一種修復骨缺損的生物復合支架及組織工程骨的制作方法

專利名稱：一種修復骨缺損的生物復合支架及組織工程骨的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種絲素蛋白/納米羥基磷灰石生物復合支架及其制備方法，以及由 其構建的組織工程骨，屬于生物醫用材料領域。
背景技術：
由于創傷、腫瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨組織缺損是臨床面臨的 難題之一。目前，臨床所用的骨修復材料各有利弊，不能達到理想的要求。研制具有生物相 容性、可降解的三維多孔支架材料是解決這一問題的關鍵問題。羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是天然骨組織的主要無機質成分，具有良好的 生物相容性，已廣泛應用于各類骨缺損的修復。但由微米級羥基磷灰石粉體制備的材料，質 脆強度低，生物機械性能較差，植入后不能被新骨完全替代，在局部形成占位。前期研究表 明通過控制試驗條件可以得到不同形態的羥基磷灰石顆粒，其顆粒尺寸及形態對其生物相 容性有較大影響。但是這距離結構功能一體化的組織工程骨相差很遠，還存在某些不可克 服的缺點，如缺少連通的、均勻的孔結構，不利于骨組織的生長；其降解速度與天然骨組織 生長替代速度不協調；力學強度與天然骨組織的力學性能不匹配等；而且純的羥基磷灰石 只具有骨傳導作用，不具有骨誘導活性。因此將納米級羥基磷灰石與具有骨誘導活性的有 機大分子復合構建與天然骨類似的復合骨替代支架材料已成為當前的研究趨勢。桑蠶絲蛋白來源豐富，除了用于傳統的紡織原料外，由于其優越的力學性能和相 對良好的生物體適應性，人們嘗試多種方法，將其制備成不同的結構和復合材料，運用于骨 組織工程。蠶絲主要由絲膠和絲素(silk fibroin, SF)兩種蛋白構成。作為植入材料，絲 膠的致敏性限制了其應用范圍。相反，絲素蛋白卻具有良好的生物相容性，對水和氧氣具有 良好的通透性。近年來，以其為基質的各種細胞生長支架材料的研究應運而生，成為組織工 程學的一個熱門研究領域。David L.Kaplan帶領的小組研究了 1 0、？^、和1^^共價修飾 絲素蛋白及其誘導骨形成作用，發現造骨細胞可在絲素蛋白上粘附、增殖；通過冷凍干燥、 粒子浙濾和氣體發泡法分別制備了三維多孔絲素支架，考察了制備方法及條件對支架形態 和功能的影響；探索了一種新的全水工藝法制備絲素支架，研究了該支架負載BMP-2后的 體內外成骨能力；在此基礎上研究了納米羥基磷灰石在絲素支架的沉積。Li Wang等人通 過濕法_機械化學合成路線制備出SF/HA納米溶膠，研究了化學修飾對SF/HA復合凝膠微 觀結構及凝膠行為的影響。四川大學的趙勇、王江等人采用仿生礦化法構建三維多孔絲素 蛋白/羥基磷灰石復合支架，并對其進行體外蛋白酶降解和成骨細胞培養。上述支架材料 具有連通的三維多孔結構，顯示出良好的生物相容性并能促進成骨細胞的生長和分化，因 而有望成為新型有機/無機復合生物材料。但對于SF/HA復合支架的制備及其相關體內外 實驗仍處于起步階段，缺少系統的研究。血管化是大塊組織工程骨發展的瓶頸和研究熱點。目前促進組織工程化骨血供 重建的方法主要有(1)利用顯微外科技術，使用帶血管蒂的筋膜瓣或血管束植入細胞與 材料復合物；(2)采用內皮細胞與成骨細胞聯合移植的方法；(3)利用血管內皮生長因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)促進血管生長。其中VEGF是血管內皮細胞 有效的有絲分裂原，是已知誘導血管再生作用最強的生長因子，并且在骨組織發生、發育以 及再生過程中，VEGF起著重要調節作用，將VEGF應用于血管化組織工程骨組織的構建應能 取得較好的效果。