專利名稱：犬瘟熱、犬細小病毒和犬腺病毒i型三聯活疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明涉及獸用三聯活疫苗，尤其涉及犬瘟熱、犬細小病毒和犬腺病毒I型三聯 活疫苗及其制備方法，屬于獸用三聯活疫苗領域。
背景技術：
犬瘟熱、犬細小病毒和犬腺病毒是當前對我國養犬業危害嚴重的3種病毒性傳染 病。犬瘟熱是一種犬類等動物的急性傳染病，幼齡動物多為急性、致死性經過，成年動 物可呈慢性持續性感染，臨診以雙相熱型、粘膜卡他、中樞神經癥狀及足墊腫脹為主要特 征。該病自1926年被發現以來幾乎呈世界性分布，是當前對我國養犬業、毛皮動物養殖業 和野生動物保護業危害最大的疾病之一，經常引起大批犬、貂、狐等動物發病，經濟損失慘 重。近年來，包括大熊貓、小熊貓以及獅、虎、豹等食肉目所有8個科、偶蹄目豬科、靈長目的 稱猴屬和鰭足目海豹科等多種動物均有CD自然發病的報道，甚至人也有CDV感染的病例， 并且CDV自然感染的動物范圍還有不斷擴大的趨勢，其危害也越來越大(蔡寶祥.家畜傳 染病學(第三版)·北京中國農業出版社.2001,347-351.)。犬細小病毒于1978年首次被發現后(AppelM J, Scott Fff, CarmichaelL E.Isolation and immunization studies of a canine parco-like virus from dogs with haemorrhagic enteritis. Vet Rec，1979，105 (8) : 156-159.)，本病流行于世界各地， 我國于1982年證實存在犬細小病毒感染(梁士哲，渠川玫，魏喜仁，等.犬傳染性腸炎的研 究I-腹瀉犬糞便中檢出的細小病毒顆粒.上海畜牧獸醫通迅，1982，2 (4) :172.)，次年徐 漢坤等正式報道了本病的流行(徐漢坤，郭保發，金淮，等.血凝和血凝抑制試驗在犬群暴 發犬細小病毒腸炎中的應.中國畜禽傳染病，1983 (4) :43-45.)。犬細小病毒是引起犬急 性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎的病原(A fshar A. . Canine Parvovirus infection-a review. Vet Bull，1981，51 :605_612.)，主要危害幼犬，特別是2 6月齡犬。該病發病急， 病程短，死亡率高，傳染性強，對實驗犬，軍犬，警犬等犬群以及寵物犬均具有很大的危險 性。I型犬腺病毒于1925年首次被發現。1984年，在我國首次分離到該病毒，證實了 我國犬中也有犬腺病毒I型的感染(殷震，劉景華.動物病毒學(第二版).北京科學出 版社，1997,757-762.). I型犬腺病毒在臨床上可導致犬傳染性肝炎(Webe J. DNA vaccine. BusinessWeek, 1996, 2 6.)、狐貍和熊腦炎的發生(夏咸柱，范泉水，扈榮良，等.II型犬 腺病毒自然弱毒YCA18株的實驗免疫研究.中國獸藥雜志，2001，35 (2) :1_4)。國外為預防與控制這幾種傳染病，已研制出多種商品用單苗與聯苗；國內已有解 放軍農牧大學犬用五聯苗(狂犬病、犬瘟熱、犬副流感、犬腺病毒2型病和細小病毒病)研 制成功的報道。聯苗是指不同種微生物或其代謝產物組成的疫苗，聯苗的使用劑量與單苗相當，
3但其效力與單苗相同，而且聯苗可簡化接種程序，減少接種動物應急反應的次數，達到一針 多防的目的。本發明在犬瘟熱單苗研究基礎上，先后又分離獲得犬細小病毒、犬腺病毒I型 病毒株，并進行了犬瘟熱、犬細小病毒病及犬腺病毒病I型三聯活疫苗的研制。
發明內容
