專利名稱：犬細小病毒弱毒疫苗株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株病毒弱毒疫苗株，尤其涉及一株由犬細小病毒強毒株CPV-YN傳 代致弱的弱毒疫苗株CPV-YNR，本發明還涉及該弱毒疫苗株在制備預防或治療由犬細小病 毒所致疾病的藥物中的用途，屬于犬細小病毒的防制領域。
背景技術：
犬細小病毒于1978 年首次被發現(AppelM J, Scott Fff, CarmichaelL E.Isolation and immunization studies of a canine parco-like virus from dogs withhaemorrhagic enteritis. Vet Rec，1979，105 (8) : 156-159.)，此后本病流行于世界各 地，我國于1982年證實存在犬細小病毒感染(梁士哲，渠川玫，魏喜仁，等.犬傳染性腸炎 的研究I-腹瀉犬糞便中檢出的細小病毒顆粒.上海畜牧獸醫通迅，1982，2 (4) :172.)，次年 徐漢坤等正式報道了本病的流行(徐漢坤，郭保發，金淮，等.血凝和血凝抑制試驗在犬群 暴發犬細小病毒腸炎中的應.中國畜禽傳染病，1983(4) :43-45.)。犬細小病毒是引起犬急 性出血性胃腸炎和幼犬急性心肌炎的病原(A fshar A. . Canine Parvovirus infection-a review. Vet Bull，1981，51 :605_612.)，主要危害幼犬，特別是2 6月齡犬。該病發病急， 病程短，死亡率高，傳染性強，對實驗犬，軍犬，警犬等犬群以及寵物犬均具有很大的危險 性。國外為預防與控制該病，已研制出多種商品用單苗與聯苗；國內已有犬用五聯苗 (狂犬病、犬瘟熱、犬副流感、犬腺病毒2型病和細小病毒病)、犬用三聯苗(犬瘟熱、狂犬病 和犬細小病毒)研制成功的報道。哈爾濱獸醫研究所也研制成功犬瘟熱單苗。但目前以 上疫苗存在造價昂貴，抗原針對性不強等缺點，因此開發一種新型高效的⑶疫苗已迫在眉睫。
發明內容
本發明目的之一是提供一株由犬細小病毒強毒株傳代致弱的弱毒疫苗株。本發明目的之二是將上述弱毒疫苗株應用于預防或治療由犬細小病毒所致的各 種疾病。本發明目的是通過以下技術方案來實現的犬細小病毒強毒株的分離與鑒定2002年冬季哈爾濱市道外區某養殖場的犬群 暴發流行病，患病犬表現為嘔吐，腹瀉，糞便呈紅色膠凍狀或水樣，病死率較高。剖檢可見腸 管膨大，腸壁上充血或出血，腸道內充滿著膠凍狀內容物或血水，4 6周齡幼犬剖檢后可 見心室擴張，懷疑為犬細小病毒感染引起的出血性腸炎和心肌炎。通過CRH(細胞分離病 毒，對分離毒進行形態學觀察，血凝、血凝抑制、特異性鑒定、動物回歸試驗及生物學鑒定， 證明分離的病毒為犬細小病毒，命名為CPV-YN株。本發明犬細小病毒弱毒株CDV-YBR的培育將本發明分離的犬細小病毒(CPV-YN 株)通過連續同步接種CRH(細胞傳代至110代，在傳代過程中，病毒的滴度逐漸提高，毒株越來越適應CRFK細胞。與之相反，病毒對犬的致病力隨著傳代次數的增加而逐漸減 低；通過形態學鑒定、純粹性檢驗、病毒的特異性和外源病毒檢驗等試驗結果驗證了培育 的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的細小病毒粒子特征，純凈無外源病毒污染。本發 明將所分離的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)提交專利認可的機構保藏，其微生物保藏號是 CGMCCNo. 