專利名稱：中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥神曲作為腸道吸收促進劑的新用途，特別是神曲在殼聚糖包覆的 溶菌酶脂質體的腸道吸收促進劑的應用。
背景技術：
溶菌酶(Lysozyme)，化學名稱為N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，又稱胞壁質酶，能切 斷N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之間的β -1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在內部滲 透壓的作用下使細胞脹裂開，具有溶解革蘭氏陽性菌細胞壁的能力，是一種堿性的粘多糖 水解酶。而且溶菌酶作為一種重要的非特異性免疫因子，在體內具有抗菌消炎、免疫調節及 加快組織修復等多種功能(Tenovuo J. ,Clinical applications of antimicrobial host proteins lactoperoxidase lysozyme and lactoferrin in xerostomia :efficacy and safety, Oral Dis.，2002，8 (1) -.23-29.) 溶菌酶作為藥物以含片、粉劑和腸溶膠囊為主，多作用于胃腸道等組織，或作為體 外用藥，其體內吸收效率低下，生物利用度也很有限。為提高溶菌酶的血藥濃度，改變口服 藥物的劑型可能克服影響溶菌酶口服吸收的各種因素。研究人員對蛋白類藥物的口服吸收給予廣泛關注，其中最普遍、有效的方法就是 將藥物微囊化處理。脂質體是一項比較成熟的藥物載體技術，能避免內容物被氧化、降解， 或被人體的酸或酶破壞，而且與細胞有一定的親和性，可增加藥物透過細胞膜的能力。作為 藥物載體，脂質體在體內具有一定的靶向性和藥物緩釋作用，能更有效并長時間的發揮藥 效。而且脂質體膜材與哺乳動物細胞相似，由磷脂等組成，不會引起局部組織損傷，不誘發 過敏反應而能多次長期使用，對人體無毒、安全。有研究發現生物黏附性的給藥系統能延長藥物在吸收部位的停留時間，有助 于藥物的吸收(Thanou M.，Verhoef J. C.，Junginger H. E.，Oral drug absorption enhancement by chitosan and its derivatives, Adv. Drug Deliv. Rev.，2001，52 117-126.)，殼聚糖是具有良好的生物相容性和較強的生物粘附性的多糖，作為藥物載體的 材料有助于藥物的吸收，其原因可能是膜上生物黏附和緊密連接的瞬間展開。因此以殼聚 糖包覆脂質體可進一步促進溶菌酶的吸收。為了更進一步促進溶菌酶的吸收，希望找到毒性小、安全性好的腸道吸收促進劑， 中藥作為我國中醫的特有藥物，可以從豐富的中藥材中篩選獲得與現有的腸道吸收促進劑 功能相同的藥物，促進溶菌酶的吸收。
發明內容
本發明的目的是提供一種中藥神曲作為殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的腸道吸收 促進劑的應用。本發明的發明目的是通過如下技術方案實現的。將中藥神曲按常規方法煎制得中藥干重0. 6g/ml的湯劑；采用薄膜法制備殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體，制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的載藥量為5. 46mg/ml，使用時， 中藥神曲與殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的體積比為15 1-5 3。所述殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體按文獻參考采用薄膜法制備，將磷脂混合物和 維生素E溶于適量無水乙醚，水浴超聲溶解。將溶液在旋轉蒸發儀上減壓蒸除有機試劑， 直至干燥脂質膜沉淀在瓶壁上，繼續抽吸IOmin后停止。加入溶菌酶溶液繼續旋轉3小 時，探針式超聲lmin，形成溶菌酶脂質體溶液。在磁力攪拌的作用下，緩慢滴加殼聚糖溶 液，10°C孵育1小時以上。選擇卵磷脂膽固醇為4 1(W/W)，溶菌酶磷脂混合物為 1 6. 25 (W/W)作為最佳制備工藝條件，制得的微球具有良好的分散性和穩定性，其平均 粒徑為(61.57士13.2)歷，包封率為81.9%，載藥量為5. 46mg/ml，溶菌酶酶活為原來的 87. 9%。中藥材——神曲(Medicated Leaven)，歸屬脾、胃經，在中醫中起健脾和胃、消食 化積的功效。本發明以殼聚糖包覆的脂質體作為蛋白類藥物溶菌酶的載體，通過實驗證明了神 曲能明顯促進口服溶菌酶的腸道吸收，提高其生物利用度，并且長期服用該藥物后使溶菌 酶在體內的停留時間延長至一周以上。本發明結果表明，小鼠僅口服溶菌酶溶液后其腸道吸收不足1 %，而小鼠連續口服 神曲與溶菌酶脂質體4天后其溶菌酶的腸道吸收高達9%，再次延長口服神曲與溶菌酶脂 質體的時間至14天后小鼠對溶菌酶的腸道吸收超過13%，而且停止給藥后9天內仍能在血 液中檢測出溶菌酶。可見神曲能大幅度促進殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的腸道吸收。
圖1溶菌酶的間接競爭ELISA法標準曲線；圖2殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的透射電鏡圖；圖3神曲對殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的腸道吸收促進作用；圖4神曲和脂質體對溶菌酶的藥效動力學影響圖(飼喂14天后停藥)。
具體實施例方式下面結合附圖1-圖4進一步說明本發明是如何實現的。實施例1.稱取神曲6g(10只小鼠用量)用常規方法煎煮至IOml液體，離心取上清，每只 小鼠口服約1.0ml每次。2.使用間接競爭ELISA法對溶菌酶的血藥濃度進行測定間接競爭ELISA法檢測步驟如下①包被0. 5 μ g/ml的溶菌酶包被酶標板，每孔加入100 μ 1，置4°C冰箱中過夜。②封閉每孔加入300 μ 1封閉液，37°C溫育2小時。③競爭每孔加入不同濃度的溶菌酶標準液50 μ 1和抗血清溶液50 μ 1，充分混合 后37°C溫育1小時。④二抗每孔加入HRP-羊抗兔IgGlOOy 1，37°C溫育1小時。⑤顯色每孔加入底物顯色液100μ 1，37°C溫育20min。