本發明目的之一是提供一種犬瘟熱、犬細小病毒和犬腺病毒I型三聯活疫苗；本發明目的之二是提供一種制備上述犬瘟熱、犬細小病毒和犬腺病毒I型三聯活 疫苗的方法；本發明目的是通過以下技術方案來實現的一種犬癌熱(Canine distemper virus)、犬細小病毒(Canine parvovirus)禾口 I 型犬腺病毒(Canine adenovirus)三聯弱毒活疫苗，包括微生物保藏號是CGMCC No. 3810 的犬瘟熱弱毒疫苗株，微生物保藏號是CGMCC No. 3841的犬細小病毒弱毒疫苗株和微生物 保藏號是CGMCC No. 3809的I型犬腺病毒弱毒疫苗株。優選的，所述犬瘟熱弱毒疫苗株，犬細小病毒弱毒疫苗株或I型犬腺病毒弱毒疫 苗株的毒價彡IO4-5TCID50/頭份。本發明犬瘟熱病毒弱毒株(CDV-YBR)的培育將分離的犬瘟熱病毒(CDV-YB株) 通過連續接種雞胚成纖維細胞(CEF)傳代至70代，之后轉在Vero細胞上傳20代，然后繼 續在雞胚成纖維細胞(CEF)上傳至105代。在傳代過程中，病毒的滴度逐漸提高，毒株越來 越適應CEF和Vero細胞。但病毒對犬的致病力隨著傳代次數的增加而逐漸減低；通過形態 學鑒定、純凈性檢驗、病毒的特異性和外源病毒檢驗等試驗，結果驗證了培育的CDV-YB弱 毒株(CDV-YBR)具有典型的副粘病毒粒子特征，純凈無外源病毒污染。本發明將所分離的犬瘟熱病毒弱毒株(CDV-YBR)提交專利認可機構保藏，其微生 物保藏號是=CGMCC No. 3810 ；分類命名為犬瘟熱病毒；保藏時間是2010年5月14日；保 藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區北 辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。將本發明分離的犬細小病毒(CPV-YN株)通過連續同步接種CRH(細胞傳代至110 代，在傳代過程中，病毒的滴度逐漸提高，毒株越來越適應CRH(細胞。與之相反，病毒對犬 的致病力隨著傳代次數的增加而逐漸減低；通過形態學鑒定、純粹性檢驗、病毒的特異性和 外源病毒檢驗等試驗結果驗證了培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的細小病毒粒 子特征，純凈無外源病毒污染。本發明將所分離的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)提交專利認可 的機構保藏，其微生物保藏號是=CGMCC No. 3841 ；分類命名為犬細小病毒；保藏時間是 2010年5月14日；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地 址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。本發明I型犬腺病毒弱毒株CAV-HR的培育將上述分離的犬腺病毒(CAV-H株) 通過連續接種MDCK細胞傳代至120代，在傳代過程中，病毒的滴度逐漸提高，毒株越來越適 應MDCK細胞。與之相反，病毒對犬的致病力隨著傳代次數的增加而逐漸減低；通過形態學 鑒定、純粹性檢驗、病毒的特異性和外源病毒檢驗等試驗結果驗證了培育的CAV-H弱毒株 (命名為CAV-HR)具有典型的腺病毒粒子特征，純凈無外源病毒污染。本發明將所分離的CAV-H弱毒株(命名為CAV-HR)提交專利認可的機構保藏，其微生物保藏號是=CGMCC No. 3809 ；分類命名為犬腺病毒；保藏時間是2010年5月14日； 保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。本發明的另一目的是提供一種制備上述犬瘟熱(Canine distemper virus)、犬細 小病毒(Canine parvovirus)禾口 I型犬腺病毒(Canine adenovirus)三聯弱毒活疫苗的方 法，包括(1)分別培養微生物保藏號是CGMCC No. 3810的犬瘟熱弱毒疫苗株，微生物保藏 號是CGMCC No. 3841的犬細小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏號是CGMCC No. 3809的I型犬 腺病毒弱毒疫苗株，得到病毒液；(2)對病毒液進行病毒滴定，混合，過濾，加入凍干保護劑，凍干，即得。