3841 ；分類命名為犬細小病毒；保藏時間是2010年5月14日；保藏單位是中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所。本發明將所分離的犬細小病毒強毒株CPV-YN通過在CRFK細胞上傳代，培育了 CPV-YN致弱毒株(CPV-YNR)，致弱評價試驗證明了致弱毒株培育成功。通過對致弱毒株病 毒的形態學觀察、純凈性檢驗、病毒的特異性和外源病毒檢驗等試驗結果驗證了本發明所 培育的CPV-YN弱毒株(CPV-YNR)具有典型的細小病毒粒子特征，純凈無外源病毒污染。免 疫效力試驗結果表明，本發明犬細小病毒弱毒疫苗株(CPV-YNR)對同源強毒攻擊的犬可以 提供很好的保護力。安全性和免疫原性試驗結果表明，本發明弱毒疫苗株CPV-YNR株對同 源強毒攻擊的犬可以提供很好的保護力。由此可見，CPV-YNR株具有良好的免疫原性，本發 明弱毒疫苗株CPV-YNR可制備成單苗或聯苗(活疫苗或滅活疫苗)，可有效預防或治療犬瘟 熱。本發明弱毒疫苗株CPV-YNR遺傳性穩定，有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期長等優 點ο
圖1本發明將所分離的犬細小病毒強毒株CPV-YN的病毒電鏡照片。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1犬細小病毒強毒分離株(CPV-YN)的分離鑒定1材料和方法1.1 材料1. 1. 1病料哈爾濱市道外區誼農綜合養殖場的發病死亡犬。1. 1. 2細胞CRFK(65 95代下同)，購自中國獸醫藥品監察所，按常規方法培養。1.1. 3試驗動物選用2 4月齡幼犬(CPV抗體效價彡1 2)，購自哈爾濱醫科大 學實驗動物學部，經驅蟲和1周觀察后，確定健康備用。1. 1. 4血清CPV標準陽性血清(抗體效價彡1 16), CPV陰性血清，由哈爾濱獸 醫研究所提供。1.2分離方法1. 2. 1病毒的分離5份 患病犬帶血糞便病料用MEM細胞營養液制成1 9的懸液， 混勻，5000r/min離心lOmin，取上清，0. 22 μ m微孔濾膜過濾，置_20°C保存。1. 2. 2病毒的培養處理的樣品按培養液體積同步接種CRFK細胞(購自中國獸醫藥品監察所)，37°C靜止培養，同時設正常細胞對照。每天觀察細胞貼壁生長情況和細胞病 變，若無CPE，則于培養的第4 5天收取上清，細胞繼續按常規傳代培養，至第5代仍無病 變視為陰性，出現細胞病變的經-20°C凍融3次后收毒，置-20°C保存。1.2. 3病毒的鑒定
1. 2. 3. 1 電鏡觀察取培養72h的CPV第五代細胞培養液作負染色，電鏡觀察病毒形態。1.2. 3.2耐酸性試驗取CPV第5代細胞培養物，調pH至3.0，于37°C下作用2h后，與pH為7. 2的細胞 培養物同時分別接種CRFK，在37°C培養96h，收獲后測定其病毒含量，觀察該培養物抗酸能 力。1.2. 3.3耐熱性試驗取CPV的第5代細胞培養物，置56°C水浴中作用不同時間，取出后分別接種CRH(， 37°C培養96h，收獲后測定其病毒含量，觀察該培養物耐熱能力。1.2. 3. 4耐乙醚試驗取CPV的第5代細胞培養物，加乙醚至20%，在4°C作用24h后取出，去掉乙醚，接 種CRFK，37°C培養96h，觀察該培養物對乙醚的耐受能力。1.2. 3. 5核酸型鑒定將加有5-溴脫氧尿苷(BUDR)的CPV第5代細胞培養物，接種CRFK，37°C培養96h， 收獲后測定其病毒含量，觀察兩組病毒增殖情況，確定病毒核酸的類型。1. 2. 3. 6 血凝(HA)試驗取CPV毒株第5代細胞培養物用1 %豬紅細胞(RBC)進行HA試驗。1. 2. 3. 7病毒含量測定將CPV的第5代細胞培養物作10倍系列稀釋，取10_6、10_5、10_4三個稀釋度，分別 接于6瓶CRFK懸液內，每瓶Iml。于37°C培養96h，觀察CPE，按Reed-Muench法計算其病