組織工程修復均屬于血管形成過程，是一個多因子協調作用的復雜調控 過程。目前認為毛細血管形成過程中，Ang-l、Ang-2及VEGF這三種因子發揮重要作用，構 成Ang/血管生成素受體信號傳導途徑。當機體啟動血管生長時，首先是VEGF與VEGF受 體結合，引發內皮細胞增生并遷移，內皮細胞相互作用形成幼稚管腔，逐漸發育形成毛細血 管。骨髓基質干細胞(Bonemarrow stromal cells, BMSCs)是骨組織工程臨床應用良好的 種子細胞來源。若將VEGF基因轉入BMSCs中，就有可能使BMSCs在發揮成骨作用的同時， 表達分泌VEGF，從而促進血管的生成與長入，有利于血管化組織工程骨組織的新生，提高組 織工程骨組織修復骨缺損的效果，并解決了活體直接應用VEGF不能長久保持其活性且價 格昂貴等問題。分析上述研究結果可知，將絲素蛋白和納米羥基磷灰石復合有望制備出力學性能 優良、微觀結構與天然骨相似的復合支架材料。目前對絲素蛋白/納米羥基磷灰石支架 材料的制備及其生物相容性研究尚處于起步階段，而通過基因轉染技術將VEGF轉染后的 BMSCs植入該復合支架構建組織工程骨的研究目前少見報道。本發明的申請人曾于2009年 06月10日申請過一項發明專利，公開號為CN 101085374A，發明名稱為“一種組織工程化骨 復合體及應用”，公開了一種組織工程化骨復合體，是由呈多空狀且孔徑間貫通的人工骨支 架及植入孔中的轉染有血管內皮細胞生長因子基因的骨髓間充質干細胞組成的，其可作為 骨缺損修復材料應用，可使種子細胞在發揮成骨作用的同時，表達分泌VEGF，從而促進血管 的生成或長入，為新骨生成提供物質基礎，有利于血管化組織工程骨組織的新生，提高組織 工程骨組織修復骨缺損的效果。但其存在以下缺陷羥甲基殼聚糖粘度大，不易降解。

發明內容
針對上述現有技術，本發明的發明人采用納米技術和三維造孔技術，將無機納米 羥基磷灰石與絲素蛋白復合，構建了一種結構功能一體化的復合支架材料。同時，依照組織 工程骨復合體三要素(支架材料、種子細胞、信號因子)的原則，利用基因轉染技術將VEGF 轉染BMSCs植入復合材料內，構建了一種新型組織工程骨，使BMSCs在發揮成骨作用的同 時，表達分泌VEGF，促進血管化，從而提高骨缺損修復的效率。本發明可以為研制理想的骨 缺損修復替代材料提供一定的實驗依據和理論基礎。本發明是通過以下技術方案實現的一種修復骨缺損的生物復合支架，是由納米羥基磷灰石與絲素蛋白構成的，其中， 納米羥基磷灰石與絲素蛋白的質量比為90 10 60 40，復合支架呈多孔狀，孔隙率 70% 95%，孔徑尺寸100 600 μ m，以圓形為主，孔徑間相互貫通。所述的修復骨缺損的生物復合支架的制備方法，包括以下步驟(1)將桑蠶絲置于0. 02mol/L碳酸鈉溶液中處理煮沸30 90min，然后用去離子 水洗滌、干燥，除去對人體組織有致敏反應的絲膠蛋白；(2)將上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于9. 3mol/L LiBr溶液中室溫下進行透析處 理，獲得絲素蛋白水溶液；
(3)按照納米羥基磷灰石與絲素蛋白質量比為90 10 60 40，分別計算出所 需Ca (NO3) 2及(NH4) 2ΗΡ04的質量；稱取所需質量的Ca (NO3) 2，將其加入上述絲素蛋白水溶液 混合得到SF-Ca(NO3)2溶液；(4)稱取相應質量的(NH4)2HPO4,配制成濃度為2mol/L的水溶液；在不斷攪拌條件 下將其逐滴加入上述SF-Ca (NO3) 2混合溶液中，在此過程中添加氨水調節pH值，使其保持在 9 10 ；(5)將上述所得沉淀洗滌至中性，過濾得到SF/HA復合溶膠；將不同尺寸(粒徑 150 250 μ m)的NaCl顆粒加入到上述復合溶膠中，攪拌，注模，將其密封并于室溫靜置 2 8h ；脫模，并將其置于甲醇中10 90min以產生不溶于水的β -折疊結構；(6)將所得復合材料室溫下置于去離子水中浸泡24h，浙濾NaCl顆 粒；-10 -80°c冷凍干燥10 24h，即得到SF/HA復合支架。