其中，所述犬瘟熱弱毒疫苗株的培養包括選擇經無菌，支原體檢測陰性的生長良 好的CEF單層，倒去培養液后，換以含2%毒種的細胞維持液，調整pH值7. 2 7. 4，置33°C 培養；當CPE達到70%時收獲。所述犬細小病毒弱毒疫苗株的培養包括將毒種按細胞維持液量的3%同步接種 于經無菌，支原體檢測陰性的生長良好的CRH(單層，調整pH值為7. 2 7. 4，置37°C培養； 待70%細胞出現CPE即可收獲。所述犬腺病毒I型弱毒疫苗株的培養包括選擇經無菌，支原體檢測陰性的生長 良好的MDCK單層，倒去培養液后，換以含2%毒種的細胞維持液，調整pH值7. 2 7. 4 ；置 37°C培養；當CPE達到70%時收獲。所述的凍干保護劑的配制包括(1)明膠8g ；蔗糖40g ；無離子水100ml ；調整 PH 值為 6. 8 7. 0 ； (2) 116°C滅菌 40min,即得。上述制備方法中，優選的，將病毒液與凍干保護劑按9 1的比例進行混合。本發明采用分離自中國病犬的野毒并經過馴化致弱的犬瘟熱病毒、犬細小病毒和 犬腺病毒I型為對象，一起配制三聯苗，并加入凍干保護劑制成。該三聯苗安全性可靠、免 疫效果好、且針對性強，適合中國病犬疾病的預防，可用于預防犬瘟熱、犬細小病毒、犬傳染 性肝炎三種傳染病；制苗工藝科學，程序可操作性強，經濟效益可觀，適于工業化生產。本發明將所制備的犬瘟熱、細小病毒病、腺病毒病三聯活疫苗分別免疫2 4月齡 犬15只，21天后分別攻擊CDV-YB、CPV-YN、CAV-H強毒，劑量均為200TCID5(1/犬。結果表 明，5批次疫苗對三種病的保護率均達到4/5，對照犬均5/5發病。因此，本發明三聯活疫苗 疫苗對預防犬瘟熱、細小病毒病、腺病毒病能起到很好的效果。
圖1⑶V-YB 105代病毒粒子電鏡照片。圖2CPV-YN 90代病毒粒子電鏡照片。圖3CAV-H 110代病毒粒子電鏡照片。圖4本發明三聯活疫苗的生產工藝路線圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術
5人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1生產用毒種的準備1. 1犬瘟熱病毒(⑶V-YB)分離株的致弱將分離的犬瘟熱病毒(⑶V-YB株)通過連續接種雞胚成纖維細胞(CEF)傳代至70 代，之后轉在Vero細胞上傳20代，然后繼續在雞胚成纖維細胞(CEF)上傳至105代。在傳 代過程中，病毒的滴度逐漸提高，毒株越來越適應CEF和Vero細胞。但病毒對犬的致病力隨 著傳代次數的增加而逐漸減低；通過形態學鑒定、純凈性檢驗、病毒的特異性和外源病毒檢 驗等試驗，結果驗證了培育的CDV-YB弱毒株(CDV-YBR)具有典型的副粘病毒粒子特征(見 圖1)，純凈無外源病毒污染；從免疫效力試驗結果可以看出，CDV-YBR株對同源強毒攻擊的 犬可以提供很好的保護力。1. 2犬細小病毒CPV-YN)分離株的致弱將分離的犬細小病毒(CPV-YN株)通過連續同步接種CRFK細胞傳代至110代，在 傳代過程中，病毒的滴度逐漸提高，毒株越來越適應CRFK細胞。與之相反，病毒對犬的致病 力隨著傳代次數的增加而逐漸減低；通過形態學鑒定、純粹性檢驗、病毒的特異性和外源病 毒檢驗等試驗結果驗證了培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的細小病毒粒子特征 (見圖2)，純凈無外源病毒污染；從免疫效力試驗結果可以看出，CPV-YNR株對同源強毒攻 擊的犬可以提供很好的保護力。1. 