毒含量。1. 2. 3. 8特異性測定將CPV第5代毒用MEM液稀釋成IOOTCID5ci，與等量抗犬細小病毒特異性血清混合， 置37°C水浴中和Ih后，同步接種CRFK，每瓶lml，觀察5d，逐日記錄CPE。同時設CPV 5代 毒同步接種CRH(對照。1.2. 3.9動物感染試驗將6只2 4月齡犬隨機分成2組，對照組2只，實驗組4只，試驗組動物口服分 離細胞培養病毒1ml，對照組犬口服細胞培養液lmL，每天觀察臨床表現，每天測體溫2次， 觀察14d，并對死亡犬觀察剖檢變化。2實驗結果2. ICPV分離與培養接種第5代病毒的細胞，在72h左右開始出現腫脹、圓縮、凝聚成團，并在細胞核 內形成圓形和橢圓形嗜酸性、大小不等的包涵體等規律性細胞病變，該分離病毒命名為 CPV-YN 株。2.2CPV毒株的鑒定
2. 2. 1電鏡觀察在培養72h的病毒培養物負染電鏡標本中，可見到多數為空芯，少數為實芯、直徑 為20nm、呈圓形的細小病毒粒子，見圖1。2. 2. 2耐熱性試驗CPV-YN第5代細胞培養物經56°C處理30min和60min，TCID50基本無變化，說明分 離的病毒具有耐熱性。
2. 2. 3耐酸性試驗CPV-YN5培養物經pH3. 0處理，TCID5q為IO5_7/0. Iml與對照無明顯差別，說明分離 的CPV-YN對pH3. 0有一定的抵抗力。2. 2. 4耐乙醚試驗經乙醚處理的試驗組與未處理的對照組的TCID5tl無明顯差別，說明該分離毒對 20%乙醚具有一定耐受力。2. 2. 5核酸型鑒定CPV-YN5經BUDR處理后，病毒含量為102 9TCID5(1/lml，說明BUDR使病毒增殖受到 了明顯抑制，表明該分離病毒是DNA病毒。2. 2. 6HA試驗CPV-YN5細胞培養物的HA效價為1 256。2. 2. 7病毒含量測定測定第5代病毒培養物的病毒含量，其結果為106_OTCID5tlA). 1ml。2. 2. 8病毒特異性試驗中和后的CPV-YN第5代培養物接種CRFK，觀察5d，細胞無CPE，對照組在90 120h出現典型的CPE。2. 2. 9動物感染試驗用細胞分離病毒液感染健康犬6d后，試驗組4只幼犬有2只先后發病。2只臨床 表現為精神不振、食欲減退、嘔吐，發熱，次日發病幼犬精神高度沉郁，食欲廢絕，劇烈嘔吐、 腹瀉，排出暗紅色、有強烈腥臭味的糞便，嚴重脫水，體溫稍高，第7d死亡1只。剖檢病死幼 犬發現；腸道粘膜出血、脫落，心臟腫大、發炎，其他器官無特征性變化。對照組2只幼犬臨 床上無任何異常。3實驗小結3. 1對分離毒的培養和電鏡觀察表明，CPV-YN株同步接種CRFK，CPE出現比較規 律，即接毒后72h，細胞開始圓縮、凝集成團；在電鏡下，分離毒為散在實芯和空芯、直徑為 20nm、圓形、無囊膜的顆粒，通過動物回歸試驗也證明了分離的是CPV。3. 2分離毒能凝集豬紅細胞與CPV標準陽性血清呈特異性結合反應。分離毒有耐 酸(pH3.0)、耐熱(56°C 60min)與抗乙醚的理化學特性。3. 3對爆發流行的犬細小病毒用CRH(傳代表明，不同代次的分離毒，其CPE出現時 間比較規律，毒價較高也比較穩定，說明分離毒株用CRFK傳代，穩定性良好且毒力較強。實施例2犬細小病毒弱毒疫苗株CPV-YNR的培育1. 1試驗材料試驗動物為2 4月齡的健康犬(CPV抗體效價< 1 2)；抗犬細小病毒特異性 血清、0. 2%紅細胞懸液由本實驗室制備，強毒為實施例1所分離的的CPV-YN 6代。
