮含量大于24%， 更優選其中黃酮含量大于60%，也優選其中還包括甘草查爾酮A和光甘草定，例如，所 述甘草總黃酮的HPLC圖譜可以如圖1、2或3的70%乙醇洗脫液的圖譜所示。
12.權利要求11所述的甘草總黃酮，其中甘草查爾酮A和光甘草定的量相較權利要求 7至9之任一所述的方法中步驟(1)得到的培養液中的甘草查爾酮A和光甘草定的量，基 本沒有減少，優選前者的量是后者的90%以上，更優選95%以上。
13.根據權利要求1-12，本發明包含一種植物毛狀根培養及經含有吐溫的誘導劑共培 養體系以提高植物黃酮類目標物合成并釋放到液體培養基中的植物黃酮類物質的生產方 法。所述方法包含但不限于甘草。
全文摘要
本發明提供了甘草毛狀根的培養方法以及利用甘草毛狀根及其培養液制備甘草總黃酮的方法，其包括將甘草毛狀根在不含吐溫的液體培養基中培養至旺盛生長期，并將得到的旺盛生長期的甘草毛狀根在含有吐溫的液體培養基中培養5天以上。通過聚酰胺層析注用不同濃度的乙醇進行洗脫，對培養液中總黃酮進行分離，甘草總黃酮的轉移率為97.23％，甘草查爾酮A的轉移率為98.14％，光甘草定的轉移率為97.54％。本發明還提供了一種由上述制備方法得到的甘草總黃酮及其醫藥應用。
文檔編號A61P39/06GK102021137SQ201010275939
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月7日 優先權日2009年9月8日
發明者劉敬梅, 李毅, 詹姆斯·周, 陳春燕, 高春春 申請人:北京未名凱拓農業生物技術有限公司, 北京未名寶生物科技有限公司