3犬腺病毒I型(CAV-H)分離株的致弱將分離的犬腺病毒(CAV-H株)通過連續接種MDCK細胞傳代至120代，在傳代過 程中，病毒的滴度逐漸提高，毒株越來越適應MDCK細胞。與之相反，病毒對犬的致病力隨著 傳代次數的增加而逐漸減低；通過形態學鑒定、純粹性檢驗、病毒的特異性和外源病毒檢驗 等試驗結果驗證了培育的CAV-H弱毒株(命名為CAV-HR)具有典型的腺病毒粒子特征(見 圖3)，純凈無外源病毒污染；從免疫效力試驗結果可以看出，致弱的CAV-HR株對同源強毒 攻擊的犬可以提供很好的保護力。實施例2制苗用病毒液準備2. 1⑶V-YBR細胞毒液的制備選擇生長良好的CEF單層，倒去培養液后，換以含2%毒種的細胞維持液，調整pH 值7. 2 7. 4。置33°C培養。每日觀察細胞，發現生長異常或污染的細胞應立即廢棄。當 CPE達到70%時收獲，置-20°C保存。2. 2CPV-YNR細胞毒液的制備在CRFK傳代的同時，按生長液的3%接種CPV-YNR毒種，調整pH值7. 2 7. 4，置 37°C培養。每日觀察細胞，發現生長異常或污染的細胞應立即廢棄。當CPE達到70%時收 獲，置-20°C保存。2. 3CAV-HR細胞毒液的制備選擇生長良好的MDCK單層，換以含2%毒種的細胞維持液。調整pH值7. 2 7. 4， 置37°C培養。每日觀察細胞，發現生長異常或污染的細胞應立即廢棄。當CPE達到70%時 收獲，置-20°C保存。實施例3犬瘟熱、細小病毒、腺病毒I型三聯活疫苗的制備
將實施例2所制備的不同含量的病毒液與穩定劑按9 1的體積比例加入凍干 保護劑凍干后，充分搖勻后，定量分裝于滅菌疫苗瓶中，分裝結束后，立即移入凍干機內，先 置-36°C以下預凍3-4小時，然后開泵升華16-18小時，當溫度升到26_27°C時維持4_5小 時后閉泵，抽空，并在真空狀態下自動加塞、壓蓋，完成凍干。試驗例1犬瘟熱病毒、細小病毒和腺病毒病三聯活疫苗免疫效力試驗1材料和方法1. 1試驗用疫苗犬瘟熱病、細小病毒病、腺病毒病三聯活疫苗；按照實施例1-3的 制備方法制備成5批，批號為9701、9702、9703、9704、9705。1. 2實驗動物2 4月齡健康犬，其⑶V、CPV、CAV血清中和抗體均彡1 2。1. 3 攻擊用強毒 CDV-YB (8 代)、CPV-YN (7 代)、CAV-H (8 代)。1. 4試驗方法每批疫苗用注射用水稀釋，肌肉接種2 4月齡犬15只，1頭份/犬。 21天后15只犬分為3組，每組5只，每組犬攻擊一種強毒，劑量為200TCID5(i/犬。同時每 組設對照犬5只(注射生理鹽水Iml)。各組犬均隔離飼養，觀察21天，記錄各組犬的發病 及死亡情況。2 結果2. 1⑶V攻毒保護結果以5批疫苗對2 4月齡犬進行免疫，免疫后21天，以 200TCID50/犬劑量的CDV-YB強毒進行攻擊，9701批疫苗免疫犬的保護率為4/5，其他批次 的保護率均為5/5，對照組5/5發病，發病犬中有2只在4天后死亡。結果見表1。表1⑶V攻毒保護結果 2. 2CPV攻毒保護結果對以5批疫苗對2 4月齡犬進行免疫，1頭份/犬，免疫后 21天，以200TCID5(1/犬劑量的CPV-YN強毒進行攻擊，9702、9704批疫苗免疫犬的保護率為 4/5，其他批次均為5/5，對照組5/5發病，有1只犬死亡，結果見表2。表2 CPV攻毒保護結果
對照5Iml鹽水5/51/5—2. 3CAV攻毒保護結果對以5批疫苗對2 4月齡犬進行免疫，1頭份/犬，免疫后 21天，以200TCID5(i/犬劑量的CAV-H強毒進行攻擊，9701批疫苗免疫犬的保護率為4/5，其 他批次均為5/5，對照組5/5發病，發病犬中有2只犬在4-5天相機死亡。結果見表3。表3 CAV攻毒保護結果 3試驗結論本發明犬瘟熱、細小病毒病、腺病毒病三聯活疫苗對犬瘟熱、細小病毒 病、腺病毒病的保護率均達到4/5，具有很好的保護效果。
權利要求