1. 2CPV-YN弱毒株的培育與鑒定1. 2. ICPV-YN弱毒株的培育通過CRFK細胞傳代CPV-YN至110代。1. 2. 2CPV-YN弱毒株的形態學觀察將收獲的CPV-YN 5、10、20、30、50、70、90、100、105、110 代次病毒細胞培養 物5000r/min離心30min，取上清經20000rpm超速離心，4 °C離心2h，沉淀用適量的 PBS(pH7. 0)懸浮，磷鎢酸負染電鏡觀察。1. 2. 3CPV-YN的純靜性檢驗取CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒，按現行《中華人民共和
國獸藥典》附錄進行，應無細菌、霉菌和支原體污染。1. 2. 4病毒含量測定取病毒的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代培養物，分別做10倍遞進稀釋
后，各取10_4、10_5、10_6、10_7四個稀釋度，同步接種0^細胞。每個稀釋度接種4瓶，每瓶 Iml。觀察5d，記錄各稀釋度病變細胞瓶數，按照Reed-Muench法計算TCID5(1。1.2. 5病毒的特異性檢驗分別取CPV-YN 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105、110 代次毒，用 MEM 液稀釋 成100TCID5(1/0. 1ml，與等量抗犬細小病毒特異性血清混合，置37°C水浴中和lh，同步接種 CRFK，每瓶lml。觀察5d，逐日記錄CPE。同時設不中和的病毒對照組2瓶。1. 2. 6外源病毒檢驗1. 2. 6. 1致細胞病變外源病毒的檢驗分別取CPV-YN 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105 代次毒，將 CPV-YN 用 MEM 液稀 釋成100TCID5(1/0. 1ml，與等量抗犬細小病毒特異性血清混合，置37°C水浴中和lh，取2個 方瓶(IOml容量)的CRH(細胞，接種中和后的病毒液lml，在37°C下吸附lh，觀察5-7d，檢 查是否出現由接種物引起的CPE，同時設未中和的病毒接種細胞2瓶為對照。1. 2. 6. 2致紅細胞吸附的外源病毒檢驗將上述接種中和病毒的細胞培養瓶，用PBS洗滌細胞單層3次，加入0. 2%紅細胞 懸液，在4°C培養30min，用PBS洗滌，檢查紅細胞吸附情況。1. 2. 7CPV-YNR株致弱評價試驗55只2 4月齡犬隨機分成11組，每組5只，1 10組犬分別用CPV-YN的5、10、 20、30、50、70、90、100、105、110 代次毒接種，各代次病毒稀釋為 IO5.5TCID50/lml, lml/犬。觀 察21d，記錄臨床癥狀和發病數，設對照5只犬，并接種相同劑量的滅菌生理鹽水。1. 2. 8CPV-YNR株免疫效力初步評價20只2 4月齡犬隨機分成A組、 組、C組和D組，A組、B組和C組均5只，D組5 只作為對照，A、B、C組犬分別用CPV-YN的90、105、110代次毒接種，接種劑量為IO4 tlTCID5ci/ 犬，D組接種滅菌生理鹽水lml。21d后，4組犬皮下攻擊同源強毒，劑量為200TCID5Q/犬。 攻毒后觀察21d，記錄臨床保護數。2 結果2. ICPV-YN弱毒株的培育及形態學觀察將CPV-YN的5、10、20、30、50、70、90、100、105、110代次毒細胞培養物負染電鏡標