一種組織工程骨，是由轉染VEGF基因的BMSCs植入修復骨缺損的生物復合支架上 構建而成的。本發明所植入的轉染VEGF基因的BMSCs同發明專利CN 101085374A中所用的一 致，在此不再贅述。本發明具有如下突出的有益效果本發明以絲素蛋白/納米羥基磷灰石溶膠為原料，利用離子浙濾結合冷凍干燥工 藝制備絲素蛋白/納米羥基磷灰石復合支架，通過調節NaCl粒子的半徑及冷凍參數控制復 合支架內孔徑的分布。與現有技術相比，采用本發明所得支架氣孔率及孔徑分布更易控制， 且具有良好的力學性能。本發明與現有技術相比，采用降解性更好的絲素蛋白代替羥甲基 殼聚糖，其性能上差異不大，但能夠在體內完全降解，效果更佳。本發明所得組織工程骨使BMSCs在發揮成骨作用的同時，表達分泌VEGF，從而促 進血管的生成與長入，有利于血管化組織工程骨組織的新生，提高組織工程骨組織修復骨 缺損的效果，并解決了活體直接應用VEGF不能長久保持其活性且價格昂貴等問題。


圖1為兔雙側橈骨缺損模型術后一周X照片；圖2為兔雙側橈骨缺損模型術后三個月X照片；圖3為兔雙側橈骨缺損模型術后八個月X照片；圖4為橈骨中段骨缺損大體標本照片(八個月后)；圖5為骨組織切片示意圖(三個月后)(IOX)；圖6為骨組織切片示意圖(八個月后)(IOX)。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的說明。實施例1(1)將桑蠶絲置于0. 02mol/L碳酸鈉溶液中處理煮沸30min，然后用去離子水洗 滌、干燥，除去對人體組織有致敏反應的絲膠蛋白；(2)將上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于9. 3mol/L LiBr溶液中室溫下進行透析處理，獲得絲素蛋白水溶液；(3)按照羥基磷灰石與絲素蛋白質量比為70/30，分別計算出所需Ca (NO3) 2及 (NH4)2HPO4的質量；稱取所需質量的Ca(NO3)2，將其加入上述絲素蛋白水溶液混合得到 SF-Ca (NO3)2 溶液；(4)稱取相應質量的(NH4) 2ΗΡ04,配制成濃度為2mol/L的水溶液；在不斷攪拌條件 下將其逐滴加入上述SF-Ca (NO3) 2混合溶液中，在此過程中添加氨水調節pH值，使其保持在 10 ；(5)將上述所得沉淀洗滌至中性，過濾得到SF/HA復合溶膠；將平均粒徑為150 μ m 的NaCl顆粒加入到上述復合溶膠中，攪拌，注模，將其密封并于室溫靜置2h ；脫模，并將其 置于甲醇中30min以產生不溶于水的β-折疊結構；(6)將所得復合材料室溫下置于去離子水中浸泡24h，浙濾NaCl顆粒；_20°C冷凍 干燥24h，即得到SF/HA復合支架。實施例2(1)將桑蠶絲置于0. 02mol/L碳酸鈉溶液中處理煮沸30min，然后用去離子水洗 滌、干燥，除去對人體組織有致敏反應的絲膠蛋白；(2)將上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于9. 