一種犬瘟熱(Canine distemper virus)、犬細小病毒(Canine parvovirus)和I型犬腺病毒(Canine adenovirus)三聯弱毒活疫苗，包括微生物保藏號是CGMCC No.3810的犬瘟熱弱毒疫苗株，微生物保藏號是CGMCCNo.3841的犬細小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏號是CGMCC No.3809的I型犬腺病毒弱毒疫苗株。
2.按照權利要求1所述的三聯弱毒活疫苗，其特征在于所述犬瘟熱弱毒疫苗株，犬細 小病毒弱毒疫苗株或I型犬腺病毒弱毒疫苗株的毒價> IO4-5TCID50/頭份。
3.權利要求1所述犬瘟熱、犬細小病毒和犬腺病毒I型病毒三聯弱毒活疫苗的制備方 法，包括(1)分別培養微生物保藏號是CGMCC No. 3810的犬瘟熱弱毒疫苗株，微生物保藏 號是CGMCC No. 3841的犬細小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏號是CGMCC No. 3809的I型 犬腺病毒弱毒疫苗株，得到病毒液；(2)對病毒液進行病毒滴定，混合，過濾，加入凍干保護 劑，凍干，即得。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述犬瘟熱弱毒疫苗株的培養包括 選擇經無菌，支原體檢測陰性的生長良好的CEF單層，倒去培養液后，換以含2%毒種的細 胞維持液，調整pH值7. 2 7. 4，置33°C培養；當CPE達到70%時收獲。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述犬細小病毒弱毒疫苗株的培 養包括將毒種按細胞維持液量的3%同步接種于經無菌，支原體檢測陰性的生長良好的 CRFK單層，調整pH值為7. 2 7.4，置371培養；待70%細胞出現CPE即可收獲。
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于犬腺病毒I型弱毒疫苗株的培養包 括選擇經無菌，支原體檢測陰性的生長良好的MDCK單層，倒去培養液后，換以含2%毒種 的細胞維持液，調整pH值7. 2 7. 4 ；置37°C培養；當CPE達到70%時收獲。
7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的凍干保護劑的配制包括(1) 明膠:8g ；蔗糖40g;無離子水=IOOml ；調整pH值為6. 8 7. 0 ； (2) 116°C滅菌40min，即得。
8.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于將病毒液與凍干保護劑按9 1的 體積比例進行混合。
全文摘要
本發明公開了犬瘟熱、犬細小病毒和犬腺病毒I型三聯活疫苗及其制備方法。該三聯活疫苗包括微生物保藏號是CGMCC No.3810的犬瘟熱弱毒疫苗株，微生物保藏號是CGMCC No.3841的犬細小病毒弱毒疫苗株和微生物保藏號是CGMCC No.3809的I型犬腺病毒弱毒疫苗株。本發明采用分離自中國病犬的野毒并經過馴化致弱的犬瘟熱病毒、犬細小病毒和犬腺病毒I型為對象，一起配制三聯苗，并加入凍干保護劑制成。該三聯活疫苗安全性可靠、免疫效果好、針對性強，適合中國病犬疾病的預防，可用于預防犬瘟熱、犬細小病毒、犬傳染性肝炎三種傳染病。
文檔編號A61K39/295GK101905021SQ20101024496
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月30日 優先權日2010年7月30日
發明者劉大飛, 劉立奎, 張洪英, 曲聯東, 王牟平 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所