本中，可見到多數為空芯，少數為實芯、直徑為20nm、呈圓形的病毒顆粒，未觀察到其它病毒的存在。2. 2CPV-YN的純凈性檢驗細菌、霉菌與支原體檢驗按現行《中華人民共和國獸藥 典》附錄所述方法進行，無細菌、霉菌及支原體生長。2. 3 病毒含量測定 CPV-YN 的 5、10、20、30、50、70、90、100、105、110 代次毒的病毒含量。2. 4病毒的特異性檢驗CPV-YN的各代毒中和后接種CRFK，觀察5d，細胞均無CPE ； 對照組2瓶細胞在90 120h出現典型的CPE。2. 5外源病毒檢驗2. 5. 1用細胞檢驗結果各代次病毒中和后接種CRFK細胞，經觀察均無CPE產生，對照組細胞出現明顯的 CPE。2. 5. 1紅細胞吸附試驗各代次病毒均不能凝集雞外周血紅細胞，說明病毒液中不含能使雞外周血紅細胞 凝集的其它病毒。2. 6CPV-YNR株致弱評價試驗CPV-YN毒株經CRFK傳代后對犬的致病力逐漸減弱。CPV-YN第5和第10代次毒對 犬的致病力均為100%，但死亡率開始出現下降，發病犬出現體溫升高平均在41°C左右、鼻 流清液、排稀便等臨床癥狀；CPV-YN第20、30、50代次毒對犬的致病力由80%下降到20%， 從50代開始感染犬不出現死亡。從80代開始到110代CPV-YN對犬的發病率和死亡率都 降到0。對照犬均正常，見表2。2.7CPV-YNR株免疫效力初步評價免疫組(A、B、C組)犬在接種后21天，皮下攻同源強毒，觀察21天無發病現象，也 無死亡發生。而對照組(D組)犬則有100%發病，死亡率為40%。發病犬表現為體溫升高 平均在40。C左右、嘔吐、排番茄汁樣便等臨床癥狀，詳見表1。表ICPV-YNR株免疫效力試驗
權利要求
一株由犬細小病毒(Canine parvovirus)強毒株CPV YN傳代致弱所得到的弱毒疫苗株，其特征在于，其微生物保藏號是CGMCC No.3841。
2.權利要求1所述的犬細小病毒弱毒疫苗株在制備預防或治療由犬細小病毒所致疾 病藥物中的用途。
3.按照權利要求2所述的用途，其特征在于所述的由犬細小病毒所致疾病包括犬急 性出血性胃腸炎或幼犬急性心肌炎。
4.一種預防或治療由犬細小病毒所致疾病的疫苗組合物，其特征在于由權利要求1 所述的有效量的犬細小病毒弱毒疫苗株和藥學上可接受的載體或輔料組成。
5.按照權利要求4所述的疫苗組合物，其特征在于所述的由犬細小病毒所致疾病包 括犬急性出血性胃腸炎或幼犬急性心肌炎。
全文摘要
本發明公開了犬細小病毒弱毒疫苗株及其應用。本發明將所分離的犬細小病毒強毒株通過細胞上傳代，培育了犬細小病毒弱毒疫苗株，其微生物保藏號是CGMCC No.3841。安全性和免疫原性試驗結果表明，本發明弱毒疫苗株CPV-YNR株對同源強毒攻擊的犬可以提供很好的保護力，具有良好的免疫原性，本發明弱毒疫苗株CPV-YNR可制備成單苗或聯苗，可有效預防或治療由犬細小病毒所致疾病。本發明弱毒疫苗株CPV-YNR遺傳性穩定，具有免疫持久、效果好、安全可靠、保存期長等優點。
文檔編號A61P9/00GK101942419SQ201010244838
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月30日 優先權日2010年7月30日
發明者劉大飛, 劉立奎, 張洪英, 曲聯東, 王牟平 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所