3mol/L LiBr溶液中室溫下進行透析處 理，獲得絲素蛋白水溶液；(3)按照納米羥基磷灰石與絲素蛋白質量比為80/20，分別計算出所需Ca(NO3)2 及(NH4)2HPO4的質量；稱取所需質量的Ca(NO3)2，將其加入上述絲素蛋白水溶液混合得到 SF-Ca (NO3)2 溶液；(4)稱取相應質量的(NH4) 2ΗΡ04,配制成濃度為2mol/L的水溶液；在不斷攪拌條件 下將其逐滴加入上述SF-Ca (NO3) 2混合溶液中，在此過程中添加氨水調節pH值，使其保持在 10 ；(5)將上述所得沉淀洗滌至中性，過濾得到SF/HA復合溶膠；將平均粒徑為180 μ m 的NaCl顆粒加入到上述復合溶膠中，攪拌，注模，將其密封并于室溫靜置2h;脫模，并將其 置于甲醇中30min以產生不溶于水的β-折疊結構；(6)將所得復合材料室溫下置于去離子水中浸泡24h，浙濾NaCl顆粒；_20°C冷凍 干燥24h，即得到SF/HA復合支架。實施例3(1)將桑蠶絲置于0. 02mol/L碳酸鈉溶液中處理煮沸30min，然后用去離子水洗 滌、干燥，除去對人體組織有致敏反應的絲膠蛋白；(2)將上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于9. 3mol/L LiBr溶液中室溫下進行透析處 理，獲得絲素蛋白水溶液；(3)按照納米羥基磷灰石與絲素蛋白質量比為60/40，分別計算出所需Ca(NO3)2 及(NH4)2HPO4的質量；稱取所需質量的Ca(NO3)2，將其加入上述絲素蛋白水溶液混合得到 SF-Ca (NO3)2 溶液；(4)稱取相應質量的(NH4) 2ΗΡ04,配制成濃度為2mol/L的水溶液；在不斷攪拌條件 下將其逐滴加入上述SF-Ca (NO3) 2混合溶液中，在此過程中添加氨水調節pH值，使其保持在 10 ；
(5)將上述所得沉淀洗滌至中性，過濾得到SF/HA復合溶膠；將平均粒徑為150 μ m 的NaCl顆粒加入到上述復合溶膠中，攪拌，注模，將其密封并于室溫靜置2h ；脫模，并將其 置于甲醇中30min以產生不溶于水的β-折疊結構；(6)將所得復合材料室溫下置于去離子水中浸泡24h，浙濾NaCl顆粒；_20°C冷凍 干燥24h，即得到SF/HA復合支架。上述3個實施例所得絲素蛋白/納米羥基磷灰石復合支架進行下列檢測經過Nicolet AVATR360FT-IR證實復合支架由絲素蛋白和納米羥基磷灰石兩相 構成；經JEM-lOOCx II SEM分析證實復合支架中孔洞相互連通，氣孔率均超過80%， 平均孔徑在150 200 μ m。經深圳三思萬能材料試驗機檢測復合支架抗壓強度均超過150MPa，符合骨支架 復合材料的要求。實施例4構建組織工程骨(I)VEGF基因轉染BMSCs 由NCBI gene bank獲得兔VEGF基因序列，利用分子生 物學的原理和方法，自兔組織提取總RNA，根據合成的引物，反轉錄制備VEGF cDNA片段。與 載體相連接，通過脂質體構建pcDNA3. I-VEGF質粒。抽取成年兔骨髓進行體外細胞培養、傳 代獲得BMSCs。將構建的VEGF質粒導入BMSCs。(2)取實施例1中制備的SF/nHA復合支架，然后通過常規方法將轉染VEGF基因的 BMSCs植入修復骨缺損的生物復合支架上，即得到組織工程骨。實施例5構建組織工程骨及檢測其性能(1)首先傳代培養BMSCs，然后將構建的VEGF質粒植入BMSCs，再置于實施例2制 備的絲素蛋白/納米羥基磷灰石復合支架材料上。(2)建立兔橈骨中段15 20mm長的骨缺損模型(建立模型的方式與發明專利CN 101085374A中記載的一致)，隨機分為4組空白對照組、單純絲素蛋白/納米羥基磷灰石 材料組、BMSCs復合SF/nHA材料組、轉染VEGF基因的BMSCs復合SF/nHA材料組，采用X線 方法觀察轉染VEGF基因的BMSCs復合SF/nHA材料組的成骨能力。觀察指標影像學觀察——按照不同時間段拍攝X線照片觀察成骨情況；結果植入組織工程骨一周后如圖1所示，骨缺損明顯；植入組織工程骨三個月 后，如圖2所示，可見，支架部分降解，髓腔貫通；植入組織工程骨八個月后，如圖3所示，可 見，修復良好，完全愈合，自體骨形成。