⑥終止每孔加入50 μ 1終止液。⑦檢測使用酶標儀在490nm處檢測其吸光度。間接競爭ELISA法的線性范圍為0. 1 μ g/ml-30 μ g/ml之間，回歸方程為y =-0. 0702x+0. 716，線性相關度為0. 99，標準曲線參見圖1。3.殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的制備按文獻參考采用薄膜法進行制備，并用
0.2%的殼聚糖進行孵育包覆，制得的脂質體為乳白色混懸液，透射電鏡檢測(參見圖2) 呈圓形，球體分散均勻，脂質體的粒徑在52-80nm之間，平均粒徑為(61. 57 士 13. 2)nm(n = 100)。4.神曲對殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的腸道吸收促進作用實驗組小鼠同時口服神曲湯劑20_60ml/kg和殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體 4-12ml/kg ；中藥對照組僅口服殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體8ml/kg ；實驗對照組僅口服服 神曲湯40ml/kg，連續口服4天后，根據該藥物藥效動力學曲線，選取4小時(血藥濃度最 高)眼眶取血，檢測溶菌酶的血藥濃度，結果參見圖3 實驗組的溶菌酶血藥濃度為(19. 33士5. 55) μ g/ml,是實驗對照組血藥濃度的 7. 95倍，可見溶菌酶的腸道吸收明顯增加。按小鼠總血量5ml計，經腸道吸收的溶菌酶總量 為96. 65 μ g，生物利用度最高達到9. 67%，較實驗對照組僅為1 %左右的生物利用度，有了 明顯的提高。而中藥對照組的血藥濃度為(4. 28士0.39) μ g/ml，是實驗對照組血藥濃度的
1.7倍，可見脂質體作為藥物載體在一定程度上也能促進溶菌酶的腸道吸收。5.神曲和脂質體對溶菌酶的藥效動力學影響(飼喂14天后停藥)因常規中藥湯劑以一至兩周為療程，為進一步研究神曲對溶菌酶的腸道吸收和體 內有效時間的維持，各組小鼠喂藥連續14天，停藥后4小時以及隔日取血，檢測溶菌酶的血 藥濃度，考察神曲對溶菌酶的藥效動力學影響，結果參見圖4 實驗組停藥后4小時后溶菌酶血藥濃度為(27. 50士3. 54) μ g/ml，按小鼠總血量 5ml計，經腸道吸收的溶菌酶總量為137. 5 μ g，比實施例一中實驗組的生物利用度提高了 4. 09%，可見適當延長服藥周期，可能更有利于中藥作用的發揮，可以提高溶菌酶的腸道吸 收。實驗對照組小鼠停藥24小時后血藥濃度從6. 5 μ g/ml下降為2. 25 μ g/ml，48小 時后為1. 65 μ g/ml，其后一直持續到停藥后第5天仍能在血液中檢測出微量的溶菌酶，可 見在脂質體的保護下能一定程度上延長溶菌酶的體內停留時間。而實驗組的血藥濃度在停 藥24小時后血藥濃度為13. 35 μ g/ml，48小時后仍有6. 25 μ g/ml，而且在之后的3 9天 內實驗組的血藥濃度在(4. 39 2. 43) μ g/ml之間，是原吸收最大值的15%左右，可見神曲 能進一步延長溶菌酶在體內的停留時間，并維持較平穩的血藥濃度。6.血液中溶菌酶的生物活性為驗證口服殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體后經腸道吸收的溶菌酶是否仍保持其生 物活性，以實施例二中各組小鼠停藥后4小時的血清檢測其酶活，采用溶菌酶微球菌比濁 法進行檢測，以其水解溶壁微球菌(Micrococcus luteus)的速度計算血清中溶菌酶的比 活，結果如表1所示表1各組小鼠的溶菌酶血藥濃度及比活
權利要求
中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體中的應用，其特征在于將中藥神曲按常規方法煎制得中藥干重0.6g/ml的湯劑；采用薄膜法制備殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體，制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的載藥量為5.46mg/ml，使用時，中藥神曲與殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的體積比為15∶1 5∶3。
2.根據權利要求1所述的中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體中的應用，其特征在 于優化制備工藝條件后制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的載藥量為5. 46mg/ml，溶菌 酶酶活為原來的87. 9%，平均粒徑為(61. 57士 13. 2)nm，包封率為81. 9%。
全文摘要
本發明涉及一種中藥神曲的新用途，尤其涉及一種中藥神曲在殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體中的應用。將中藥神曲按常規方法煎制得中藥干重0.6g/ml的湯劑；采用薄膜法制備殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體，制得的殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的載藥量為5.46mg/ml，使用時，中藥神曲與殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的體積比為15∶1-5∶3。神曲能明顯促進殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的口服吸收，大幅度提高殼聚糖包覆的溶菌酶脂質體的腸道吸收效率，提高溶菌酶的血藥濃度。并且溶菌酶在體內保持良好的生物活性，能較好的行使其生物學功能。本發明對中藥神曲和殼聚糖包覆的脂質體挖掘了新的醫藥用途，有很好的藥用前景。
文檔編號A61K36/00GK101933949SQ201010273320
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月3日 優先權日2010年9月3日
發明者沈彥萍, 沈文婧, 陳宇光 申請人:上海沈李科工貿有限公司