另外，實驗中并未發現明顯異常反應，生物相容性良好。植入組織工程骨八個月后，取出橈骨，如圖4所示，可以看到，骨質連續均勻，質地 硬韌。完全愈合，復合材料已降解。植入組織工程骨三個月后，組織切片如圖5所示，由圖可見，復合支架材料已基本 降解完，新骨生成，骨髓腔貫通。(圖中，黑色的代表復合支架，灰色代表骨頭，白色發亮處代 表骨髓腔)；植入組織工程骨八個月后，組織切片如圖6所示，由圖可見，復合支架材料已完 全降解，骨髓生成，骨頭已修復成正常骨組織狀態。結論經上述動物實驗證實
1.復合支架具有良好的生物相容性；2.支架降解速度較為理想，且能完全降解；3.骨生長良好；4.骨組織周圍血管生長豐富，給骨生長提供了良好的生長環境；5. BMSCs具有良好的促進骨生長能力。
權利要求
一種修復骨缺損的生物復合支架，其特征在于是由納米羥基磷灰石和絲素蛋白構成的，其中，納米羥基磷灰石與絲素蛋白的質量比為90∶10～60∶40，復合支架呈多孔狀，孔隙率70％～95％，孔徑尺寸100～600μm，以圓形為主，孔徑間相互貫通。
2.權利要求1所述的修復骨缺損的生物復合支架的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟(1)將桑蠶絲置于0.02mol/L碳酸鈉溶液中處理煮沸30 90min，然后用去離子水洗 滌、干燥，除去對人體組織有致敏反應的絲膠蛋白；(2)將上述脫膠處理后的絲素蛋白溶于9.3mol/LLiBr溶液中室溫下進行透析處理， 獲得絲素蛋白水溶液；(3)按照羥基磷灰石與絲素蛋白質量比為90 10 60 40，分別計算出所需Ca(NO3)2 及(NH4)2HPO4的質量；然后稱取所需質量的Ca(NO3)2，將其加入到上述絲素蛋白水溶液，超 聲分散得到SF-Ca(NO3)2溶液；(4)稱取相應質量的(NH4)2ΗΡ04,配制成濃度為2mol/L的水溶液；在不斷攪拌條件下將 其逐滴加入到上述SF-Ca (NO3) 2混合溶液中，在此過程中通過添加氨水調節pH值，使其保持 在9 10 ；(5)將上述所得沉淀洗滌至中性，過濾得到SF/HA復合溶膠；將粒徑150 250μ m的 NaCl顆粒加入到上述復合溶膠中，攪拌，注模，將其密封并于室溫靜置2 8h ；脫模，并將其 置于甲醇中10 90min，以產生不溶于水的β -折疊結構；(6)將所得復合材料室溫下置于去離子水中浸泡24h，浙濾NaCl顆粒；-10 _80°C冷 凍干燥10 24h，即得到SF/HA復合支架。
3.一種由權利要求1所述的修復骨缺損的生物復合支架構建的組織工程骨，其特征在 于是由轉染VEGF基因的BMSCs植入修復骨缺損的生物復合支架上構建而成的。
全文摘要
本發明公開了一種修復骨缺損的生物復合支架，是由納米羥基磷灰石和絲素蛋白構成的，其中，納米羥基磷灰石與絲素蛋白的質量比為90∶10～60∶40，復合支架呈多孔狀，孔隙率70％～95％，孔徑尺寸100～600μm，以圓形為主，孔徑間相互貫通。本發明還公開了一種組織工程骨，是由轉染VEGF基因的BMSCs植入修復骨缺損的生物復合支架上構建而成的。本發明以絲素蛋白/納米羥基磷灰石溶膠為原料，利用離子瀝濾結合冷凍干燥工藝制備絲素蛋白/納米羥基磷灰石復合支架，通過調節NaCl粒子的半徑及冷凍參數控制復合支架內孔徑的分布。與現有技術相比，采用本發明所得支架氣孔率及孔徑分布更易控制，且具有良好的力學性能。
文檔編號A61L27/22GK101905037SQ20101023467
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者盧志華, 李鵬, 王海斌, 趙冬梅 申請人:山東大學